Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биологических свойств ангиогенина молока - полифункциональной рибонуклеазы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование биологических свойств ангиогенина молока - полифункциональной рибонуклеазы"

На правах яукопи*

/о/уе^/

РУСТАМЬЯН Юлия Леонидовна

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНГИОГЕНИНА МОЛОКА -ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в научно-учебном отделе биохимических проблем экологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Ведущая организация:

Государственный Научный Центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН

Защита диссертации состоится « ¿5 » 2005 г. в « // » часов на

заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан « » « СМ(7л » 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Г.С. Комолова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, вед.н.с. Л.И. Ковалев доктор химических наук, профессор Э.Г. Розанцев

кандидат биологических наук

1Ш7

Лет?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В 1988 году в молоке был открыт новый белок -представитель суперсемейства рибонуклеаз, названный ангиогенином (от греч. angion - сосуд) [Maes et al., 1988]. Он оказался мощным индуктором роста кровеносных сосудов. В настоящее время достаточно полно изучены структура, физико-химические и ферментативные свойства ангиогенина молока [Комолова и др. (обзор), 2002]. Однако его биологические свойства мало изучены. На основании уже имеющихся исследований можно заключить, что открытый белок полифункционален и играет важную роль в поддержание гомеостаза различных систем животного организма. В свете результатов недавних исследований есть основание рассматривать ангиогенин в качестве одного из значимых факторов пассивного иммунитета, передаваемого с молоком от матери к потомству. Исследования его функций делают только первые шаги, и в этой области следует ожидать значимых для практического использования (медицина, фармакология, пищевая отрасль) открытий. Настоящая работа проводилась в рамках нового перспективного направления исследований функций биологически активных белков молока и их комплексов с целью создания на их основе физиологически активных пищевых добавок, а также новых эффективных препаратов лечебного назначения.

Цель и задачи исследования:

Цель настоящей работы заключалась в изучении биологических свойств ангиогенина коровьего молока, связанных с его защитной функцией.

Поставленная цель определила задачи диссертационной работы:

1. Получить из коровьего молока высокоочищенный, биологически активный препарат ангиогенина.

2. Разработать количественный иммуноферментный метод определения ангиогенина в биологических жидкостях.

«»ос национальна^;

* "пцпипадьнля i

библиотека I

«

3. Исследовать способность ангиогенина проникать в кровь животных при пе-роральном введении.

4. Изучить антимикробное действие ангиогенина молока, используя в качестве тест-системы патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) - Е.СоН.

5. Исследовать влияние ангиогенкна на цитокиновое звено иммунитета - значимое составляющее пускового механизма иммунного ответа.

6. Исследовать фармакокинетику ангиогенина в лимфоидных органах.

Научная новизна. Разработаны новые способы хроматографической очистки ангиогенина (АНГ) из молока и количественный иммуноферментный метод определения ангиогенина в биологических жидкостях. Установлены новые биологические свойства АНГ молока: проникновение через ЖКТ в кровь; бактериоста-тическое действие; иммуномодулирующее действие на уровне цитокинового звена иммунитета. На основании фармакокинетических исследований установлено проникновение АНГ через гематотимотический барьер и накопление его в тимусе.

Практическая значимость. Результаты исследования могут найти применение в рекомендации АНГ в качестве биологически активной основы в разработках препаратов парафармацевтаческого назначения широкого спектра действия, в-частности, иммунокорректирующего, антимикробного, заживляющего, а также продуктов функционального назначения.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на всероссийской конференции с международным участием "Политика здорового питания в России: пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека" (Москва, 1999), 3-ей международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек." (Москва, 1999), школе-конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), международной научно-технической конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Моск-

2

ва, 2002) и 7-ой школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе десять статей и один патент.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (6 глав), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на /3D страницах, включает 26 рисунков и 9 таблиц. Список цитируемой литературы включает 188 наименований, в том числе 146 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. В экспериментах in vivo использовали мышей линии BALB/c и крыс породы Вистар. Для получения антител к ангиогенину проводили иммунизацию кроликов (самцов) породы Шиншилла. Оценку содержания ангиогенина проводили в свежевыдоенном молоке коров черно-пестрой породы одной популяции в первой половине лактации; в сборном молоке, поступающем-на переработку на молочные заводы; во вторичном молочном сырье. Изучение влияния ангиогенина на бактерии группы кишечной палочки проводили на Escherichia coli штамм В-125, полученный из коллекции Государственного института селекционного контроля им. JI. А. Тарасевича. Влияние ангиогенина на продукцию интерлейкинов исследовали на лейкоцитах человека, выделенных центрифугированием донорской крови в градиенте фиколл-верографина по общепринятому методу.

Препаративные методы. Выделение ангиогенина из цельного коровьего молока проводили с использованием ионообменной (КМ-целлюлоза 52, СМ-Toyopearl 650 S) и гидрофобной (Butyl-Toyopearl 650 S) хроматографии. О чистоте выделенного ангиогенина судили на основании электрофоретических исследо-

3

ваний (белковый SDS-электрофорез в 15%-ом ПААГ). Выделение из печени крыс рибосомной РНК проводили методом фенольной экстракции.

Аналитические методы. Рибонуклеазную активность панкреатической РНКазы А и ангиогенина определяли спектрофотометрическим методом, с использованием в качестве субстратов: тотальной дрожжевой РНК, транспортной РНК, поли U.

Для изучения ферментативной активности ангиогенина против рибосомной 28S и 18S РНК проводили электрофорез в 1,1% агарозном геле, содержащем 6% формальдегид.

Содержание ангиогенина в исследуемых образцах определяли методом ИФА и методом, основанным на реакции конкурентного взаимодействия ангиогенина и пРНКазы с плацентарным ингибитором РНКазы.

Количество продуцируемых лейкоцитами цитокинов определяли иммунофер-ментным методом на основе моноклональных антител с применением в качестве индикаторного фермента пероксидазы хрена согласно руководству, прилагаемому к набору реагентов для определения интерлейкинов фирмой ООО "Протеиновый контур" (Россия).

Ангиогенную активность очищенного препарата АНГ определяли методом кожной пробы и методом микрокармана в роговице глаза крыс.

Антимикробное действие ангиогенина молока исследовали путем посева на чашки Петри со средой Эндо по методу Дригальского, с последующим подсчетом числа выросших колоний.

Кристаллическую структуру белков крови изучали с использованием методик клиновидной дегидратации (закрытая капля) с последующим поляризаци-онно-оптическим изучением препарата в скрещенных поляризаторах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Очистка ангиогеиииа из коровьего молока и его идентификация.

Для исследования функциональных свойств ангиогснина молока необходимо иметь в достаточных количествах интактный высоко очищенный препарат ан-гиогенина. В связи с этим нами был разработан достаточно простой эффективный метод очистки ангиогенина из молочного сырья с использованием хроматографии (катионообменной и гидрофобной) низкого давления.

На первом этапе - на колонке с КМ-целлюлозой 52 получали фракцию кати-онных белков, обогащенную сильно основным белком - ангиогенином (изоэлек-трическая точка выше 10,5). После диализа белок наносили на колонку с СМ-Тоуореаг1 650Б. Элюцию проводили повышающимся градиентом концентрации КС1 (Рис. 1). На этой стадии удавалось эффективно очистить препарат от большинства балластных белков, однако препарат был значительно загрязнен панкреатической РНКазой А - ферментом, гомологичным по структуре ангиогенину и присутствующем в молоке в сравнительно высокой концентрации (до 30 мг/л) [Шидловская, 1985]. Для очистки от РНКазы А была использована гидрофобная хроматография на колонке с В1Ду1-Тоуореаг1 6508. Белки элюировали понижающимся градиентом концентрации сульфата аммония. Как следует из хромато-граммы на рисунке 2, ангиогенин выходил с колонки четким симметричным пиком. Обладающие ангиогенной активностью фракции не содержали РНКазу А, которая выходила с колонки отдельным пиком.

Как следует из данных, приведенных в таблице 1, в результате трех этапов очистки был получен гомогенный, по данным электрофореза в ПААГ (Рис. 3), препарат ангиогенина с выходом 49% и степенью очистки в 12000 раз.

5 10 15 20 25 30

№ фракций

,2,0 , 20 " 0,5

■ 1Л • 15 0,4 0,3 Рис. 1. Профиль элюции ангиогенина с CM-Toyopearl 650 S.

■ 1.0 ■ 10 0,2 1 - оптическая плотность А при 280 нм,

■ 0,5 - 5 0,1 2 - концентрация ангиогенина, 3 - активность РНКазы А,

-Jo.o 0 00 4 - концентрация KCl.

1

Рис. 2. Профиль эгаоции ангиоге-нина с Butyl-Toyopearl 650 S.

1 - оптическая плотность А при 280 нм,

2 - концентрация ангиогенина,

3 - активность РНКазы А,

4 - концентрация KCl.

Jo

Таблица 1. Хроматографическая очистка ангиогеиина из коровьего молока.

Этап очистки Объем, мл Белок, мг АНГ, мг* Выход, % Степень очистки, п

Обезжиренное молоко 4000 1.4 х 105 12.0 100 1

КМ-целлюлоза 52 45 83.0 9.0 75 1300

СМ-Тоуореаг1650Б 9 11.0 7.1 59 7500

Ви1у1-Тоуореаг1650Б 9 5.7 5.9 49 12000

- Для определения концентрации ангиогеиина использовали реакцию конкурентного взаимодействия АНГ и пРНКазы с плацентарным ингибитором РНКазы [Ионова, 1998].

97

66 45

29

1 2 3

Рис. 3. Электрофорез ангиогеиина в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия: 1 - маркерные белки, 2 - ангиогенин из коровьего молока, 3 - рекомбинантный ангиоге-нин человека.

Выделенный белок обладал характерной для ангиогенинов низкой рибонук-леазной активностью против тРНК и в то же время был практически неактивен относительно таких стандартных для панкреатических РНК аз субстратов как по-ли-и и тотальная дрожжевая РНК, но проявлял специфическую для ангиогенинов

7

активность относительно 28S и 18S рРНК из печени крыс (Рис. 4). Все указанные ферментативные свойства исследуемого белка присущи ангиогенину.

Рис. 4. Результаты гидролиза 28S и 18S рРНК ангиогенином.

рРНК (20 мкг) инкубировали в отсутствие и присутствии ангиогенина при 37° С в течение 30 минут.

1 - рРНК без ангиогенина, 2-5 - концентрация ангиогенина 20,40,60,80 мкг/мл соответственно.

1 2 3 4 5

Однако для окончательной идентификации очищенного белка существенно было его проанализировать на ангиогенную активность - свойство, присущее всем известным ангиогенинам. Исследование показало, что выделенный препарат обладает ангиогенной активностью, что было установлено как по кожному тесту, так и по индукции васкуляризации на роговице глаза крыс. Через 7 суток после внутрикожной инъекции 5 мкг исследуемого белка в составе низкоплавкой агаро-зы на внутренней стороне отпрепарированного участка кожи крыс в районе им-плантата появлялось большое количество хорошо различимых под ми|фоскопом (12-кратное увеличение) вновь сформированных кровеносных сосудов (Рис. 5). В контрольных образцах (агарозный имплантат не содержал белка или содержал панкреатическую рибонуклеаза А в той же концентрации, что и исследуемый белок) заметной индукции васкуляризации не наблюдалось. При имплантации в роговицу глаза крыс импрегнированной анализируемым белком "таблетки" из ме-тилцеллюлозы через 5 суток наблюдалось образование новых капилляров, растущих от кровеносных сосудов каймы глаза к имплантату (Рис. 5).

Рис. 5. Индуцированная ангиогенином неоваскуляризация: в роговице глаза крыс (А-ангиогенин, Б-контроль), в коже крыс (В-ангиогенин, Г-контроль).

Таким образом, на основании полученных данных относительно молекулярной массы, субстратной специфичности, особенностей ферментативного гидролиза 28S и 18S рРНК и ангиогенной активности можно заключить, что выделенный из коровьего молока описанным способом белок обладает основными, характерными для семейства ангиогенинов признаками.

2. Иммуноферментный анализ ангиогенина.

Для количественного определения АНТ из коровьего молока был адаптирован конкурентный вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Очищенный ангиогенин использовали для получения поликлональных кроличьих антител. Максимальный иммунный ответ при стандартной схеме иммунизации появлялся на 37 день после первичной иммунизации и детектировался до 66 дня методом радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони. Аналогичные данные были получены при определении титра антисыворотки методом непрямого твердофазного иммуноанализа. Титр составил 1:12800 для стандартной схемы иммунизации.

Модифицированным периодатным методом [Карулин А.Ю. и др., 1989] получали коньюгат поликлональных антител с пероксидазой хрена (АТанг-ПХ), который исиользовали при проведении твердофазного иммуноферментного анализа. Как показано на рисунке 6 коньюгат может быть использован для детекции антигена в концентрации от 1 до 5 мкг/мл, используя в качестве субстрата диаммони-вую соль 2,2-азино-ди(3-этил-2,3-дигидробензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS).

405

0,400,350,300,250,200,150,100050,00-3,0

-■-АТ-ПХ I— контроль

1 ■ I ■ I '1 ■—I 1—I—1—1 • ,„ f, -2,5. -2,0 -1,5 -1,0 -0.5 0,0 0,5 45

Рис. 6. Определение оптимальной концентрации (С, мкг/мл) коньюгата АТ^-ПХ для иммуноферментного анализа. Время инкубации с субстратом (ABTS) - 30 мин при комнатной температуре в 0.01 М натрий-цитратном буфере, pH 4.0.

По оси ординат - оптическая плотность А при 405 нм продукта пероксидазного окисления ABTS перекисью водорода.

При использовании конкурентного метода ИФА планшеты с сорбированным ангиогенином инкубировали в течение 1 ч при температуре с раствором, содержащим антиген в известных концентрациях и коньюгат пероксидазы с поликлональными антителами к ангиогенину (1 мкг/мл). Ферментативную активность, связанную с твердой фазой, определяли по ABTS спектрофотометрически на считывающем устройстве для иммуноферментного анализа "Dynatech МР600" (США). На рисунке 7 представлена типичная калибровочная кривая для определения концентрации ангиогенина методом конкурентного ИФА в биологических жидкостях. Чувствительность метода составляет 10 нг/мл.

Рис. 7. Типичная калибровочная кривая для определения концентрации ангиогенина (С) методом конкурентного ИФА с использованием коньюгата АТ,НГ- ПХ (1 мкг/мл).

По оси ординат - оптическая плотность А при 405 нм продукта пероксидазного окисления ABTS перекисью водорода.

•gC

Метод был апробирован для определения содержания ангиогенина в молоке коров в зависимости от периода лактации и физиологических факторов, а также во вторичном молочном сырье.

3. Проникновение ангиогенина в кровь животных через желудочно-кишечный тракт при пероральном введении.

Есть основание рассматривать ангиогенин молока в качестве биологически

активного фактора, участвующего в механизмах передачи иммунитета через мо-

11

локо от матери потомству, особенно в ранний постнатальный период, когда собственные защитные механизмы в полной мере еще не сформированы. С таким представлением согласуется тот факт, что содержание ангиогенина в молоке коров зависит от стадии лактации, причем, наиболее высокий его уровень приходится на молозивный период [Ионова, 1998]. Известно, что в основном пищевые белки под влиянием пищеварительных ферментов в ЖКТ подвергаются расщеплению до аминокислот и низкомолекулярных пептидов. Однако неоспорим и тот факт, что стенка тонкой кишки, через которую происходит всасывание пищевых веществ, проницаема для определенной части нерасщепленных и пи слабо расщепленных белков, не утративших своих биологических свойств [Тимофеева и др., 2000]. Известно, что ангиогенин устойчив к низким значениям рН и к действию прогеолитических ферментов, в том числе к протеазам желудочно-кишечного тракта. Представляло интерес исследовать проникает ли при псроральном приеме ангиогенин коровьего молока из желудочно-кишечного тракта в кровь?

Мышам линии ВАЬВ/с (самцы) различных возрастных групп вводили ангиогенин из расчета 6 мкг/г массы тела. Животные контрольных групп получали корм, не содержащий ангиогенина. Анализ АНГ в крови методом ИФА проводили до начала кормления (фоновое связывание), сразу после окончания кормления, а затем каждые 30 мин в течение трех часов. Величину фонового связывания антител к бычьему ангиогенину с белками крови мыши учитывали при расчете в анализируемых образцах концентрации экзогенного ангиогенина.

Исследования показали, что у животных контрольных групп на протяжении всего срока наблюдений не отмечается изменений в связывании белками крови коньюгатов, содержащих антитела к бычьему ангиогенину.

На рисунке 8 показана динамика изменения уровня ангиогенина в крови животных различных возрастных групп. Как видно из представленных данных, не имеется существенных различий в динамике изменения концентрации ангиогенина в крови мышей зрелого и предстарческого возраста. В тоже время наблюдается

выраженное различие в динамике процесса для животных этих групп по сравнению с первой группой (молодые мыши).

Рис. 8. Динамика изменения в крови мышей концентрации АНГ.

Ось абсцисс - время после перо-рального введения ангиогенина; ось ординат - концентрация ангиогенина (М±ш) в крови мышей (линии BALB/c, самцов) опытных групп различного возраста:

1 - ювенильный (1,5 месяца);

2 - зрелый (10 месяцев);

3 - предстарческий (15 месяцев). Максимальная концентрация экзогенного ангиогенина в крови мышей первой группы (63.7±7.2 мкг/мл), по сравнению со второй (92.1±10.3 мкг/мл) и третьей (96.2±10.5 мкг/мл), ниже (различия статистически достоверны), причем, максимум достигается раньше. Очевидно перорально вводимый молодым мышам ан-гиогенин быстрее проникает в кровь и быстрее из нее выводится.

Таким образом, ангиогенин проникает через стенку желудочно-кишечного тракта, и этот процесс зависит от возраста животных.

4. Антимикробное действие ангиогенина молока.

Проникновение АНГ через стенку желудочно-кишечного тракта скорее всего связано с его защитной функцией. Не исключено, что ангиогенин является одним из неспецифических факторов антибактериального комплекса молока. Поскольку потомство получает АНГ с молоком матери, можно предположить его действие и непосредственно в желудочно-кишечном тракте. Представляло интерес исследование влияния АНГ на жизнеспособность патогенной микрофлоры

ЖКТ на примере бактерий группы кишечной палочки. Принятый в качестве тест-культуры серологический тип Е. Coli, штамм В-125 относится к энтеропатоген-ным кишечным палочкам, которые при определенных условиях (например, снижение иммунитета, неконтролируемое применение антибиотиков) способны вызывать колиэнтериты, пищевые токсикоинфекции и другие острые кишечные заболевания.

lg ЧЖКУсм' ю

Рис. 9. Влияние ангиогенина на динамику роста Е. coli штамм В-125 в гидролизованном молоке. ЧЖК -число жизнеспособпых клеток.

1 - без ангиогенина (контроль);

2, 3, 4 - с ангиогенином в концентрации соответственно 12,5, 50 и 100 мкг/мл.

24

36

48

60

Динамика роста исследуемых бактерий в отсутствии и при разных дозах ангиогенина в культуральной среде показана на рисунке 9. В контрольных образцах логарифмическая фаза роста пролонгируется приблизительно до 24 часов. При введении в культуральную среду ангиогенина в дозе, приближенной к его естественному максимальному содержанию в молоке, через сутки культивирования отмечалось снижение количества клеток тест-культуры. Ингибирующий эффект имел место на протяжении всего периода культивирования и зависел от дозы ангиогенина. Так, при концентрации ангиогенина 12,5 мкг/мл число жизнеспособных клеток снижалось приблизительно в 3-5 раз, а при увеличении дозы в 4 раза -почти на два порядка. При концентрации 100 мкг/мл рост тест-культуры был незначителен. Следует отметить, что в пределах интервала исследуемых концентраций ангиогенина дозовая зависимость его действия на тест-культуру не являлась прямопропорциональной.

Рис. 10. Снятие бактериостатического эффекта ангиогенина из молока РПазином (М±ш). ЧЖК - число жизнеспособных клеток.

1Q0

12 3 4

Варианты (состав культуральной среды):

1 - ГМ (гидролизованное молоко);

2 - ГМ + ангиогенин (50мкг/мл);

3 - ГМ + ангиогенин (50мкг/мл) + РНазин (1,1'Ю3 Ед/мл);

4 - ГМ + РНазин (1.1103 Ед/мл).

* - Статистически достоверные различия с 1,3 и 4

Известно, что ангиогенин образует с плацентарным ингибитором РНКазы стойкий комплекс с потерей ферментативной активности. Из данных, представленных на диаграмме (Рис. 10) следует, что сам ингибитор на рост тест-кулыуры не влияет, но снимает бактериостатический эффект ангиогенина. В образцах, содержащих ангиогенин в концентрации 50 мкг/мл через 24 часа культивирования, по сравнению с интактным контролем, число клеток Е.СоН было снижено. Однако если в опытные образцы дополнительно вносили ингибитор, то бактериостатиче-ское действие ангиогенина не проявлялось. Вероятно, ферментативная активность ангиогенина играет определенную роль в антагонистическом его действии на исследуемые бактерии.

Таким образом, ангиогенин, очищенный из коровьего молока, обладает бак-териостатическим действием относительно Е.СоН (штамм В-125). Эффект проявляется уже при дозах, соответствующих концентрации ангиогенина в молозиве и повышается с увеличением дозы.

5. Влияние ангиогенина на репродукцию лейкоцитами крови иммунных ци-токинов.

Учитывая высокую чувствительность цитокиновой системы к защитным белкам молока, в качестве теста на иммуномодулирующее влияние ангиогенина, также входящего в "защитный комплекс" молока, была выбрана репродукция вторичных иммунных мессенджеров клетками иммунной системы (лейкоцитами) в отсутствии и присутствии известного индуктора - фитогемагтлютинина (ФГА). Было изучено влияние АНГ на продукцию интерлейкина-1р (ИЛ-1Р), интерлей-кина-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухолей-а (ФНОа) - цитокинов, функционально связаных между собой, и играющих важнейшую роль в первой линии защиты организма при иммунном ответе.

Из полученных данных следует, что АНГ способен индуцировать в лейкоцитах продукцию всех исследованных цитокинов. Уровень продуцируемых цитокинов зависит от концентрации ангиогенина и времени, прошедшего после начала его контакта с лейкоцитами.

а

Рис. 11. Продукция ИЛ-1(5 лейкоцитами крови человека после индукции ангиогенином и фитоге-магглютинином (ФГА).

АНГ: а - 50 мкг/мл, б - 200 мкг/мл, ФГА - 15 мкг/мл.

б

24

«

б

I_11-мираь

■Ш2-4ГА

ЩШЗ-анжгени

б

ТА

С целью изучения влияния ангиогенина на способность лейкоцитов продуцировать цитокины при одновременном действии с ФГА, в культуральную среду лейкоцитов вводили препараты в концентрациях - ФГА (15 мкг/мл), АНТ (50 и 200 мкг/мл). Как следует из данных, представленных на рисунке 11, через 6 часов после контакта с ангиогенином (независимо от его дозы) активация продукции ИЛ-1Р в равной мере проявлялась как для активированных, так и неакгивирован-ных ФГА лейкоцитов. Однако через 24 часа проявлялся синергический эффект при двойной индукции (ФГА+АНГ). Через 48 часов влияние контакта с индукторами проявлялось незначительно как при раздельном, так и совместном действии.

Рис. 12. Продукция ИЛ-6 лейкоцитами крови человека после индукции ангиогенином и фитоге-магглютинином (ФГА).

АНГ: а - 50 мкг/мл,

б - 200 мкг/мл, ФГА -15 мкг/мл.

I И-капрояь

М2-ФГА

- tffHVCMtf

|4-»сисга«н+ФГА

Как следует из данных, представленных на рисунке 12, при использованных дозах ангиогенин является более сильным индуктором в отношении продукции ИЛ-6, чем ИЛ-1 р. Как через 6 часов, так и через 24 часа после контакта с лейкоцитами, АНГ (в обеих дозах) оказался также более активным индуктором, чем ФГА. При их совместном действии по сравнению с действием одного АНГ не происходило статистически достоверного изменения уровня продуцируемого ИЛ-

6. Через 48 часов еще сохранялся эффект АНГ (при дозе 200 мкг/мл). При двойной индукции эффект усиливался.

Установленный факт способности ангиогенина индуцировать в лейкоцитах крови человека продукцию цитокинов (ИЛ-1р, ИЛ-6, ФНОа) позволяет предположить участие ангиогенина в механизмах функционирования иммунной системы на уровне цитокинового звена.

6. Характеристика распределения и элиминации ангиогенина молока в головном мозге и иммунокомпетентных органах животных.

Иммуномодулирующие свойства ангиогенина [Елисеева и Мертвецов, 1993, 1997] могут реализоваться, очевидно, не только непосредственно через иммуно-компетентные клетки крови [Matousek et al., 1995], но и их предшественники в лимфоидных органах. Другая важная для этих процессов мишень - головной мозг, так как иммунитет находится под контролем центральной нервной системы. В связи с этим была исследована фармакокинетика вводимого внутривенно животным ангиогенина с учетом распределения в головном мозге, тимусе и костном мозге. Оценку параметров фармакокинетической модели ангиогенина после введения проводили с помощью стандартной однокамерной кинетической модели [Каркищенко и др., 2001].

Полученные результаты свидетельствуют о высокой скорости оборота ангиогенина в животном организме, что согласуется с литературными данными по фармакокинетике рекомбинантного ангиогенина [Vasandani et al., 1996]. Уже в первые минуты после инъекции отмечается быстрое падение содержания препарата в сыворотке крови (Рис. 13). Через пять минут снижение составляет около 50%. Достоверное содержание препарата в крови отмечается приблизительно до 90 минут от начала его введения. Уровень ангиогенина в крови в данный момент времени зависит, в случае непосредственного введения его в кровь, в-основном от

мин

Рис. 13. Изменение концентрации ангиогенина в сыворотке крови мышей. Ось абсцисс - время после инъекции (мин); ось ординат - концентрация ангиогенина (С, мкг/мл).

двух факторов - элиминации и распределения по органам. Согласно полученным значениям фармакокинетических параметров (Табл. 2), в рассматриваемом случае элиминация не столь значима, как распределение, так как величина общего клиренса, отражающего способность организма к элиминации, довольно низкая.

Таблица 2. Основные фармакокинетические параметры ангиогенина для сыворотки крови.

tl/2, Со» V* к« CL, AUC, AUMC, MRT,

мин мкг/мл мл/г мин"1 мл/минт мкг-мин/мл мкгмин2/мл мин

52,90 20 0,029 0,0131 0,38Т0"3 1526,72 11,65-Ю4 76,33

tj/2 - период полувыведения; С„- начальная концентрация АНТ в плазме крови; Vd- кажущийся объем распределения; К, - константа элиминации; CL - клиренс; AUC - суммарная площадь под кривой концентрации АНТ от момента его попадания в организм до полного удаления; AUMC - суммарная площадь под кривой произведения времени на концентрацию АНГ в организме от момента его попадания в организм до полного выведения из него; MRT - среднее время удержания АНГ в организме.

Была изучена динамика накопления ангиогенина в лимфоидных органах и головном мозгу мышей. Из результатов экспериментов следует, что введенный в кровь ангиогенин проникает во все исследуемые органы. Накопление препарата в них во времени проходит через максимум, нарастая с константой скорости Ка и убывая с константой скорости Ке. Для органов оценку параметров однокамерной фармакокинетической модели АНГ проводили с учетом всасывания (Табл. 3).

Таблица 3. Основные фармакокинетические параметры ангиогенина

для тест-органов.

Органы Ка, Ке, ha, Qo, AUC, AUMC, MRT,

мин"1 мин'1 мин MKT мин мин2 мин

Костный мозг 0.084 0.020 34.65 0.93 46.5 2325 50

Тимус 0.153 0.015 46.20 8.87 591.3 39422 67

Головной мозг 0.042 0,090 7.70 24.27 269.6 2996 11

К, - константа всасывания; Ке - константа элиминации; Х\п - период полувыведения; Q0 - предел накопления АНГ в органе при заданном значении дозы; AUC - суммарная площадь под кривой концентрации АНГ от момента его попадания в орган до полного удаления; AUMC - суммарная площадь под кривой произведения времени на концентрацию АНГ в органе от момента его попадания в орган до полного выведения из него; MRT - среднее время удержания АНГ в органе.

Повышение содержания ангиогенина в исследованных органах в начальный период после инъекции происходит одновременно с наиболее выраженным падением его содержания в сыворотке крови, но при этом отмечается определенная избирательность распределения. В частности, в костный мозг распределяется наименьшее количество ангиогенина, достигая максимума к 20 минутам, а в головной мозг - наибольшее. При этом максимум достигается к 15 минутам, но белок быстро выводится. В этом случае константа элиминации приблизительно в 2 раза больше, чем константа всасывания. Как следствие, время удерживания составляет всего 11 минут против 50 и 67 минут в костном мозге и тимусе соответственно. Это объясняется тем, что в тимусе и костном мозге константы элимина-

ции меньше, чем константы всасывания (на порядок для тимуса и в - 4 раза для костного мозга).

Таким образом, ангиогенин дольше всего удерживается в тимусе и медленнее всего из него выводится, что может свидетельствовать о преодолении им ге-матотимотического барьера и определять более длительный его контакт с предшественниками тимус-зависимых иммунокомпетентных клеток. Можно полагать, что in vivo накопление в тимусе ангиогенина функционально связано с его имму-номодулирующим действием.

ВЫВОДЫ

1. С использованием катионообменной и гидрофобной хроматографии низкого давления разработан способ получения из коровьего молока элекгрофо-ретически чистого нативного препарата ангиогенина (выход 49%, степень очистки 12000 раз).

2. Конкурентный метод иммуноферментного анализа на основе коньюгата по-ликлональных антител к ангиогенину с пероксидазой хрена адаптирован для количественного определения бычьего ангиогенина в биологических жидкостях. Чувствительность метода составляет 10 нг/мл.

3. Впервые обнаружена способность ангиогенина или его фрагментов при пс-роральном введении проникать в кровь через желудочно-кишечный тракт.

4. Установлено, что ангиогенин обладает бактериостатическим действием относительно условно патогенного штамма E.Coli. Дозозависимьгй эффект ангиогенина проявляется уже при значениях концентрации его в культураль-ной среде, соответствующих физиологическим.

5. Показано, что ангиогенин является индуктором продукции лейкоцитами человека провоспалительных интерлейкинов (ИЛ-1р, ИЛ-6, ФНОа) - значимых посредников в механизмах развития иммунного процесса на уровне цитокинового звена.

i

21

6. На основании фармакокинстических исследований установлена высокая скорость обмена инъецированного животным ангиогенина в головном мозге, костном мозге и тимусе.

Работа выполнена прн финансовой поддержке РФФИ (грант № 00-04-48067).

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Шалыгина A.M., Тихомирова H.A., Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С. "Новый белок молока ангиогенин" // Научно-технич. сборник АГРОНИИТЭИ ММП. 1995. В. 1.С. 14-15.

2. Шалыгина A.M., Тихомирова H.A., Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С. "Выделение ангиогенина из молочного сырья" // Молочная промышленность. 1995. № 4. С. 22-23.

3. Poi ов И.А., Шалыгина A.M., Тихомирова H.A., Рустамьян Ю.Л., Скоробогатько О.В., Михайлов A.M., Степанова Б.В., Комолова Г.С. "Количественное определение ангиогенина быка" //Биохимия. 1995. Т. 60. В. 8. С. 1344-1348.

4. Рогов И.А., Михайлов A.M., Шалыгина A.M., Тихомирова H.A., Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С. "Очистка ангиогенина из коровьего молока" // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 1. С. 107-110.

5. Рустамьян Ю.Л., Шалыгина A.M., Тихомирова H.A., Рабинович М.Л., Плеша-нов А.Н., Комолова Г.С. "Иммуноферментный анализ ангиогенина в молоке коров" // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 1. С. 105-108.

6. Тихомирова H.A., Шалыгина A.M., Ганина В.И., Алякина Е.А., Комолова Г.С., Рустамьян Ю.Л. "Влияние катионной фракции белков молока на бактерии группы кишечной палочки" // Молочная промышленность. 1999. № 11. С. 31-33.

7. Рогов И.А., Шалыгина A.M., Комолова Г.С., Рустамьян Ю.Л., Тихомирова H.A., Ионова И.И. "Способ количественного определения ангиогенина в молочном сырье" Патент №2133464, 1999.

8. Рустамьян Ю.Л., Тихомирова H.A., Комолова Г.С. "Использование иммуно-ферментного анализа ангиогенина для разработки диетических молочных продуктов" // "Политика здорового питания в России: пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека" Материалы Всероссийской конференции с международным участием. Москва. 1999. С.43.

9. Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С., Тихомирова H.A., Шалыгина A.M. "Анализ содержания ангиогенина в молоке коров черно-пестрой породы" // "Пища. Экология. Человек." Материалы 3-ей Международной научно-технической конференции. Москва. 1999. С. 33.

10. Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С. "Определение ангиогенина в молоке коров" // "Горизонты физико-химической биологии" Материалы школы-конференции молодых ученых. Пущино. 2000. Т. 1. С. 152.

11. Рустамьян ЮЛ., Комолова Г.С. "Проникновение в кровь мышей вводимого перорально ангиогенина из коровьего молока" // Известия АН. Серия биологическая. 2002. № 2. С. 224-227.

12. Тихомирова H.A., Шалыгина A.M., Ганина В.И., Алякина Е.А., Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С. "Влияние ангиогенина коровьего молока на бактерии группы кишечной палочки" // Иммунология. 2002. Т. 23. № 2. С. 105-106.

13. Рогов И.А., Тихомирова H.A., Ионова И.И., Федорова Т.В., Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С. "Изучение БАД парафармацевтического действия на основе ангиогенина" // "Живые системы и биологическая безопасность населения" Материалы Международной научно-технической конференции. Москва. МГУ ПБ. 2002. С. 119.

14. Щегловитова О.Н., Максянина Е.В., Ионова И.И., Рустамьян Ю.Л., Комолова Г.С. "Ангиогенин молока коров индуцирует в лейкоцитах крови человека продукцию цитокинов" // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135. №2. С. 182-185.

15. Плаксина Г.В., Комолова Г.С., Машков А.Е., Рустамьян Ю.Л., Пыхтеев Д.А. "Стабилизирующий эффект ангиогенина из молока на кристаллическую структуру биологических жидкостей" // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136. № 10. С. 406-409.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печали 19.09.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 553. Тел. 939-3890. Тел /Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

P165 24

РНБ Русский фонд

2006-4 12397

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рустамьян, Юлия Леонидовна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структура и свойства ангиогенина из коровьего молока

1.1.1. Структура и физико-химические свойства.

1.1.2. Ферментативная активность.

1.1.3. Известные физиологические свойства.

1.1.3.1. Ангиогенная активность.

1.1.3.2. Ангиогенин - как иммуномодулятор.

1.1.3.3. Цитотоксичность.

1.1.3.4. Антивирусное действие.

1.1.4. Биохимические механизмы биологического действия ангиогенина.

1.2. Идентификация ангиогенина.

1.3. Очистка ангиогенина из биологических жидкостей.

1.4. Практическое использование ангиогенина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование биологических свойств ангиогенина молока - полифункциональной рибонуклеазы"

Известно, что цельное молоко - богатый природный источник биологически активных белков, обладающих антибактериальными, антиоксидантными, иммуномодуляторными и регенерирующими свойствами.Однако биологически активные компоненты молока изучены еще недостаточно. Особый интерес представляет функциональная рибонуклеаза ангиогенин (от греч. angion - сосуд). Впервые он был выделен в 1985 году из культуральнои жидкости клеток человека, позже найден в сыворотке крови, а в 1988 году - в коровьем молоке. За прошедшие годы новый белок активно изучался: определена его структура, исследованы физико-химические свойства, ферментативная активность. Выявлены некоторые свойства, направленные на поддержание гомеостаза различных систем животного организма. В свете результатов недавних исследований есть основание рассматривать ангиогенин в качестве одного из значимых факторов пассивного иммунитета, передаваемого с молоком от матери к потомству. Биологические свойства ангиогенина мало изучены. Хотя несомненно, что это полифункциональный белок. Предстоит еще немало открытий в этой области. Успехи в исследовании молочного ангиогенина, входящего в комплекс защитных белков молока, намечают перспективу создания на его основе биопрепаратов широкого спектра действия как в биотехнологии, так и в медицинской практике.Данная работа укладывается в рамки нового направления исследований функций биологически активных белков молока и их комплексов с целью создания на их основе физиологически активных пищевых добавок, а также новых эффективных препаратов лечебного назначения.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рустамьян, Юлия Леонидовна

1. с использованием катионообменной и гидрофобной хроматографии низкого давления разработан способ получения из коровьего молока электрофоретически чистого нативного препарата ангиогершна (выход 49%, степень очистки 12000 раз).2. Конкурентный метод иммуноферментного анализа на основе коньюгата поликлональных антител к ангиогенину с пероксидазой хрена адаптирован для количественного определения бычьего ангиогенина в биологических жидкостях. Чувствительность метода составляет 10 нг/мл.3. Впервые обнаружена способность ангиогенина или его фрагментов при пероральном введении проникать в кровь через желудочно-кишечный тракт.4. Установлено, что ангиогенин обладает бактериостатическим действием относительно условно патогенного штамма Е.СоИ. Дозозависимый эффект ангиогенина проявляется уже при значениях концентрации его в культуральной среде, соответствующих физиологическим.5. Показано, что ангиогенин является индуктором продукции лейкоцитами человека провоспалительных интерлейкинов (ИЛ-1р, ИЛ-6, ФНОа) -

значимых посредников в механизмах развития иммунного процесса на уровне цитокинового звена.6. На основании фармакокинетических исследований установлена высокая скорость обмена инъецированного животным ангиогенина в головном мозге, костном мозге и тимусе.Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (фант № 00-04-48067).Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю д.б.н., профессору Комоловой Галине Сергеевне за ценные консультации и постоянное содействие при выполнении диссертационной работы.Автор искренне благодарен руководителю нашего отдела д.х.н., профессору Рабиновичу Михаилу Львовичу и всему коллективу: к.б.н. К.Н. Карапетяну, к.б.н. Л.Г. Васильченко, к.б.н. А.В. Болобовой, к.б.н. Е.А. Зверевой, к.т.н. И.И. Ионовой, к.б.н. В.В. Хромоныгиной за помощь в работе.Автор искренне признателен к.б.н. О.В. Королевой, к.б.н. Е.В. Степановой, к.т.н. Т.В. Федоровой и другим сотрудникам группы "Ферментативные основы биодеградации" за помощь и техническое содействие в проведении экспериментальной работы.Особую благодарность автор выражает своим близким за постоянную моральную поддержку при выполнении диссертационной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рустамьян, Юлия Леонидовна, Москва

1. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Громковский Ю.В. Планирование экспериментапри поиске оптимальных условий. // М.: Наука. 1976. 279 с.

2. Безбородова СИ., Бородаева Л.И., Панкова Л.Н. Способность низших грибовсинтезировать внеклеточные РНКазы. // Микробиология. 1968. Т. 37. № 1. 10-14.

3. Бурлев В.А., Павлович СВ. Ангиогенез и ангиогенные факторы роста врегуляции репродуктивной системы у женщин. // Проблемы репродукции. 1999. 1. Т. 5. №5. 6-13.

4. Бурлеева Е.П., Мертвецов Н.П., Крохина Н.Б,, Бродская И.Б. // Третьяежегодная сессия научного центра сердечно-сосудистой хирургии им.

5. А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых. Москва.1999. Тез. докл. 117.

6. Горбатова К.К. Химия и физика белков молока. // М.: Колос. 1993.192 с.

7. Дрейнер Н., Смит Г. Прикладной регрессионный анализ в 2-х кн. Кн. I. Пер. сангл. 2-е изд., переработ, и доп. // М.: Финансы и статистика. 1986. 366 с.

8. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практикаиммуноферментного анализа. // Высшая школа, Москва. 1991. С 95-102.

9. Елисеева Л.С, Мертвецов Н.П. Иммунорегуляторные свойстварекомбинантного ангиогенина человека. // Бюлл. экс. биол. и медицины. 1993. 1. Т. 115. №5. 510-512.

10. Елисеева Л.С, Мертвецов Н.П. Реакция на антигенную информацию вусловиях повышенного уровня ангиогенина. // Бюлл. экс. биол. и медицины. 1997. Т. 123. №4. С 427-430.

11. Ионова И.И. Разработка способа количественного определениябиологически активного вещества - ангиогенина в молочном сырье. // Автореф. дис. канд. техн. наук. М.: МГУПБ, 1998. 20 с.

12. Ионова И.И., Федорова Т.В., Комолова Г.С Тезисы докладов школыконференции. Горизонты физико-химической биологии. // Пущино.:

13. Пущинский научный центр РАН, 2000. С 120-121.

14. Ионова И.И., Комолова Г.С, Шалыгина A.M., Есипова Л.Н. Содержаниеангиогенина в женском молоке в ранний период лактации. // Вопросы питания. 2001. Т. 70. № I .e . 7-9. 1.l l

15. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева А., Каркищенко В.Н.

16. Фармакокинетика. // Ростов н/Д: Феникс. 2001. 381 с.

17. Карулин А.Ю., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Корчагина И.С, Егоров A.M.

18. Изучение влияния условий периодатного синтеза на состав коньюгатовиммуноглобулина G с пероксидазой методом высокоэффективной жидкостной хроматофафии. // Биотехнология. 1989. Т. 5. № 3. 324-332.

19. Клеменс М. Транскрипция и трансляция. // М.: Мир, 1987. 254-276.

20. Клесов А.А. Ангиогенин - белковый фактор кровоснабжения опухолевыхклеток человека. // Успехи современной биологии. 1988. Т. 106. Вып. 2(5). 264-277.

21. Комолова Г.С, Маштакова А.Д., Клесов А.А. Количественная оценкабиологической активности ангиогенина. // Изв. РАН (сер. биол.). 1992. № 5. 684-689.

22. Комолова Г.С, Рустамьян Ю.Л. Ангиогенин-индуцируемый ангиогенез какмишень в терапии опухолей. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1998. Т. 61. № 5. 81-84.

23. Комолова Г.С, Федорова Т.В. Ангиогенин молока (обзор). // Прикладнаябиохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 3. 229-236.

24. Копиева В.Г., Плескова А.В., Маклакова И.А., Ситникова Ю.Б.

25. Неоваскуляризация роговицы: современные аспекты патогенеза и лечения. //

26. Вестник офтальмологии. 1993. Т. 109. № 5. С 35-38.

27. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике для научных работников иинженеров. // М.: Наука. 1984. 830 с.

28. Корнева Е.А. Иммунофизиология. // -Петербург: Наука. 1993. 684 с.

29. Маштакова А.Д., Комолова Г.С. Влияние агиогенина на пролиферациюкровеносных сосудов у крыс. // Морфология. 1993. Т. 105. № 11-12. 37-42.

30. Мертвецов Н.П. Химико-ферментативный синтез гена ангиогенина человека.

31. Конструирование бактериальных штаммов - продуцентов ангиогениначеловека. Разработка технологии производства и очистки ангиогенина. // Изв.

32. АН. (сер. хим.) 1996. № 12. 2837-2846.

33. Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е. Ангиогенин и механизм ангиогенеза. //

34. Новосибирск.: Наука. СО РАН, 1997. 78 с.

35. Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К., Вихоть И.Е. Иммунология. Практикум. //

36. Киев.: Вища шк. 1989. 294 с.

37. Плаксива Г.В., Римарчук Г.В., Урсова Н.И. Методические рекомендации.

38. Кристаллография в детской гастроэнтерологии. // Москва. 1995. 3-5.

39. Прозоровская К.Н., Стефани Д.В., Штеренгарц Б.П., Лазарев В.П., Абросимова

40. Н.А. Изучение защитных свойств женского молока в лабораторных иклинических исследованиях. // Иммунология. 1981. № 5. С, 77-79.

41. Рогов И.А., Шалыгина A.M., Попова И.И., Михайлов A.M., Тихомирова П.А.,

42. Комолова Г.С. Определение ангиогенина в коровьем молоке на основеконкурентной пробы "панкреатическая РНКаза/плацентарный ингибитор

43. РНКазы - ангиогенин". // Вопросы питания. 1997. № 2. 32-37.

44. Рогов И.А., Михайлов A.M., Шалыгина A.M., Тихомирова Н.А., Рустамьян

45. Ю.Л., Комолова Г.С. Очистка ангиогенина из коровьего молока. // Прикладнаябиохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 1. 107-110.

46. Скоробогатько О.В., Джафарова А.И., Ярополов А.И. Влияние условий синтезаиммунолакказных конъюгатов на характеристики и состав получаемых соединений. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 3. 477482.

47. Терпиловская О.П., Третьяк Т.М., Зелепуга Е.А., Понамарева Р.Б.

48. Проникновение панкреатической РПКазы через гематоэнцефалический барьерв паренхиму мозга. // Вопросы медицинской химии. 1993. Т. 39. № 5. 41-43.

49. Тимофеева Н.М., Иезуитова Н.Н., Громова Л.В. Современные представления овсасывании моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке млекопитающих. // Успехи физиол. наук. 2000. Т. 31. № 4. 24-37.

50. Тихомирова Н.А. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике илечении наиболее распространенных заболеваний человека. // Государственная концепция. Политика здорового питания в России. Мат. всес. конф. М., 1999. 1. 31-33.

51. Тихомирова Н.А. Научные и практические основы получения из молочногосырья биологически активного вещества ангиогенина. // Автореф. дне. док. техн. наук. М.: МГУПБ, 2000.48 с.

52. Федорова Т.В. Разработка способа получения белкового концентрата,содержащего ангиогенин, из молочного ультрафильтрата. // Автореф. дис. канд техн. наук. М.: МГУПБ, 2003. 21 с.

53. Харламова П., Иоффе Р. Практикум. Лабораторная мышь (справочныйматериал). // Лаб. животные. 1992. Т. 2. № 4. 49-56.

54. Храмцов А.Г., Василисин СВ., Кунижев СМ., Чеботарев Е.А. Рациональноеиспользование молочной сыворотки по безотходной технологии в региональной программе ДГТУ-КУБГТУ. // Изв. вузов. Пищевая технология. 1998. №4. С 27-29.

55. Шалыгина A.M., Ионова И.И., Тихомирова Н.А., Комолова Г.С Определениеангиогенина в коровьем молоке. // Молочная промышленность. 1997. № 3. С32.

56. Шестенко О.П., Никонов Д., Мертвецов П.П. Ангиогенин и его роль вангиогенезе. // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 3. 349-371.

57. Шидловская В.П. Ферменты молока. // М.: Агропромиздат, 1985. С 152.

58. Acharya K.R., Shapiro R., Allen S.C, Riordan J.F., Vallee B.L. Crystal structurehuman angiogenin reveals the structural basis for its functional divergence from ribonuclease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 8. P. 2915-2919.

59. Acharya K.R., Shapiro R., Riordan J.F., Vallee B.L. Crystal structure of bovineangiogenin at 1.5-A resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. № 7. P. 2949-2953.

60. Amdt M.A., Krauss J., Vu B.K., Newton D.L., Rybak S.M. A dimeric angiogeninimmunofusion protein mediates selective toxicity toward CD22+ tumor cells. // J. 1.munother. 2005. V. 28. № 3. p. 245-251.

61. Alexandrakis M.G., Passam F.IL, Pappa C.A., Sfiridaki K., Tsirakis G., Damilakis J.,

62. Stathopoulos E.N., Kyriakou D.S. Relation between bone marrow angiogenesis andserum levels of angiogenin in patients with myelodysplastic syndromes, // Leuk. Res. 2005. V. 29. № 1 . P. 41-46.

63. Badet J. Angiogenin, a potent mediator of angiogenesis. Biological, biochemical andstructural properties. // Pathol. Biol.(Paris). 1999. V. 47. № 4. P. 345-351.

64. Badet J. Angiogenin. // Vascular Biology & Pathology: an encyclopedic reference.2000. P. 16-29.

65. Bickncll R., Vallee B.L. Angiogenin activates endothelial cell phospholipase C. // Proc.

66. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 16. P. 5961-5965.

67. Bickncll R., Vallee B.L. Angiogenin stimulated endothelial cell prostacyclin secretionby activation of phospholipase A2. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. № 5. P. 1573-1577.

68. Blaser J., Tricbel S., Kopp C, Tschesche H. A highly sensitiveimmunoenzymometric assay for the determination of angiogenin. // Eur. J. Clin.

69. Chem. Clin. Biochem. 1993. V. 31. № 8. P. 513-516.

70. Bodner-Adler В., Hefler L., Bodner K., LeodoUer S., Frischmuth K., Kainz C ,

71. Mayerhofer K. Serum levels of angiogenin (ANG) in invasive cervical cancer and incervical intraepithelial neoplasia (CIN). // Anticancer Res. 2001. V. 21. № IB. P. 809-812.

72. Bond M.D. An in vitro binding assay for angiogenin using placental ribonuclcaseinhibitor. //Anal. Biochem. 1988. V. 173. K^ 1. P. 166-173.

73. Bond M.D., Vallee B.L. Isolation of bovine angiogenin using a placentalribonuclcase binding assay. // Biochemistry. 1988. V. 27. № 17. P. 6282-6287.

74. Bond M.D., Strydom D.J. Amino acid sequence of bovine angiogenin. //

75. Biochemistry. 1989. V. 28. № 14. P. 6110-6113.

76. Bond M.D., Strydom D.J., Vallee B.L. Characterization and sequencing of rabbit, pigand mouse angiogenins: discernment of functionally important residues and regions. // Biochem. Biophys. Acta. 1993. V. 1162. № 1-2. P. 177-186.

77. Brunner В., Gunsilius E., Schumacher P., Zwierzina H., Gastl G., Stander R. Bloodlevels of angiogenin and vascular endothelial growth factor are elevated in myelodysplastic syndromes and in acute myeloid leukemia. // J. Hematother Stem

78. Cell Res. 2002. V. 11. № 1. P. 119-125.

79. Burgmann IL, Hollenstein U., Muca Т., Zedwitz-Liebenstein K. Increased serumlaminin and angiogenin concentrations in patients with peripheral arterial occlusive disease. // J. of clinical pathol. 1996. V. 49. X» 6. P. 508-510.

80. Campo L., Turley II., Han C, Pezzella F., Gatter K.C., Harris A.L., Fox S.B.

81. Angiogenin is up-regulated in the nucleus and cytoplasm in human primary breastcarcinoma and is associated with markers of hypoxia but not survival. // J. Pathol. 2005. V. 205. №5. P. 585-591.

82. Chamoux М., Dehonck M.P., Fruchort J., Spik G., Montrenil J., Cecchelli R.

83. Characterization of angiogenin receptors on bovine brain capillary endothelial cells.// Bioch. Bioph. Res. Commun. 1991. V. 176. № 2. P. 833-839.

84. Chang S.I., Jeong G.B., Park S.H., Ahn B.C., Choi J.D., Chae Q., Namgoong S.K.,

85. Chung S.I. Detection, quantitation and localization of bovine angiogenin byimmunological assay. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 1997. V. 232. № 2. P. 323-327.

86. Chao Y., Li СР., Chau G.Y., Chen СР., King K.L., Lui W.Y., Yen S.H., Chang

87. Chen Y., Zhang S,. Chen Y.P., Lin J.Y. Effect of angiogenin on angiogenesis ingastric carcinoma. //Ai. Zheng. 2005. V. 24. № 3. P. 317-320.

88. Chiarelli F., Pomilio M., Mohn A., Tumini S., Verrotti A., Mezzettii A., Cipollone F.,

89. Wasniewska M., Morgese G., Spagnoli A. Serum angiogenin concentrations in youngpatients with diabetes mellitus. // Eur. J. Clin. Invest. 2002. V. 32. № 2. P. 110-114.

90. Eissa S., Kenawy G., Swellam M., El-Fadle A.A., Abd El-Aal A.A., El-Ahmady O.

91. Comparison of cytokeratin 20 RNA and angiogenin in voided urine samples asdiagnostic tools for bladder carcinoma. // Clin. Biochem. 2004. V. 37. № 9. P. 803810.

92. Espinosa Cervantes M.C., Rosado Garcia A. Angiogenesis in reproductive physiology.

93. Follicular development, formation and maintenance of the софи8 luteum. // Ginecol.

94. Obstet. Мех. 2002. V. 70. P. 17-24.

95. Fajardo L.F., Kowalski J., Kwan H.I I., Prionas S.D., Allison A.C Methods in1.boratory Investigation. The disc angiogenesis system. // Laboratory Investigation. 1988. V. 58. №6. P. 718-724.

96. Fett J.W., Strydom D.J., Lobb R.R., Alderman E.M., Bethune J.L., Riordan J.F.,

97. Vallee B.L. Isolation and characterization of angiogenin, an angiogenic protein fromhuman carcinoma cells. // Biochemistry. 1985. V. 24. № 20. P. 5480-5486.

98. Fett J.W., Bethune J.L., Vallee B.L. Induction of angiogenesis by mixtures of twoangiogenic proteins, angiogenin and acidic fibroblast growth factor, in the chick chorioallantoic membrane. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 1987. V. 146. № 3. P. 1122-1131.

99. Folkman J., Klagsbrun M. Angiogenesis factors. // Science. 1987. V. 235. № 23. P.442-447.

100. Folkman J. The role of angiogenin in tumor growth. // Semin. Cancer. Biol. 1992. V.3. № 1 . P. 65-71.

101. Folkman J. Clinical applications of research on angiogenesis. // New England Journalof Medicine. 1995. V. 333. № 26. P. 1750-1757.

102. Foumier G.A., Lutty G.A., Watt S., Fenselau A., Patz A. A corneal micropocketassay for angiogenesis in the rat eye. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1981. P. 351354.

103. Fox E.A., Riordan J.F. Molecular biology of angiogenin: Molecular biology of thecardiovascular sistem. Ed. By Shu. Chien. M.D., Ph. D. Copyright Lea Febirger.

105. Нафег J.W., Vallee B.L. Mutagenesis of aspartic acid-116 enhances the ribonucleolyticactivity and angiogenic potency of angiogenin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. №14. P. 7139-7143.

106. Нафег J.W., Vallee B.L. Conformational characterization of human angiogenin bylimited proteolysis. // J. of protein chemistry. 1988. V. 7. № 4. P. 355-363.

107. Нафег J.W., Vallee B.L. A covalent angiogenin/ribonuclease hybrid with a fourthdisulfide bond generated by regional mutagenesis. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 1875-1884.

108. Нафег J.W., Fox E.A., Shapiro R., Vallee B.L. Mutagenesis of residues flanking Lys40 enhance the enzymatic activity and reduces the angiogenic potency of angiogenin. //

109. Biochemistry. 1990. V. 29. № 31. P. 7297-730.1.latzi E., Badet J. Expression of receptors for human angiogenin in vascular smooth muscle cells. // Eur. J. Biochem 1999. V. 260. № 3. p. 825-832.

110. Hemmila LA. Application of fluorescence in immunoassays. // Chemical Analysis.1991. V. 117. № LP. 37-42.

111. Hernandez СМ., Van Markwisk B.W., Vreeman H.J. Isolation and properties oflactoperoxidase from bovine milk. // Ncthcrland Milk and Dairy Journal. 1990. V. 44. 1. P. 213-231.

112. Hollahan T.W., Shapiro R., Vallee B.L. Dual site model for the organogenic activity ofangiogenin.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. №6. P. 2222-2226.

113. Hollahan T.W., Shapiro R., Strydom D.J., Vallee B.L, Importance of asparagine-61 andasparagine-109 to the angiogenic activity of human angiogenin. // Biochemistry. 1992. 1. V. 31. №34. P. 8022-8029.

114. Homer J.J., Greenman J., Stafford N.D. Circulating angiogenic cytokines as tumourmarkers and prognostic factors in head and neck squamous cell carcinoma. // Clin.

115. Otolaryngol. 2002. V. 27. № 1. P. 32-37.

116. Hooper L.V., Stappenbeck T.S., Hong C.V., Gordon J.I. Angiogenins: a new class ofmicrobicidal proteins involved in innate immunity. // Nature Immunology. 2003. V. 4. N2 3. P. 69-273.

117. Hosaka S., Shah M.R., Barquin N., Haines G.K., Koch A.E. Expression of basicfibroblast growth factor and angiogenin in arthritis. // Pathobiology. 1995.V. 63. № 5. 1. P. 249-256.

118. Hu G. F., Chang S.I., Riordan J.R., Vallee B.L. An angiogenin - binding protein fromendotelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 6. P. 2227-2231.

119. Hu G.F., Stryrom D.J., Fett J.W., Vallee B.L. Actin is a binding protein for angiogenin.// Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. № 4. P. 1217-1221.

120. Hu G.F., Riordan J.F., Vallee B.L. Angiogenin promotes invasiveness of culturedendothelial cells by stimulation of cell - associated proteolytic activities. // Proc. Natl.

121. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 25. P. 12096-12100.

122. Hu G.F., Riordan J.F,, Vallee B.L. A putative angiogenin receptor in angiogeninresponsive human endotelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, V, 94. № 6. 1. P. 2204-2209.

123. Hu G.F., Xu C, Riordan J.F. I luman angiogenin is rapidly translocated to the nucleusof human umbilical vein endothelial cells and binds to DNA. // J. Cell. Biochem. 2000. 1. V. 76. №3. P. 452-462.

124. Ни G.F. Neomycin inhibits the angiogenic activity of fibroblast and epidermal growthfactors. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 2001. V. 287. № 4. P. 870-874.

125. Hu H., Gao X., Sun Y., Zhou J., Yang M., Xu Z. Alpha-actinin-2, a cytoskeletalprotein, binds to angiogenin. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 2005. V. 329. № 2. P. 661-667.

126. Huhn M., Sasse S., Tur M.K., Matthey В., Schinkothe Т., Rybak S.M., Barth S.,

127. Engert A. Human angiogenin fused to human CD30 ligand (Ang-CD30L) exhibitsspecific cytotoxicity against CD30-positive lymphoma. // Cancer Res. 2001. V. 61. № 24. P. 8737-8742.

128. Hum B.A., Chantler S.M. Methods in Enzymology (Vanakis H. and Langone J.J.,ed.), 1980. 70, Pt. A. P., P. 104-112.

129. Jang S.H., Kang D.K., Chang S.I., Scheraga H.A., Shin H.C. High level production ofbovine angiogenin in E. coli by an efficient refolding procedure. // Biotechnol. Lett. 2004. V. 26. № 19. P. 1501-1504.

130. Jardine A.M., Leonidas D.D., Jenkins J.L., Park C , Raines R.T., Acharya K.R.,

131. Shapiro R. Cleavage of 3',5'-pyrophosphate-linked dinucleotides by ribonuclease Aand angiogenin. // Biochemistry. 2001. V. 40. № 34. P. 10262-10272.

132. King T.V., Vallee B.L. Neovascularisation of the meniscus with angiogenin. // J.

133. Bone Joint Sury. Br. 1991. V. 73. № 4. P. 587-590.

134. Kishimoto K., Liu S., Tsuji Т., Olson K.A., Hu G.F. Endogenous angiogenin inendothelial cells is a general requirement for cell proliferation and angiogcnesis. //

135. Oncogene. 2005. V. 24. № 3. P. 445-456.

136. Klagsbrun M., D'Amore P.A. Regulators of angiogcnesis. // Annu. Rev. Physiol. 1991.1. V. 53. № LP. 217-241.

137. Kolben M., Blaser J., Ulm K., Schmitt M., Schneider K.T.M., Tschesche IL, Gracff H.

138. Angiogenin plasma levels during pregnancy. // Am J. Obstet. Gynecol. 1997. V. 176. №1. Part LP. 37-41.

139. Koutroubakis I.E., Xidakis C , Karmiris K., Sfiridaki A., Kandidaki E., Kouroumalis

140. E.A. Serum angiogenin in inflammatory bowel disease. // Dig. Dis. Sci. 2004. V. 49, №11-12. P. 1758-1762.

141. Madazli R., Atis A., Uzun H., Aksu F. Mid-trimester amniotic fluid angiogenin, lactatedehydrogenase and fibronectin in the prediction of preterm delivery. // Eur. J. Obstet.

142. Gynecol. Reprod. Biol. 2003. V. 106. № 2. P. 160-164.

143. Madhusudhan M.S., Vishveshwara S., Das A., Kalra P., Jayaram B. A moleculardynamics study based post facto free energy analysis of the binding of bovine angiogenin with UMP and CMP ligands. //Indian. J. Biochem. Biophys. 2001. V. 38. №1-2. P. 27-33.

144. Maes P., Damart D., Rommens C , Montreuil J., Spik G., Tartar A. The completeamino acid sequence of bovine milk angiogenin. // FEBS Lett. 1988. V. 241. № 1-2. 1. P. 41-45.

145. Malamitsi-Puchner A., Sarandakou A., Giannaki G., Rizos D., Phocas I. Changes ofangiogenin serum concentrations in the perinatal period. // Pediatric Research, 1997. V. 41.№6. P. 909-911.

146. Malamitsi-Puchner A., Tziotis J., Protonotariou E., Sarandakou A., Creatsas G.

147. Angiogenic factors in the perinatal period: diversity in biological functions reflected intheir serum concentrations soon after birth. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. V. 900. P. 169-173.

148. Malamitsi-Puchner A., Sarandakou A., Baka S.G., Tziotis J., Rizos D., Hassiakos D.,

149. Malamitsi-Puchner A., Sarandakou A., Baka S., Hasiakos D., Kouskouni E., Creatsas

150. G. In vitro fertilization: angiogenic, proliferative, and apoptotic factors in the follicularfluid. //Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. V. 997. P. 124-128.

151. Malamitsi-Puchner A., Sarandakou A., Tziotis J., Stavreus-Evers A., Tzonou A.,1.ndgren B.M. Circulating angiogenic factors during periovulation and the luteal phase of normal menstrual cycles. // Fertil. Steril. 2004. V. 81. № 5. P. 1322-1327.

152. Matousek J., Soucek J., Stratil A., Vallee B.L. Immunosuppressive activity ofangiogenin. //Anim. Genet. 1992. Suppl. V. 23. P. 46.

153. Matousek J., Sousek J., Riha J., Zankel T.R., Benner S.A. Immunosuppressive activityof angiogenin in comparison with bovine seminal ribonuclease and pancreatic ribonuclease. // Сотр. Biochem. Physiol. 1995. V. 112B. № 2. P. 235-241.

154. Molskness T.A., Stouffer R.L., Burry K.A., Gorrill M.J., Lee D.M., Patton P.E.

155. Circulating levels of free and total vascular endothelial growth factor (VEGF)-A,soluble VEGF receptors-1 and -2, and angiogenin during ovarian stimulation in nonhuman primates and women. // Hum. Reprod. 2004. V. 19. № 4. P. 822-830.

156. Montero S., Lloveras В., Cortes-Funes H., Colomer R. Correspondence re: S.

157. Shimoyama et.al., increased serum angiogenin concentration in colorectal cancer iscorrelated with cancer progression. // Clin. Cancer Res. 1999. V. 5. P. 1125-1130.

158. Moore F., Riordan J.F. Angiogenin activates phospholipase С and elicits a rapidincoфoration of fatty acid into cholesterol esters in vascular smooth muscle cells. //

159. Biochemistry. 1990. V. 29. №1. P. 228-234.

160. Moroianu J., Riordan J.F. Identification of the nuclear targeting signal of humanangiogenin. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 1994. V. 203. № 3. P. 1765-1772.

161. Moroianu J., Riordan J.F, Nuclear translocation of angiogenin in proliferatingendothelial cells is essential to its angiogenic activity. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. №5. P. 1677-1681.

162. Newton D.L., Nicholls P.J., Rybak S.M., Youle R.J. Expression and characterizationof recombinant human eosinophil-derived neurotoxin and eosinophil-derived neurotoxin-anti-transferrin receptor sFv. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. № 43. P. 26739-26745.

163. Newton D.L., Xue Y., Olson K.A., Fett J.W., Rybak S.M. Angiogenin single-chainimmunofusions. Influence of peptide linkers and spacers between fusions protein domains. // Biochemistry. 1996. V. 35. № 2. P. 545-553.

164. Newton D.L., Pollock D., DiTullio P., Echelard Y., Harvey M., Wilbum В., Williams

165. J., Hoogenboom H.R., Raus J.C., Meade II.M., Rybak S.M. Antitransferrin receptorantibody-RNase fusion protein expressed in the mammary gland of transgenic mice. //J. Immunol. Methods. 1999. V. 23. № 1-2. P. 159-167.

166. Ng T.B., Lam T.L., Au Т.К., Ye X.Y., Wan C.C. Inhibition of humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase, protease and integrase by bovine milk proteins. // Life Sci. 2001. V. 69. № 19. P. 2217-2223.

167. Olson K.A., French T.C., Vallee B.L., Fett J.W. A monoclonal antibody to humanangiogenin suppresses tumor growth in athymic mice. // Cancer Res. 1994. V. 54. № 17. P. 4576-4579.

168. Olson K.A., Fett J.W., French T.C., Key M.E., Vallee B.L. Angiogenin antagonistsprevent tumor growth in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. J^ 2 2. P. 442-446.

169. Olson K.A., Verselis S.J., Fett J.W. Angiogenin is regulated in vivo as an acute phaseprotein. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1998. V. 242. № 3. P. 480-483.

170. Olson K.A., Byers H.R., Key M.E,, Fett J.W. Inhibition of prostate carcinomaestablishment and metastatic growth in mice by an antiangiogenin monoclonal antibody. // Int. J. Cancer. 2002. V. 98. № 6. P. 923-929.

176. Poon R.T., Fan S.T., Wong J. Clinical implications of circulating angiogenic factorsin cancer patients.//J. Clin. Oncol. 2001. V. 19. №4. P. 1207-1225.

177. Rajashckhar G., Loganath A., Roy A.C., Wong Y.C. Expression and localization ofangiogenin in placenta: enhanced levels at term over first trimester villi. // Mol. Reprod.

178. Dev. 2002. V. 62. № 2. P. 159-166.

179. Rajashekhar G., Loganath A., Roy A.C., Wong Y.C. Over-expression and secretion ofangiogenin in intrauterine growth retardation placenta. // Mol. Reprod. Dev. 2003. V. 64. Ко 4. P. 397-404.

180. Reisdorf C , Abergel D., Bontems F., Lallemand J-Y., Decottignies J-P., Spik G.

181. Proton resonanceassigments and secondary structure of bovine angiogenin. // Eur. J.

182. Biochem. 1994. V. 224. № 3. P. 811-823.

183. Reuvckamp A., Velsing-Aarts F.V., Poulina I.E., Capello J.J., Duits A.J. Selectivedeficit of angiogenic growth factors characterises pregnancies complicated by preeclampsia. // Br. J. Obstet. Gynecol. 1999. V. 106. № 10. P. 1019-1022.

184. Riordan J.F., D'Allessio G. Ribonucleases: structure and functions. // Academic

186. Riordan J.F., Shapiro R. Isolation and enzymatic activity of angiogenin. // Metods

187. Mol. Biol. 2001. V. 160. P. 375-385.

188. Rybak S.M., Fett J.W., Yao Q.Z., Vallee B.L. Angiogenin mRNA human tumor andnormal cells. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 1987. V. 146. № 3. P. 1240-1248.

189. Rybak S.M., Vallee B.L. Base cleavage specificity of angiogenin with

190. Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli 5S RNAs. // Biochemistry. 1988. V.27. P. 2288-2294.

191. Rybak S.M., Hoogenboom H.R., Meade H.M., Raus J.C, Schwartz D., Youle R.J.

192. Humanization of immunotoxins chimeric antibody (ribonuclease/angiogenin). // Proc.

193. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 8. P. 3165-3169.

194. Saxena S.K., Rybak S.M., Davey R.T., Youle R.J., Ackerman E.J. Angiogenin is acytotoxic tRNA-specific ribonuclease in the RNase A superfamily. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 30. P. 21982-21986.

195. Shaarawy M., Al-Sokkary F., Sheba M., Wahba O., Kandil H.O., Abdel-Mohsen L

196. Angiogenin and vascular endothelial growth factor in pregnancies complicated bypreeclampsia. // Int. J. Gynaecol. Obstet. 2005. V. 88. № 2. P. 112-117.

197. Shapiro R., Riordan J.F., Vallee B.L. Characteristic ribonucleolytic activity of humanangiogenin. // Biochemistry. 1986. V. 25. № 12. P. 3527-3532.

198. Shapiro R., Strydom D.J., Olson K.A., Vallee B.L. Isolation of angiogenin fromnormal human plasma. //Biochemistry. 1987. V. 26. № 16. P. 5141-5146.

199. Shapiro R., Vallee B.L. The PRI is the inhibitor of ribonuclease from human placentalcells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. № 8. P. 2238-2241.

200. Shapiro R., Vallee B.L. Site-directed mutagenesis of histidine-13 and histidine-114 ofhuman angiogenin. Alanin derivates inhibit angiogenin - induced angiogenesis. //

201. Biochemistry. 1989. V. 25. № 15. P. 3527-3532.

202. Sheen-Chen S.M., Eng H.L., Chen W.J., Chou F.F., Chen H.S. Serum level ofangiogenin in breast cancer. // Anticancer Res. 2000. V. 20. № 6C. P. 4769-4771.

203. Shimazaki K. Lactoferrin: a marvelous protein in milk. // Anim. Sci. J. 2000. V. 71.№ 4. P. 329-347.

204. Soncin F. Angiogenin suppots endothelial and fibroblast cell adhesion. // Proc. Natl.

205. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 6. P. 2232-2236.

206. Soncin F., Shapiro R., Fett J.W. A cell-surface proteoglycan mediates humanadenocarcinoma HT-29 cell adhesion to human angiogenin. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. №12. P. 8999-9005.

207. Soncin F., Guitton J.-D., Cartwright Т., Badct J. Interaction of human angiogenin withcopper modulates angiogenin binding to endothelial cells. // Bioch. Bioph. Res.

208. Commun. 1997. V. 236. № 3. P. 604-610.

209. St. Clair D.K., Rybak S.M., Riordan J.F., Vallee B.L. Angiogenin abolishes cell-freeprotein syntesis by specific ribonucleolytic inactivation of ribosomes. // Proc. Natl.

210. Acad. Sci USA. 1987. V. 84. № 13. P. 8330-8334.

211. St. Clair D.K., Rybak S.M., Riordan J.F., Vallee B.L. Angiogenin abolishes cell-freeprotein synthesis by specific ribonucleolytic inactivation of 40S ribosomes. //

212. Biochemistry. 1988. V. 27. № 19. P. 7263-7268.

213. Steff A.M., Gagne D., Page M., Rioux A., Hugo P., Gosselin D. Serumconcentrations of insulin-like growth factor-1, soluble tumor necrosis factor receptor1 and angiogenin in endometriosis patients. // Am. J. Reprod. Immunol. 2004. V. 51. №2. P. 166-173.

214. Strydom D.J., Bond M.D., Vallee B.L. An angiogenic protein from bovine serum andmilk, purification and primary structure of angiogenin-2. // Eur. J. Biochem. 1997. V. 247. № 2. P. 535-544.

215. Strydom D.J. The angiogenins. // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V. 54. № 8. P. 811-824.

216. Suzumori N., Zhao X.X., Suzumori K, Elevated angiogenin levels in the peritonealfluid of women with endometriosis correlate with the extent of the disorder. // Fertil.

217. Steril. 2004. V. 82. № 1. P. 93-96.

218. Tschesche H., Kopp C, Horl W.H., I lempelmann U. Inhibition of degranulation ofро1утофЬопис1еаг leukocytes by angiogenin and its tryptic fragment. // J. Biol.

219. Chem. 1994. V. 269. № 48. P. 30274-30280.

220. Tsuji Т., Sun Y., Kishimoto K., Olson K.A., Liu S., Hirukawa S., Hu G.F.

221. Angiogenin is translocated to the nucleus of HeLa cells and is involved in ribosomal

222. RNA transcription and cell proliferation. // Cancer Res. 2005. V. 65. № 4. P. 13521360.

223. United States Pat. 1997. № 5698185.

224. Vallee B.L., Riordan J.F., Lobb R.R., Higachi N., Fett J.W., Grossley G., Buhler R.,

225. Budzik G., Breddom K., Bethune J.L., Alderman E.M. Tumor derived angiogenesisfactor from rat Walker 256 carcinoma: an experimental investigation and review. //

226. Experientia. 1985. V. 41. № 1. P. 1-15.

227. Vallee B.L., Riordan J.F. Organogenesis and angiogenin. // Cell. Moll. Life Sci.1997. V. 53, №8. P. 803-815.

228. Vasandani V.M., Wu Y.-N., Mikulski S.M., Youle R.J., Sung C. Moleculardeterminants in the plasma clearance and tissue distribution of ribonucleases of the ribonuclease A superfamily. // Cancer Res. 1996. V. 56. P. 4180-4186.

229. Verselis S.J., Olson K.A., Fett J.W. Regulation of angiogenin expression human Hep02 hepatoma cells by mediators of the acute-phase response. // Biochem. and

230. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 259. № 1. P. 178-184.

231. Waldman T.A., Strober W., Blaese B.M. Immunoglobulins (Merler E., ed.),

233. Wang H., Ye X., Ng T.B. First demonstration of an inhibitory activity of milkproteins against human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase and yhe effect of succinylation. // Life Sci. 2000. V. 67. № 22. P. 2745-2752.

234. Webb K.E. Intestinal absoфtion of protein hydrolysis products: A review. // J. Anim.

236. Weiner H.L., Weiner L.H., Swain J.L. Tissue distribution and developmentalexpression of the messenger RNA encoding angiogenin. // Science. 1987. V.237. № 4812. P. 280-282.

237. Wong C.W., Seow H.F., Husband A.J., Regester G.O., Watson D.L. Effects ofpurified bovine whey factors on cellular immune functions in ruminants. // Veterinary 1.munology and Immunopathology. 1997. V. 56. P. 85-96.

238. Xu Z., Monti D.M., Hu G. Angiogenin activates human umbilical artery smooth musclecells. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 2001. V. 285. № 4. P. 909-914.

239. Xu Z.P., Tsuji Т., Riordan J.F., Hu G.F. The nuclear function of angiogenin inendothelial cells is related to rRNA production. // Bioch. Bioph. Res. Commun. 2002. 1. V. 294. № 2. P. 287-292.

240. Ye X.Y., Cheng K.J., Ng T.B. Isolation and characterization of angiogenin-1 and anovel protein designated lactogenin from bovine milk. // Bioch. Bioph. Res.

241. Commun. 1999. V. 263. № 1. P. 187-191.

242. Zhang Y., Li W., Su Z. Trends in the pharmaceutical research of ribonucleases andtheir therapeutic uses. // Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2001. V. 18. № 3. P. 456-460.

243. Zydney A.L. Protein separations using membrana filtration: new opportunities forwhey fractionation. // Inter. Dairy J. 1998. V. 8. № 3. P. 243-250.