Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная интернализация экспрессионных генноинженерных конструкций при помощи лактоферрина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Синогеева, Наталья Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.;.

Глава I. Генная терапия - универсальный способ лечения различных заболеваний.

Глава И. Рецепторные пути переноса генетического материала.

Глава III. Химические методы для синтеза коньюгатов на основе белков-лигандов и белоксвязывающих соединений.

Глава IV. Невирусные способы доставки генетического материала.

Глава V. Лактоферрин.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава VI. Материалы и методы исследования.

6.1. Трансформация Е. coli.

6.2. Выделение плазмидной ДНК.

6.3. Получение ЛФ.

6.3.1. Выделение и очистка ЛФ.

6.3.2. Насышение ЛФ ионами железа.

6.4. Синтез производных ЛФ.

6.4.1. Получение иодуксусного ангидрида.

6.4.2. Синтез К-1.

6.4.3. Синтез К-2.

6.5. Электрофорез в неденатурирующих условиях.

6.6. Электрофорез в денатурирующих условиях.

6.7. Получение и характеристика моноспецифических антител против ЛФ.

6.8. Ракетный иммунофорез.

6.9. Иммуноблоттинг.

6.10. Получение препаратов ЛФ, меченных 1251.

6.11. Измерение радиоактивности органов крыс после введения 1251-[К-1].

6.12. Ретардация комплексов в агарозном геле.

6.13. Определение констант диссоциации комплекса ЛФ и плазмидной ДНК.

6.14. Определение влияния солей на комплексообразование ЛФ и его производных с плазмидной ДНК.

6.15. Лазерная корреляционная спектроскопия.

6.16. Условия трансфекции клеточных культур.

6.16.1. Приготовление трансформирующих комплексов.

6.16.2. Трансформация клеток НерС2 плазмидой рСМУЬас2 в составе комплексов с ЛФ.

6.16.3. Трансформация клеток НерС2 плазмидой рСМУСа1 в составе комплексов с ЛФ.

6.16.4.Трансформация миобластов С2С12 плазмидой рСМУЬис в составе комплексов с ЛФ.

6.17. Условия трансфекции животных.

6.17.1. Условия внутривенной трансфекции крыс комплексом рСМУароА1/К-1.

6.17.2. Условия внутривенной трансфекции мышей комплексом рЕОЕРС-3/К-1.

6.17.4. Условия внутримышечной трансфекции мышей комплексами плазмидная ДНК/ЛФ.

6.18. Определение накопления продуктов экспрессии после трансфекции животных.

6.18.1. ПЦР-анализ после внутривенной трансфекции крыс комплексом рСМУароА1/К-1.

6.18.2. Определение накопления продукта экспрессии в гомогенатах органов после внутривенной трансфекции мышей комплексами рЕОРРС-3/К-1.

6.18.3. Определение накопления продукта экспрессии в гомогенатах органов после внутримышечной трансфекции мышей комплексами рЕОРР-СЗ/ЛФ и рСМУЬасг/ЛФ.

6.18.4. Определение накопления (3-галактозидазы в целых мышцах после внутримышечной трансфекции мышей комплексами рСМУЬасг/ЛФ и рСМУЬас2/К-1.

6.18.5. Иммуноцитохимическое определение накопления дистрофина человека после внутримышечной трансфекции mdx-мышей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава VII. Характеристика исходных препаратов.

7.1. Характеристика ЛФ.

7.2. Синтез производных ЛФ.

7.3. Характеристика производных ЛФ.

7.4. Исследование органного распределния конъюгата К-1.

Глава VIII. Характеристика взаимодействия ЛФ и его производных с плазмидными ДНК.

8.1. Электрофорез в агарозе комплексов плазмид с ЛФ и его производными.

8.2. Анализ нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК.

8.3. Определение констант диссоциации комплексов плазмид с немодифицированным ЛФ.

8.4. Определение влияния солей на комплексообразование ЛФ с плазмидными ДНК.

8.5. Определение гидродинамических размеров комплексов плазмид с ЛФ.

Глава IX. Доставка маркерных генов в культивируемые клетки млекопитающих.

9.1. Трансформация клеточных культур комплексами плазмида/ЛФ.

9.2. Трансформация клеток HepG2 плазмидой pCMVCat в комплексе с К-1 или К-2.

9.3. Трансформация клеток HepG2 плазмидой pCMVLacZ в комплексе с К-1.

9.4. Трансформация миобластов С2С12 плазмидой pCMVLuc в комплексе с К-1.

Глава X. Трансфекция лабораторных животных содержащими ЛФ комплексами.

10.1. Доставка маркерных генов при помощи внутривенного введения в составе комплексов с К-1.

10.1.1. Доставка pCMVApo-Al при помощи внутривенного введения в составе комплексов с К-1.

10.1.2. Доставка pEGFPC-3, pCMVLacZ при помощи внутривенного введения в составе комплексов с К-1.

10.2. Доставка репортерных генов в составе комплексов с ЛФ после внутримышечного введения.

10.2.1. Доставка pCMVLacZ, комплексированной с ЛФ, при внутримышечном введении.

10.2.2. Доставка рСМУЬас2 и рЕОБРС-З в составе комплексов с ЛФ после внутримышечного введения.

10.2.3. Доставка рБМВ-1 в миофибриллы мутантных по дистрофину мышей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточная интернализация экспрессионных генноинженерных конструкций при помощи лактоферрина"

Актуальность проблемы.

Успехи, достигнутые в конце 20 века в области биологических наук, в частности в области молекулярной биологии и генетики, позволили по-новому подойти к решению многих медицинских проблем. В последнее время все более отчетливо осознается перспективность нового магистрального направления - разработки способов лечения различных заболеваний при помощи направленного введения генетического материала. Это направление получило название - генная терапия. Суть направления заключается в трансформации клеток больного определенным экспрессируемым геном или его фрагментом, продукт экспрессии которого обеспечивает лечебный эффект. Главной проблемой генной терапии является достижение эффективной экспрессии целевых генов в клетках-мишенях. Её основными задачами являются разработка способов тканеспецифичной доставки целевых генов и путей стабилизации и регулирования уровня экспрессии привнесенной последовательности ДНК. По мере расширения исследований в данном направлении стало ясно, что лечение практически любого заболевания может быть осуществлено методами генной терапии. Помимо вирусных или липосомных способов доставки генов, которые в большинстве случаев имеют целый ряд недостатков, генетический материал может быть введен в клетки-мишени при помощи механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза (РЭ). Под этим подразумевается взаимодействие между различными лигандами, в первую очередь белковой природы, и интернализующими их рецепторами на клеточной поверхности с последующим проникновением лиганда в цитоплазму. На сегодняшний день, для придания генноинженерным конструкциям тканеспецифичности, используют немногим более 10 белковых или других высокомолекулярных лигандов. К сожалению, предлагаемыми способами по разным причинам не удается достичь достаточно высокого уровня трансформации клеток и экспрессии вводимых генов. Поэтому поиск новых пар лиганд-рецептор перспективен как для выявления более эффективных проводников генетических конструкций, так и для расширения списка органов, которые могут быть целенаправленно подвержены трансформации. Естественно, что поле для исследований в данной области практически безгранично, а любой вклад в развитие идей генной терапии имеет весомое теоретическое и практическое значение.

В данной работе впервые предложено в качестве лиганда использовать лактоферрин - ЛФ. Это негемовый железосодержащий гликопротеин семейства трансферринов. ЛФ синтезируется в эпителиальных секреторных клетках и в нейтрофилах. В норме его содержание в плазме составляет 0,6-4,5 х 10~9 М. ЛФ в большом количестве содержится в молозиве (0,67 мг%) и грудном молоке (0,26 мг%). Каждая молекула ЛФ очень прочно (Кс1 ~ лл <5 >

10' М) связывает 2 иона Бе . Из свойств ЛФ следует отметить устойчивость фрагмента, связывающегося с собственными рецепторами ЛФ, к протеолитической деградации трипсиноподобными ферментами, устойчивость к воздействию лизосомальных ферментов, наличие сигнала ядерной транслокации и способность связываться с определенными последовательностями ДНК. При этом аффинность ЛФ (К<1 = 3,8 х 10"8 М) к этим последовательностям превосходит аффинность гистонов (Кс1 = 2,5 х 10"7 М) к ДНК. Вместе с этим, для человека ЛФ из женского молока не является иммуногеном, он быстро удаляется из кровотока и белки плазмы крови не нарушают его связывания с ДНК.

Таким образом, резонно предположить, что ДНК-комплексы с ЛФ или его производными могут служить эффективными посредниками для переноса в клетки-мишени чужеродного генетического материала.

Цели исследования.

В рамках большого проекта развития геннотерапевтических подходов к лечению моногенных, а также различных мультифакториальных заболеваний цель данной работы заключалась в оптимизации способов доставки генетического материала в клетки млекопитающих.

Задачи исследования.

1. Выбрать новые и перспективные для последующего всестороннего исследования пары белок-лиганд - интернализующий клеточный рецептор.

2. Синтезировать на основе этих белков-лигандов и ДНК-конденсирующих агентов конъюгаты, способные связывать и доставлять маркерные гены в клетки-мишени.

3. Определить физико-химические характеристики получаемых ДНК - белковых комплексов.

4. Изучить влияние различных факторов на характер взаимодействия белков и их конъюгатов с ДНК.

5. Исследовать возможности использования белков-лигандов и их конъюгатов для доставки маркерных генов в клетки млекопитающих.

6. Проанализировать органную специфичность доставки маркерных генов в экспериментах на лабораторных животных.

7. Проанализировать динамику накопления продукта экспрессии маркерных генов в зависимости от способа доставки.

Научно-практическая значимость результатов.

Впервые в мире удалось показать, что железосодержащий белок молока - ЛФ способен в немодифицированном состоянии или в виде конъюгатов с ДНК-связывающими соединениями доставлять экспрессируемые гены в составе плазмид в различные клетки, в частности, в мышечные волокна. Найдено, что доставляемые при помощи ЛФ гены экспрессируются в трансформированных клетках. Трансформации подвергаются как клеточные культуры, так и клетки в составе организма. Показано, что комплексы ЛФ - ДНК достаточно эффективно внедряются в мышечные волокна, направляют синтез дистрофина человека у мутантных по дистрофину мышей. Предложены новые способы синтеза белковых конъюгатов, которые исключают гомополимеризацию белков и ДНК-связываюгцих соединений. Охарактеризованы физико-химические параметры взаимодействия ЛФ с плазмидными ДНК, в частности, измерены константы диссоциации и установлены размеры образующихся комплексов. Апробация нового способа трансгеноза на линейных mdx-мышах позволяет увеличить список методов лечения тяжелого наследственного моногенного заболевания - миодистрофии Дюшенна.

Апробация работы.

Результаты исследования доложены на: Втором Съезде Биохимического Общества Российской Академии Наук, Москва, 19-23 мая, 1997 г.; на 1-ой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга, Санкт-Петербург, 17-19 ноября 1997 г.; Международной конференции по медицине для молодых ученых, Люблин, Польша, 24-26 апреля, 1998 г.; конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", посвященной 240-летию ММА им. И.М. Сеченова, Москва, 1998 г.; Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 21-25 сентября, 1998 г.; 9-ой итоговой конференции «Геном человека - 99», Черноголовка, 2-5 февраля, 1999 г.; Международном Конгрессе Геном Человека, Брисбон, Австралия, 27-30 марта, 1999 г.; 10-ой Европейской конференции молодых ученых по биологии и медицине, Берлин (Charité), Германия, 20-24 октября, 1999 г.; 2-ом Международном симпозиуме по трансплантации и генной терапии,

Идар-Оберштайн, Германия, 21-23 октябрь, 1999 г.; 7-ом заседании Европейского общества генной терапии (аббревиатура Е\УОТ), Мюнхен, Германия, 26-28 ноября, 1999 г.; конференции "Современные медицинские технологии", Новосибирск, 30 ноября, 1999 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложен способ химического синтеза межмолекулярных конъюгатов белков и ДНК-связывающих соединений для комплексирования с плазмидами.

2. Выявлены особенности взаимодействия различных плазмид, содержащих маркерные экспрессируемые гены, с очищенным ЛФ человека и с конъюгатами этого белка.

3. Впервые доказана возможность использования ЛФ человека и конъюгатов данного белка для переноса репортерных или целевых генов в клеточные культуры и в ткани лабораторных животных.

4. Показано, что при внутримышечном введении мутантным по дистрофину мышам (модель миодистрофии Дюшенна) комплексов ЛФ и конъюгатов ЛФ с плазмидой, содержащей ген дистрофина человека, в мембранах мышечных волокон накапливается дистрофии человека.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 151 страницах и содержит: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 17 рисунками, 6 диаграммами и 7 таблицами. Список литературы содержит 186 названий работ на русском и английском языках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Синогеева, Наталья Ивановна

выводы.

1. Разработан способ химического синтеза конъюгатов, включающих белки потенциальные лиганды клеточных рецепторов и ДНК-связывающие соединения.

2. Установлены особенности распределения конъюгатов ЛФ в органах крысы после внутривенного введения.

3. Определены физико-химические параметры взаимодействия различных плазмид, содержащих маркерные гены, с ЛФ и с конъюгатами ЛФ.

4. Определено влияние солей Са2+, ЭДТА на взаимодействие ЛФ и его конъюгатов с плазмидами.

5. Впервые показано, что после внутривенного или внутримышечного введения лабораторным животным комплексов плазмидных ДНК с ЛФ и с конъюгатами ЛФ имеет место экспрессия маркерных генов в определенных тканях.

6. Найдено, что внутримышечное введение мышам с моделью миодистрофии Дюшенна комплексов ЛФ или конъюгатов этого белка с плазмидой, содержащей ген дистрофина человека, приводит к накоплению в мышечных волокнах мышей дистрофина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Данная работа посвящена разработке нового способа комплексирования и транспорта генетического материала в клетки млекопитающих на уровне клеточных культур и целого организма. Этот способ заключается в использовании железосодержащего белка молока -ЛФ в чистом виде, а также в форме конъюгатов с ДНК-связывающими агентами для транспортировки генетического материала в различные клетки животных. Результаты проведенных исследований дают основание рассматривать ЛФ как новый весьма перспективный носитель для доставки чужеродных генов ш vivo в органы млекопитающих, особенно в их мышцы. Особенно пристального внимания и всестороннего изучения заслуживает применение ЛФ-лиганда для доставки различных вариантов экспрессирующихся конструкций кДНК гена дистрофина и разработка на основе этого носителя подходов к генотерапии смертельного наследственного заболевания -миодистрофии Дюшенна. Полученные и апробированные в работе молекулярные конъюгаты на основе ЛФ оптимизируют пути доставки генов при использовании внутривенного введения, за счет более сильного взаимодействия с ДНК, а так же придавая комплексам большую резистентность к протеолитическому или нуклеазному воздействию. Отсутствие высокой тканеспецифичности доставки генетического материала объясняется отсутствием синхронизированности работы используемых компонентов ДНК-комплексов и их высокой гетерогенностью. В дальнейшем требуется получение однотипных (по содержанию ЛФ и конденсирующего агента) конъюгатов либо подбором способа очистки препарата, либо путем оптимизации условий химического синтеза.

Факт зависимости эффективности трансформации клеток-мишеней от физико-химических параметров ДНК-комплексов на сегодняшний день не подлежит сомнениям. Многообразие таких параметров и отсутствие информации о законах по увязыванию возможных компонентов ДНК-комплексов друг с другом для достижения максимального

133 терапевтического эффекта открывают широкое поле для исследований. Несомненно, что любой вклад в изучение таких зависимостей или прямая физико-химическая характеристика ДНК-комплексов имеет большое значение. Кроме того, результаты исследований по изучению влияния различных солей на связывание ЛФ с плазмидами или по изучению способности ЛФ декомпактизовать плазмидные ДНК могут пролить свет на биологические свойства ЛФ, которые до сих пор в полном объеме неясны.

Результаты исследований показали необходимость дальнейшего изучения эффективности трансгеноза предлагаемых транспортных систем с использованием ЛФ. Возможно, исследования будут включать оптимизацию количеств пришиваемого лиганда (в случае работы с конъюгатами), расчет не только гидродинамических радиусов, но и формы получаемых ДНК-комплексов, изучение влияния этих характеристик на тканеспецифичность доставки чужеродного генетического материала в клетки-мишени и многое другое.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Синогеева, Наталья Ивановна, Санкт-Петербург

1. Баранов А.Н., Киселев A.B., Иващенко Т.Э. и др. Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека доставленного в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2 // Генетика, 1999, т. 35, № 1, стр. 22-27.

2. Баранов А.Н., Киселев A.B., Иващенко Т.Э. и др. Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека доставленного в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2 // Генетика, 1998, т. 34, № 12, стр. 1-6.

3. Баранов B.C., Тарасенко О.В., Баранов А.Н. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в мышечных волокнах мышей mdx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигопептидов // Генетика, 1998, т. 34, № 7, стр. 876-882.

4. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С-Пб.: "Специальная литература", 1997, 287 стр.

5. Горман К. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих в книге «Клонирование ДНК». Ред. Д. Гловер., М.: Мир, 1998, стр. 403-463.

6. Дарбре А. Практическая химия белка, М.: Мир, 1989, 621 стр.

7. Зеленин A.B., Тарасенко О.В., Колесников В.М. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции // Генетика, 1998, т. 34, № 6, стр. 730-736.

8. Лебедев А.Д., Левчук Ю.Н., Ломакин A.B., Носкин В.А. Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии. Киев.: Наук, думка, 1987, 256 стр.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.: Мир, 1984, 480 стр.

10. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.: Мир, 1971.

11. Мецлер Д. Биохимия. Пер. с англ. под ред. Браунштейна А.Е. М.: Мир., 1980, том 2, стр. 270.

12. Платэ Н.А, Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986, 296 стр.

13. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М.: Советская наука, 1957,137 стр.

14. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк А.В., Кузнецова И.М. Комплекс аппаратных и програмных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе // Цитология, 1998, 40, стр. 806-817.

15. Харбоу Н., Ингильд A (Harboe N.M.G., Ingild А.). Иммунизация, выделение иммуноглобулинов, определение титра антител, руководство по количественному иммуноэлектрофорезу, VI, Получение антисывороток. Ред. Аксельсен Н., Мир. 1977, стр 200-205.

16. Alton EWFW., Middletton P.G., Caplen N.G., et al. Noninvasive liposome-mediated gene delivery can correct the ion transport defect in cystic fibrosis mutant mice // Nat. Genetic, 1993, 5, p. 135-142.

17. Amara J.F., Clackson Т., Rivera V.M., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein- protein interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 10618-10623.

18. Anderson R.G.W., Vasile R.J., Mello M.S., et al. Immunocytochemical visualization of coated pits and vesicles in human fibroblasts: relation to low density lipoprotein receptor distribution // Cell, 1978, 15, p. 919-933.

19. Anderson B.F., Baker H.M., Dodson E.J., et al. Structure of human lactoferrin at 3,2 A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, p. 1769-1763.

20. Ascadi G., Dickson G., Love D., et al. Cultured human myoblasts and myotubes show marcedly different transcducibility by replication-defective adenovirus recombinant // Gene Therapy, 1994 a, l,p. 338-340.

21. Ascadi G., Walsh F.S., Wolff J.A., et al. A differential efficiency of adenovirus-mediated in vivo gene transfer into sceletal muscle cells at different maturity // Hum. Mol. Gen., 1994 6, 3, p. 579-584.

22. Azuma N., Mori H., Kaminogawa S., Yamauchi K. Stimulatory effect of human lactoferrin on DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells // Agric. Biol. Chem., 1989, 53, p. 31-35.

23. Baker E.N., Rumball S.V., Anderson B.F. Transferrins: insights into structure and function from studies on lactoferrin // TIBS, 1987, 12, p. 350-353.

24. Baranov A., Glazkov P., Kiselev A. et al. Local and distant transfection of mdx muscle fibers with dystrofin and LacZ genes delivered in vivo by synthetic microspheres // Gene Therapy, 1999, v. 6, p. 1406-1414.

25. Barinaga M. Step taken toward improved vectors for gene transfer // Science, 1994, 266, p. 1326.

26. Beguinot L., Lyall R.M., Willingham M.C., Pastan I. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization and subsequent degradation in lisosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, p. 2384-2388.

27. Behr J.-P. Synthethic gene transfer vectors // Pure & Appl. Chem., 1994, v. 66, № 4, p. 827835.

28. Behr J.-P. The proton sponge, a means to enter cells viruses never thought of // M/S-Med. Sci., 1996,12, p. 56-58.

29. Bennett R.M., Mohla C. A solid phase radioimmunoassay for the measurement of lactoferrin in human plasma: variations with age, sex and disease // J. Lab. Clin. Med., 1976, 88, p. 156-165.

30. Benvenisty N., Reshef L. Direct introduction of genes into rats and expression of the genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, v. 83, p. 9551-9555.

31. Bi B.Y., Liu J.L., Legrand D., et al. Internzlization of human lactoferrin by the Jurkat human lymphoblastic T-cell line // Eur. J. Cell Biol., 1996, 69, № 3, p. 288-296.

32. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucl. Acid. Res., 1979, v.6, p. 1513-1524.

33. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, p. 7297-7301.

34. Boxer L.A., Haak R.A., Yang H-H. et.al. Membrane-bound lactoferrin alters the surface properties of polymorphonuclear leukocytes // J. Clin. Invest., 1980, 70, p. 1049-1057.

35. Brown M.S., Anderson R.G.W., Goldstein J.L. Recicling receptors: the round-trip itinerary of migrant membrane proteins // Cell, 1983, 32, p. 663-667.

36. Brown V.I., Greene M.I. Molecular and cellular mechanisms of receptor-mediated endocytosis // DNA and Cell Biology, 1991,10, № 6, p. 399-409.

37. Capecchi M. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells // Cell, 1980,22, (2 Pt 2), p. 479-488.

38. Carpenter G., Cohen S. Epidermal growth factor // Annu. Rev. Biochem., 1979, 48, p. 193-216.

39. Chan C.K., Htibner S., Hu W., Jans D.A. Mutual exclusivity of DNA binding and nuclear localization signal recognition by the yeast transcription factor GAL4: implication for nonviral DNA delivery // Gene Therapy, 1998, 5, p. 1204-1212.

40. Chen J. Stickles R.J. Daichendent K.A. Galactosylated histone-mediated gene transfer and expression // Hum. Gene Ther., 1994, 5, p. 429-435.

41. Clemens P.R., Kochanek S., Sumada Y.S. et al. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with adenovirus vector that lacks all viral genes // Gene Therapy, 1996, v. 3, № 11, p. 965-972.

42. Cotten M., Wagner E., Zatloukal K., et al. Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants // J. Virology, 1993, 67, p. 3777-3785.

43. Courtoy P. J., Moguilevski N., Retegui L., et al. Uptake of lactoferrin by the liver. II. Endocytosis by sinusoidal cells // Lab. Invest, 1984, 50, № 3, p. 329-334.

44. Cristiano P., Iovene M.R., Simioli F. et.al. Clinical evaluation of the imipenem/cilastatin combination in the therapy of severe infections in patients with malignant diseases//Drugs Exp. Clin. Res., 1990,16, № 6, p. 293-297.

45. Cristiano R.J., Roth J.A. Molecular conjugates: a targeted gene delivery vector for molecular medicine // J Mol Med., 1995, 73, № 10, p. 479-486.

46. Crystal R.G., MaElvaney N.G., Rosenfeld M. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis // Nature Genet., 1994, 8, p. 42-51.

47. Culver K.W. Gene Therapy. A handbook for physicians. New York.: Mary Ann Liebert Inc. Publ., 1994., p. 117.

48. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., et al. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p. 8850-8854.

49. Dagert V., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of E. coli cells // Gene, 1979, v. 6, № 1, p. 23-28.

50. Damke H. Dynamin and receptor-mediated endocytosis // FEBS Letters, 1996, 389, p. 48-51.

51. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery // Nucleic Acids Research, 1997,25, № 15, p. 3095-3101.

52. Dautry-Varsat A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin // Biochimie, 1986, 68, p. 375381.

53. Davis C.G., Van Driel I.R., Russell D.W., et al. The low density lipoprotein receptor: identification of amino acids in cytoplasmic domain required for rapid endocytosis // J. Biol. Chem., 1987,262, p. 4075-4082.

54. Davis C.G., Lehrman M.A., Russell D.W., et al. The J.D. mutation in familial hypercholesterolemia: amino acid substitution in cytoplasmic domain impedes internalization of LDL receptors // Cell, 1986,45, p. 15-24.

55. Deshmukh H.M., Huang L. Liposome and polylysine mediated gene transfer // New J. Chem., 1997,21, p. 113-124.

56. Davidson L.A., Lönnerdal B. Specific binding of lactoferrin to brush-border membrane: ontogeny and effect of glycan chain // Am. J. Physiol. 1987, 254. p. G580-G585.

57. Dzau V.J., Mann M.J., Morishita R., Kaneda Y. Fusigenic viral liposome for gene therapy in cardiovascular diseases // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, v. 93, p. 11421-11425.

58. Eglitis M.A. & Anderson W.F. Retroviral vectors for introduction of genes into mammalian cells // Biotechniques, 1988, 6, p. 608-614.

59. Ellison R.T., Laforce F.M., Giehl T.J., et al. Lactoferrin and transferrin damage of the gramnegative outer membrane is modulated by Ca and Mg // J. Gen. Microbiol., 1990, 136, p. 1437-1446.

60. Ellison R.T., Giehl T.J., Laforce F.M. Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin // Infect. Immun., 1988, 56, p. 2774-2781.

61. Erbacher P., Remy J.-S., Behr J.-P. Gene transfer with synthetic virus-like particles via the integrin-mediated endocytosis pathway // Gene therapy, 1999, 6, p. 138-145.

62. Erbacher P., Bousser M.-T., Raimond J., et.al. Gene transfer by DNA/glycosylated polylysine complexes into human blood monocyte-derived macrophages // Human gene therapy, 1996, 7, p. 721-729.

63. Feigner P.L. Discovery, development, and application of synthetic gene delivery system. Gene Therapy. Series editors: G. Stock, U-F. Habenicht. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1998.

64. Fercol Th., Perales J.C., Mularo F., Hanson R.W. Receptor-mediated gene transfer into macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 101-105.

65. Fleet J.C. A new role for lactoferrin: DNA binding and transcription activation // Nutr. Rev., 1995,53, №8, p. 226-227.

66. Fominaya J., Wels W. Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein//J. Biol. Chem., 1996, 271, p. 10560-10568.

67. Fraley R., Subramani S., Berg P. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells // J. Biol. Chem., 1980, 255, p. 10431-10435.

68. Fransson G.B., Lonnerdal B. Iron in human milk // J. Pediatr., 1980, 2, p. 693-701.

69. Gao X., Huang L. Cationic liposome-mediated gene transfer // Gene Ther.,1995, 2, p. 710-722.

70. Gao X., Huang L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991,179, p. 280-285.

71. Garcia-Ramirez M., Subirana J. A. Condensation of DNA by basic proteins does not depend on protein composition // Biopolymers, 1994, 34, p. 285-292.

72. Geuze H.J., Slot J.W., Strous GJ.A.M. Intracellular site of asialoglycoprotein receptor-ligand uncoupling // Cell, 1983, 32, p. 277-287.

73. Goavec M., Mazurier J., Montreuil J., Spik G. Role des gliycannes dans la fixation de la sérotransferrine et de la lactotransferrine sur les macrophages alvéolaires humains // C.R. Acad. Sc. Paris, 1985,16, p. 689-694.

74. Goldman A.S., Garza C., Schanler R.J., Goldblum R.M. Molecular forms of lactoferrin in the stool and urine from infants fed human milk // Pediatr. Res., 1990, 27, p. 252-255.

75. Goldsmith S.J., Eitenmiller R.R., Barnhart H.M. et.al. Unsaturated iron-binding capacity of human milk//J. Fd. Sci., 1982, 47, p. 1298-1304.

76. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson R.G.W., et al. Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system // Annu. Rev. Cell Biol., 1985, 1, p. 1-39.

77. Gottschalk U., Chan S. Somatic Gene Therapy (present situation and future perspective) // Drug Res., 1998, 48 (II), Nr. 11, p. 1111-1120.

78. Gottschalk S., Cristiano R.J., Smith L., Woo SLC. Folate-mediated gene delivery and expression in vitro // Gene Therapy, 1994,1,185-191.

79. Gottschalk S., Sparrow J.T., Hauer J. et. al. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells // Gene Therapy, 1996, 3, № 5, p. 48-51.

80. Graham F.L., Van Der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of humanadenovirus 5 DNA//Virology, 1973, 52, p. 429-438.

81. Greber U., Willetts M., Webster P., Helenius A. Stepwise dismantling of adenovirus 2 during entry into cells // Cell, 1993, 75, p. 477-486.

82. He J., Furmanski Ph. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA //Nature, 1995, 373, p. 721-724.

83. Heldin C.-H., Wasteson A., Westermark B. Interaction of platelet-derived growth factor with its fibroblast receptor // J. Biol. Chem., 1982,257, p. 4216-4221.

84. Herbomel Ph., Bourachot B., Yaniv M. Two distinct enhancers with different cell specificities coexist in the regulatory region of polyoma // Cell, 1984 (part 2), 39, p. 653-662.

85. Hara T. Aramaki Y., Takada Sh., et al. Receptor-mediated transfer of pSV2CAT DNA to a human hepatoblastoma cell line HepG2 using asialofetuin-labeled cationic liposomes // Gene, 1995,159, p. 167-174.

86. Hodgson S.P. The vector void in gene therapy // Biotechnology, 1995, 13, p. 222-225.

87. Hoffman E.P., Kunkel L.M. Dystrophin abnormalities in Duchenne/Becker muscular dystrophy //Neuron, 1989, v. 2, p. 1019-1029.

88. Honegger A.M., Dull T.J., Felder S., et al. Point mutation at the ATP binding site of EGF receptor abolishes protein-tyrosine kinase activity and alters cellular routing // Cell, 1987, 51, p. 199-209.

89. Hopkins C.R. The appearance and internalization of transferrin receptors at the margins of spreading tumor cells // Cell, 1985, 40, p. 199-208.

90. Hopkins C.R., Trowbridge I.S. Internalisation and processing of transferrin and the transferrin receptor in human carcinoma A431 cells // J. Cell Biol., 1983, 97, p. 508-521.

91. Huckett B., Ariatti M., Hawtrey A. Increased affinity of insulin for its receptor following conjugation to a second protein // Med Hypotheses, 1991, 36, № 2, p. 135-139.

92. Huckett B., Ariatti M., Hawtrey A.O. Evidence for targeted gene transfer by receptor-mediated endocytosis. Stable expression following insulin-directed entry of NEO into HepG2 cells // Biochem. Pharmacol, 1990, 15, 40, № 2, p. 253-263.

93. Huettinger M., Retzek H., Hermann M., Goldenberg H. Lactoferrin specifically inhibits endocytosis of chylomicron remnants but not a-macroglobulin // J. Biol. Chem., 1992, 267, № 26, p. 18551-18557.

94. Nutrition, 1993, 47, p. 232-241. 103 Jans D.A. The regulation of protein transport to the nucleus by phosphorylation // Biochem. J., 1995,311, p. 127-137.104Johansson B.G. Isolation of an iron-containing red protein from human milk // Acta Chem.

95. IKing G.L., Johnson S.M. Receptor-mediated transport of insulin across endothelial cells //