Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецептор-опосредованный транспорт биологически активных веществ с использованием в качестве векторных молекул альфа-фетопротеина и гормона роста человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецептор-опосредованный транспорт биологически активных веществ с использованием в качестве векторных молекул альфа-фетопротеина и гормона роста человека"

РГб од

О 2 ИЮН 1997

На правах рукописи

БЕЛОУСОВА ЮЛИЯ ВЛАДИСЛАВОВНА

РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННЫЙ ТРАНСПОРТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРНЫХ МОЛЕКУЛ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА И ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА.

03. 00. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в отделе биохимии Московского научно-исследовательского института медицинской экологии

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, профессор Северин Е.С.,

кандидат биологических наук Москалева Е.Ю.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Глухов А.И.,

доктор химических наук Габибов А.Г.

Ведущая организация:

Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченоза

Защита состоится " с^А с-С1 с^ 1997 года на заседании Диссертационного Совета Д. 171. 02. 01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан " 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук /п В.В. Отраднова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема направленного транспорта биологически активных веществ (БАВ) имеет два аспекта. Во-первых, это избирательная доставка БАВ в клетки-мишени. Избирательность транспорта при этом достигается специфичностью молекулы-вектора, которая обладает способностью связываться с рецепторами, зкспрессированными только на клетках-мишенях и индуцировать при этом рецептор-опосредованный эндоцитоз. Последний процесс определяет перенос БАВ в клетки.

Второй, практически важный, аспект проблемы направленного транспорта связан с необходимостью введения во все клетки организма тех БАВ, которые в свободном виде в них не проникают, например, определенных генов для лечения некоторых наследственных заболеваний. Для транспорта отдельных БАВ в любые клетки организма, по-видимому, возможно использование конъюгатов гормона роста (ГР) с БАВ так как, рецептор ГР экспрессируется и эндоцитируется практически всеми клетками человека {Kelly P.A. et al., 1993; Mertani H.C. et al., 1995).

В течение последних десятилетий исследуется возможность направленного транспорта БАВ в клетш-мишени в результате эндоцитоза конъюгатов этих веществ с лигандами рецепторов клеточной поверхности (Michael S.l. et al., 1994). Эта проблема в значительной мере решена в случае избирательной доставки БАВ с помощью иммунотоксиноэ, когда в качестве векторной молекулы для БАВ используют антитела к специфическим антигенам цитоплазматической мембраны клеток-мишеней (Ford С.Н. et al., 1986; Embleton M.J., 1987; Pastan I. et al., 19S6; Friedman P.N. et al., 1993; Vitetta E.S., 1993). Однако введение конъюгатов как с поликлональными, так и с моноклональными антителами, осложняется возможностью развития иммунных реакций при повторном введении таких препаратов.

Помимо иммунотоксинов, для рецептор-опосредованной доставки БАВ в клетки могут быть использованы их конъюгаты с физиологическими лигандами клеточных рецепторов. Если некие рецепторы представлены

избирательно на клетках определенного типа, то конъюгат БАВ с физиологическими лигандами таких рецепторов будет обеспечивать высокоизбирательную направленную доставку БАВ в эти клетки. Такой системой, по-видимому, может являться рецептор альфа-фетопротеина (АФП) и АФП, конъюгированный с БАВ (Modjtahedi Н. et al., 1994; Hoshino Т. et al., 1995; Moro R. et al.. 1993; Moro R. 1994; Severin S.E. et al., 1995). Ее избирательность определяется тем, что рецепторы АФП представлены, в основном, на опухолевых и, в значительно меньшей мере, на нормальных клетках.

Особой проблемой при создании конструкций лиганд рецептора-БАВ для направленного транспорта является получение биологически активных конъюгатов, сохраняющих как активность БАВ, так и лиганда соответствующего рецептора, т. е. его способность к связыванию с рецептором и индукции рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Цепь работы. Целью настоящей работы явилось изучение возможности внутриклеточной доставки БАВ в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза с использованием в качестве векторных молекул АФП и ГР человека, а в качестве клеток-мишеней - различных линий опухолевых клеток человека и нормальных лимфоцитов периферической крови человека. В качестве модельного БАВ использовали доксорубицин (ДР), так как флуоресцентные свойства этого вещества позволяют контролировать его накопление в клетках, а цитотоксическая активность ДР может служить критерием его биологической активности как в свободном виде, так и в составе конъюгатов.

Научная новизна. В данной работе впервые продемонстрирована цитотоксическая активность конъюгатов АФП и ГР с противоопухолевым антибиотиком ДР в отношении различных культур опухолевых клеток человека, экспрессирующих рецепторы этих белков. Изучены параметры, необходимые для проявления максимальной биологической активности

конъюгатов ДР с АФП и ГР. Впервые продемонстрирована зависимость величины цитотоксической активности конъюгата от природы молекулы-вектора. Показана возможность использования конструкции БАВ с АФП для направленного транспорта БАВ в опухолевые клетки человека.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Совещании "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994), на XXIIIrd Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Montreal, Canada, 1995). Диссертационная работа апробирована 18 декабря 1996 г. на научном семинаре МНИИМЭ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение и список цитированной литературы. Работа

изложена на _ страницах печатного текста и иллюстрирована _

рисунками и_таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и очистка АФП. АФП получали из ретроплацентарной сыворотки рожениц по методу, описанному в работе С.Е. Северина и соавт, (Severin S.E. et.al.,1995).

Выделение, очистка и определение активности рекомбинантного гормона роста человека. Гормон роста человека выделен и очищен по методике, предложенной A.A. Шульгой (Лопатин С.А. и соавт., 1994),

Биологическую активность гормона роста определяли по его способности стимулировать пролиферацию клеток Т-клеточной лимфомы крысы линии Nb2-11С (Tanaka Tet. а)., 1980).

Получение конъюгэтов АФП и ГР с ДР и АФП с хлорином. Конъюгаты АФП и ГР с ДР и АФП с хлорином получали с помощью водорастворимого карбодиимида (Severin S.E. et.a/., 1995). Конъюгаты хранили при -70°С. Концентрацию белка в коньюгатах определяли по методу Лоури (Lowry О.Н. et.al., 1951). Концентрацию свободного ДР и хлорина определяли спектрофотометрически по поглощению при длине волны 450 нм и 664 км, соответственно. Молярное соотношение АФП : ДР, ГР : ДР или АФП : хлорин 8 синтезированных коньюгатах, зависело от исходных концентраций реагирующих веществ в процессе синтеза. Его определяли, пользуясь калибровочной кривой, построенной с использованием смеси ДР с АФП, ДР с ГР или хлорина с АФП.

Получение конъюгатов АФП и ГР с ФИТЦ. Флуоресцентно-меченные белки получали путем введения в молекулу белка флюоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) по методу Sakal Е et al. (1991). Концентрацию белка в конъюгате определяли по методу Лоури, а ФИТЦа - спектрофотометрически по поглощению при 492 нм, считая коэффициент молярной экстинции равным 68000 (Butcher, 19S0).

Исследование связывания АФП и ГР с их клеточными рецепторами методом проточной иитофлуориметрии. Связывание и эндоцитоз АФП и ГР клетками различных линий исследовали с использованием флуоресцентно-меченных с помощью ФИТЦ препаратов АФП и ГР на проточном цитофлуориметре-сортировщике клеток EPICS-C как описано в работе Laborda J. el al. (1987). Для определения степени связывания клетки инкубировали с ФИТЦ-АФП или с ФИТЦ-ГР на холоду (+4°С) в присутствии 0,1% азида натрия в течение 1 часа, затем отмывали холодным раствором фосфатно-солевого

буфера (ФСБ) с добавлением 0,1% азида натрия и измеряли интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуори метре EPICS-C. Специфическое связывание оценивали в присутствии 50-100-кратного избытка немеченного белка. Для оценки способности клеток к эндоцитозу их инкубировали с ФИТЦ-АФП или ФИТЦ-ГР в течение 1 часа при 37°С и после отмывания измеряли интенсивность их флуоресценции.

Клеточные линии. В работе использовали клетки Т-клеточной лимфомы человека линии QOS, карциномы яичника человека линии SKOV3, В-клеточной лимфомы человека линии lrn-9, миелолейкоза человека линии К562 и Т-клеточной лимфомы крысы линии Nb2-11C из банка клеток ВНЦМДЛ. Лимфоциты периферической крови человека выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколл-пак из крови здоровых доноров. Клетки культивировали в пластиковых флаконах 75 см^ ("Costar") в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СОг.

Для получения культуры, синхронизированной в фазе Go\Gi, клетки Nb2-1lC помещали на 20-24 ч в среду с лошадиной сывороткой вместо ФБС в концентрации 2x10й клеток в 1 мл.

Определение цитотоксической активности препаратов. Цитотоксическую активность препаратов определяли по ингибированию пролиферативной активности клеток. Количество выживших клеток определяли с использованием бромида 3-[4,5-Диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в качеств® витального красителя (Mossmann Т., 1983).

Исследование транслокации свободного ДР и его коньюгатов в клетки

Транслокацию свободного ДР и его конъюгатов в клетки различных линий исследовали, используя флуоресцентные свойства этого антибиотика (длина

волны возбуждения 473 нм, длина волны эмиссии 556 нм). Гашение флуоресценции ДР после его интеркаляции в ДНК клеток и последующее возгорание флуоресценции исследовали при добавлении 0,1 % додецилсульфата натрия (ДСН) (Тагаэшк X е1.а1., 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Связывание и эндоцитоз АФП и ГР опухолевыми и нормальными клетками. Для исследования возможности использования АФП и ГР человека в качестве векторных молекул для направленного транспорта БАВ предварительно был изучен вопрос о наличии соответствующих рецепторов на поверхности клеток, выбранных в качестве модели. Для этого были синтезированы конъюгаты АФП и ГР с ФИТИ Молярное соотношение АФП:ФИТЦ составило - 1:1 и ГР:ФИТЦ - 1:3.

Показано, что опухолевые клетки Т-клеточной лимфомы человека линии ООЭ, В-клеточной лимфомы человека линии 1т-9 и карциномы яичника человека линии ЭКСЛ/З обладали способностью связывать АФП на своей поверхности при 4°С, и интенсивно накапливать АФП при инкубации при 37°С. Клетки этих линий экспрессируют рецептор АФП, взаимодействие с которым приводит к интенсивному накоплению АФП в клетках в результате эндоцитоза. Все указанные выше линии клеток, а также клетки Т-клеточной лимфомы крысы линии ЫЬ2-11С, содержали значительное количество рецепторов ГР и он интенсивно интернализовался этими клетками. При сравнении уровня связывания и эндоцитоза меченных ФИТЦ АФП и ГР опухолевыми клетками было обнаружено, что степень связывания для обоих меченных белков довольно близка, но АФП эндоцитируется значительно более активно, чем ГР (Рис.1, 2).

Связывание АФП с клетками было специфическим, так как при инкубации клеток с ФИТЦ-АФП в присутствии 50-кратного избытка немеченного белка ингибирование связывания составило 66 %. При

Рис. 1. Гистограммы связывания при 4°С (1, Г) и поглощения при 37°С (2, 2*) ФИТЦ-меченного АФП (1", 2*) и ГР (1, 2) клетками карциномы яичника человека линии БКОУЗ. Левый пик на гистограммах - аутофлуоресценция. По оси ординат - количество клеток, %; по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, усл. ед. 50-,

0 -ф0--1-1-г-1-1-г~

0.0 0.5 .1-0 1.5

Концентрация белка, мкМ

Рис.2. Зависимость степени связывания при 4°С (1,1*) и поглощения при 37°С (2, 2*) от концентрации ФИТЦ-меченных АФП (1*, 2") и ГР (1, 2) клетками карциномы яичника человека линии БКОУЗ.

инкубаци и клеток с ФИТЦ-ГР в присутствии 100-кратного избытка немеченного ГР ингибирование связывания составило 53 % (Рис. 3).

60 80 100 [ФИТЦ-ГР], мкг/мл

Рис. 3. Связывание ФИТЦ-меченного ГР с клетками В-клеточной лимфомы человека линии 1пп-9 при 4°С: общее связывание (1), неспецифическое связывание в присутствии 100-кратного избытка немеченного ГР (2), специфическое связывание (3).

При исследовании прямого светорассеивания мононуклеарных лейкоцитов человека показано, что они представлены несколькими популяциями, а именно, лимфоцитами, моноцитами и примесью гранулоцитов. При работе с мононуклеарными лейкоцитами исследовали субпопуляцию, соответствующую по светорассеиванию Т-лимфоцитам. У свежевыделенных нестимулированных лимфоцитов периферической крови человека уровень связывания с АФП был очень низким, а его эндоцитоз практически отсутствовал (Рис.4, 5),что позволяет предположить возможность избирательности действия конъюгатов БАВ с белком в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальными лимфоцитами в случае использования АФП в качество векторной молекулы. Степень связывания и эндоцитоза ФИТЦ-меченного ГР нестимулированными лимфоцитами периферической крови человека практически совпадала с таковой для опухолевых клеток.

ЕГистограммы связывания при 4°С (1) и поглощения при 37°С (2) ФИТЦ-меченного АФП нестимулированными лимфоцитами периферической крови человека. Левый пик на гистограммах -аутофлуоресценция. По оси ординат - количество клеток, %; по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, усл. ед.

[ФИТЦ-АФП], мкг/мл Рис. 5. Зависимость интенсивности связывания при 4°С (1) и поглощения при 37°С (2) АФП, меченного ФИТЦ, нестимулированными лимфоцитами периферической крови человека от концентрации белка.

Влияние степени модификации АФП на его биологическую активность.

Необходимость изучения влияния степени модификации АФП на его биологическую активность определялась тем, что при синтезе конъюгатов возможно повреждение рецептор-узнающего участка АФП, которое может приводить к снижению степени связывания и эндоцитоза конъюгата и в результате к снижению цитотоксической активности конъюгата. Вероятность такого повреждения белка возрастает с увеличением числа вводимых молекул БАВ на молекулу АФП или другую векторную молекулу. Поэтому для

оценки биологической активности АФП после конъюгирования использовали сравнение цитотоксической активности нескольких конъюгатов АФП с ДР с разной степенью модификации АФП.

Для этого синтезировали четыре типа конъюгатов АФП с ДР с соотношением АФП:ДР, равным 1:3, 1:5, 1:8 и 1:20. Цитотоксическую активность этих конъюгатов исследовали в отношении различных типов опухолевых клеток человека и сравнивали с цитотоксической активностью свободного ДР. Показано, что наибольшей цитотоксической активностью обладали конъюгаты с соотношением АФП к ДР равным 1:3 и 1:5, а токсичность конъюгатов с более высокой степенью модификации АФП не отличалась от таковой для свободного ДР (Рис.6).

120

.120£

„-Ю0'

0 80Н

1 60

со

| 40 л

ш 20-| О

б

^562! XV х

10 100 [ДР], нМ

1000

—I I пин.—I—гни—I I I Iш! 1 _10 100 100 [ДР], нМ

гптп—гтттпт—гттта—гтгпп 1 10 100 100.0 10000 [ДР], нМ

Рис.6. Зависимость цитотоксической активности конъюгатов АФП с ДР от степени модификации АФП в отношении клеток В-клеточной лимфомы человека линии 1т-9 (а), миелолейкоза человека К562 (б) и карциномы яичника человека линии БКОУЗ (с) в сравнении с активностью свободного ДР. Выживаемость клеток оценивали через 72 часа после добавления конъюгатов АФП-ДР с молярным соотношением АФП:ДР 1:3 (1), 1:5 (2), 1:8 (3), 1:20 (4) и свободного ДР (5).

Эта закономерность повторяется для всех исследованных линий клеток. По-видимому, более существенная, чем при соотношении АФПДР равном 1:5, модификация молекулы АФП может приводить к нарушению взаимодействия АФП с его рецепторами. Цитотоксическая активность таких конъюгатов может определяться экстраклеточным отщеплением ДР, в то время как при рецептор-опосредованном транспорте отщепление ДР происходит, в основном, после эндоцитоза, под действием внутриклеточных протеаз. Именно этот процесс должен обеспечить избирательность действия препарата.

Влияние степени модификации ГР на его биологическую активность.

Для оценки влияния степени модификации ГР при его конъюгировании с ДР на биологическую активность гормона синтезировали 4 коньюгата с различным молярным соотношением ГР : ДР,равным 1:5, 1:10 и 1:20. Биологическую активность конъюгатов определяли по их способности стимулировать пролиферацию предварительно синхронизированных клегок крысиной лимфомы линии №2-110. Эффективность синхронизации контролировали по распределению клеток №2-110 по фазам клеточного цикла. Полученные данные свидетельствуют о высокой степени синхронизации клеток, так как через 18 часов после замены ФБС на лошадиную сыворотку доля клеток в Со/й,, Э и в2/М фазах составила 82, 13 и 5%, соответственно. При этих условиях культура может сохраняться на протяжении 72 часов без признаков спонтанной пролиферации или гибели клеток. Изучение распределения клеток №2-110 по фазам клеточного цикла под действием ГР позволило заключить, что стимуляция их пролиферации гормоном приводит к снижению доли клеток в фазе Со/в, и к соответственному ее увеличению в фазах Б и й2/М. Уже через 15 часов после добавления ГР доля клеток в фазах Од/О,, Э и в2/М составляла 60, 27 и 13%, а через 20 - 42, 42 и 16%.

Степень стимуляции пролиферативной активности предварительно синхронизированных клеток оценивали по увеличению количества клеток

после добавления ГР с использованием МТТ-теста, используя в качестве контроля клетки без добавления препаратов. ГР обладает способностью стимулировать пролиферативную активность клеток в очень низких концентрациях (от 0,5 пМ). Это позволяет определять биологическую активность ГР в составе конъюгатов с ДР, т. к. в таком низком диапазоне концентрации белка, концентрация ДР в конъюгате ( до 20 нМ ) еще не оказывает токсического действия на клетки. Эти эксперименты показали, что введение до 5 молекул ДР на одну молекулу ГР не влияет на его биологическую активность, а для конъюгатов с молярным соотношением 1:10 и 1:20 она снижается незначительно с увеличением количества введеных молекул ДР (Табл. 1).

Таблица 1.

Зависимость биологической активности ГР от степени модификации белка ДР.

Препарат Индекс стимуляции клеток №2-11С, %

ГР 100

ДР+ГР 100

ГР:ДР 1:5 100

ГР:ДР 1:10 93

ГР:ДР 1:20 86

Таким образом, при введении в молекулу ГР до 10 молекул ДР гормон практически полностью сохраняет свою биологическую активность, оцениваемую по стимуляции пролиферации клеток линии 1\1Ь2-11С, то есть по его митогенной активности.

Транслокация доксорубицина в опухолевые клетки в свободном состоянии и в виде конъюгатов с белками. Известно, что транслокация свободного ДР в клетки млекопитающих осуществляется в результате

диффузии через клеточную мембрану по градиенту концентрации. Этот процесс бывает значительно замедлен лишь в тех клетках, на мембране которых экспонируется белок р170, принимающий участие в выбросе ДР из клеток на этапе его прохождения через мембрану и определяющий множественную лекарственную устойчивость некоторых опухолей .

Возможные пути переноса ДР в различные компартменты клеток при их инкубации со свободным ДР или с ДР в составе конъюгата с АФП или ГР приведены на схеме:

1 2 3

При исследовании накопления ДР в клетках линий №2-11С, 1т-9 и 005 по его флуоресценции в лизатах клеток в присутствии ДСН и флуоресценции инкубационной среды до и после окончания инкубации клеток с ДР или с конъюгатами АФП-ДР и ГР-ДР видно, что в процессе инкубации происходит деградация свободного ДР, регистрируемая по снижению флуоресценции. Очевидно, ДР распадается с образованием нефлуоресцирующих продуктов. В то же время при инкубации клеток Г4Ь2-11С, !т-9 и ООЭ с конъюгатами АФП и ГР с ДР деградация ДР значительно снижалась, что обусловлено прежде всего более высокой стабильностью ДР в форме конъюгата по сравнению со стабильностью, свободного ДР. Это, скорее всего, связано с отсутствием свободной МН2-группы у ДР в составе конъюгата, так как именно по этой группе происходит его конъюгирование с белком (Табл.2).

Таблица 2.

Содержание ДР в клетках и в среде инкубации по отношению к его исходному количеству в среде через 1 час инкубации клеток №2-11С, (ЗОБ и 1т-9 со свободным ДР и конъюгатами АФП и ГР с ДР в концентрации 1 мкМ.

СсдсрАчЗНмЭ ДР] %

Препарат Клетки Среда инкубации Распад ДР

Клетки №2-11С

Свободный ДР 11.8 67,6 20,6

Конъюгаты ГР:ДР = 1:5 45,5 63,6 0

ГР:ДР = 1:10 67,5 57,8 0

ГР:ДР = 1:20 55,4 59,7 0

Клетки 1т-9

Свободный ДР 8 52 40

Конъюгаты ГР:ДР = 1:10 20 58 22

ГР:ДР = 1:20 20 54 26

Клетки оов

Свободный ДР 12 53 35

Конъюгаты АФП:ДР = 1:5 65 25 10

АФП:ДР= 1:8 65 30 5

Кроме того нельзя исключить, что разная скорость деградации свободного ДР и ДР в составе конъюгата определяется различиями в способе его транслокации в клетку ( см. схему ). Так скорость накопления ДР в ядре будет определяться его транспортом по пути 1,2,3 в случае инкубации со

свободным ДР и по пути 1,4,6,3 (1,4,5,7,3) либо 1,4,8 при инкубации с конъюгатами ДР с АФП или ГР, поэтому ДР в состава конъюгатов в меньшей мере может подвергаться действию мембранных и околомембранных цитоплазматических ферментов, например, транс-глугэминазы.

Исследование внутриклеточного распределения ДР по его накоплению в ядре и цитоплазме клеток линий МЬ2-11С, 1т-9 и (ЗОБ через 1 ч инкубации со свободным ДР и с ДР в виде конъюгатов с АФП и с ГР по флуоресценции ДР показало, что при инкубации клеток с конъюгатами АФП и ГР с ДР, как и при инкубации со свободным ДР, происходит накопление ДР в ядре клеток. Распределение ДР по внутриклеточным компартментам происходит одинаково для свободного ДР и ДР, добавляемого к клеткам в виде конъюгата с АФП или с ГР. Таким образом, при использовании таких конъюгатов для направленного транспорта происходит быстрое накопление ДР в опухолевых клетках, причем ДР в составе конъюгатов более устойчив к деградации под действием ферментов клеток. При этом около 80 % ДР в клетках концентрируется в ядре (интеркалирует в ДНК).

Цитотоксическая активность конъюгатов АФП с БАВ в отношении опухолевых клеток.

Выше была продемонстрирована цитотоксическая активность конъюгатов АФП с ДР в отношении нескольких линий опухолевых клеток и были выбраны значения оптимальных для проявления цитотоксической активности молярных соотношений АФП и ДР в конъюгатах (см. Рис. 6). В то же время, важно оценить цитотоксическую активность конъюгатов в сравнении с активностью свободных препаратов при краткосрочной инкубации с клетками. При этом возможность токсических эффектов в результате экстраклвточной деградации свободного ДР под действием ферментов клетки минимальна. Поэтому клетки Т-клеточной лимфомы человека линии СЮЭ инкубировали с конъюгатом АФП-ДР, с молярным соотношением 1:5, и со свободным ДР 60 минут, после чего их отмывали три раза свежей средой и продолжали инкубацию еще 72 часа. Из полученных

данных, представленных на рисунке 7, видно, что цитотоксическая активность конъюгата, оцениваемая по IC-50 (концентрация препарата при которой ингибирование пролиферации достигает 50%), в 4 раза выше, чем свободного ДР и составляет для конъюгата с молярным соотношением 1:5 и для свободного ДР 70 и 500 нМ, соответственно.

[ДР]. кМ

Рис. 7. Цитотоксическая активность конъюгата АФП-ДР с молярным соотношением 1:5 (1 ) и свободного ДР (2) в отношении клеток Т-клеточной лимфомы человека линии QOS.

Цитотоксические свойства хлорина еб, возникающие в процессе его освещения, хорошо известны. Однако, для того, чтобы исследовать возможность более эффективной доставки хлорина в опухолевые клетки, в качестве векторной молекулы был использован АФП. Конъюгат АФП с хлорином синтезировали с молярным соотношением равным 1:2. Цитотоксическую активность конъюгата определяли в отношении Т-клеточной лимфомы человека линии ООЭ в сравнении с цитотоксической активностью самого хлорина. Клетки через час после добавления препаратов отмывали три раза свежей средой, затем подвергали освещению от источника света

(200 \Л/) в течение 5 минут и инкубировали еще 48 часов. В качестве контроля использовали клетки, к которым добавляли конъюгат без световой экспозиции. Количество живых клеток определяли с помощью МТТ - теста (Рис.8).

[Хлорин], мкМ

Рис. 8. Цитотоксическая активность коньюгата АФП-хлорин с молярным соотношением 1:2 без освещения (1) и при освещении клеток е течении 5 мин (1*) в сравнении с действием свободного хлорина при таком же освещении (2).

Более высокая цитотоксическая активность ДР и хлорина в составе конъюгзта с АФП обусловлена их эффективным транспортом в клетки в результате рецептор-опосредованного эндсцитоза при использовании АФП в качестве вектора. Полученные результаты обосновывают возможность использования АФП для направленного транспорта в клетки-мишени БАВ различных классов.

опухолевых клеток.

Исследование цитотоксической активности конъюгатов ГР с ДР проводили на двух линиях клеток: №2-110 и 1т-9. Из полученных данных

следует, что клетки Nb2-11C обладают по IC-50 в 5,6 раз большей чувствительностью к действию ДР, чем клетки lm-9 (табл. 3).

Таблица 3.

Цитотоксичсская активность свободного ДР, конъюгатов ГР-ДР и смеси ГР с ДР в отношении клеток Nb2-11С и 1ш-9.

Приведены средние значения IC50 (нМ) по четырем экспериментам для каждого типа клеток, препараты инкубировали с клетками 1 час, затем отмывали, инкубация продолжалась в свежей среде 72 часа.

Линии клеток Препарат

ДР ДР+ГР Конъюгаты 1:5 1:10 1:20

Nb2-11С 76,3 98 123 119 140

lm-9 424,6 526 877 421 438,5

Для обеих линий клеток цитотоксическая активность, оцениваемая по 1С-50, не зависела от того, были ли они предварительно синхронизированы. Поскольку ГР оказывал на клетки некоторое защитное действие при их инкубации с ДР, цитотоксическую активность конъюгатов целесообразно сравнивать с таковой для смеси ГР с ДР, а не для свободного ДР. Данные цитотоксической активности конъюгатов ГР с ДР коррелируют с результатами, полученными при исследовании транслокации ДР в виде конъюгатов в клетки ЫЬ2-11С и 1т-9. Таким образом, показано, что конъюгаты ГР с ДР обладают цитотоксической активностью в отношении клеток линии №2-110 и 1гп-9. Их токсичность близка (несколько ниже для клеток №2-110 или выше для клеток. 1т-9) токсичности свободного ДР в смеси с ГР, и практически не зависит от соотношения ГР.ДР в диапазоне 1:51:20 для клеток линии ЫЬ2-11С и в диапазоне 1:10 - 1:20 для клеток линии 1т-9.

Срзвнение цитотоксической активности коньюгатов АФП и ГР с ДР в отношении опухолевых клеток.

Для сравнения цитотоксической активности коньюгатов АФП и ГР с ДР были выбраны конъюгаты с таким молярным соотношением белка с ДР, при котором кокьюгат был наиболее активен в отношении опухолевых клеток человека. Для конъюгата АФП-ДР это соотношение было равным 1:5, при конъюгировании ГР с ДР наиболее активным был конъюгат с молярным соотношением 1:10. Клетки через час после добавления препаратов отмывали ФСБ и продолжали инкубировать 72 часа. Полученные результаты, представленные на рисунке 9 показывают, что цитотоксическая активность конъюгата ГР с ДР практически совпадает с цитотоксической активностью свободного ДР, а конъюгата АФП с ДР в 4 раза, выше, чем свободного ДР. Таким образом, для транспорта БАВ в опухолевые клетки, АФП является более эффективной векторной молекулой, чем ГР.

0

т—1—I I I ) [

1000

[ДР], НМ

Рис. 9. Цитотоксическая активность коньюгатов АФП-ДР (1) и ГР-ДР (2) в сравнении с активностью свободного ДР (3) в отношении клеток В-клеточной лимфомы человека линии !т-9.

Резюмируя полученные результаты можно заключить, что и АФП и ГР обеспечивают эффективный направленный транспорт ДР при его

конъюгировании с этими белками, но цитотоксическая активность его конъюгатов с АФП выше, чем с ГР.

Избирательность цитотоксической активности конъюгатов АФП с ДР-

Для оценки возможности избирательного действия конъюгатов АФП с ДР исследовали цитотоксическую активность конъюгата с соотношением АФП:ДР, равным 1:5, в отношении клеток Т-клеточной лимфомы человека линии (ЗОв в сравнении с его действием на лимфоциты периферической крови человека. Через час после добавления ДР или его конъюгатов, клетки несколько раз промывали ФСБ и лимфоциты стимулировали фитогемагплютинином (ФГА) для индукции их пролиферации, после чего клетки обеих линий инкубировали 72 часа. Этот вариант в большей мере соответствует сравнению чувствительности нормальных покоящихся и интенсивно пролиферирующих опухолевых клеток, в то время как в том случае, когда конъюгат остается в среде инкубации после добавления ФГА, он может взаимодействовать с рецепторами АФП, индуцируемыми ФГА в процессе бласттрансформации. Ингибирование пролиферации клеток Т-клеточной лимфомы и лимфоцитов периферической крови под действием конъюгата ДР с АФП представлено на рисунке 10.

[ДР], нМ

Рис. 10. Цитотоксическая активность конъюгата АФП-ДР с молярным соотношением, равным 1:5, в отношении клеток Т-клеточной лимфомы человека линии 008 (1) и лимфоцитов периферической крови человека (2).

Из полученных данных следует, что чувствительность опухолевых клеток к действию конъюгата по крайней мере в четыре раза выше, чем нормальных лимфоцитов при сравнении 1С50 для ингибирования пролиферации (15 и 60 мМ, соответственно). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование ДР в виде конъюгата с АФП приводит к существенно большему повреждению опухолевых клеток по сравнению с нормальными лимфоцитами человека.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что на исследованных линиях опухолевых клеток человека, выбранных в качестве модели для изучения транслокации биологически активных веществ, содержатся рецепторы АФП и ГР и происходит связывание и активный эндоцитоз АФП и ГР, а свежевыделенные лимфоциты периферической крови человека практически не содержат рецепторов АФП.

2. Показана эффективная транслокация ДР в опухолевые клетки человека в виде коньюгатов с АФП и с ГР.

3. Обнаружено, что конъюгаты АФП с ДР и ГР с ДР обладают высокой цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток человека.

4. Обнаружено, что цитотоксическая активность коньюгатов АФП с ДР значительно выше, чем свободного ДР, если молярное соотношение АФП:ДР не превышает 1:10.

5. Показано, что при получении конъюгатов ГР с ДР биологическая активность белка сохраняется при молярном соотношении, равном от 5 до 20 молекул ДР на 1 молекулу ГР. Цитотоксическая активность конъюгатов ГР с ДР не зависит от степени модификации белка и практически совпадает с таковой для свободного ДР.

6. Показано, что АФП может быть использован для избирательного направленного транспорта цитотоксических препаратов в опухолевые клетки, а ГР может быть использован для направленного транспорта биологически активных веществ в любые клетки.

1. M.E. Severina, V.G. Serebryakov, Yu.V, Belousova, S.E. Severin, R. Nakachian, Yu.M. Luzhkov, J. Andreani, P. Torreoillas. Photosensitizing cytotoxic effect of chlorine e6 conjugated with alpha-fetoprotein. XXIIird Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Montreal, Canada, 1995, p.61.

2. К.Г. Скрябин,.C.E. Северин, Е.Ю. Москалева, Ю.В.Белоусова,.И.И. Шмырев, М.П. Кирпичников. Изучение направленного транспорта конъюгатов гормона роста сдоксорубицином в клетки Nb2-11C. Цитология, 1995, т.37, с. 394-395.

3. S.E. Severin, E.Yu. Moskaleva, I.I. Shmyrev, G.A. Posypanova, Yu.V. Belousova, V.K. Sologub, Yu.M. Luzhkov, R, Nakachian, J. Andreani, E.S. Severin. Alpha-fetoprotein-mediated targeting of anti-cancer drugs to tumor cells in vitro. Biochem. and Mol. Biol, int., 1995, V.37, № 2, p.385-392.

4. Ю.В. Белоусова, А.А. Шульга, А.Э. Габриэлян, И.В. Левичкин, С.А. Лопатин, Б.К. Чернов, И.В. Захарова, Н.В. Кузина, Л.И. Михайлова, Е.Ю. Москалева, Т.Я. Кондратенко, Е.С. Северин, К.Г. Скрябин, М.П. Кирпичников. Биологическая активность рекомбинантного гормона роста человека и его аналогов. Молекулярная биология, 1996, т.30, N° 3, с.673-684.

5. Ю.В. Белоусова, И.И. Шмырев, Г.А. Посыпанова, Е.Ю. Москалева, С.Е. Северин, Л.И. Михайлова, М.П. Кирпичников, Е.С. Северин, К.Г. Скрябин. Рецептор-опосредованный транспорт биологически активных веществ в клетки с помощью рекомбинантного гормона роста человека. Молекулярная биология, 1997, т. 31, № 1, с. 118-123.