Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ рибонуклеазы А и родственных белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ рибонуклеазы А и родственных белков"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

2 9 АПР ЮНО На правах рукописи

КОЛБАНОВСКАЯ Елена Юльевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РИБОНУКЛЕАЗЫ А И РОДСТВЕННЫХ БЕЛКОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории стереохимии ферментативных реакций Института молекулярной биологии им. ВА Энгепьгардта РАН.

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук М.Я. КАРПЕЙСКИЙ

Официальные оппоненты: -

доктор химических наук А.Г. ГАБИБОВ доктор химических наук В.О.ПОПОВ

Ведущая организация: Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН

Защита состоится "_21?" У1/^ 1996 года в № час. на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

1 -Автореферат разослан ■IV 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди наиболее интенсивно исследуемых проблем моле-улярной биологии важное место отводится изучению связи между аминокислотной оследовательностью белка, его трехмерной структурой и свойствами. Ценная информация может быть получена при структурно-функциональном анализе природ-ых семейств гомологичных белков. Установление закономерностей пространствен-ой организации таких белков, которые отличаются - иногда значительно - по ами-окислотной последовательности, позволяет выявить структурную и функционально значимость аминокислотных замен. Кроме того, такой анализ позволяет рас-матривать одновременно большое число белков, принадлежащих к гомологичному емейству на основе данных о пространственной структуре базового белка. В связи этим очевидную актуальность приобретает разработка новых подходов к структур-о-функциональному анализу гомологичных семейств. Такие подходы дают возмож-ость более полно использовать информацию, содержащуюся в трехмерной струк-уре балка. "

Цель работы. Разработка нового подхода к структурно-функциональному нализу семейства гомологичных белков, базирующегося на анализе простран-гвенной структуры белка и позволяющего качественно предсказывать влияние минокислотных замен на пространственную структуру и свойства базового белка.

Научная новизна работы. На примере суперсемейства рибонуклеазы А раз-аботан новый подход к структурно-функциональному анализу семейстз гомологич-э!х белков, основанный на изучении нековалентных взаимодействий между боко-э!ми группами аминокислотных остатков базового белка с известной простран-гвекной структурой и последующим анализом консервативности этих взаимодей-"вий в родственных белках Показано, что в белковой молекуле имеются плотные 1ра, состоящие из неполярных атомов боковых групп, которые определяют взаим-по пространственную ориентацию элементов вторичной структуры и расположение ;татков активного центра. Существенное значение этих вдер для поддержания юстранственной структуры белка подтверждено их консервативностью в белках персеыейства рибонуклеазы А. На основании полученных данных было предска-!н0, что: 1) консервативность ядер будет определять способ укладки полипептид->й цепи, характерный для данного семейства и 2) отличия в структуре и бнологиче-этх свойствах между белками гомологичного семейства будут определяться соста-

вам, расположение« и конформацией экспонированных петель. Сделанные предсказания были подтверждены структурно-функциональным анализом снхоназы Р-30 - белка, принадлежащего к суперсемейству рибонуклеазы А.

Практическая значимость. Предложенный метод позволяет проводить изучение неполярной области в белках с последующим использованием полученных данных для анализа гомологичных белков, пространственная структура которых неизвестна. Установленные закономерности пространственной организации белков суперсемейства рибонуклеазы А служат теоретической базой дизайна и конструирования биологически активных белков и ферментов, имеющих перспективу использования в медицине в качества антипирусных и противораковых средств.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на ме;здународном симпозиуме "Современная энзимология: проблемы и перспективы" (С.-Петербург, Кижи, 1002), на конкурсе научных работ ИМБ РАН'(1992) - вторая премия, на Третьем международном симпозиуме "Рибонуклеазы: химия, биология и биотехнология" (Капри, Италия 1993), в лекции на факультете биохимии Университета г. Гронингена (Нидерланды, 1395).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из четырех разделов: введение, литературный обзор, методические подходы, результаты и обсуждение, а также выводов и списка литературы, содержащего ссылок. Она изложена на страницах и содержит ^ртаблиц и *2£\ РисУнка-

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.ВВЕДЕНИЕ. Обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи и сформулированы цели работы.

2. РАЗДЕЛ. С одержит данные литературного обзора.

2.1. Приведены и систематизированы литературные данные об .общих свойствах и первичных структурах белков, составляющих супзрсемейство рибонук-леазы А. Рибонуклеазы суперсемейства определяются как ферменты, которые расщепляют РНК с образованием З'-фосфомоно- или олигонуклеотидов, оканчи; вающихся на -Ср или-11р. Промежуточными продуктами этого расщепления являются соответствующие 2',3-циклофосфаты {1]. Далее приводится характеристика аминокислотных последовательностей для панкреатических р'лбонукпеаз млекопи-

тающих (семейство С1) и, отдельно, для ряда рибонуклеаз из других органов и тканей позвоночных, а также для белков, обладающих (наряду с рибонуклеазной) специфической биологической активностью (семейство С2). К таким белкам относятся анг.тогенины, некоторые нейротоксины н пектины, онконаза Р-30. Уровень рибонуклеазной активности балков семейства С2 значительно ниже, чем у рибонуклеазы А. Эта активность необходима, но недостаточна для специфической биологической активности указанных белков, механизм которой в настоящее время окончательно не установлен. Суммируя данные по первичным структурам белков суперсемейства РНКазы А (табл. 1), следует отметить, что они содержат 17 инвариантных остатков аминокислот и ряд консервативных позиций, в основном занимаемых гидрофобными аминокислотами [2].

2.2. Далее приведены литературные данные об исследованиях структуры рибонуклеазы А и других белкоз суперсемейства методом рентгеноструетурного анализа (РСА). Структура рибонуклеазы А была получена с высоким разрешением как для фаркента в нативной форме, так и в комплексах с ингибиторами [3-5]. При структурно-функциональном анализе рибонуклеазы А были использованы атомные координаты, полученные с разрешением 1,25 А в работе Влодавера [4].

Результаты исследования структур ангиогенина человека (ИАпд) и бычьего ангиогенина (ЬАпд) были опубликованы соответственно с разрешением 2,4 А и 1,5 А в 1994-95 г.г. [6,7], а структура онконазы Р-30 определена методом РСА с разрешением 1,7 А в 1994 г. [8]. Пространственный ход полипептидной цепи бычьего ангиогенина (ЬАпд), анпюгеника человека .(ИАпд) и онконазы принципиально совпадает с ходом цепл РНКазы А. Молекулы указанных белков имеют значительное сходство в числе и расположении таких элементов вторичной структуры, как спиральные участки (три участка) и антипараллельные р-слои. Три дисульфидных мостика из четырех, содержащихся в молекуле РНКазы А, присутствуют также в структурах Апд и Р-30. Дисульфидный мостик в РНКазе А (65-72), поддерживающий структуру экспонированной петли на данном участке полипептидной цепи, отсутствует как в ангио-генинах, так и в онконазе. В онконазе Р-30 имеется четвертый дисульфидный мостик (87-104), характерный для рибонуклеаз амфибий в суперсемействе РНКазы А.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности белков семейства С2. Нумерация последовательностей приведена по РНКазе А [2].

(г Название белка

9

10 11 12

13

14

15

16

17

18

ПАНКРЕАТИЧЕСКАЯ РНКаза БЫКА (А)

ПАНКРЕАТИЧЕСКАЯ РНКаза ЧЕРЕПАХИ

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ АНГИОГЕНИН

БЫЧИЙ АНГИОГЕНИН

АНГИОГЕНИН ИЗ ШЕЗ

АНГИОГЕНИН ИЗ КРОЛИКА

АНГИОГЕНИН ИЗ СВИНЬИ

РНКаза БЫЧЬЕГО МОЗГА

РНКаза К ПОЧЕК БЫКА

РНКаза U МОЧИ ЧЕЛОВЕКА*EDN

РНКаза BL ПЕЧЕНИ БЫКА (мелочная)

РНКаза PL ПЕЧЕНИ СВИНЬИ (щелочная!

РНКаза ПЕЧЕНИ ЛЯГУ2ХИ (Catesbeiana)

ЯЕКТИН ЯИЦ ЛЯГУИКИ (Catesbeiana)

ЛЕКТИН ЯКЦ ЛЯГУШКИ (Japónica)

КАТИОННЫЙ ЗЕЛОК Э03ИН0ФИПА ЕСР

QHK0HA3A Р-30'

KSFK

1 2

12345678901234567890123 * * * *

KETAAAKFEKQHMDSSTSAASSS -ETRYEKFLROHVDYPKSSAPDS QDNSRYTHFLTQHYDAKPQGrt-DD AQDDYRYIHFLTQHYDAKPKGR-ND <QD0SRYTKFLTOHHDAKPKGR-DD <QDDSRYKHFLTQHYDAKPFGR-ND KDEDRYTHFLTOHYDAKPKGR-DG KESAAAKFRRQtfMDSGSSSSSNP

VPKGLTKARWFEIQHIQPR------L

KPFQFTWAQWFETO'! 1!'HT------S

EDRMYQRFLRQHVDPDETGGNDS EDRMYQRFLRObVDPDATGGNDA

-<b№!AKFKEXI!IRST-----SS

-<ENWATFOQKHIINT-----PI

-<ENWAKFQEKHIPNT-----SN

RP PQFTRAQWFAIQH1 S Ш------p

- - EDWLTFQKKHI -TÍJTR DVD- --VPTYQDFLYKKÍlDFPKTSFPSN

3 4 5 6 7 8

-45678S012345678-90123456789012345678SQ12-34567890--1224S6789012345

* ** ** **** * ** * л

1 -WCNO№1KSRNLTK0-RCKPVNTFVHESLADVOAVC5QKN-VACKNGQT--NCYQSYSTÍ1SITDCR

2 RTYCNQMMORRGKTSP-V'CKFTNTFVHASAASITTVCGSGG-TPASGD-----LRDSNASFALTTCR

3 -RYCESIMRRRGLTSP--CKDXNTFIHGNKRSIKAICENKN-GNPliRE----NLRISKS3FQVTTCK

4 -EYCFNMMKNRRLTRP--CKDRNTFIHGMKNDIKAICEDRÍ-bGQPYRG----DLRISK3EFQITICK

5 -P.YCERMMKRRSLT3P-- CXDVNTFJHGNKSNIKAICGA-N-GSPYRE----NLRMSKSPFQVTTCK

6 -RYCET№!KRRDLTSP—CKDTNTFVHGNKGSIKDVCEDKN-GKPYGK----HFRISKSSFQVTTCK

7 -RYCESIMÍ.QRGLTRP—CKEVNTFXHGTPJÍDIKAICNDKN-GEEYH-----NFRRSKSPFQITTCK

8 -NYCNQM-TKRRRMTHG-RCKÍVNTFVHESLDIJVKAVCSQKM - ITCKtiGHP—HCYQSKSTMSITDCR

9 -LQCNKAMSG VNNYTQ- HCKPENTFLHNVFQDVTAVCDMPf!-1ICKNGRH - - NCHQS PKPVNLTQCM

10 -QOCTNAMQVINNYQR-BCKNQNTFLLTTFANWNVCGMPN-MTCPSNKTRKNCHHSGSQVPblHCN

11 --YCNLMHORRKMTSH-QCKRFNTFIHEDLWNIRSICSTTN-IQCKNGQM--tlCHE--GVVRVTDCR

12 ■ --YCNUa4QRRKMTSH-YCKRFNTFIHEDIWNXRSICSTSN-IQCKNGQM--HCHE--GWKVrDCR

13 -IDCNTIMDKAIYIVGGKCKERNTFIISSEDMVKAICSGVS-PDRKE--------LSTTSFKLNTCI

14 -INCNTIMDmiYIVGGQCKKVNTFIISSATTVKAICTGVI-líMNV---------LSTTRFQUWCT

15 - INCNTIMDKSIYIVGGQCKERNTFIISSATTVKAICSGASTNRNV---------LSTTRFOLNTCI

16 -PRCTIAHRAIÍWRW-RCWQNTFmTTFANVVNVCGNOS-IRCPromTLNNCHRSRFRVPLLHCD

17 ---CDNXMSTNLF----HCKDKNTFIYSRPEPVKAICK-GI-IASKNVLT------T-SEFYLSDC-

18 AAYCMV¡!MVRRGHTAHGRCKSFNTFVHTDPRNLNTLCIHQP-D-Q-------ALRTTRRHFRXTDCK

9 10 11 12 13 14

678901—2345678901234567890123---------456789012345678901234567890

* * * * * ****

1 ЕТСЗБК—УРЫСАУКТТОАШНИУАСЕС«------—РУУРУНГСАЗУ

2 вдсго—трмсрудаолзтонилаага;-----------ьр\яггокз1

3 ШССЭР—МРРСОУЙАТАСГИНУУУАСЕМО-----------ЬРУНЬ1ХК1ГЕНР

4 НКССЗЗ--КРРСНУСАТЕВЗКУ1\Л«ЗСЕШ-----------ЬР^ОЕЗИТРЕН

5 нтосзр--кррсоуказаш«от1асеш-----------ьрунроезргзь.

6 (М^Р—НРРСКУНАТЗСЗКЫХУХАСЕНС-----------ЬРУНГОЕЭУГООКУН

7 нк5сзн—иррссукатаспшаулсето-----------ьрунгбезрххтзо

8 ЕТСЗЭК—УРМСАУКТ30К0ХУ1ТУАСЕ(М---------РУУРУНГОСАУЬЬРАБРУРЗЬРРРНКЬ

9 ' паз-й—^росйунвмдатпуасорр-октсрр-уньурукеоетр ю ьггрзрон1жсяуАОТРАжтудссткдаорроуру\/1>ун1^11

11 етсзйя—армскукакастиплаасесм---------реурунгок

12 етаззк—армскукамазпдаппасесн---------реурунгок

13 кп31тр-^р-срунрзреяж1сухсек(2-----------ьрунгуо-1скс

14 кт31тр—кр-срузватетмуютсеко-----------урунрао-1(№ср

15 rsatap--rp~cpynsrtetгívlcvkcenr-----------1л>унрас-1скс

16 ЬХЫРСАОШЗГГСКУАВНРСШгГ^АСШКО-РКОЗРНУРУУРУНЬОТТ!

17 —ыутг—рр-скукьккзтахгсутсшо-----------арунрусусэс " '

18 -irs----нртскузсадрмкяукуссйсс-----------бруньсстяр

ЕйН - Нейротоксин эозинофила;

<Е - пироглутаминовая кислота (2-пирролидок-5~карбоновая кислота). В нумерации последовательностей * соответствует номерам инвариантных или консервативных остатков (по сравнению с ЯЧКазой А) .

Было показано сходство структуры основных участков активного центра 3НКазы А, ангиогенинов и онксназы, что определяет наличие у всех белков суперсемейства пиримидинспецифичной рибонуклеазной активности. Расположение ка-•алитических остатков и треонина, определяющего пиримидинспецифичность в рассматриваемых белках, практически идентично.

Пространственная структура участка связывания второго основания (В2) зна-штельно отличается в обоих ангиогенинах и онконазе Р-30 от аналогичной в 'НКазе А, поэтому наблюдающийся для РНКазы А в реакции расщепления МрХ ди-(уклеотидов порядок предпочтения для Х=А>в»С>и [9] не соблюдается для ука-анных белков. Значительные расхождения в структурах наблюдали также за пре-(елами активного центра а области экспонированных петель.

Результаты исследований ангиогенинов и онконазы Р-30 методом РСА пред-стазляют особый интерес, так как предсказания и выводы, полученные в настоящей шботе, были опубликованы до появления данных РСА по этим белкам, которые, в свою очередь, послужили проверкой полученных результатов.

¡.РАЗДЕЛ. Методические подходы и основные.определения,

3.1.-3.2. Для наглядного двухмерного представления и анализа эксперимен-альных данных о трехмерной структуре белка был использован метод контактных :арт [10]. В нашей работе метод был модифицирован и применен для всех неводо-юдных атомов аминокислотных остатков белка.

При составлении контактных карт аминокислотная последовательность исследуемого белка откладывается по вертикальным и горизонтальным осям. Пересе-!ение ¡-ой строки и ]-го столбца выделено квадратиком, если для двух пар атомов соответствующих остатков расстояние между ними г попадает в заданное ограничивающее расстояние. Условие - два контакта - было выбрано, чтобы уменьшить ¡лияние погрешностей з атомных координатах При выборе ограничивающего рас-тояния учитывалось, что в третичной структуре белка нековаленткые взаимодей-■твия между атомами боковых цепей аминокислотных остатков количественно опи-ываются онэртвй таких взаимодействий. Однако, приблизительным критерием для щенки этой энергии к ожег служить число пар атомов или остатков, находящихся в онтакте [11]. Неводородный атом или объединенный атом для неполярных групп

J

СН, СН2, СНз остатка 1 и атом или объединенный атом остатка ) считаются контактирующими, если расстояние г мевду их центрами меньше или равно с! , то есть:

г < сГ = (2 - 2"1,й)([|0 + г°), (1)

где г°- соответствующий Ван-дер-Ваальсов радиус. Для выбора максимального ограничивающего расстояния г следует принимать во внимание известные значения

Ван-дер-Вазльсовых радиусов и точность определения координат атомов пои мато-

%

де РСА. В качестве г было использовано значение 5.2 А. Для плотных контактов в большинстве расчетов использовали наиболее харзэтерное значение г, равное 4,5 А [12].

На рис.1 предстазг.она составленная по указанным выше критериям карта не-ковалентных контаетоз с молекуле РНКазы А. Видны злеыонты вторичной структуры: спиральные участки выглядят как утолщенные вытянутые области, параллельные главной диагонали, идущие вплотную к ней. Антипэрэллельные (3-слои - вытянутые области, расположенные перпендикулярно глазной диагонали, на некотором расстоянии от нее. Из рис. 1 видно, что неполярные контакты в молекуле белка сосредоточены, в основном, в р-слоях и контактных доменах, не принадлежащих к регулярным элементам структуры.

3.3. Анализ неполярного окружения остатков по контактной карте позволил разработать количественные критерии определения неполярной области в молекуле белка. В литературе обосновывается доминирующий вклад неполярных взаимодействий в процесс образования и поддержания стабильности пространственной структуры белка [13,14]. Используемый обычно подход для отнесения аминокислотных остатков к гидрофобному ядру, основанный на расчетах площади доступной воде поверхности боковых цепей остатков [15], недостаточен для изучения состава, топологии и свойств неполярных областей в белках. Поиск гидрофобного ядра осуществляется путем анализа расстояний между всеми парами контактирующих между собой неполярных групп СН, СНг, СН3 и Б аминокислотных остатков белковой молекулы на основе следующих определений [12):

1) Гидрофобное семейство остатка. Ряд остатков, выбранных на основе условия, что каждый из них имеет по крайней мере два неполярных контакта с данным остатком при выбранном ограничивающем расстоянии (условие гидрофобного соседа).

Рисунок 1. Карта нековалентных контактов в рибонуклеазе А при ограничивающем расстоянии 4.5 А (по данным РСА [4]). Контактные пары отмечены квадратиком. Черные квадратики - контактные пары, имеющие неполярные контакты атомов боковых цепей остатков ( и Белые квадратики - контактные пары, не имеющие неполярных контактов.

2) Библиотека гидрофобных семейств. Список всех гидрофобных семейств остатков в соответствии с аминокислотной последовательностью белка.

3) Непалярная область бэлкозой глобулы. Часть белковой глобулы, состоящая из остатков, входящих в библиотеку гидрофобных семейств.

4) Гидрофобный кластер. Часть негголярнсй области, в которой каждый остаток имеет по крайней мера двух неполярных соседей при расстоянии 5.2 А.

5) Гидрофобное ядро. Наиболее компактная часть неполярной области в структура белка, состоящая из аминокислотных остатков, имеющих не менее двух

неполярных соседей при ограничивающем расстоянии 4.5 Л при атом по крайней мере три из этих остатков контактируют друг с другом, образуя взаимодействующий треугольник. Аминокислотные остатки, имеющие одного неполярного ссседа в составе гидрофобного ядра, считаются ассоциированными с ядром.

6) Гидрофобный микрокластер. Группа аминокислотных остатков из неполярной области белка, не попадающих в ядро, в которой каждый остаток имеет по крайней мерс одного непопярного соседа при ограничивающем расстоянии 4.5 А. Остатки не образуют взаимодействующего треугольника.

По данным контактных" Карт и согласно приведенным выше определениям составляется полная граф-схема неполярных контактов »лежду аминокислотными остатками белка. Визуальное рассмотрение такой схемы позволяет в соответствии с определениями 5 и 6 сделать заключение о составе гидрофобных ядер и микрокластеров рассматриваемого белка.

Определение аминокислотного состава гидрофобных ядер позволило ввести для их характеристики и сравнения некоторые количественные параметры, в частности среднюю плотность контактов для атомоз боковых цепей. Средняя плотность контактов атомов боковых цепей (О) остатков белка, входящих в рассматриваемую группу при ограничивающем расстоянии 4,5 А, вычисляют по формуле:

0 = —-, (2)

п

где, Ск- нормализованная сумма контактов между атомами боковой цели к-ого остатка (к - номер остатка по аминокислотной последовательности белка) и всеми атомами других остатков, и п - число остатков в рассматриваемой группе контактирующих остатков.

¿(Ли)

где N - число остатков в аминокислотной последовательности белка; ГЮНМ(ТУРЕ(Н|))- среднее максимальное значение числа контактов атомов боковых цепей для данного тела I аминокислотного остатка при ограничивающем расстоянии 4,5 А [16]. Ач- число атомов основной и боковой цепи остатка], которые находятся в пределах 4,5 А от атомов боковой цепи остатка к. Аналогично определяется сред-

«я плотность неполярных контактов (Опр). В этом случае в расчет берутся только «полярные контакты остатка к для объединенных атомов.

^-РАЗДЕЛ. Результаты н обсуждение.

4.1.Анализ неполярной области в молекуле рибонуклеазы А На основе раз-эаботанных методических подходов была составлена полная библиотека гидрофобных семейств в молекуле РНКазы А и построена граф-схема неполярных контактов между аминокислотными остатками белка, при ограничивающем расстоянии 4,5 А.

Рисунок 2. Граф-схема сети неполярных контактов в рибонуклеазе А при ограничивающем расстоянии 4.5 А. Черные кружки - консервативные или инвариантные остатки в семействе С1.' Квадратики - консервативные или инвариантные остатки в семействе С2. Звездочками "отмечены остатки активного центра.

В молекуле РНКазы А было идентифицировано три гидрофобных ядра и пять микрокластеров. Их состав приведен в табл. 2.

Таблица 2. Гидрофобные ядра (у) и микрокластеры (тс) в молекуле РНКазы А. (минимальное число контактов между остатками (К)=2; минимальное число неполярных соседей - 2)._

у1 Р8; 011*; Н12; М13; Т45; У47; Е49; 151; У54; <355; У57; С53; У73; М73; 181; А102; К104; 1106; У108; С110; У115; Р117; Р120 (Е9; N62; в75; V116; Б123)#

у2 К61; У63; С65; С72; 074; У76; 1107 (ОЗО; 069; 0121; А122; У124)

уз А20; У25; С26; М29; МЗО; ЯЗЗ*; 1.35*; К41; Р4С Т82; С84; УЭ7 (т 0; Р42; N44; Н48; Е86; Т99)

тс1 А4; Е111; У118

тс2 Т36; С40; У92; Р93; С95

тсЗ У43; №5

тс4 Т78; Н105

тс5 А109; Н119

# - остатки, ассоциированные с ядром, приведены в скобках;

* - остатки, образующие перемычку между у1 и уЗ,

Как видно из рис. 2 и табл. 2, неполярная область даже в таком небольшом по размеру белке, как РНКаза А, не является единым целым, а состоит из нескольких обособленных ядер, которые могут быть связаны между собой перемычками. Эти ядра содержат в своем составе, помимо классических гидрофобных аминокислотных остатков, обладающих наиболее разветвленной сетью неполярных контактов, также полярные и заряженные аминокислотные остатки.

Гидрофобные ядра РНКазы А различаются по форме, числу "треугольников", составу, количеству внутриядерных контактов и по числу ассоциированных остатков. Количественные характеристик этих ядер приведены в табл. 3.

Была вычислена средняя плотность контактов для атомов боковых цепе? аминокислотных остатков ядер и, для сравнения, всех остальных остатков в'РНКазе А при ограничивающее,) расстоянии 4,5 А (табл. 4).

Таблица 3. Количественные характеристики гидрофобных ядер в рибокуклеазе А и знконазе Р-30. - ______

71 71 72 уз 72

РНКаза А Р-30 РНКаза А РНКаза А Р-30

М(е.р.) 98 131 16 56 85 Число контактирующих пар атомов (СН. СН2, СН3 и в);

N(1) 81 77 23 45 53 Общее число неполярно контактирующих атомов;

ЩсЩ 2.42 3.4 1.39 2.49 3.21 Среднее число контактов на контактирующий атом;

Щс/гев.) . -8.52 11.3 4.57 9.33 10.63 Среднее число контактов на остаток;

Щп) 2.6 3.2 2.0 2.5 3.0 Среднее число соседей на остаток;

Т/пис 0.13 0.5 0.14 0.25 0.69 Среднее число "треугольников" на остаток;

(А.г.)Ж 0.23 0.3 0.71 0.50 й 13 Среднее число ассоциированных остатков на остаток;

<В> . 12.0 11.9 16.5 11.6 12.6 Среднее значение температурного фактора-для (СН, СНг, СНз и 5)-атомоо боковых цепей (А).

Таблица 4. Средняя плотность контактов для атомов боковых цепей аминокислотных остатков РНКазы А при ограничивающем расстоянии 4.5 А_

Группа остатков 0 Опр

у1(п = 23) 0.93 0.28

у2(п = 7) 0.83 0.21

уЗ (п = 12) 1.02 0.31

1п (п = 23) 0.88 0.10

Уп (п = 56) 0.47 0.03

у1, у2, уЗ - группы остатков, принадлежащих соответствующим гидрофобным ядрам в РНКаза А; ¡п - группа остатков, инвариантных в семействе панкреатических рибо-нуклеаз млекопитающих (за исключением остатков гидрофобных ядер); Уп - группа остатков, не входящих в у1, у2, уЗ и 1п; п - число остатков, составляющих данную группу.

Данные табл. 3 и 4 показывают, что остатки ядер образуют многочисленные некозалентные контакты с окружением, и это определяет их функциональную и структурную значимость. Расположение гидрофобных ядер в трехмерной структуре рибонуклеазы А представлено на рис. 3

А

В

Рисунок 3. Взаимная ориентация гидрофобных ядер и элементов вторичной структуры в рибонуклеазе А. Атомы каждой неполярной группы в аминокислотных остатках ядер представлены Ван-дер-Ваальсовыми сферами. А - у1; В - у?.; С - уЗ.

Наиболее компактную часть основного гидрофобного ядра у1 составляют остатки первой a-спирали, неяолярно контактирующие с остатками третьей а-спл-рали, и их взаимная ориентация стабилизируется контактами с Туг 73, Met 79, Не 106 и Val 108, принадлежащими основным [i-слоям, а также с Phe 120 и Val 47, входящими в два других более коротких ¡3-слоя. Второе гидрофобное ядро у2, в котором центральным остатком яоляется Не 107, относительно мало, менее компактно, более подвижно (<В> из табл. 3). Остатки этого ядра составляют центральную часть полипептидной цепи РНКазы А, расположенную близко к поверхности белковой глобулы. Остатки второй a-спирали участвуют в неполярных контактах с Туг 97 и Phe 46, образуя третье ядро уЗ. Была показана функциональная значимость гидрофобных ядер для стабилизации конформации активного центра рибонуклеазы А. Активный центр формируется из аминокислотных остатков, принадлежащих к разным участкам полипептидной цепи фермента и образующих разветвленную сеть некова-лентных контактов, причем часть из них приходится на остатки гидрофобных ядер у1 и уЗ (рис. 2), что является необходимым условием для фиксации "каталитически

продуктивной" конформацим аетизного центра. Таюш образом, каждое гидрофобное ядро фиксирует взаимное расположение нескольких элементов вторичной структуры, ограничивает подвижность функционально значимых нерегулярных участков полипептидной цепи и в значительной степени стабилизирует конформацию белковой глобулы.

4.2.-4.3. Полученные для рнбонухлеазы А данные о составе, пространственное расположении и фу! ¡азональной значимости гидрофобных дцер бьти проанализированы в контексте, как семейства панкреатических рибонуклеаз млекопитающих, тах и остальных белков суперсемейства РНКазы А. Основным постулатом данной части работы явилось предположение об идентичности фолдинга попипеп-тидной цепи для белков, входящих в суперсемейство рибснуклеазы А.

Аминокислотные последовательности панкреатических рибснуклеаз имеют . гомологам с последовательностью РНКазы А выше 70%. Это дает основание утверждать, что особенности распределения и характера нековалентных контактов, установленные для трехмерной структуры рибонуклеазы А, будут с необходимостью сохраняться в структурах этих близкородственных ферментов [17]. Сравнение вариабельности остатков, составляющих ядра, с другими сстатка?ли (кроме остатков активного центра, практически идентичных в семействе С1) показало, что ядра у1 и уЗ являются наиболее консерьатинной областью в молекулах панкреатических рибо-нуклеаз млекопитающих (рис. 2). Замены остатков в гидрофобном ядре -/2 также в основном носят консервативный характер.

, На рис.4 представлена зависимость .между средней плотностью контактов для атомов боковых цепей остатков в рибонуклеазо А и числом различных типов аминокислотных остатков, встречающихся в данном месте последовательностей панкреатических рибонуклеаз. -

Полученные результаты позволяют однозначно утзерждать, что остатки, образующие разветвленную цепь нековалентных контактов в трехмерной структуре рибонукпеазы А (подобно остаткам гидрофобных ядер и активного центрз), являются наиболее консервативными в семействе гомологичных белкоз.

Статистическая доступность <Е%> для аминокислотных остатков в молекуле РНКазы А также коррелирует с числом замен, которые были обнаружены для каждого остатка в аминокислотных последовательностях панкреатических рибонуклеаз.

0,8 -

0,6 -

1 2 3 4 5 6

Рисунок 4. Корреляция между средней плотностью контактов для атомов боковых цепей аминокислотных остатков в РНКазе А и числом замен, встречающихся в аминокислотных последовательностях семейства С1. N - число аминокислот, обнаруженных в рассматриваемой позиции последовательности РНКазы А. О - среднее значение плотности контактов для остатков с данным N.

Е(%)

БО ■

70 -60 50 40 30 -20 -10 О

. • а

5 6 7

9 10

N

Рисунок 5. Корреляция между статистической доступностью аминокислотных остатков в РНКазе А и числом замен, встречающихся в аминокислотных последовательностях семейства С1. N - число аминокислот, обнаруженных в рассматриваемой позиции последовательности РНКазы А. Е - среднее значэк;<е статистической доступности для остатков с данным N.

1

Усредненное значение <Е> возрастает, начиная с наименьшего значения для инвариантных остатков (М = 1) и достигая примерно постоянного уровня для вариабельных остатков (Ы > 4). Наиболее вариабельные позиции расположены о петлях, где среднее значение <Е> составляет 59%. Для погруженных боковых цепей остатков ядер у1 и уЗ в РНКазе А (<Е> не более 5-7%, в ядре у2 нет таких остатков) было также рассчитано изменение объема боковых цепей при заменах этих остатков в последовательностях семейства С1. Для остатков ядра у1 это изменение составило п среднем 9.0 А3-, а для остатков ядра уЗ - 2.2 А3, что удовлетворяет требованиям для сохранения структуры и функции белка [18]. Таким образом, можно полагать, что постулат идентичного фодцинга будет выполняться в случае панкреатических рибонуклепз млекопитающих.

Для остальных белкоз суперсемейства РНКазы А (семейство С2) рассчитанный процент гомологии значительно варьируется и составляет величину ниже 50%, что не позволяет с достоверностью утверждать, что фолдинг этих белков и РНКазы А будет полностью идентичным. Из 27 инвариантных и консервативных остатков з последовательностях изучаемых белкоз на остатки гидрофобных ядер у1 и уЗ приходится около 80%. Из рис. 2 видно, что контактная сетка ядер у1 и уЗ в РНКазе А сохраняется для всего семайстза С2, в перЕую очередь для тех остатков, которые являются наиболее погруженными с белковую глобулу. Рассчитанные для белков семейства С2 средние изменения объема боковых цепей остатков ядра у1 (53,8 А3) и ядра уЗ>(19,4 А3) удовлетворяют требованиям для сохранения структуры и функции белка. Однако, следует отметить, что ряд белков (лектмны, ангиогенины, онко-нзза Р-30) содержит такие замены, которые могли бы приеодйть к некоторым изменениям в структуре в области кластера 1_аи-51 (ядро у1), и кластера Туг-25 (ядро уЗ) (рис. 2).

Небольшое ядро у2 является наиболее вариабельным участком иеполярной области в суперсемействе. В РНКазе А ядро у2 необходимо для поддержания кон-формации экспонированной петли в районе четвертого дисульфидного мостика (6572), которая, в свою очередь, связана с остатками, сходящими в участок связывания уходящей группы при расщеплении РНК (¡32). Было предсказано, что отсутствие соответствующей РНКазе А конформации петли в области гидрофобного ядра у2 в ангиогенине, онконазе, пектинах, РНКазе черепахи должно приводить к изменениям контактов на участке В2, а, следовательно, к изменениям кинетических параметров

рибонуклеазной реакции. Это предсказание было подтверждено экспериментально [19,20].

Был сделан вывод о том, что ядро у2 не вносит решающий вклад в стабилизацию пространственной структуры РНКазы А и не сохраняется в неизменном виде для белков семейства С2.

Ключевую роль в пространственной организации гидрофобных ядер играют классические гидрофобные аминокислотные остатки типа Phe, Leu, Va!, Met, tie, Trp. Эти остатки имеют наиболее "населенные" гидрофобные семейства в библиотеке и являются центральными остатками гидрофобных ядер. Сеть неполярных контактов, образуемых этими базовыми остатками, сохраняется для всех гомологичных белков, что подтверждает значимость гидрофобных ядер для поддержания пространственной структуры. Можно предсказать, что наличие гидрофобных остатков в установленных ключевых позициях (рис. 2, см. инвариантные и консервативные остатки в семействе С2) аминокислотной последовательности белка будет определять способ укладки его полипептидной цепи, характеризующий данное семейство. Состав и структура экспонированных петель, а также взаимная ориентация некоторых элементов вторичной структуры будут различаться для белков, значительно отстоящих по эволюционной лестнице. Эти изменения определяются неконсервативностью остатков, расположенных на периферии гидрофобных ядер и в,локальных микро- , кластерах, поддерживающих конформацию петель. Следствием этого может являться изменение основной активности белков рассматриваемого семейства и появление новых биологических свойств, ассоциированных с экспонированными участками в структуре.

4.4. Анализ неполярной области в молекуле онконазы P-3G. На основе описанных выше методических подходов проведен анализ неполярного окружения остатков в молекуле онконазы Р-30 [8]. Это позволило впервыз получить экперимен-тапьные доказательства сделанных нами ранее предположений о .составе и роли ядер в пространственной организации белков рассматриваемого суперсемейства.

Для выявления и анализа закономерностей построения трехмерной структуры онконазы Р-30 была составлена контактная дистанционная карта и проведено ее сопоставление с контактной картой для РНКазы А, которое дало возможность выявить участки различия во вторичной структуре. Это в первую очередь область второй спирали, а также участил ß-слоев в РНКазе А 61-63 и 71-75, полностью отсут-

1-7

ствующие в Р-30. Остальные элементы вторичной структуры совпадают достаточно полно.

На основе анализа конгаетной карты была составлена полная библиотека гидрофобных семейств в молекуле онконазы Р-30 и построена граф-схема неполярных контактов между аминокислотными-остатками белка при ограничивающем расстоянии 4,5 А.

Рисунок 6. Граф-схема сети неполярных контактов в онконазе Р-30,при ограничивающем расстоянии 4.5 А. Квадратики - консервативные или инвариантные остатки в семействе С2. Звездочками отмечены остатки активного центра.

В молекуле онконазы идентифицированы два гидрофобных ядра и семь микрокластеров. Их состав приведен в табл. 5.

Как видно из рис. 6 и табл. 5, гидрофобные ядра в онконазе Р-30, так же как и в РНКазе А, включают в себя как классические гидрофобные остатки с наиболее "населенными" семействами, так и заряженные и полярные аминокислоты. Количественные характеристики этих ядер приведены в табл. 3. Атомы боковых цепей

остатков, составляющих ядра в Р-30, образуют большее число контактов между собой, таким образом, среднее число "соседей" и треугольников на остаток превышает соответствующие значения для РНКазы А. Средние значения температурного фактора, характеризующего подвижность атомов в аминокислотных остатках, входящих в гидрофобные ядра, очень близки для обоих белков и сравнимы с таковыми для атомов остатков, входящих в элементы вторичной структуры. Гидрофобные ядра можно рассматривать в качестве структурных элементов построения белка, как относительно жесткие участки белковой глобулы.

Таблица 5. Гидрофобные ядра (у) и ыккрокластеры (тс) в молекуле онкоказы Р-30. (минимальное число контактов между остатками (К}=2; минимальное число непо-1 :ярных соседей - 2)._

У1 1РСА; 3W; 5Т; 6F; 9К*; ЮН; 111; 35Т; 371; 44V; 45К; 471; 48С; 511; 59Т; 63F; 65L; 86F; 88V; SOC; 95Р; 98F; 101V (7Q; 39S; 41Р; 55К; 57V; 94А; 97Н)#

72 12Т; 15R; 17V; 19С; 22I; 23М; 27L"; 28F; 34N; 36F; 38Y; 64Y; 68С; 77Y; 79L; 81К (70V; 83Т)

шс1 87С; 99V; 104С

тс2 40R; 42Е; 43Р . , . . ...

тсЗ 58L; 85К

тс4 89Т; 91Е; 96V

тс5 ЗОС; 75С

тсб 71Т; 78К

шс7 73R; 76К

# - остатки, ассоциированные с ядром, приведены в скобках; , .

* - остатки, образующие мостик между у1 и у2.

Гидрофобное ядро у1 в онконазе составляют остатки первой a-спирали, неполярно контактирующие с остатками третьей а-спирапи и остатками Phe 63, Leu 65, Phe 86, Val 88 и Phe 98, принадлежащими основный ß-слоям. Второе гидрофобное ядро у2 включает в себя остатки второй а-спирали, которые участвуют в неполярных контактах с Туг 77 и Phe 36, также входящими в ß-слоп.

Гидрофобные ядра в онконазе, как и в РНКазе Дестабилизируют структуру участка активного центра. Остатки активного центра б Р-30 образуют сеть неполяр-

ных контактов с остатками гидрофобных ядер (в первую очередь с ядром у1) (рис. G). Основные остатки активного центра двух ферментов имеют одинаковое пространственное расположение. Главное наблюдаемое различие, которое не было предсказано в наших работах, - наличие неполярных контактов между каталитаче-с;мм His 97 и Руг 1. Можно предположить, что эти контакты приводят к фиксации имидазольного кольца His 97 в одной конформзции, в отличие от His 119 в нативнсй РНКазе А, для которого было показано наличие двух конфорияций (А и В) [5]. Это может служить одной из причии уменьшения рибонукпеазной активности у онконазы Р-30 по сравнению с РНКазой А.

Сопоставление состава гидрофобных ядер (табл. 2 и табл. 5), а также наложение соответствующих граф-схем (рис. 2 и рис. 6) для онконазы и РНКазы А полностью подтверждает сделанные предсказания. Два гидрофобных ядра являются консервативной областью в структура белков супзрсемзйства, как по аминокислотному составу, так и по взаимному расположению остатков ядер в пространственной структуре. На рис. 7 представлена прстранственная суперпозиция боковых цепей остаков, составляющих у1 - у1 и у2 - уЗ в онконазе и в РНКазе А соответственно.

А В

Рисунок 7. Пространственная суперпозиция аминокислотных остатков, входящих в гидрофобные ядра рибонуклеазы А (тонкие линии) и онконазы Р-30 (утолщенные линии). А - у1 РНКаза А, у1 Р-30; В - уЗ РНКаза А, у2 Р-30.

Пространственное расположение базовых остатков гидрофобных ядер хорошо совпадает для обоих белков. Локальное, небольшое ядро у2, поддерживающее в

РНКазе А структуру петли на участке В2, как и было предсказано в наших работах, отсутствует в структуре молекулы онконазы. Специфичность онконазы ко второму основанию отличается от таковой для РНКазы А [8]. Остальные участки различий в составе гидрофобных ядер также расположены близко к поверхности молекулы онконазы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. В рамках работы получил дальнейшее развитие разработанный в лабораториях стереохимии ферментативных реакций Института молзкулярной биологии РАН и структуры белков Института кристаллографии РАН метод изучения неполярной области в трехмерной структуре белков, основанный на простых количественных критериях - расстояниях между контактирующими неполярными атомами боковых групп аминокислотных остатков. Экспериментальной базой этого подхода являются данные рентгеноструктурного анализа высокого разрешения.

2. Предложенный метод применен к изучению неполярной области в структурах панкреатической рибонуклеазы А и онконазы Р-30, в которых выделены отдельные гидрофобные ядра и микрокластеры. Показано, что гидрофобные ядра включают в себя боковые цепи не только классических гидрофобных аминокислотных остатков, но и заряженных и полярных остатков. Приведены количественные характеристики выделенных ядер.

3. Установлено, что каждое гидрофобное ядро определяет взаимную пространственную ориентацию нескольких элементов вторичной структуры. Расположение остатков активного центра стабилизируется за счет неполярных контактов с аминокислотными остатками гидрофобных ядер. Гидрофобные ядра можно рассматривать как отдельные элементы структуры балка.

4. Проведен детальный анализ состава и свойств гидрофобных ядер в белках суперсемейства рибонуклеазы А. Показано, что два основных гидрофобных ядра, выделенных в РНКазе А, являются наиболее консервативной частью белковой глобулы. Было предсказано, что наличие гидрофобных остатков в установленных ключевых позициях аминокислотной последовательности белка будет определять способ укладки полипептидной цепи, характерный для данного семейства. Отличия изжду белками гомологичного семейства будут связаны, в первую очередь, с составом и

:труктурсй экспонированных петель, которые будут определять различия в биологических свойствах членов этого семейства.

5. Предложенный подход применен к изучению неполярной области в структуре он-<оназы Р-30. Анализ состава и структуры гидрофобных ядер в онконазе Р-30 подтвердил сделанные ранее предсказания о консервативности ядер в семействах гомологичных белков. Основные отличия в структурах онконазы и РНКазы А сосредоточены в гкспонировзнных участках петель.

3. Установленные закономерности пространственной организации белков суперсемейства р'/бонуклеазы А могут найти применение при планировании экспериментов в области сайт-направленного мутагенеза.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Карпейский М.Я., Колбановская Е.Ю., Борисов В.В. Внутримолекулярные взаимодействия в панкреатических рибонуклеазах. Докл. Акад. Наук СССР, 1990, т. 315, с. 495-499.

2. Koibanovskaya E.Yu., Saihyanarayana В.К., Wlodawer A., Karpeisky M.Ya. Intramolecular interactions in pancreatic ribonucleases. Protein Science, 1992, v. 1, p. 1050-1060. ... . _ ...

3. Колбановская Е.Ю., Морозов Н.Ю., Гаврюшоа C.A., Ильин В.А., Байнтема Дж., Влодасер А., Карпейский М.Я. Структурно-функциональный анализ рибонукпеазы А и родственных белков. Молекулярная биолошя, 1993, т. 27, N6, с. 1315-1334,4. Koibanovskaya E.Yu., Ilyin VA, Karpeisky M.Ya, Beintema J.J., Wlodawer A.

Comparativa analysis of nonpolar regions in cyclizirig ribonucleases. In: Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology. Proceedings of the 3rd International Meeting, Capri, 1993, P9

Цитированная литература:

1. Richards F.M., Wyckoff H.W. In: The Enzymes, the 3-rd Edn., Academic press, New York, 1971, v. IV, p. 647-806

2. Beintema J.J., Schüller С., Irie M., Carsana A. Prog. Biophys. moiec. Bio!., 1983, v. 51, p. 165-192

3. Wlodawer A. In: Biological Macromolecules and Assemblies, Vol. li: Nucleic Acids and Interactive Proteins, (A.McPherson and F.Jurnak, Eds.), John Wiley and Sons, N.Y., 1935, p. 395-439

4. Wlodawer A., Svensson LA., Sjolin L., Giüiland G.L. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 27052717

5. Zegers !., Maes D., Dao-Thi M-H., Poortmans F., Palmer R., Wyns L. Protein Sei.,

1994, v. 3, p.2322-2339

6. Ravi Acharya K., Shapiro R., Alien S.C., Riordan J.F., Vailee B.L. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, v. 91, p. 2915-291S

7. Ravi Acharya K., Shapiro R., Riordan J.F., Vailee B.L. Proc. Mali Acad. Sei. USA,

1995, v. 92, p. 2949-2953

8. Mosimann S.C., Ardelt W„ James M.N.G. J. Mol. Biol., 1994, v. 236, p. 1141-1153

9. Witzel H., Barnard E.A. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1962, v. 7, p. 295-299

10.Rosspian M.G., Liijas A..J. Mol. Biol., 1974, v. 85, p. 177.-101......-

11.Chou K.C., Nemethy G„ Rumsey S., Tuttle R.W., Scheraga H.A. J. Mol. Biol., 1085, v. 186, p. 591-609

12.Karpetsky M.Ya., Ilyin V.A., J. Mol. Biol., 1992, v. 5, p. 629-63S

13.Dill K.A. Biochemistry, 1890, v. .29, p. 7133-7155

14.Houry W.A., Rothwarf D.M., Scheraga H.A. Nature, Structural biology, 1995, v. 2, N6, p. 495-502 '

15.Richards F.M. Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 1S77, v. 6, p. 151-176

16.Heringa J„ Argos P. J. Mol. Biol., 1991, v. 220, p. 151-171

17.Chothia C., Lesk A.M. EMBO J., 1986, v. 5, p. 823-826

18.LimW.A-, Sauer R.T. J. Mol. Biol., 1991, v. 219, p. 355-376

19.Bond M.D., Vailee B.L. Biochemistry, 1990, v. 29, p. 3341-3349 ' ■ •

20.Raines R.T., Toscano M.P., Nierengarten D.M., Hoi Ha J., Auerbach R. J. Biol. Chsm., 1995, v. 270, p. 17180-17184