Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Банки генов высших растений и водорослей и особенности их получения

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Банки генов высших растений и водорослей и особенности их получения"

.. . / Ч

П и У . .'

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ШАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им.К.А.ТИМИРЯЗЕВА.

На правах рукописи

ГУРОВА. Татьяна Федоровна

БАЙКИ ГЕНОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ВОДОРОСЛЕЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических-наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

В.Е.СВлЕНЕНКО Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Н.л.КлЯЧКО - кандидат биологических наук Е.Б.КУЗЬМИН

Ведущая организация - Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Защита состоится "_"_1992 г. в "_"час

на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук /К.002.45.01./ при Институте физиологии растений РАН по адресу: 127276, Москва, ул.Ботаническая, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН.

Автореферат разослан "_"___1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Л.И.Сергеева

-----

•»упдег.тГ^ЧПЛ:: !. "' .•.

5!я ' -дМ'уадь'Ность проблемы: - Сложность организации растительных геномов, а также структурные и биохимические особенности растительных клеток (обилие полисахаридов и эндогенных РНКаз, наличие нескольких типов генетических систем , высокая нагруженность повторяющимися последовательностями) вызывают определенные трудности при изучении их молекулярно-генетическими методами. При сохранении основной стратегии генно-инженерных работ , хорошо отработанных на прокариотах, изучение генов растений часто требует модификаций и дополнений. Для изучения метаболитной, световой регуляции фотосинтеза, адаптивных свойств хлоропласта и взаимодействия ядерного и пластидаого геномов на генетическом уровне необходимо иметь представление об общей организации геномов изучаемых объектов и о структуре отдельных генов. Для получения информации о структуре генов, их регуляторных участков, копийносги в мультигенных семействах, а также для построения физических карт необходимо иметь представительные банки генов. ""Работа в этом направлении с практически ценными объектами (пшеницей и водорослями, имеющими биотехнологическое применение) позволит использовать выделенные гены в опытах по направленному мутагенезу, а также в поиске светорегулируемых участков фотосинтетических генов.

Цель и задачи работы заключались в изучении особенностей клонирования ДНК и РНК растительных видов и создании универсальной векторной системы для клонирования геномов различной степени сложности.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Оптимизировать условия подготовки донорных растительных нуклеиновых кислот для составления кДНК и геномных библиотек.

2. Сравнить эффективность клонирования полученных донорных молекул пшеницы и водорослей в различных типах векторных систем.

3. Для космидного клонирования сконструировать новый вектор, при использовании которого исключается образование фона го-ликосмид и повышается эффективность клонирования.

4 Проверить универсальность нового вектора для составления по предложенной схеме банков генов прокариот, водорослей и высших растений.

5. Провести скрининг полученных библиотек и выделить некоторые гены, участвующие в различных фотосинтетических реакциях.

Г

Научная новизна работы. Впервые для суспензии клеток водорослей предложен метод получения высокополимерной ДНК путем обработки их в слое легкоплавкой агарозы. Метод исключает случайные разрывы крупных молекул ДНК и позволяет повысить эффективность клонирования, а также значительно сокрадает "расхода" начального растительного материала

Сконструирован новый космидный вектор, обладающий малыми размерами и большой емкостью, что позволяет успешно клонировать крупные растительные геномы. Предложена новая схема клонирования, исключающая образование фона клонов' ДШ космид, не содержащих вставок. При использовании новой космиды получены представительные банки генов различных организмов, в том числе, "трудноклонируемых". Геномная библиотека водоросли Dunaliella salina получена впервые.

Практическая значимость работы состоит в том, что полученные результаты могут быть использованы как практическое руководство по составлению банков генов растений на всех его этапах. Новый вектор может быть использован для составления банка генов любого другого растительного объекта При этом будут проклонированы крупные участки генома, что важно для построения физической карты малоизученных геномов, при изучении организации мультигенных семейств генов и их ре-гуляторных участков.

Апробация работы Результаты работы докладывались на I и II Всесоюзных конференциях молодых ученых по физиологии растительной клетки С Москва, 1983 и 1986 ), Научной конференции молодых ученых и специалистов НЦБИ (Пущино, 1983), на II Делегатском Съезде физиологов растений (Минск, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа(13б страниц, й£ рисунок*^ б таблиц) состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов рабо ты, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы ^»¡наименований, из них зарубежных авторов

Материалы и методы. Бактериальные штаммы Е.coli DHI, К 802, М3101, Q 359, ВНВ 2688, ВНВ 2690 (Манкагис ,1984), QD 5003 (SíiIII, Y ¡reí; cured ofjO использовались в экспериментах по клонированию и упаковке in vitro.

Объект исследований. В работе использовали штаммы одноклеточных юдорослей из коллекции микроводорослей IPPAS ИФР РАН и растет

пшеницы сорта Мироновская 808.

При выделении РНК из растений руководствовались методами, описанными (Brawerman,1974; Wostemeyer,1981; Hall,1978; Beachy,1980) с собственными модификациями, описанными в разделе "Результаты и сб-суждение".

Электрофорез препаратов РНК проводили в смешанном геле: 3Z ак-риламид + 0,5Х агар&за с окрашиванием акридиновым оранжевым, либо в денатурирующих условиях в 6Z акриламиде с 6М мочевиной. Анализ размеров кДНК и «ЗзДНК проводили в 1,5% щелочном и нейтральном агарозных гелях.

Аффинная хроматография РБК выполнялась по методике (Aviv, Leder,1972)

кДНК- клонирование проводили линкерным методом в фаге Ш3гпр2 (Gronenborn, Messing, 1978), либо в системе Окаяма-Берга (Okayama, Berg, 1982).

Высокополимерную ДНК из растений и водорослей выделяли различными методами (Blm,Stafford,1976; Murray, Thompson, 1980; Carle, Olson,1984), комбинируя и модифицируя методы да увеличения размерности получаемых препапатов ДНК. Результаты представлены в работе.

Электрофорез в пульсирующем поле проводили на приборе оригинальной конструкции (Еериташвили,1991), используя методику Чурикова (Чуриков, 1988).

Методы молекулярного клонирования: выделение плазмидной ДНК, рестрикция, электрофорез, трансформация E.coli, ник-транеляция и концевое мечение, гибридизация колоний и блотинг-гибридизация, дотирование и упаковка фагов in vitro , применявшиеся нами, соответствовали руководству Маниатиса (Маниатас,1084).

Содержание работы .

1. Подготовка донорных молекул для составления банков генов Выделение нуклеиновых кислот.

Один из наиболее ответственных этапов создания библиотек генов от которого во многом зависит успех клонирования - подготовка донорного материала. Качественные препараты нуклеиновых кислот не обходимы для идентификации и выделения отдельных генов , а также для изучения их на молекулярном уровне. кДНК-библиотеки использу втся в основном для изучения кодирующей области интересующих генов, тогда

как для изучения их регуляторных участков, локализации, физического картирования необходимы геномные библиотеки. Часто требуется комбинированные знания о структуре мРНК и соответствующей структуре ДНК, ее нуклеотидной последовательности в некодирующей цепи. Такие комплексные исследования, например, проводились группой Шинозаки (Shiriozaki et al,1986; при определении полной нуклеотидной последовательности хлоропластного генома табака, и на отдельном этапе этой работы - при изучения структуры гена rbcL (большой субъединицы РБЗК). В нашей работе было уделено много внимания первому зтапу составления банков генов: выделению РЯК и ДЦЖ из растительных объектов.

Выделение мРНК m пшеницы. Несмотря fia то, что выделение мРНК кз клеток животных в настоящее время на представляет проблемы, выделить биологически активную мРНК из растений очень трудно из-га обилия полисахаридов и эндогенных РНКаз (Ross, 1988)

3 сводной таблице (1) показан общий выход нуклеиновых кислот и поли (А) РНК., которые были выделены нами различными методами из созревающих зерен пшеницы, так как предполагалось выделить матрицы син теза запасных белков пшеницы -глиадинов. Кроме количественного выхода , спектрофотометрических характеристик, мРНК в каждом опыте испы-тывадаеь на активность в бесклеточной системе из зародышей пшеницы или лизата кроличьих ретикулоцитов. Наиболее эффективным методом для этого вида растительной ткани оказался фенольный в сочетании с сар-козинатом натрия и протемназой К. в буфере для гомогенизации. Тага<е примененный нами бесфенольный метод исключает неприятности работы с фенолом - сильным окислителем и летучим веществом. Без существенного снижения выхода этим методом можно получать активные матрицы для бесклеточного синтеза и построения кДНК для клонирования. Путем многократных. отмывок удаляются почти все полисахариды, которые очень мешают проведению дальнейших ферментативных реакций. Кроме того дифференциальное осаждение хлористым литием позволяет получать фракцию высокомолекулярных mFHK с размерами 12S и более. мРНК , кодирующая запасные белки пшеницы (-30 кД), будет иметь размеры около 12 S, и. следовательно, может быть не только выделена данным методом, но и от-селектирована от низкомолекулярных фракций. мРНК, выделенную феноль-ным методом , использовали для синтеза кДНК и клонирования линкерным способом в фаге W13 шрй. Для клонирования кДШ. в системе Окаяма-Берга пользовались препаратами ДНК, полученными методом осаждения хло- ' ристым литием.

Синтез кДНК е помощью обратной транскриптазы и динкерное клонирование кДНК. На активных матричных РНК проводили синтез комплиментарной ДНК с помощью обратной транскриптазы (АМУ), полученной из ВНИИПМ Главмикробиопрома. Использовались различные модификации стандартной реакционной смеси (Е1е(:.га!иас113,1979). Олиго (сГГ) 12-60 использовалась в качестве затравки, остальные условия подбирали , внося коррективы из различных литературных данных (й1,г1ск1апс!,19'/7; Кгие^ег,1978).

фрагментом Кленова этого фермента. Полученный ферментативно набор фрагментов ДНК имел молекулярную массу от 0,9 до 1,4 мегадальтон (1, 4-2, 3 т.п.н. ,рис. 1) Двухцепочечну» кДНК встраивали в фаговый вектор М13 тр2 с помощью Eco R I - линкера, в соответствии с руководством (Gronenborn, Messing, 1978). Полученный в результате низкий выход ре-комбинантов (7 бесцветных колоний) на фоне высокого уровня восстановления вектора происходит, по-видимому, из-за конкуренции молекул в реакции лигирования, либо из-за появления "неполноценных" кДНК после присоединения линкера. Кроме того, в ходе клонирования не была проведена защита метилированием кДНК перед рестрикцией молекул с линкером по ECO RI -сайту что существенно повышает еыход рексмбинан-тов. Таким образом, клонирование кДНК пшеницы в выбранной системе не имело успеха. Вероятность обнаружить среди полученных рекомбинантных клонов полноразмерные копии геноЕ была слишком мала. Возможно, данная Еекторная система не является оптимальной для клонирования генов данного объекта.

Сообщение Окаямы-Берга (Okayama, Berg, 1982), было принципиально новым подходом к созданию высокоэффективной системы ■ клонирования полноразмерных кДНК. Построение молекулы ДНК на РНК -матрице частич-

j

Рис. 1. Анализ кДНК пшеницы электро-

3 - ДНК pBR322, рестриктированная Bgll

Вторую цепь ДНК синтезировали ДШ-полимеразой I Е. coli или

но протекает внутри живой клетки (in vivo) при естественной репликации введенных векторных молекул. Вектор одновременно играет роль праймера-затравки в синтезе молекул кДНК.

Мы использовали имеющиеся препараты пшеничной мРНК для клонирования этим методом с модификациями. Pst 1 был сайтом встраивания по накей схеме, соответственно и отбор оекоыбинантов - по другому селективному признаку - устойчивости к тетрациклину. Кроме того, трансформация клеток Е. col i, лмгирование проводилось в обычных условиях , без подбора специальных условий, как эго рекомендуют акторы метода. Было получено в результате трансформации более 100 тетрациклин-резистентных ионов. В соответствии с расчетами авторов метода только 80% полученных рекомбинангов имели вставку интересующего гена, остальные несли случайные вставки. Из оставшихся только 1/10 исследуемых клонов содержали полноразмерные кДНК, остальные были гетерогенными поли dA:dT - сегментами, которые появились при размножении вводимых химер в E.coli. Проведя аналогичные расчеты, среди полученных нами клонов только 8, вероятно, содержали нужные последователь-кости генов. Такое количество клонов недостаточно для анализа гетерогенной популяции глиадинов, насчитывающей от 12 до 100 индивидуальных полмпеятидов. Идентификация де этих генов по продукту трансляции в бесклеточной системе также затруднена из-за сложности получения высокоспецифичшй иммунной сыворотки к этим белкам. Поэтому в дополнение к подученным клонам и для выделения иолноразмерных генов, которые необходимы для экспериментов по направленному мутагенезу и дальнейшей клеточной трансформации пшеницы, нужно бы ло иметь полную геномную библиотеку генов, в которой отдельные клоны содержа. ли бы г.о возможности крупные вставки растительной ДНК.

Кроме того, геномную библиотеку можно использовать для изучения повторяющихся последовательностей, в том числе, мультнгенных семейств, Организация последних, обеспечивавшая дифференциальную активность генов, вызывает особый интерес у физиологов растений. Один из примеров таких генов, экспрессии которых отражает координированное взаимодействие ядерного и пластидного геномов в процессе роста и адаптации растений, елукат гены большой и малой субъединиц РВФК. Дл: изучения вопросов регуляции фотосинтеза на генетическом уровне, изучения отдельных генов, задейстованных в фотосинтетических реакциях, и их регуляторных участков на удобном модельном объекте - одноклеточных водорослях - была поставлена задача получения представитель-

Таблица I. Количественный выход мРВД, выделенной различными методами

Метод Кол-во Тотальных Поли(А) Конечный

ткани нуклеино- фракция выход , .

повтор- (г) вых кис- Тмкг) поли(А)на г

ности лот (мг) ткани (мкг)

I. Полисомный 50 1,78 6,8 0,13

2. Фенольннй I 20 4,5 16 0,8

2 100 - 80 0,8

3. Фенольный в I 75 65 561 7,5

сочетании с 2 25 51 394 17

протеиназой К 3 25 32 288 ' 12

и саркозилом

4. Бесфенольный, I 5 2,4 32 6

дифференциаль- 2 10 5,6 56 5,6

ное осаждение хлористым литием ( 11 С1)

Таблица 2. Характеристика препаратов ДНК, выделенных различными методами

Метод, объект

I. Цетавлон хлороформ/о ктано л цетавлон (шеница) 1,85 1,9 2 1,54 30-50

2. Саркозил+протеи-наза фенольно/ крезольная смесь Et ОН (пшеница) 1,86 -1,78 2 2 50-72

3, Комбинированный: саркоэил+протеи-наза К хлоро-форм/октанол цетавлон (хлорелла) 2,01 1,99 0,25 0,525 50

4. Метод "агарозной подушки" (дуналиелла) I 500 300-400

Спектральные Выход ДНК Размеры

характеристики получен.

- ДНК тин

Кол-во Кол-во а260/280 а260/230 исход. ^К

(г)

ных библиотек генов для Puñal ¡ella sal i na sí Chlorella sp. В процессе составления библиотек решались некоторые специальные генно-инженерные задачи.

Выделение высокополимерной ДНК. Необходимыми условием создания геномных библиотек является использование препаратов ДНК клонируемых организмов, содержащих по возможности целые молекулы, чтобы при расщеплении рестриктазами статистический набор фрагментов представлял весь геном. Для эукариот исходная ДНК должна быть как можно более еьюокополимердай. '¿то необходимо для того, чтобы оба конца етдеш*-емых после рестрикции фрагментов имели нужный сайт.

Выделение высокополимерной ДНК из растений является непростой задачей. Добиваясь лучших результатов, мы применяли несколько методов выделения ДНК для разных объектов (таблица 2.) Полученные препараты ДНК имели молекулярную массу 50-70 и 300-400 тпн, имели хорошие спектральные характеристики и были пригодны для клонирования.

2 i 2 i

Рис.2. Электрофорез высокополимерной «о ДНК D. sali па в пульсирующем

поле в IX агарозе (справа схема)

1 - мультимеры фага лямбда

2 - ДНК D.salina

50тпн

При выделении ДНК из меток водорослей, имеющих очень прочную клеточную стенку, применяли комбинацию отдельных этапов двух методов, выбранных нами для выделения пшеничной ДНК.

Для клонирования в космиде ДНК. водоросли Dunaliella salina, у которой отсутсвует клеточная стенка, применяли мягкий метод выделения ДНК в "агарозкой подушке", разработанный для суспензии клеток дрожжей (Carie, Olson, 1984). Модифицировали метод на начальных этапах и получили качественные препараты ДНК очень высокой степени полимерности (рис. 2). Размеры препаратов ДНК - 300-400 т. п. н. и более.

Оценку молекулярного веса высокополимерной ДНК Dunaliella salina осуществляли электрофорезом в пульсирующем поле. Метод позео-

ляет разделить не только крупные фрагменты ДНК, но и целые хромосомы (Schwartz, Cantor,1984). При подборе условий для разделения хромосом Dunaliella в пульсирующем поле, удалось добиться вхождения в гель только самых мелких из них. Но это не исключает возможности определения локализации некоторых генов на отдельных хромосомах , либо их частях, если фрагменты будут получены с помощью крупнощепящих рест-риктаз: Mot-I, Sf i i.

Одним из преимуществ метода выделения ДНК в " агарозной подушке" является возможность начинать работу с очень небольшим количеством исходного материала (менее 1 мл клеточной суспензия средней плотности 6-15 млн клеток в 1 мл) достаточно для составления представительного банка организма. При клонировании в коемидах количество донорной ДНК часто является лимитирующим. Метод "агарозного слоя" исключает эту трудность. Выделяя ДНК из небольшого кусочка агарозы, а затем проводя рестрикцию по ЗаиЗА в этом же кусочке, мы сводим до минимума случайные разрывы молекул ДНК и получаем набор фрагментов максимум концов которых комплиментарны ВатН- концам векторной косми-ды.

Таким образом, нами были подобраны методы получения качественных препаратов нуклеиновых кислот (донорных молекул) различных растительных объектов, предназначенных для клонирования в различных векторных системах.

Клонирование ДНК пшеницы и водоросли в фаговом векторе лямбда ^47.1 Фаговый вектор лямбда L 47.1 относится к груше векторов замещения, такте как наиболее шярокоиспользуемые для составления банков фаговые векторы EM8L3 и EMBL4. Лямбда L 47.1 позволяет клонировать фрагменты ДНК длинной около 20 т. п. н., образующиеся при обработке рестриктазами EcoRI, H uni III, Ваш HI. Для успешного клонирования в лямбда - системе некоторых видов зукариотической ДНК необходимо помнить о правилах совместимости вектора с генетической системой хозяина.

Подготовка фагового вектора для клонирования заключалась в обработке его ДНК реетриктазой BarxHÍ, последующим отделением правого и леЕого плечей вектора, которые несут вею генетическую информацию, необходимую для логического развития фага, от среднего фрагмента, и замене его фрагментами чужеродной ДНК от 4 до 17 г. п. н. ■ Для очистки плечей использовали центрифугирование в градиенте плотности сахарозы

(10-40 X) и препаративный электрофорез. Для оценки эффективности клонирования в данном фаговом векторе в реакцию упаковки была взята также ДНК бактериального вида T'nermus thermophilic.

Донорную ДНК обрабатывали рестриктазой Sau ЗА, добиваясь частичного расщепления, как описано ( Маниатис, 1984). Затем обогащали фракцию фрагментов размерами 20 т. п. н., разделяя фрагменты в сахарозном градиенте.

Соединение плечей вектора с донорной ДНК проводили при молярном соотношении вектор: вставка 2:1, соотношение коцентрации вектора и вставки составляло 1:1 . После проведения реакции лигирования смесь оеаадали формамидом - это повышало эффективность клонирования и выход рекомбинантов.

Условия упаковки фагов in vitro и качество полученных упаковочных экстрактов подбирали в нескольких пробных реакциях, пока не получали оптимального соотношения донора предголовок и донора упаковочного белка. Результаты нескольких опытов приведены в таблице 3. Эффективность упаковки в расчете на 1 jav контрольной кнтактной ДНК фага лямбда С1857 от 8,6Хю'до l,35xlo! что составляет верхний предел по данным литературы (Grosveld,1981). В результате упаковки различных видов ДНК были получены банки генов различных организмов : бактерий (Thernus themophilus) , водорослей (Chlorella sp.K) и высшего растения (пшеницы).

Для получения представительного банка указанного бактериального вида (размер генома 3X1 cf п. н. ) с вероятностью наличия индивидуального гена в банке равной 0,89 при при вставке 15-20 т. п. н., количество клонов должно составлять l,4Xlcf ( вероятностная формула ста--тиетичеекей природы банков (Мат-виенко.1982 Маниатис , 1984).

В действительности получено 1,13X101 фаговых частиц в упаковочной смеси, следовательно, число колоний, . полученных для Г. thertrophiius, полностью перекрывает необходимое для создания полного банка.

Количество рекомбннантных клонов хлореллы сопоставимо с с , теоретически раечитакным для данного генома и данного размера вставки. Однако, в литературе (Кагп,1960) указывается на возможность клонирования в системе лямбда L 47' е большей эффективностью.

Коллекция клопов гняенкцы является неполным банком, поскольку отличается го количеству необходимых клонов на дза порядка от теоретически рассчитанного. Следовательно эффективность клонирования

3D

последовательностей злаков (аналогичные результаты получен ы в параллельных опытах, проведенных с ДНК ячменя) в выбранной системе является низкой. По-видимому обилие повторяющихся последовательностей, присутствующих в геномах злаков, препятствует клонирован!««' их ДНК в данной фаговой системе.

При размножении тшшдрсмных последовательностей (Lyach, Stahl, 1983) делегирование предотвращается субклонироеанием и выращиванием на Ree А-хозяевах. В нашем случае условия совместимости вектора и хозяина выполнялись, да я генетической селекции был выбран ¡¡¡там Q S59, на котором могут растя только рекомбинанты. Однако эффективность клонирования оказалась низкой. Трудности клонирования пшеничного генома обсуждаются многими исследователями. Так, а работе (Boston,1983) отмечается, что при смешивании двух видов ДНК Е.coli и пшеничной и введение их с помощью вектора Ch 4А (подобном лямбда L 47) в бактериальные клетки, получается нормальная эффективность клонирования ДНК Е. col i, но не пшеничных последовательностей. Подчеркивается возможность, что определенные элементы, рассеянные по пшеничному геному, могут мешать размножению палиндромов в общепринятых фаговых векторах.

Последнее рассуждение наводит на мысль о необходимости создания особой векторной системы, в которой мокко было бы успешно клонировать самые различные ( в том числе повторяющиеся) последовательности растительных геномов. Для того, чтобы полностью клонировать весь геном злаковых , самых крупных зукариотических геномов с меньшей вероятностью "выпадения" тех или иных участков, самыми удобными будут векторы с возможно большей емкостью. Чаще в таких случаях применяются космиды.

Принцип клонирования а новой космиде.

По мнению многих авторов (Di leí la, 1987; Chracharîi.i9S7; Gillespie,199Q) коемидная система клонирования является наиболее подходящей для выделения крупных сегментов ДНК. Высокая емкость снижает число клонов, которые необходимо проанализировать, при псииске уникальных последовательностей.

Клонирование в космидах тем не менее, не вытеснило применение фаговых и прочих векторных систем, поскольку требует некоторых специальных условий и сопряжено с целым рядом трудностей. В их числе мультимеризация векторных космид при лигировании их "самих на себя". Чтобы исключить этот важнейший недостаток космидного клонированйя, а

обрайоткарестрикта аой Bee кг и

Вудаление фрагмента

loo ЕТ Вал HI

обработка рестриктазоЯ Бдя 21

Обработка рестриктаэой г II * выделение злыиэго фрагмента В*a Hi ВЬ* II

лигиров&ние с фрагментами высокоыолеку-яярноЧ Р, расщеплённой ре^т^идаэой

ynaxosxa 1а ritro в ГОЛОйку бактериофага

заражение кдетокв.ооИ, устойчивые к Ар и Те трансформанты

Рис. 3. Клонирование в космиде рЫ^-амц

I ^

' II ро В1 ВЪу II I

ВЪУ II

щеплем*« я ■

.¿Р

¡глолепле £со*1, ВЫДМвКК»

жпфраптнта

мента

1 т,ь I Г- - ., *оо ю:

раоцеменме ос«хдвнК9 &ЫМГ/ГО

фрагмент®

литровая*« по лмлххк

«ОНЦАЫ

Усо 21

достраивание дипхмх ЮНЦОВ фрдгмдегом Клётва ЛВК-полимерааы I

лигировамв по тупым когщш

_шп II

^ЕМ II

Рис. 4. Схема конструирования нового космидного вектора.

также избежать фосфатазной обработки, которая снижает эффективность клонирования, мы сконструировали новую космиду (схема клонирования, рис.3). Для клонирования по указанной схеме, космидный вектор обрабатывали тремя рестриктазами: Bam HI, EcoRV и BbvII. Последняя редко используемая рестриктаза выделенная из Bacillus Brevis (Matvienkü, 1984), узнает несимметричную гекеануклеотидную последовательность и "разрезает" ДНК на расстоянии "ф нуклеотидов от сайга узнавания:

5'-GAAGAC-NlN2-3'

3' -CTTCTG-NlN2NoN4N5N6-5'.

При обработке такой рестриктазой образуются фрагменты ДНК с непостоянным составом нуклеотидов то концам. Вторая рестриктаза, используемая при клонировании Eco RV - образует при воздействии на сайт узнавания "тупые" концы, лигирование по которым обычно затруднено :

5' -GAT АТС-3'

З'-СТА TAG-5'

Встраивание чужого фрагмента происходит по Bam HI - сайту кос-миды. Как и в схеме, предложенной (Jsh-Horowicz, Burke, 1981) используется преимущество от обработки векторных молекул несколькими рестриктазами. Получается лишь один тип способных упаковываться молекул, которые содержат фрагмент с "левым" сайтом cos, вставку длинной 35-45 т. п. н. и фрагмент с "правым" сайтом cos. Среди продуктов лигирования будут гсатенаш, в которых чужеродная ДНК соединена с молекулами космиды таким образом, что оба сайга cos находятся в одной ориентации. Полученные фрагменты практически лишены возможности ди-меризоваться, исключая тем самым образование "фона" поликосмид, не содержащих вставок.

Конструирование космиды.

За основу была принята космида рНС 79 (Collins,Hohn, 1976) в которой Pst-EcoRI - фрагмент был заменен на аналогичный малый фрагмент из плазмиды pur 288, но не содержащий BbVII-сайта. В новой космиде должен был остаться лишь один из трёх сайтов BbVII, содержащихся в исходной (рис. 4.) Серией трансформаций и отбора по нарушению признака устойчивости антибиотикам - Ар и Тс были отобран ы несколько гибридных клонов, устойчивых одновременно к двум антибиотикам, содержащие cos -

сайт (гибридизация in situ с меченной ДНК фага лямбда и блот-гибри-

Затем проводили анализ на присутствие сайтов реетриктаз BamHI, EooK'V, Hindi!I, Hirßll , Йо анализируемых клонов выбрали один, ь котором произошла спонтанная делеция участка бактериальной хромосомы размером 500-600 п. н. в которой был один из "лишних "сайтов рестрик-тазы BbVII. Как показал рестрикционный анализ, делеция не затронула -oos-участка к приле&ащих к нему с одной и с другой стороны Mlu I и Pvu II - сайтов.

Эта промежуточная конструкция имела значительно меньший размер по сравнению с исходной, она была названа pBfcircosI.

Второй сайт узнавания рестриктазы Bbv 1N 4355 удаляли нугем обработки линеаризованной EcoRI ДНК pBbv-cosl зкзонуклеазой Bai31. Затем концы полученных фрагментов репарировали и лигированными молекулами трансформировали клетки E.coli К802. 40 из 168 полученных трансформантов были устойчивы к ампициллину и тетрациклину одновременно. Космиды из некоторых кланов действительно содержали один сайт для Bbv II.

HinüIII Еоо EV Ваи л

Таким образом, окончательная конструкция космиды, которая была названа рВЬу-азз11, содержала один сайт для рестриктазы ВЬуII, а также была делетирована, по сравнению с исходной космидой, в области бактериальной хромосомы на 500-600 пар нуклеотидов. Молекулярный вес полученной космиды - около 4.3 т. п. н.

■стпие лямбда - последовательностей с же зондом ^

ibv II

Рис.5. Конечная конструкция космиды pBbv-cosII.

lUu I

Векторную ДНК для клонирования обрабатывали рестриктазами, как указано в схеме, а затем отделяли "плечи" (большие фрагменты) косми-ды препаративным электрофорезом.

Подготовка высокомолекулярной донорной ДНК описана выше. Частичный гидролиз проводили по (Маниатис,1984).

Условия лигирования подбирали в нескольких пробных реакциях ли-гирования и упаковки, меняя соотношения донорных и векторных молекул. Теоретически соотношение по концам Еектор: вставка должно быть 2:1, а по концентрациям (учитывая разницу молекулярных весов) 1:5. Однако в нашем случае упаковка была оптимальна при соотношении концентраций вектор: вставка в реакции лигирования как 1:2,5-1:3. При увеличении соотношения концентраций от 1:0,5 до указанных и выше происходит увеличение выхода упакованных частиц, затем наступает насыщение и уровень упаковки более не увеличивается

Оптимальные соотнокения упаковочных экстрактов и буферов также подбирались в нескольких пробных реакциях упаковки. При оптимальных условиях эффективность упаковки ДНК фага лямбда составляла 7,2X10* негативных колоний на 1 микрограмм ДНК.

Применение космиды.

Полученная векторная космида была использована для состав^ления библиотек генов организмов различной степени сложности. Результаты упаковки косшдных молекул, содержаащх ДНК фага ®Z , пшеничную и ДНК одноклеточной зеленой водоросли Dunaliella. sali ra представлены в таблице 3. Число клонов, полученных для всех трех видов геномов, сопоставимо с теоретически расчитанным для репрезентативных библиотек, пригодных для идентификации и анализа любых генов. Новый . космидный вектор оказался более эффективным, чем лямбда L 47.1, при клонировании пшеничной ДНК. Эффективным было клонирование водоросли Dunaliella salina в данной системе и составило 5,6X10 рекомбинантных колоний . Для репрезентативной библиотеки генома с размерами 2X10 и вероятностью клонирования каждого фрагмента в 40 т. п. н. равной 0,99 теоретическое '-тело рекомбинантов должно быть 2044. Значит, среди полученного нами набора клонов мокно обнаружить все неперекрывающиеся фрагменты генома D.salina.

В случае пшеницы (размер генома 18Х109п.н. ) число клонов, перекрывающих геном, (с вероятностью присутствия уникальных генов 0,99) должно быть 1,7X10 (ГловерД988) при размере встраиваемых

Таблица 3. Результаты клонирования ДНК различных организмов в лямбда-системе и в космиде

Размер Эффективность 2е?а^&рекомбитн?^ Вектор -траивае- рекомбинантньпс

Источник ДНК

мента (тпн)

Получено практически

Расчитано теоретически

Контроль Ц CI857) О L 47)

Бактериальная ( Thermus }Ь 47 15-20 thermophilus) ■

Одноклеточные зеленые " Водоросли (Oblorella sp.K)

Растения (пшеница)

Б.б-Ю^.ЗбЛО8 3,б-106-4,6'Ю6

6,05-Ic£ 1,13-Ю4

2,95-Ю4 5,9-Ю3 3,97.I03

1.4-Ю3

4.5-Ю3

4.6-I06 4,3-Ю2

2,0-Ю3 1,7'Ю6

Фаговая (фаг сркг ) космада- 37-45 рВЪу-соеН

Одноклеточные зеленые

ВОДОРОСЛИ (БипаИеНа ва11па)

Растения (пшеница)

2-Ю3 5,2-Ю3

1,69-Ю4 5,6-Ю5

5,7-Ю4 1,68'Ю6

фрагментов длинной около 40 т. п. н. Некоторые авторы (Забаровский, 1989; Han, 1987) указывают что для получения репрезентативной библиотеки концевых последовательностей - при составлении "прыжовых" клонотек в космидах^либо фагах с крупными вставками - количество необходимых рекомбинантных клонов в них должно быть несколько выше, чем в обычных из-за того, что в значительной части рекомбинантов содержатся повторяющиеся последовательности. Таким образом подчеркивается прямая связь между большой длинной проклонированных участков и вероятностью содержания в них повторяющихся последовательностей.

Скрининг библиотек.

Мы использовали традиционные методы скрининга, применив для поиска доступные нам зонды.

При анализе более 500 Ар-7сГ клонов из банка Dunaliella быстрым скринингом (Blœm, Yu Lei,1990) оказалось, что почти все они содержат вставку. На рисунке б показан рестриктный анализ нескольких клонов. При обработке космидной ДНК этих клонов рестриктазой Eco RV за исключением клонов N 19 и N 23, получается разный набор фрагментов. Во всех клонах присутствовал фрагмент космидных плеч длин-.ой около 3,59 т. п.н. Суммированием набора фрагментов мозкно подсчитать приблизительный размер вставки от 30 до 45 г. п. н.

Гибридизацией in situ клонов банка Dunaliella salina с меченным 32Р фрагментом гена малой субъединицм РВДК гороха отобраны 12 клонов с наиболее сильным положительным сигналом (рис.7).

ДНК отобранных клонов банка Dunaliella, была рестриктирован.:а крупнощепящей рестриктазой Notl и полученные фрагменты еубклонир_.: ны в векторе pBS(+), использование которого удобно для секвенирова-ния. Блот-гибридизация ДНК этих клонов по Саузерну позволила выбрать только 2 клона, гибридизующихся с зондом гена малой субъединицы РБФК гороха.

Отмечен также положительный сигнал гибридизации четырех клонов с фрагментом хлоропластного гена PsaXA) шпината. Это позволяет предположить, что в полученном банке содержатся вставки как ядерной, так и хлоропластной ДНК D.salina

Кроме того, как показал контрольный опыт, эффективность клони-■ рования ДНК Dunaliella в новой космиде была примерно в четыре раза выше, чем в исходной - рНС 79.

Из банка пшеницы отобран, .о 9 клонов с положительным сигналом

ОП

0 И II ¡Ъ 3 5 ч- б 4 3 i

о О -

•"Ч

^

■щ

■ *

, ' п

? •

КМ- •}

ии ш-1 ■•■■'■

г * ; -

' "■■ Р Г й ■

Р

«о

«г?

Еис. 6. Элекгрофореграмма рестриктных фрагментов ДНК рекомбинантных клонов банка 30. мЬ'»*

I- дак фага лямбда, обработанная ¿'сой/ 3 - нативная ДНК кобмиды рш-со$и 4-13 - ДНК рекомбинантных клонов_ № 17-26, обработанная бсо

Гибридизация клонов банка .

я?

дуналиеллы с Р-меченым фрагментом гена малой субъединицы РБФК гороха. В качестве контроля (указано стрелками) нанесены клоны с плазмидами, содержащими фрагменты генов мблой ($£) и большой {¡.в) субъединиц ЕБФК.

гибридизации при использовании в качестве зонда фрагмента гена малой субъединицы РБФК гороха Приблизительный размер встроившихся фрагментов - 30-40 т. п. н. Учитывая,что достигнута высокая эффективность клонирования и банк содержит большое количество клонов, очень велика вероятность большой представленности повторяющихся последовательностей, так как в случае их делетирования значительно бы уменьшился размер банка.

Таким образом, предложенная и проверенная схема клонирования в новой космиде включает в себя все преимущества разработанных в последнее время систем космидкого клонирования, исключает их недостатки - нет необходимости проводить дефосфорилирование для предотвращения мультимеризации космид, что несколько снижает эффективность клонирования.

Как показано в работе ^тоеге, 1986) , при клонировании генов растений в нескольких типах векторных молекул самыми стабильными оказались космидше клоны. Высокая эффективность коррелирует со стабильностью. Клоны были нестабильны, когда погибала вся космида, без перестроек в чужеродной ДНК, и это снижало выход рекомбинантов. Автор связывает большой выход рекомбинантов при клонировании последова тельностей растительной ДНК с их способностью стабильно размножаться в данном хозяине.

Пересеваемые нами космидные клоны такие сохраняли жизнеспособность в течение многих поколений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты нашей работы могут дополнить существующие методические руководства по созданию банков генов, облегчить и сократить время их получения.

Отработанные методы выделения мРНК и высокополимерных ДНК пшеницы и водорослей могут быть полезными для работы с другими видами растительных тканей.

С особой тщательностью должен быть продуман выбор векторной системы при создании банков генов растений. Из испытанных нами векторных систем , новая космидная система оказалась наиболее надежной. В ней могут быть клонированы геномы различной степени сложности, геномы организмов, приспособленных к различным средам обитания, в

том числе тех , на которых трудно выполнимы обычные генетические эксперименты (например, Dunaliella salina).

Полученные библиотеки генов могут использоваться в различных направлениях генетических исследований и при изучении вопросов физиологии растений. Они могут служить для поиска ядерных и хлоропласт-ных генов растений и водорослей и изучения их взаимодействия. Построение физической карты некоторых , в первую очередь, генов малой субъединицы РБФК D. salina, определение их первичной нуклеотидной последовательности и характеристика этого мультигенного семейства-следующий логический этап Яашей работы. Ее можно продолжать, пользуясь последними успешными разработками методов картирования крупных участков генома с помощью электрофореза в пульсирующем поле, который применялся нами для предварительной характеристики ДНК дунаишеллы.

Одна из основных задач - поиск светорегулируемых генов и изучение их организации. В случае идентификации нужных генов возможно использование космидных клонов в качестве зондов для выявления, соответствующих регуляторных областей ДНК полученных в лаборатории му-тантных штаммов одноклеточных водорослей.

Созданный банк генов пшеницы может быть использован для изучения повторяющихся последовательностей, определения их представленности, а также для поиска генов запасных белков пшеницы и дальнейшей работы с ними.

ВЫВОДЫ

1. Отработан и методы предварительной подготовки донорных препаратов нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) для составления банков генов растений (первичная экстракция, фракционирование по размерам, ферментативная обработка), обеспечивающие высокий выход недеградированных молекул достаточно большого молекулярного веса. Предложен принципиально новый метод получения высокополимерных препаратов ДНК для суспензии одноклеточных водорослей, позволяющий получать целые молекулы ДНК или ее крупные фрагменты (300-400 т. п.н. и более).

2. Оптимизированы условия реакции обратной транскрипции на мРНК-матрнцах пшеницы, включающие изменение концентрации дезокситри-фосфатов, одновалентных катионов и соотношения количества матрица/затравка; матрица/ревертаза, обеспечивающие достаточно высокий выход полноразыерных молекул кДНК.

3. Проведено клонирование последовательностей ДНК пшеницы в различных клонирующих векторах - ЖЗ-кДНК-системе (Messing,1978), плаз-

мидной кД!К системе Окаяыы-Еерга и геномной ДНК в фаговом (лямбда L47) и космидяом векторах. Отмечены особенности в проведении стандартных этапов клонирования (трансформации, лигировании и упаковки фагов in vitro).

4. В фаговом векторе лямбда L47 получены банки генов Chlorella sp.K и неполньй банк гекоз пшеницы (3,9X10 клонов).

5. Создана новая констругацга космидного вектора pBbV-cosII для клонирования крупных фрагментов ДНК растений (30-40г. п. н.). Вектор имеет малые размеры и большую емкость, еодерют уникальные сайты для рестрикгаа BbvII, BamHl, EcoRV, использование которых предотвращает самолигирование векторных молекул и исключает необходимость их обработки фосфатаэой.

6. Предложена схема аффективного клонирования в хосмиде pBbV-cosll, позволяющая избежать фона поликосмид и эффективно клонировать ДНК геномов различной степени сложности.

7. С использованием космиды новой конструкции лолученны представительные банки генов Dunaliella salina, пшеницы, фага $KZ, насчи-

Г ь i

тывающие 5,6x10 ; 1,68x10 ; 5,2x10 клонов соответственно.

8. Сравнительный анализ эффективности клонирования ДНК прокариот, водорослей и злаков в фагоЕом и новом космидном векторе продемонстрировал универсальность и эффективность последнего.

9. Предварительный скрининг полученнх библиотек, позволил отобрать клены, ДШС которых гибридазуется с зондами для генов малой субъедишщы РБФК и хлоропласткого гена pSa(A) - агшртеина Р700 фотосистемы I.

Список работ, опубликовании по теме диссертации.

1. Гурова Т.Ф. мРИК из созревающих зерен пшеницы и их трансляция в бесклеточной системе. / В сб. Физике- химические основы функционирования клеток. Пущино. 1983. С. 39-42.

2. Гурова Т. Ф., Матвиенко Н.И. Банк ферментативно синтезированных генов на поли(А)- РНК пшеницы. / Тезисы I Конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки. Москва 1983. С. 7.

3. Лось Д. А. .Гурова Т.Ф. Препаративное выделение хлоро!мастной ДНК Dunaliella salina.//Тезисы 2 Конференции по физиологии растительной клетки. Москва. 1986. С. 80.

4. Гурова Т. Ф., Семененко Е Е. Получение космидной библиотеки генов Dunaliella salina// Тезисы докладов II Съезда Всесоюзного общества физиологов растений. Минск. 1990. С. 6Q.

5. Гурова Т.Ф., Семененко RE. Библиотека генов Dunaliella salina, полученная в космидном векторе новой конструкции.// Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т. 28. N. а С. 449-454.

6. Гурова Т.Ф., Лось Д.А., Семененко RE. Эффективность клонирования некоторых растительных ДНК в различных векторных системах.

Физиология растений. 1992. Т. 39. N. 2. С. 239-248.