Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Линейный плазмидный вектор E. coli: конструирование, свойства и применение для клонирования геномной ДНК эукариот

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Линейный плазмидный вектор E. coli: конструирование, свойства и применение для клонирования геномной ДНК эукариот"

На правах рукописи

Л УДК 575.133

1 fi

577.323.43

t f Г* 1

573.262.3

РАВИН НИКОЛАЙ ВИКТОРОВ!«

ЛИНЕЙНЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР E.coll: КОНСТРУИРОВАНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ЭУКАРИОТ

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярного клонирования Центра "Биоинженерия" РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Л.А.Заычук

кандидат биологических наук.М.А.Эльдаров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.К.Янковский

доктор биологических наук С.П.Синеокий

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный технический университет, кафедра биофизики

Защита состоится "<?2" /2. 199^. в К часов на заседании Диссертационного совета Д 002.49.01 при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 117807, Москва, ул.Губкина, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Автореферат разослан " 'Л" '¿е.? ШЙ^г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теыы.

Изучение генома человека в силу его большого практического значения становится одной из важнейших задач современной биологии. Значительный вклад в мировые достижения по геному человека внесли работы, выполненные в рамках Российской национальной программы "Геном человека". Программа ставит задачи картирования и секвенирования генома человека, концентрируя основные усилия в этой области на 3, 13 и 19 хромосомах. Среди других важнейших задач - структурно-функциональное изучение генома, генотерагам и генодиагностика, компьютерный анализ секвенированных последовательностей генома.

Решение практически всех этих задач требует в качестве обязательного промежуточного этапа клонирование фрагментов геномной ДНК человека. Хотя различные вектора для создания геномных библиотек применяются уже давно и в них получены достаточно представительные библиотеки, задача создания библиотек геномной ДНК человека, полно и без искажений представляющих весь геном, продолжает оставаться актуальной. Постепенно накапливаются данные, свидетельствующие о непредставленности отдельных последовательностей в широко распространненных геномных библиотеках. Проблемы, связанные с неклонируемостью или нестабильностью отдельных последовательностей геномной ДНК при клонировании, возникают также при реализации крупномасштабных сиквенсных проектов.

Одной из важнейших причин, препятствующих нормальному клонированию отдельных фрагментов геномной ДНК, считают наличие в них инвертированных повторов (Литтл, 1989). Трудности при клонировании таких последовательностей в обычных кольцевых векторах связаны с образованием ими аномальных вторичных структур в условиях сверхспирализовации (Slnden, 1994).

В связи с этим представляется перспективным создание линейного плазмидного вектора E.coll, не имеющего кольцевой сверхспи-рализованной формы и его применение для клонирования геномной ДНК эукариот. В качестве основы для создания такого вектора может быть использована единственная известная в настоящее время линейная плазмида E.coll - профаг умеренного бактериофага N15.

Данная работа выполнялась в рамках Российской программы "Геном человека".

' ° — Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение возможностей использования линейных плазшвдпых векторов E.coll для клонирования ДНК с инвертированными повторами (палиндромами) и геномной ДНК эукариот. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

- получение мини-плазмид на основе репликона бактериофага N15. Отбор линейной мини-плазмиды минимального размера.

- конструирование вектора из выбранной мини-плазмиды и его характеристика: определение максимальной емкости, числа копий, зависимости эффективности трансформации от размера вставки и др.

- клонирование исскуственных и природных палиндромов в линейном и в кольцевом векторе.

- клонирование геномной ДНК человека в линейном и в кольцевом векторе.

- анализ последовательностей геномной ДНК человека клонируемых только в линейном векторе, если таковые будут обнаружены.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате выполнения диссертационной работы создан линейный плазмидный вектор E.coli. Полученный вектор pN15L имеет ряд значительных преимуществ по сравнению с существующими векторами для клонирования относительно крупных фрагментов ДНК. Показано, что емкость вектора составляет по меньшей мере 50 тпн.

Важным достоинством вектора pN15L является. высокое число копий, около 250 на хромосому, причем при включении в него вставки общее количество плазмидной ДНК сохраняеся. Так, при размере вставки 48 тпн число копий составляет около 50 на хромосому, что значительно выше, чем в случае космидных векторов. Высокое число копий облегчает получение больших количеств рекомбинантной ДНК и скрининг колоний методом гибридизации. Вектор pN15L может быть также использован для проведения крупномасштабного секвенирования вместо pUC или. М13.

В результате исследования ¡^локирования различных искусственных и природных палиндромов в векторе pN15L и, для сравнения, в кольцевом векторе pUC19 сделан вывод, что линейный вектор позволяет успешно клонировать палиндромы, в различной степени подавляющие репликацию кольцевого вектора.

Один из важнейших результатов, имеющих наибольшее практичес-

кое значение, получен при исследовании клонирования геномной ДНК человека. Было установлено, что около 5% фрагментов геномной ДНК человека могут быть успешно клонированы в линейном, но не в кольцевом векторе. Этот результат согласуется с известными данными о том, что около 1-5% космидных клонов, содержащих геномную ДНК человека, нестабильны. Таким образом, представляется перспективным применение вектора pN15L для клонирования последовательностей геномной ДНК, нестабильных или неклонируемых в космидных векторах.

Апробация работы.

Материалы исследований по теме диссертации доложены на следующих российских и международных конференциях: "Геном челове-ка-96" (Москва, 1996), школе молодых ученых "Молекулярная биология и биоинженерия: новое поколение" (Черноголовка, 1997), конференции Центра "Биоинженерия" РАН (Москва, 1997), "Геном человека - 98" (Москва, 1998), шестой международной конференции "Р2, Р4 и родственные бактериофаги" (ФРГ, Берлин, 1998).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано шесть печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из 7 разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы" и "Цитированная литература". Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 28 рисунков, 3 таблицы и список литературы, содержащий 96 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Получение и анализ мини-плазмид. ,

Целью этой части работы было получение на основе репликона бактериофага N15 мини-плазмид и оценка их свойств как потенциальных клонирующих векторов.

В первом из ойытов по получению плазмид на основе репликона фага N15 фаговую ДНК обрабатывали рестриктазой Bgl11. Полученные рестрикционные фрагменты дотировали с геном устойчивости к кана-мицину, вырезанным из плазмиды р!_!С4К при помощи рестриктазы Ваш HI. Лигазной смесью трансформировали бактерии E.coll С, рекомби-нанты отбирали на агаре с канамицином. Были получены рекомбинанты

одного типа - линейная плазмида N15-G54 размером 21.4 тпн. Эта плазмида помимо гена устойчивости к канамицину включает фрагмент ДНК фага N15 между вторым и третьим Bgl II сайтами (по карте фаговой ДНК). Плазмида N15-G54 является низкокопийной, как и профаг N15 (2-3 копии на хромосому), но, в отличие от профага, утрачивается в неселективных условиях. Плазмида N15-G54 сохранила все гены, ответственные за репликацию ДНК, поддержание лизогенного состояния профага N15 и утратила гены, кодирующие структурные белки и гены, ответственные за стабильное поддержание плазмиды (область par).

В последующих экспериментах плазмиды создавались из различ-'ных по расположению и размеру фрагментов фаговой ДНК. С этой целью ДНК фага N15 подвергалась неполному гидролизу рестриктазой Sau3A. Доза фермента была подобрана таким образом, что средний размер образующихся фрагментов состапвлял около 10 тпн. Затем полученные фрагменты лигировали с ДНК гена устойчивости к канамицину, трансформировали бактерии E.coll С, рекомбинанты отбирали на агаре с канамицином. В этом эксперименте было получено несколько десятков линейных и кольцевых плазмид размером от 8 до 30 тпн средней копийности. Все они содержали репликон бактериофага N15. Один рекомбинант - pN15L - представлял особый интерес благодаря необычно большому числу копий плазмиды.

Кольцевые плазмиды N15-1408 и N15-3113 получены из pN15L. Плазмида N15-1408 получена в результате разрезания pN15L рестриктазой Bsp 1191 и внутримолекулярного дотирования. Плазмида N15-3113 - делеционный вариант N15-1408, полученный в результате неполного разрезания плазмиды N15-1408 рестриктазой Sau3A и внутримолекулярного дотирования. Эти плазмиды имеют среднее число копий (10-20 на хромосому) и утрачиваются в неселективных условиях.

Физические карты фага, профага и полученных плазмид показаны на рис.1.

Линейная плазмида pN15L длиной 13.8 тпн представляет особый интерсс. Эта плазмида трансформирует лизогенные штаммы E.coll С(N15) и DH5a(N15) с эффективное тыс примерно вдвое нитке f чем PUC4K. Однако на нелизогенных штаммах E.coll С и DH5a трансфир-мантов получено не было. Видимо, плазмида pN15L неспособна синтезировать какой-то необходимый для нее продукт, недостаток которого восполняется профагом. Первоначальный клон, содержащий плазми-ду pN15L, возник, вероятно, в результате двойной трансформации:

eos__¡=_E E £ a® £

1 ''-- ' 1-1—*- 1 --3-'—- ccf>

~r

B> teLi е. В

ФАГ N15

ее н S ai £ в Ê e«

Г ишш^ 1 11 I ' ' , ' " \

„ I J I 1 I-

bu в a g е. в ъ

ПРОМТ N15

Е с ê km

' i..,;,,,, О

. -,-ЩШ-J

ü ü Le и

СЛ

ПЛАЗЩЦА N15-G54

t t е

es

A.u •

ПЛАЗМВДА pN15L

ПЛАЗМИДА N15-3113

ПЛАЗМИДА N15-1408

Рис.1 Физические карты фага N15

и полученных на его основе плазмид. Обозначения на рисунке соя — "когезивные концы Tal —теломеры

Ка —ген устойчивости к канамицину черным выделен мини-репликон фага N15 Рестрикционные сайты:

Е — Eco RI В — Ваш HI Bg— Bgl II

рекомбинант pN15L и ДНК фага. Последняя могла сохраниться при неполной рестрикции.

Плазмида pN15L имеет аномально высокое число копий, около 250 на хромосому в растущей при 37 С культуре в присутствии 50 мкг/мл канамицина. В стационарных культурах число копий возрастает до 300 на хромосому. Причины аномально высокого числа копий плазмиды pN15L окончательно не установлены. Район между 2 и 3 EcoRI сайтами на карте ДНК профага содержит ген репрессора, контролирующего репликацию плазмидной ДНК. У плазмиды pN15L, в отличие от плазмиды G54, этот район частично делегирован. Вероятно, в результате этой делеции снимается репрессия репликации плазмидной ДНК, а также повреждается неизвестная функция, восполняемая только в лизогенном штамме.

Таким образом, в результате выполнения этой части работы были получены различные кольцевые и линейные мини-плазмиды. Среди всех линейных плазмид наибольший интерес как потенциальный клонирующий вектор представляет плазмида pN15L поскольку, во-первых, она имеет наименьший размер, и, во-вторых, аномально высокое число копий. Плазмида pN15L была взята за основу при конструировании линейного вектора:

2. Создание вектора pHIBL и его характеристика.

Для создания линейного клонирующего Еектора в лежащий вне мини-репликона уникальный BglII - сайт плазмиды pN15L (рис.1.), была вставлена генетическая конструкция, включающая промоторы SP6 и Т7, а также полилинкер с клонирующими сайтами Bgl II и Notl, лежащий между ними.

Для оценки свойств вектора pN15L были предприняты эксперименты по клонированию различных по величине фрагментов ДНК. Для клонирования была выделена высокополимерная хромосомная ДНК из AgTobacterium tumefaclens.

ДНК агробактерии была подвергнута неполному гидролизу рест-риктазой Ваш HI. Доза фермента была подобрана таким образом, что средний размер получаемых фрагментов составлял около 100 тпн. Вектор pN15L был обработан Bgl II, а затем дефосфорилирован. 2.5 мкг Ваш HI фрагментов ДНК агробактерии лигировали с 1 мкг вектора в объеме 50- мкл. Затем полученной смесью трансформировали бактерии DH5a(N15) и анализировали полученные клоны трансформантов.

Длины рекомбинантных плазмид оценивали при помощи импульсно-

-1-го электрофореза, а затем, в случае необходимости, точно определяли с помощью рестрикционного анализа. Таким образом была проанализировано 81 плазмида. Установлено, что средний размер вставок около 30 тпн, доля нерекомбинантных плазмид 10%. Максимальная из проанализированных вставок имела размер 48 тпн.

Было обнаружено, что включение фрагментов ДНК размером до 20 тпн несколько снижает эффективность трансформации и число копий плазмиды (табл.1). Однако, общее количество плазмидной ДНК, а также эффективность трансформации в расчете не на мкг ДНК, а на число молекул не снижаются. При дальнейшем увеличении размера вставки происходит быстрое снижение эффективности трансформации.

Именно этот факт препятствует получению ещё более крупных вставок, однако использование более высокоэффективных методик трансформации (например, электропорации) может увеличить максимальный размер клонируемых фрагментов.

Табл.1 Свойства рШБЬ и её вариантов.

Плазмида Длина (тпн) эффективность трансформации на штамме 0Н5а(М15) Число копий в 0Н5а(Ы15)

рШ5Ь 13.8 6 5 * 10 250

рЫ15Ь + вставка 18 тпн 31.8 2 * Ю6 120

рШ5Ь + вставка 30 тпн 43.8 7 * 105 75

рЫ1БЬ + вставка 48 тпн 61.8 2 * 10 ^ 50

рШ4К 4.0 1.5 а 10? 10

, Таким образом, был получен линейный вектор размером 13.8 тпн, имеющий последовательности промоторов Т7 и 5Р6 и полилинкер

- а -

с клонирующими сайтами Bglll и NotI, расположенный между ними. Число копий вектора составляет около 250 на хромосому. Вектор позволяет успешно ¿тонировать фрагменты ДНК размером до 50 тпн и, вероятно, выше, что необходимо для создания библиотек геномной ДНК.

3. Клонирование искусственных палиндромов.

Для сравнительного исследования клонирования искусственных палиндромных последовательностей в кольцевом и линейном векторе первоначально была получена генетическая конструкция, представляющая собой неидеальный палиндром состоящий из трех фрагментов ДНК бактериофага лямбда. Два из них - BamHI-Bglll фрагменты длиной 5,5 тпн , ориентированные "голова к голове". Третий - Bglll фрагмент длиной 2,4 тпн, включенный между двумя первыми. Вся конструкция клонирована в BamHI сайте pUC19 (рис.2). Если полученную таким образом плазмиду (pUC19-pal) обработать рестриктазой Bglll, религировать продукты реакции и провести трансформацию E.coll, то все получнные рекомбинанты обязательно содержат центральный Bglll фрагмент. Рекомбинантов, содержащих только два BamHI-Bglll фрагмента не получается. Этот факт показывает, что протяженный идеальный палиндром, состоящий только из двух BamHI-Bglll. фрагментов не клонируется, вероятно, вследствие образования крестообразной структуры.

Вероятность образования крестообразной структуры будет возрастать по мере уменьшения длины центрального фрагмента. Таким образом, заменяя центральный фрагмент палиндрома на вставки меньшего размера можно получить набор искуственных палиндромов и исследовать их судьбу в кольцевом и линейном векторах.

В качестве источника центральных фрагментов различной длины мы использовали набор фрагментов ДНК фага лямбда, полученных в результате полной рестрикции ДНК рестриктазой Sau3A. Из 117 получающихся при этом фрагментов 28 имеют длину менее 100 н.

ДНК план»иды pUC19-pal была обработана рестриктазой Bglll и лигирована с препаратом Sau3A фрагментов ДНК лямбда. Колонии, полученные после трансформации бактерий ¿.coll DH5a, были зассяны в L - бульон с ампициллином. Плазмидная ДНК была выделена и анализирована при помощи электрофореза.

Из 72 анализированных трансформантов 4 имели аномально низкое содержание плазмидной ДНК и 2 меньшую ожидаемой длину плазми-

,В> б.б

Л

,в-3 2.4 ,Е3 Б.б ,В

рЦС19-ра1

\ 2 Ь Ц 5 6780 Ю 11 1

Рис.2. Клонирование искусственных палиндромов в р11С19 и в рЫ15Ь. Панель А. Генетическая конструкция, использованная для изучения клонирования искусственных палиндромов. Панель Б. Искусственные палиндромы в р11С19

1-4 - плазмиды, содержащие палиндромы и имеющие нормальное число копий.

5 - маркер молекулярной массы

6. 7, 8, 10 - плазмиды, содержащие палиндромы и имеющие аномально низкое число копий.

9 и 11 - плазмиды, содержащие часть палиндрома Препараты плазмидной ДНК выделены из равных количеств бактерий. Панель В. Искусственные палиндромы, вырезанные из р1!С19 и клонированные в рЬИбЬ.

1 - маркер молекулярной массы

2-5 - плазмиды рШБЬ, содержащие включения, вырезанные из плазмид, показанных на дор. 1-4 панели А

6-9 - плазмиды рЫ15Ь, содержащие включения, вырезанные из плазмид, показанных на дорожках 6, 7, 8, 10 панели А Препараты плазмидной ДНК выделены из равных количеств бактерий.

ды. В последних случаях, очевидно, произошла утрата части клонируемой последовательности. На рис.2 показан результат электрофо-ретического анализа этих 6 плазмид и, для сравнения, нескольких нормальных.

Для показанных на рис.2 плазмид, имеющих аномально низкое число копий и плазмид, имеющих нормальное число копий, при помощи рестрикционного анализа был определен размер центральной вставки. Установлено, что длины центральных вставок (петель) в палиндромах плазмид с нормальным числом копий (рис.2, панель Б, дор.1-4) составляют соответственно 125, 145, 100, и 105 нуклеотидов. Для плазмид, имеющих аномально низкое число копий (рис.2, панель Б, дор.6,8,10) эти длины составляют соответственно 55, 40 и 60 нуклеотидов. Для одной из плазмид (рис.2, панельБ, дор.7 ) вместо центральной вставки была обнаружена несимметричная делеция в од-"ном из BamHI-BglII - фрагментов палиндрома. Таким образом, при длине центральной вставки менее 100 нуклеотидов происходит резкое снижение копийности плазмиды pUC19.

Включения из плазмид, имеющих аномально низкое число копий и из нескольких контрольных, были вырезаны при помощи рестриктазы BamHI и клонированы в линейном векторе. Все полученные рекомби-нанты имели нормальное число копий (рис.2, панель В) и, как показал рестрикционный анализ, содержали палиндром, состоящий из упомянутых выше двух фрагментов ДНК фага лямбда и короткой центральной вставки.

Таким образом, было показано, что при уменьшении длины центральной вставки возрастают трудности при репликации кольцевого вектора,- что проявляется в снижении числа его копий. Вероятно, это обусловлено возрастающей вероятностью образования препятствующих репликации ДНК крестообразных структур в условиях сверхспи-рализации. Все эти палиндромы были успешно "клонированы в линейном векторе.

4. Клонирование природного палиндрома.

В качестве естественного палиндрома был использован экстрахромосомный кластер генов рибосомной РНК Tetrahymena pyriformls. Для * клонирования был использован центральный Bam HI фрагмент этого кластера представляющий собой неидеальный палиндром длиной 12.5 тпн. с центральным спейсером 25н.

Стабильное поддержание этого палиндрома в pUC19 является

проблемой и возможно лишь при использовании специальных штаммов.

Равные количества ДНК BamHI фрагмента были лигированы или с вектором pN15L, разрезанным по Bglll сайту и дефосфорилированным, или с вектором pUC19, разрезанным по BamHI сайту и дефосфорилированным. Продукты лигазной реакции были использованы для трансформации бактерий E.coli Dh5a(N15). Выросшие колонии были перепечатаны на мембраны Hybond N (Amersham). Рекомбинантные клоны, имеющие палиндром или его часть, были обнаружены с помощью гибридизации с радиоактивной пробой, синтезированной на палиндроме.

Было обнаружено, что гибридизационный сигнал в случае вектора pN15L не отличается для различных клонов, в то время как для PUC19 сигнал был во много раз ниже и варьировал для различных клонов. Колонии рекомбинанатов были выращены в L-бульоне. Плазмид-ная ДНК была выделена и анализирована электрофоретически в агароз-ном геле. Было обнаружено, что все из 22 анализированных рекомби-нантов, содержащих палиндром в векторе pN15L, имели приблизительно одинаковое число копий плазмидной ДНК и его длина соответствовала ожидаемой величине 13,8+12,5 тпн. Среди 19 анализированных реком- ' бинантов, содержащих палиндром в векторе pUC19, 2 имели неполный палиндром, а другие 17 имели аномально низкое число копий плазми-ды ( рис.3).

Эти факты дают основание предполагать, что включение палиндрома в кольцевой вектор либо затрудняет репликацию плазмиды либо влияет на выход плазмидной ДНК при ее выделении. Для проверки этих предположений была выполнена дот-гибридизация лизированных бактерий (без выделения ДНК) с несколькими радиоактивными пробами.

С этой целью были выбраны два трансформанта ( из анализированных в предыдущем опыте), имеющие полный палиндром. Один из них имел палиндром в векторе pN15L, другой -в векторе pUC19. Бактерии были центрифугированы, ресуспендированы в том же объеме ТЕ-буфера и лизированы путем добавления NaOH до 0,1 М. Доты были сделаны на мембране Hybond N. Для проверки того факта, что подавление репликации плазмиды pUC19 обусловлено именно включением в нее палиндрома, сравнивали результат гибридизации для палиндромной естайки и непалиндромного включения, в качестве которого использовали BamHI фрагмент ДНК фага лямбда длиной 5,6 тпн. Результат дот-гибридизации показан на рис.3. Как следует из рис.3, гибридизационный сигнал имеет в случае линейного вектора примерно одинаковую величину как для непалиндромного, так и для палиндромного включе-

Рис.3. Клонирование палиндрома из ТеЬгаЬушепа руг1Гогт1в в рЦС19 и в рШ5Ь.

Панель А. Электрофорез ллазмвдной ДНК рекомбинантов, имеющих па-линдромные последовательности из Те1:гаЬутепа руг1Гогт1з в р1]С19. 1 - мартер молекулярной массы

2-4, 6-11 - плазмиды риС19, содержащие палиндром

5, 12 - плазмиды р1)С19, сохранившие часть палиндрома ■ Препараты плазмидной ДНК Еыделены из равных количеств бактерий.

Панель Б. Дот-гибридизация бактерий, содержащих палиндром в рМ15Ь и в р11С19.

1 (слева направо): доты из 5*10 , 1*10 , 2*10 , 4*10 лизированных бактерий, содержащих вектор рН15Ь с палиндромом.

2 - те же количества бактерий, но содержащих вектор р1ГС19 с палиндромом

3-4 - тоже самое, как 1-2, но векторы содержат 5.6 тпн ВатН1 -фрагмент ДНК фага лямбда.

Радиоактивные пробы синтезированы либо на палиндром! (1-2) либо на 5.6 тпн ВатН1 - фрагменте ДНК фага лямбда (3-4). Пробы имели одинаковую общую и удельную активность.

ния (дорожки 1 и 3). В случае р11С19 гибридизационный сигнал для палиндромного включения во много раз ниже, чем для непалиндромно-го (дорожки 2 и 4).

Таким образом, включение палиндрома резко снижает число копий кольцевого вектора по сравнению с непалиндромной Еставкой. Для линейного вектора этот эффект отсутствует.

Следует отметить, что даже для непалиндромной вставки гибридизационный сигнал в случае риС19 во много раз ниже чем в случае линейного вектора. Это связано с тем, что вектор рЫ15Ь имеет во.много раз большее число копий, чем рис*19.

Таким образом, результаты исследования клонирования как ис-кустЕенных так и природного палиндрома в типичном кольцевом векторе риС19 и в линейном векторе рМ15Ь, показывают явные преимущества линейного вектора при клонировании ДНК, содержащей палиндромы. Мы полагаем, что причиной более успешного клонирования палиндромов в рШ5Ь является меньшая вероятность формирования крестообразных структур вследствие отсутствия суперскрученности. Дру-' гой причиной может быть различие в "репликационных машинах" у риС19 и рЫ15Ь. Этот вопрос является предметом дальнейших исследований.

5. Клонирование геномной ДНК человека.

Как известно из литературных данных, в геномной ДНК человека существуют последовательности, которые не могут быть успешно клонированы в кольцевых векторах и отсутствуют в обычных библиотеках геномной ДНК. Одной из важнейших причин, по которым тот или иной фрагмент геномной ДЕК не клонируется или подавляет репликацию вектора, является наличие в нем палиндромов. Как было показано в предыдущих разделах нашей работы, линейный вектор имеет преимущества при клонировании палиндромных последовательностей. Следо-, вательно, есть основания полагать, что в линейном векторе будут успешно клонироваться в том числе и те последовательности геномной ДНК, которые подавляют репликацию кольцевых векторов. В этой части работы мы провели сравнительное исследование клонирования геномной ДНК человека в линейном и в кольцевом векторе.

Для выполнеия этой работы были использованы вектора рЫ15Ь и рШ19. Выбор в качестве примера кольцевого вектора р1)С19 был обусловлен тем, что именно репликон Со1Е1, на котором основана Р11С19, используется в наиболее часто применяемых для клонирования

- 14 -

геномной ДНК космидных векторах.

Для оценки частоты встречаемости в геномной ДНК человека последовательностей, подавляющих репликацию риС19, был проведен следующий эксперимент.

Эксперимент 1.

Выделенная из лейкоцитов геномная ДНК человека была обработана рестриктааой ВашН1, полученные фрагменты были клонированы в ВатН1 сайте плазмиды р1)С19.

Для 70 случайно выбрашшх рекомбинантных клонов было проведено щелочное выделение ДНК и электрофорез с целью определения числа копий плазмид со вставками. Для большинства клонов количества нлазмидной ДНК были приблизительно одинаковыми, однако для 3 клонов было обнаружено аномально низкое число копий плазмиды, причем этот эффект не был обусловлен размером включения (рис.4).

Было проверено, что низкая копийность является свойством именно плазмиды, а не клетки - хозяина. Для этого выделенная плазмидная ДНК была использована для трансформации культуры ЮНЮВ, плазмиды в полученных клонах сохраняли свойство малокопий-ности. Для проверки того, что малокопийность обусловлена именно свойствами клонированного фрагмента, а не мутацией в векторе, включения из малокопийных плазмид были выделены и перенесены в "новую" рШ19. Свойство ыалокопийности сохранялось, причем независимо от ориентации включения отностельно полилинкера.

Фрагменты геномной ДНК человека из малокопийных и нескольких нормальных рекомбинантных плазмид были перенесены в линейный вектор рМ15Ь. С этой целью рекомбинантные плазмиды были обработаны рестриктазой ВатН1, включения были выделены из агарозного геля после электрофореза продуктов рестрикции. Полученные включения были клонированы в Ве1 II сайте рЬИБЬ. Для оценки копийности полученных плазмид было проведено щелочное выделение ДНК и электрофорез. Все полученные клоны имели одинаково нормальное число копий (рис.4).

Таким образом, в ходе этого эксперимента было установлено, что в геномной ДНК человека существуют последовательности, подавляющие репликацию кольцевого вектора (около 5Х ВатН1 - фрагментов) . Все эти последовательности успешно клонируются в линейном векторе рЫ15Ь.

А

4 2 Л Ч 3 6

У 2 5 Ч £ 6

Мм .

Рис.4. Электрофорез плазмидной ДНК клонов, содержащих ВапН! -фрагменты геномной ДНК человека, клонированные е рИС19 и в рМ15Ь.

Панель А. Плазмиды риС19, содержащие фрагменты геномной ДНК человека.

1 - маркер молекулярной массы

2-4 - плазмиды, имеющие аномально низкое число копий 5,6 - плазмиды, имеющие нормальное число копий Препараты ДНК выделены из равных количеств бактерий

Панель Б. Плазмиды рМ15Ь, содержащие фрагменты геномной ДНК человека, перенесенные из р11С19. 1 - маркер молекулярной массы

2-6 - плазмиды с включениями, перенесенными из плазмид, показанных на дорожках 2-6 панели А

Препараты ДНК выделены из равных количеств бактерий

- 16 -Эксперимент 2.

В следующем эксперименте была поставлена цель установить, существуют ли последовательности геномной ДНК человека, клонируемые только в линейном, но не в кольцевом векторе.

Для этого было получено и проанализировано около 200 клонов, содержащих фрагменты геномной ДНК человека в линейном векторе. Все эти фрагменты были затем переклонированы в р1!С19, что позволило идентифицировать последовательности, клонируемые в линейном векторе, но полностью или частично подавляющие репликацию кольцевого вектора.

Выделенная из лейкоцитов человека ДНК была обработана рест-риктазой II лигирована с ДНК вектора рШ.5Ь, обработанного В&1 11 и дефосфорилированного. Продукты лигазной реакции были использованы для трансформации бактерий 0Н10В(Ы15), рекомбинанты отбирали на агаре с канамицином.

Было отобрано 200 рекомбинантных клонов, содержащих одиночные вставки размером не более 15 тпн. Для всех этих клонов была проведена оценка числа копий при помощи электрофореза препаратов ДНК. Было установлено, что все плазмиды имеют приблизительно одинаковое число копий (рис.5). Тагам образом, последовательностей, подавляющих репликацию линейного вектора, в этом эксперименте в ДНК человека обнаружено не было.

Для всех 200 клонов был проведен эксперимент по переносу вставки из рЯ15Ь в р1!С19. С этой целью продукты II - рестрикции препаратов ДНК рекомбинантных клонов в рЫ15Ь лигировали с ДНК вектора рШ19, обработанного Ваш Н1 и дефосфорилированного. Полученная лигазная смесь была использована для трансформации культуры 0Н10В, рекомбинанты отбирали на агаре с ампициллином с использованием цветного теста.

В большинстве случаев были получены рекомбинантные клоны, содержащие рШ19 с перенесенным фрагментом геномной ДНК. Однако, в 3 случаях таких клонов получено не было. Для того, чтобы убедиться в том, что вставки из этих клонов действительно не могут быть клонированы в р1!С19, был проведен следующий контрольный эксперимент. Препараты ДНК этих 3 включений были выделены из агароз-ного геля после электрофореза продуктов Ве1 II - рестрикции ДНК плазмид рН15Ь, содержащих эти 3 вставки. Также были выделены препараты ДНК из 3 контрольных вставок (т.е. тех, которые переносились в р11С19) и Ваш Н1 - фрагмент ДНК фага лямбда размером 5.6 тпн. Для каждого из этих фрагментов была проведена реакция лиги-

рования с р11С19 и трансформации культуры 01110В продуктами дотирования. Трансформанты отбирали на агаре с ампициллином с использованием цветного теста.

При анализе полученных колоний трансформантов было обнаружено, что фрагмент ДНК фага лямбда и контрольные включения успешно переносились в р1!С19, в то время как 3 "аномальные/ вставки не переклонировались в р11С19 (табл.2).

В тех случаях, когда вставку удалось перенести в риС19, было проведено определение числа копий плазмиды в полученных реком-бинантах. Было установлено, что 7 рекомбинантных клонов содержат малокопийные плазмиды риС19 с перенесенным фрагментом геномной ДНК, причем это не обусловлено размером вставки, (рис.5).

Табл.2. Результаты эксперимента по переносу "аномальных" и контрольных вставок из рЫ15Ь в риС19.

Клон Размер Общее Число Из них Из них

в рЫ15Ь вставки число "белых" проана- имели

(тпн) колоний колоний лизиро- перене-

вано сенную

вставку

Аномальные

ЕСТаЕКИ

Клон 1 5.9 320 о о 3 0

Клон 2 3.5 250 0 0 0

Клон 3 6.9 24Ü о о 0

Контрольные

вставки

Клон 4 5.0 410 140 10 10

Клон 5 2.5 310 244 10 10

Клон 6 8.0 270 84 10 9

Вставка из

ВамШ -

фрагмента

Клон 7 5.6 390 220 10 10

Таким образом было установлено, что около 5% фрагментов геномной ДНК человека, клонированных в линейном векторе рЫ15Ь, в различной степени подавляют репликацию кольцевого вектора рШ19.

А

У г. 2. Ч 3 678 в <0 н

ги-

Рис.5. Эксперимент но клонированию геномной ДНК человека в рШ5Ь и переносу клонированных фрагментов в рЦС19.

Панель А.

Электрофорез плазмидной ДНК клонов, содержащих II - фрагменты геномной ДНК человека в рШ51-.

Препараты ДНК выделены из равных количеств бактерий

Панель Б.

Электрофорез плазмидной ДНК клонов, содержащих риС19 с фрагментами

геномной ДНК человека, перенесении:.'.',; из пМ151_.

1 - маркер молекулярной массы

2-8 - плазмиды с аномально низким числом копий

9-11 - плазмиды с нормальным числом копий

Препараты ДНК выделены из равных количеств бактерий

Это проявляется либо в том, что эти фрагменты вообще не .могут быть клонированы в pl)C19 ( 3 из 200 ), либо в резком снижении числа копий плазмиды с такой вставкой (7 из 200). С большой долей вероятности можно предположить, что такие последовательности будут представлены с низкой частотой или вообще не будут представлены в космидных библиотеках. Полученные результаты согласуются с известными данными о том, что около 1-5% космидных клонов, содержащих геномную ДНК человека, нестабильны. Более того, накапливаются данные, свидетельствующие о том, что некоторые последовательности геномной ДНК человека вообще не представлены в космидных библиотеках, хотя они и содержатся в YAG - клонах ("провалы") . Представляется перспективным применение линейного вектора PN15L для клонирования последовательностей, лежащих в таких "провалах".

6. Анализ последовательностей геномной ДНК человека, не клошфуемых в кольцевом векторе.

В ходе описанной в предыдущем разделе работы было найдено 10 фрагментов геномной ДНК человека, которые клонируются в pN15L, но в различной степени подавляют репликацию в pUC19. Два из этих фрагментов, длиной 3.5 тпн (клон 1) и 5.9 тпн (клон 2), были детально проанализированы.

Целью этой части работы были локализация и секвенирвание ответственного за неклонируемость участка ДНК. Рестрикционная карта фрагмента 1 показана на рис.6. ДНК этого фрагмента была обработана рестриктазой Нае III, полученные фрагменты были клонированы в плазмиде pUC19. Было обнаружено, что успешно клонируются Есе Нае III - фрагменты. Таким образом, неклонируемая последовательность, содержащаяся во фрагменте 1, содержит точку Haelll и разбивается при субклонировании.

Все клонированные в pUC19 фрагменты были секЕенированы с концов с использованием стандартных праймеров pUC. Фрагменты 1-1 и 1-3 были секвенированы полностью, фрагменты 1-2 и 1-4 - только с концов. Также была определена нуклеотидная последовательность концевых участков исходной вставки в pN15L, использовались прай-мера SP6 и Т7.

При анализе полученных последовательностей было установлено, что фрагмент 1 содержит палиндром, расположенный вблизи его левого конца. Палиндром имеет стебель длиной 270 нт и центральный

R

Ьз i-

i-x

H

i-2

d-i

H i

палиндром

1-4

J

h

фрагмент 1 3.5 тпн

Б

428 CCTCATTGTTGTGAGTTTTTATCATGAAGGGATGCCAAATTIATCAGATGCTTTTTCTATGTCTATTGAGATGATCAT ATGGITTTT * * * * * ****

517 TTTTAATTCTGTTTATGTGGCXl^TC^CATTTATTGATTTGCATATCTXGAACXATCCTTGTATCTCTAGAATAAGACCCACTTGACT * * * * * * * *

607 GGTGTATTATCTiriCGATGTGCTGCTAAATTTGGTTIGCTAGTATTTGGTTGAGGATTCTTGCATCTATGTIAATCAGGGTTATTCT

697 GGCCCCITCAAAGGTACCTICTCTAACCTAATGAACICTCA . G2ACTTTCTATATCATGGATTTACTCTTTCTTTTTTTTG GAAIG

784 CTBTTATCGGCTOTTCAMGGTACCTICTCTMCCTMT^

Haelll

873 GAATGTACTGTT ATCGG CCAGAGAATAACXX!TGATTAÄCATAGATGCAAGAATCXn'CAACCAAATACTAQC!AAACXJAAATTTAGCA

951 ACATCGAAAAGATAATACACCACAGTCAAGTGG TCITATTCTAGAGATACAAGGATGGTTCAACATATGCAA ICA TAA TGTGAT

* * * *

1047 GCCA ATAA CAGATTAAAAAACAAAAACGATGATCAT ATCICAATAG CATAGAAAA GCATCTGATAA TT GGCATCC TTCAT * * . * * * * * * * * * *

1129 TAAAA CTCACAACAATGAGG 1148

Рис. 6 Локализация и секвенирование аномальной последователъ-ности во фрагменте 1

А Рестрикционная карта фрагмента 1.

Местоположение палиндрома отмечено стрелкой. Рестрикционные сайты: Н - Нае III, Bg - BglII Б Часть нуклеотидной последовательности фрагмента 1, представляющая собой палиндром.

Звездочками отмечены некомплементарные нуклеотиды в пределах стебля палиндрома. Центральный спейсер подчеркнут пунктирной линией. Нумерация нуклеотидов начинается от левого конца фрагмента 1

епейсер длиной 190 н., представляющий собой прямой повтор последовательности длиной 95 н. Нуклеотидная последовательность участка фрагмента 1, содержащего палиндром, представлена на рис.6.

Аналогичным образом было установлено, что фрагмент 2 содержит неидеальный палиндром общей длиной около 600 н.

Таким образом, в обоих проанализированных {слонах обнаружены палиндромные последовательности. Очень вероятно, что именно эти палиндромы являются причиной неклонируемости содержащих их фрагментов геномной ДНК в pUC19.

Для сравнения можно привести результаты, полученные в работе (Chlssoe et all. 1997), в которой были проанализированы участки BAC1D9 клона геномной ДНК человека, не клонируемые в pUC19. Один из этих участков содержал палиндром со стеблем 79н. и спейсером 705н., другой - палиндром со стеблем 100н. и спейсером 50н. В то же время палиндром со стеблем 88н. и спейсером 747н. успешно клонировался в pUC19. Ранее в моей работе было показано, что исс-куственные палиндромы подавляли репликацию pUC19 лишь при длине спейсера менее 100н.

Таким образом, можно видеть, что даже палиндромы с достаточно большими спенсерами могут быть нестабильны в pUC19. Видимо, возможность образования крестообразной структуры в значительной степени определяется не только длиной палиндрома и степенью его неидеальности (в данном случане - длиной спейсера), но и особенностями его нуклеотидной последовательности. Возможно, значительное влияние на вероятность образования креста оказывает также наличие различных прямых и инвертированных повторов в пределах самого палиндрома.

ВЫВОДЫ

1. На основе мини-репликона умеренного бактериофага N15 создан клонирующий вектор pN15L. Вектор представляет собой линейную плазмиду длиной 13.8 тпн, число копий около 250 на хромосому. Вектор имеет полилинкер, содержащий последовательности промоторов SP6 и Т7 и клонирующие сайты Bglll и Notl. Показано, что вектор способен клонировать фрагменты ДНК размером до 50тпн, определена зависимость эффективности трансформации от размера встаЕки и другие характеристики вектора.

2. В результате исследования клонирования искусственных палиндромов и природного палиндрома из Tetrahymena pyriformis было показано, что вектор pN15L позволяет клонировать палиндромы, которые не могут стабильно поддерживаться в кольцевом векторе pUC19.

3. Показано, что около 5% BglII фрагментов геномной ДНК человека, клонирующихся в линейном векторе, в различной степени подавляют репликацию кольцевого вектора pUC19. Это проявляется в том, что такие фрагменты либо вообще не могут быть клонированы в pUC19, либо в резком снижении числа копий плазмиды с такой вставкой.

4. Анализ последовательностей геномной ДНК человека, клонируемых только в линейном, но не в кольцевом векторе, показал наличие в них палиндромов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Н.В.Равин, В.К.Равин. Сверхкопийная плазмида на основе репли-кона умеренного бактериофага N15. 1994, Молекулярная Генетика Микробиология и Вирусология, N1, стр.37-39

2. Н.В.Равин, В.К.Равин. Клонирование крупных неидеальных палиндромов в кольцевом и линейном векторах. 1998, Генетика, том.34, N1, стр.38-44.

3. Н.В.Равин, О.И.Дорошенко, В.К.Равин. COS-район умеренного бактериофага N15. 1998, Молекулярная Генетика Микробиология и Вирусология, N2, стр.17-20

Тезисы материалов конференций:

4. Н.В.Равин, Т-С.Страхова, В.К.Равин. Создание и анализ библиотеки геномной ДНК человека в линейном сверхкопийном векторе. Тезисы конференции "Геном человека-96", стр.15-16, 1996, Москва.

5. Н.В.Равин, О.И.Дорошенко, Т.С.Страхова, В.К.Равин. Создание и анализ библиотеки геномной ДНК человека в линейном сверхкопийном векторе, «шаввшбачммммшвявхзавсэяцанзшзяпссямтавя^ИЦИК

Тезисы конференции "Геном человека-98", стр.28-29, 1998, Москва.

6. S.Casjens, R.Hendrix, N.Ravin, M.Ford, V.Ravin. General description and sequence of temperate bacterlophage N15. The 6th International workshop on P2,P4 and related bacterlophages, abstracts, p.20-21, 1998, Berlin, Germanv.