Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы Streptomyces aureofaciens

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы Streptomyces aureofaciens"

На правах рукописи

Митькевич Владимир Александрович

Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы 8&ерЮтусез аигео/асгет

03 00.03- Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа Инсгитута молекулярной биологии им. В.А Энгельгард1а РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН А А. Макаров

доктор химических наук, профессор Г И. Яковлев

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор В.Г. Туманян доктор химических наук, профессор В П. Варламов

Ведущая организация:

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «_» июня 2005 года в_на заседании диссертационного совета

Д 002.235 01 при Институте молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «_» _2005 года

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

А М. Крицын

2J6 4ZV3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибонуклеазы (РНКазы) являются традиционными объектами исследования молекулярной биологии Биологические функции РНКаз, важнейших ферментов клеточного метаболизма, заключаются в трансформации РНК от первичных 1енных транскриптов до функциональных компонентов трансляционной системы, продукции малых регуляторных РНК и деградации определенных типов РНК В настоящее время большое внимание уделяется функциям РНКаз, связанным с регуляцией экспрессии генов, ростом и дифференцировкой клеток, защитой от патогенов, индукцией аномгоза. Эти белки находяг широкое применение в генной инженерии, биохимии и медицине Кроме того, они являются удобными объектами для изучения механизмов реализации высокой специфичности ферментов. Поэтому изучение молекулярного механизма действия РНКаз является важной задачей не только для энзимологии ферментов нуклеинового обмена, но и для понимания процессов клеточной регуляции.

В последние годы возрос интерес к созданию эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКаз как потенциальных противораковых средств, подавляющих активность ангиогенина, а также как противоаллергических препаратов, ингибирующих активность РНКаз эозинофилов человека Потребность в эффективных ингибиторах РНКаз связана и с необходимостью блокирования аюивности примесных РНКаз при биохимических работах с РНК-содержащими препаратами Понимание молекулярного механизма действия этих ферментов и изучение структуры их активных центров важно для создания эффективных ингибиторов РНКаз

Было обнаружено, что некоторые РНКазы семейства РНКазы Л токсичны для клеток млекопитающих, особенно для опухолевых клеток В ряде случаев они избирательно атакуют злокачественные клетки, запуская апоптозную реакцию, и поэтому могут рассматривался как альтернатива классическим хими01ерапевтическим препаратам Так, РНКаза из ооцитов лягушки Rana ptpiens, онконаза, в настоящее время проходит клинические испытания как препарат для лечения мезочелиомы легких Бактериальные РНКазы составляют важное семейство РНКаз, некоторые представители которою )акже обладают цитотоксическими свойствами Одним из важных факторов цитотоксичности микробных РНКаз по отношению к клеткам млекопитающих является их невосприимчивость к действию цитоплазматического ингибитора РНКаз. присутствующего практически во всех тканях человека и блокирующего кашштическую активность экзогенных РНКаз жив ~т,~~мотряна

большой интерес исследователей к цитотоксичным РПКазам, факторы, определяющие их цитотоксичность, до сих пор недостаточно изучены.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было установление молекулярного механизма действия и определение цитотоксических свойств РНКазы Sa из Streptomyces aureofaciens. В задачи исследования входило 1) определение функциональной роли остатков активного центра РНКазы Sa и их вкладов в каталитическую активность фермента; 2) конструирование эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКазы Sa; 3) изучение влияния замен остатков активного центра РНКазы Sa на конформационную стабильность фермента; 4) исследование цитотоксических свойст в РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с обращенным зарядом, оценка влияния отдельных клеточных компонент на цитотоксические эффекты, проявляемые РНКазами

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые установлена функциональная роль остатков активною центра РНКазы Sa и определены вклады этих останов в каталитические свойства фермента Показано, что определяющий вклад в каталитическую активность РНКазы Sa дают остатки Glu54, Arg65 и His85 Обнаружено, что гуаниловая специфичность РНКазы Sa определяется способностью белка образовывать специфичные водородные связи с атомами Об и N7 гуанинового основания субстрата Определены константы ионизации каталитических групп фермента Показано, что катионизация молекулы РНКазы Sa путем замены отрицательно заряженных аминокислотных ociaiKOB на поверхности молекулы белка положительно заряженными остатками не приводит к существенным изменениям каталитической активности фермента

Предложен новый подход к конструированию ингибиторов РНКаз на основе производных нуклеотидов с М-гидроксимочевиной, связывающих ионы цинка(Н) Показано, что нуклеотидное производное Л^-гидроксимочевины использует ион Zn2+ для увеличения эффективности ингибирования энзиматической активности РНКазы Sa и РНКазы из Bacillus intermedius, бипазы. Данная стратегия может быть использована как для ингибирования РНКаз, так и ферментов других типов

Обнаружено, что аминокислотные остатки активного центра РНКазы Sa, отвечающие за связывание лигандов, не оптимальны для термостабильности белка. Эю показывает, что недавно предложенная гипо1еза о том, что реализация каталитической функции белка сопровождается образованием неоптимальной для ею стабильности

структуры активною центра фермента, относится преимущественно к субстрат-связывающему участку.

Обнаружено, что увеличение положительного заряда молекулы РНКазы Sa повышает се цитотоксичность Показано, что цито токсичный мутант РНКазы Sa, в котором пять остатков дикарбоновых кислот заменены на остатки лизина, проявляет специфичность к фибробластам, экспрессирующим онкоген ras. Установлено, что клетки, экспрессирующие Кс a-каналы, существенно менее чувствительны к цитотоксичным микробным РНКазам по сравнению с клетками, лишенными этих каналов. Результаты, полученные в работе, показывают, что цитотоксичность РНКаз в значительной степени определяется положительным зарядом их молекул. Избирательная токсичность РНКаз по отношению к раковым клеткам является важным параметром их использования в онкотерапии, поэтому конструирование РНКаз с увеличенным положительным зарядом может привести к созданию эффективных терапевтических средств.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международной школе по биофизике "From molecular genetics to structural biology", (Trieste, Италия, 1-12 октября 2001), на пятой, шестой и седьмой международных Энгельгардтовских конференциях по молекулярной биологии (Москва, 21-26 июня 2001; Санкт-Петербург - Москва, 29 июня - 5 июля 2003; Суздаль, 28 ноября - 2 декабря 2004), на шестой международной конференции по рибонуклеазам (Bath, Великобритания, 19 23 июня 2002). на международной конференции "Advances in Molecular Cell Biology" (Москва, 17-18 июня 2004)

Публикации. Основной материал диссертационной работы нашел отражение в 11 печатных работах Из них шесть работ опубликовано в зарубежных журналах, одна в отечественном журнале, одна в сборнике грудов конференции и три в сборниках тезисов докладов научных конференций.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 108 страницах и включает в себя 17 1аблиц и 30 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 160 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Структурно-функциональный анализ активного центра РНКазы З^ерЮтусеч аигео/асЫт (РНКазы Яа)

Роль аминокислотных остатков 01и54, Ал^б5 и Н1зВ5 РНКазы Яа в катализе была постулирована на основании сравнения аминокислотных последовательностей и кристаллических структур ряда гуанил-специфичных микробных РНКаз (Беуык е1 а!., 1990). В соогветствии с данными рентгеноструктурного анализа, во всех комплексах РНКазы 8а с нуклеотидами гуаниновое оспование фиксируется примерно одинаково за счет образования сети водородных связей между гетероатомами основания и пептидными группами остатков С1п38, Авп39 и Аг§40 и боковой цепью остатка 01и41 (рис 1) Остатки 01и54, Аг§65 и Н1з85 локализуются вблизи сахарофосфашого фрагмента нуклеогида Мы ставили своей целью изучить функциональную роль каталитических остатков Кроме того, поскольку для реализации гуаниновой специфичности РНКазы 8а достаточно образования водородных связей между белком и кето-группой гуанинового основания, возник вопрос о роли остатков 01п38 и 01и41 в связывании гуанинового основания субстрата. В число исследуемых был также включен остаток 01и74, замена которого на остаток лизина, скорее всего, является причиной снижения ферментативной активности мутанта РНКазы 8а с обращенным зарядом. Для того чтобы оценить вклад остатков 01п38, С1и41, 01и54, А^65, 01и74 и Н]я85 в каталитическую активность РНКазы Ба, нами было изучено влияние замен, элиминирующих возможную функцию этих остатков, на кинетические параметры ферментативной реакции В связи с тем, что субстраты РНКаз являются полианионами, было также исследовано влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы 8а на ее ферментативную активность

Рис. 1. Активный центр РНКазы Ба в комплексе с ехо 2',3'-циклофосфотиоатом гуанозина Возможные водородные связи обозначены пунктирными линиями (РОВ идентификатор для структуры комплекса РНКазы Б а с указанным нуклеотидом 1Л8М)

1.1. Роль остатков С1п38 и С1и41 в связывании субстрата

Резучьтаты измерений кинетических параметров характеризующих реакцию гидролиза ро1у(1) РНКазой ва и ее мутантами, представлены в табл 1 Активность мутанта 01п38А1а, выражаемая как отношение ксаЖм, в 13 раз ниже активное ш нативпою фермента По данным рентгеноструктурного анализа, амидная 1-руппа остатка 01п38 в комплексах РНКазы ва с нуклеотидами связана водородной связью с N7 атомом гуанинового основания Боковая цепь остатка 01п38 в нативном ферменте не образует водородных сиязей с друшчи белковыми группами и экспонирована в растворитель При замене остатка 01п38 на остаток аланнна из-за гидрофобных взаимодействий боковой цепи аланина с белковым окружением наиболее вероятно изменяется ориентация пептидной МП-группы относительно атома N7 гуанинового основания В этом случае изменяется расположение сахарофосфатной группы субстрата относительно каталитических групп фермен га, что и приводит к наблюдаемому снижению активности мутанта 01и38А1а РНКазы Ба. '1аким образом, остаток 01и38 поддерживает наиболее эффективную для катализа ориентацию рибозного фра! мента субстрата.

Таблица 1. Кинетические параметры реакции гидролиза ро1у(1) и ври РНКазой 8а и ее мутантами при 25°С и рН 6,5

РНКаза Ба Субстрат ^саЬ С Км х 104, М ксй/КмхЮ-4, М^с'1

Дикий тип Ро1у(1) 178+10 1,51±0,15 117,9

ври 1,9±0,1 5,5±0,3 0,35

ап38А1а Ро1у(1) 23+2 2,53:0,2 9,2

ОМН^ув ро1уа> 173+11 1,6+0,2 108

йри 1,8±0,1 10,0±0,5 0,18

01и5401п Ро1у(1) 0,50±0,05 3,1+0,3 0,16

А^65А1а Ро1у(1) 0,21 ±0,03 2,0±0,2 0,11

01и74Ьу8 Ро1у(Т) 34±4 1,7±0,2 20

Ори 0,5010,05 5,7±0,3 0,09

Шз8501па Ро1у(1) - - <0,007

а Активность не наблюдалась при концентрации фермента в растворе до 1-10'6М, что превышает рабочую концентрацию фермента дикого типа в 1000 раз.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, в кристалле карбоксильная группа боковой цепи остатка Ои41 участвует в связывании основания субстрата, образуя водородную связь с агомом N1 гуанозина Однако, мы обнаружили, что мутация 01и41Ьуз практически не влияет на кинетические характеристики РНКазы Ба (табл 1). Поскольку карбоксильная группа остатка 01и41 является акцептором МН-протона, а аминогруппа остатка лизина может выступать только в качестве донора нротона, то остаток лизина не может участвовать в связывании гуанинового основания субстрата Поэтому неизменность кинетических параметров в случае мутации 01и41 Ьув означает, что в растворе, в отличие от кристалла, остаток 01и41 не участвует в связывании субстрата. Можно было предположить, что остаток лизина способен связываться с фосфатными группами полианионно! о субстрата, и это компенсирует отсутствие взаимодействий с остатком 01и41 Для проверки этого мы провели сравнение активностей мутанта 01и41 Г,уз и РНКазы Ба дикого типа, используя в качестве субстрата динуклеозидфосфат ОрИ. При использовании этого субстрата активность муташа йи41Ьу5 была только в два раза ниже, чем активность РНКазы Ча дикого типа (табл 1) Это показывает, что взаимодействие остатка ЬуБ41 с ро!у(1) не может определять высокую активность мутант 01и41Ьуз на полимерном субстрате Таким образом, очевидно, что остаток СТи41 РНКазы Яа не участвует в связывании субстрата. Этим РНКаза Яа отличается от других гуаниловых РНКаз, замена в которых остатка, гомологичного остатку 01и41 в РНКазе 8а, приводила к уменьшению активности в 300-600 раз. Можно заключить, что гуаниловая специфичное гь РНКазы ?а реализуется за счет образования водородной связи между белком и Об атомом гуанинового основания

1.2. Функциональная роль остатков С1и54, А^б5, НЬ85 и С1и74

Замены остатков 01и54, А^65, и Н1з85, элиминирующие их возможные каталитические функции, приводят к резкому снижению активности РНКазы Ба (табл 1) Уменьшение активности РНКазы ва на три порядка величины при замене остатка 01и54 осшгком глушмина позволяет считать, что этот остаток является каталитическим и выступает в роли общего основания в каталитическом механизме фермента В случае замены Н1ч850!п каталигическая активность мутанта практически отсутствовала Стабл 1) Это согпасуегся с тем, чш имидазольное кольцо остатка №$85 в протонированной форме играет роль обшей кисло!ы в механизме дейшвия РНКазы Эа Замена остатка Агд65 на остаток аланина снижала скорость ферментативной

реакции на три порядка и практически не влияла на величину Км- Это соответствует ожидаемому уменьшению молекулярной каталитической константы при элиминировании функции этого остатка в сгруктуре РНКазы, которая состоит в облегчении образования переходного состояния субстрата во время ферментативной реакции.

Принятый механизм действия цикдизующих РНКаз предполагает, что катализируемая ферментом реакция трансэтерификации заключается в пуклеофильном замещении уходящей группы при атоме фосфора на 2' аюм кислорода рибозы. Реакция протекает через образование промежуточного пентаковалентного состояния атома фосфора. В случае реализации этой реакции под действием РНКазы 8а можно считать, что боковая цепь остатка 01и54 акцептирует протон атакующей фосфат 2'ОН-группы рибозы, а имидазольное кольцо остатка Шя85 в протонированной форме являехся донором протона уходящей 5'0-группы. Положительный заряд боковой цепи остатка А^65 понижает энергию образования переходного пентаковалентного состояния расщепляемой фосфатной группы Образование переходного состояния сопровождается большими изменениями в геометрии фосфатной группы, т к ее геометрия изменяется от тетраэдральной в основном состоянии до геометрии тригоналъной бипирамиды в переходном состоянии В пентаковалентном состоянии на одном из экваториальных атомов кислорода появтяется второй отрицательный заряд Нейтрализация этого второго отрицательного заряда положительным зарядом одною из остатков белка уменьшает свободную энергию переходного состояния на величину энергии их электростатического взаимодействия

Остаток 01и74 удален более чем на 15 А от активного центра РНКазы 8а Несмотря на это, его замена на остаток лизина приводит к шестикратному снижению активное га фермента на ро1у(1) и к четырехкратному снижению активности на (5ри, в основном из-за уменьшения величины ксМ (табл 1). Возможной причиной уменьшения величины кса для мутанта 01и74Ьуч могло быть изменение значений рК групп, участвующих в катализе Для проверки этого предположения была исследована зависимость параметров кса, и Км от рН для реакции гидролиза ро1у(1) фермептом дикого типа и мутантом 01и74]1у8 (рис. 2).

Константы ионизации ионогенных групп в свободном состоянии фермента и субстрата приведены в табл 2. Наиболее вероятно, что группы с рК 5,7 и 7,0 соответствуют остаткам 01и54 и 111385 фермента Аминокислотный остаток с рКл° может соответствовать некоторому остатку дикарбоновой кислоты, ионизация которого

влияет на рК остатка в1и54 и/или Н1э85 Группа с рКо°, по-видимому, относится к остатку Н1з53, поскольку найденное здесь значение рК0° близко к рК остатка Нгз53, измеренному методом ЯМР (Huyghues-Despointes а1, 2003).

Рис. 2. Зависимость ^(кса/Км) от рН для реакции гидролиза poly(I) РНКазой Sa (■) и ее мутантом Glu74Lys (О) Измерения

проводились при 25°С в буфере, содержащем 0,05 М Tris-HCl, 0,1 М NaCl и 0,05 М ацетата натрия.

Таблица 2. Кинетические параметры и константы ионизации ионогенных групп РНКазы ва и ее 01и74Ьуь мутанта, определяющих рН-зависимость кса(/Км реакции гидролиза ро1у(1) (рис. 2)а

Параметр РНКаза Sa

Дикий тип Glu74Lys

kcat> С 207+12 38,1+1,5

¿¡а1/ КМ 10 \ М-1 С"1 17,0+1,5 2,7±0,2

рКА° 4,39±0,23 4,46±0,16

рКв° 5,68+0,09 5,6б±0,06

рКс° 7,02±0,08 7,22±0,06

pKD° 8,35±0,24 8,78+0,26

а и Км - независимые от рН величины числа оборотов фермента и константы Михаэлиса, соответственно; Кл°, Кв°, Кс°, и Кп° - макроскопические константы кислотной диссоциации, характеризующие группы на свободном ферменте/субстрате, рК - десятичный логарифм константы ионизации К

Из таблицы 2 видно, чю рК ионогенных групп практически не изменяются после замещения остатка 01и74 в РНКазе За на осгаюк лизина Это свидететьствует о том что изменение активности мутанта не связано с изменением степени ионизации

каталитических групп белка. Поэтому можно полагать, что наблюдаемое изменение активности РНКазы За вследствие снижения кса после замены остатка 01и74 лизином обусловлено изменениями ориентации каталитических групп фермента относительно реакционных групп субстрата как результат структурных изменений, обусловленных мутацией С1и74Ьуз.

1.3. Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы 8а на ее ферментативную активность

РПКаза ва дикого типа является кислым белком (р1=3,5), не содержащим остатков лизина и имеющим общий заряд молекулы -7 при рН 7 Заменяя остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот на поверхности РНКазы ва па остатки лизина мы получили мутанты ЗК (АэрП^уя, АврПЬуэ, 01и41Ьу5) с общим зарядом -1 (р1=6,4) при рН 7 и 5К (ЗК + Азр251,у5, 01и74Ьуз) с общим зарядом +3 (р1=10,2) при рН 7 Таким образом, путем обращения знака пяти зарядов на РНКазе 8а, мы превратили один из самых кислых белков в один из самых основных. Все заменяемые остатки хорошо экспонированы в раствори ¡ель и не образуют ионных пар или водородных связей (рис. 3).

Asp 1

100% экспонировано в растворитель

Glu 41

Glu74

63%

экспонировано в растворитель

70,5% экспонировано в растворитель

66% зкепонировано в растворитель

Asp 25 93% экспонировано в

pacniüpiriejii.

Рис 3. Третичная структура

РНКазы Ба. Аминокислотные остатки, замененные на остатки лизина, представлены в виде шариков и стержней. Около остатков указаны величины экспонированности их боковых цепей в растворитель (РОВ идентификатор для структуры РНКазы 8а 1КОС}).

Поскольку субстрат рибонуклеаз - РНК - яьляется полианионом, ю изменение общего заряда молекулы фермента может влиять на его сродство к субстрату, т е на величину Км Чтобы выяснить, как изменение общего заряда влияет на скорость ферментативной реакции, мы измеряли кинетические параметры реакции гидролиза poly(l) мутантами РНКазы Sa ЗК и 5К в диапазоне pH от 4 до 8,5. Это позволило нам

определить рН-независимые значения кинетических параметров для этих белков (табл. 3).

Таблица 3. Независимые 01 рН кинетические параметры реакции гидролиза ро1у(1) РНКазой Эа и ее ЗК и 5К мутантами

РНКаза За Кмх105, М ксаь с ¿¡а(/ КмхЮ5, М'1 с"1

Дикий тип 12±1 207±12 17,0+1,5

ЗК 9,4±0,8 139±9 14,8±2,9

5К б,7±0,5 12,7+1,3 1,9±0,6

Из табл 3 видно, что активность мутанта ЗК, выражаемая как отношение к^/ Км, мало отличается по величине от активности фермента дикою типа Величина кса,/ Км для мутанта 5К РНКазы Яа по отношению к соответствующей величине для фермента дикого типа уменьшается в 9 раз Замена в РНКазе ва остатка 01и74 на лизин приводит к снижению активности фермента в 6,3 раза за счет структурных изменений в молекуле (шбл 2) Полагая, что в мутанте 5К замена С1и74Ъуз также приводит к снижению активное™ в 6,3 раза, можно считать, что уменьшение активности 5К мутанта, связанное только с изменением заряда молекулы белка, составляет 1,4 раза. Вместе с этим, для мутантов ЗК и 5К наблюдается понижение величин как Км, так и к-а1 по сравнению с соответствующими значениями для РНКазы 8а, что является характерным признаком непродуктивного связывания субстрата Таким образом, можно заключить, что катионизация РНКазы Ча не влияет на каталитическую активность фермента, но сопровождается возрастанием непродуктивного связывания субстрата.

2. Конструирование ингибиторов РНКазы 8а и родственных ферментов

РНКаза 8а и биназа катализируют расщепление РНК без участия ионов металлов в качестве кофакторов Анализ кристаллических структур этих РНКаз показывает, что остатки в1и54 и Шз85 в РНКазе ва и 01и73 и ШэКК в биназе в каталитическом процессе расщепления РНК действуют как общая кислота и общее основание Карбоксильная и имидазольная группы боковых цепей этих остатков могли бы служи 1ь лигандами для иона Тп2+ при наличии определенного зачес 1ителя в 3'-положении рибозы, связанного в активном центре нуклеотида

о

о

гп2+ + РНКаза

ны

ны

=0

чон

' Г/П/+И10 \>.........

^'РНКаза

Схема 1. Предполагаемая схема цинк(П)-зависимого ингибирования рибонуклеазы З'-И-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфатом.

В качестве такого заместителя мы предложили использовать К-гидроксимочевину. Соответственно, в качестве ингибиюра РНКаз, использующею хелатированный ион цинка, был предложен З'-Ы-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфат (рТ-З'-М-гидроксимочевина) Выбор этого соединения был основан на следующих соображениях Гидроксамовые кислоты хорошо связывают ионы 7п2+. Нуклеозид как аналог субстрата должен специфично связываться с ферментом. Использование дезоксинуклеозида позволяет иону Ъг?* образовывать две координационные связи с группами бетка (схема 1)

Константы ингибирования активности РНКазы ва и биназы рТ-3'-1Ч-гидроксимочсвиной н отсутствие в растворе ионов цинка равны 0,95 и 1,30 мМ, соответственно. При отсутствии в растворе рТ-З'-М-гидроксимочсвины ингибирования активности РНКазы Ба и биназы ионами Хпг* не наблюдалось вплоть до концентрации ионов цинка 5-10"3 М.

На рис. 4 показана зависимость скорости гидролиза ро1у(1) РНКазой Ба от конценграции субстрата в присутствии в растворе различных концентраций рТ-З'-М-гидроксимочевины и ионов Еп2+ (зависимое 1ь для биназы выглядит сходным образом) При увеличении концентрации ионов цинка в растворе рТ-З'-К-гидроксимочевипа более эффективно ишибирует обе РНКазы. Характер ингибирования РНКаз -конкурентный. Для расчета консшнт ингибирования биназы и РНКазы Ба в присутствии ионов Хп2' использовали уравнение (1), соответствующее схеме 2'

... [Е0][5]кеа

И+к? '

СО

и

где + + [Но], [Б], [I] и ]7лг*} - концентрации фермента,

К

К,

субстрата, ингибитора и ионов цинка в растворе, соответственно; [I ¿п ] -конценфация комгпекса ингибитора и цинка в растворе, [ЕI] и [Е12п2+] -концентрации комплекса фермента с шлибитором и тройного комплекса фермент-ингиби юр-цинк; к^ - константа скорости реакции гидролиза ро!у(1) РНКазой; Км -константа Михаэлиса реакции гидролиза ро1у(Т) РНКазой; К; - константа ингибирования активности фермента рТ-З'-М-гидроксимочсвиной; К, - константа ингибирования активности фермента компчексом 11п2+, К^ - константа диссоциации комплекса I гп2'

Рис. 4. График в координатах Лайнуивера-Берка для

ингибирования РНКазы За рТ-3'-]Ч-гидроксимочевиной в присутствии 7п2*. Исследования проводились при 25°С, рН 6,2. ■, [1]=0, [гп2+]=0;

М, мМ;

А, [1]=410" М, [гп2+]-1 мМ;

▼, и-1 ю-4 м, [гп2>5 мм, [1]=3-10ц М, [7.п2>5 мМ.

1/[ро1у(1)], мМ'

Е+1+гп2+ ^^ Е-Б Е+Р

Схема 2. Опосредованное ионом / \ ингибирование РНКазы

Е+1'2п2* рТ-З'-К-гидроксимочевипой

Схема 2 не учитывает образование комплекса между ингибитором и ионами Хп2+, когда их ассоциация осуществляется за счет взаимодействия ионов 2п2' с фосфатной группой ингибитора. Для расчета констант ингибирования по уравнению (1) использовали в качестве величин [I] и [гп31] значения [10] и [¿п]"], так как концентрация фермента [Е0] была много меньше величин [10] и [Хп20*] Концентрацию комплекса I Zn2+ рассчитывали, используя оценочное значение Ка, равное 6,3 мМ

Величина К, для РНКазы Ба составляет около 0,12 мМ, что примерно на порядок ниже константы ингибирования без цинка. В случае биназы ин1 ибирование рТ-З'-Н-гидроксимочевиной в присутствии ионов цинка улучшается более чем в 25 раз, значение К, составляет 0,05 мМ.

РНКаза За представляет собою кислую рибонуклеазу с изоэлектрической точкой р1 ~ 3,5 При рН 6,2, при котором измерялись константы ингибирования, суммарный заряд молекулы фермента отрицательный. Биназа, напротив, является щелочной рибонуклеазой с р! ~9,6 и имеет положительный суммарный заряд при рН 6,2. Однако, константы ингибирования РНКазы 8 а комплексом рТ-З'-М-гидроксимочевины с ионом 7п2+ близки к соответствующим значениям для ингибирования биназы и составляют 0,05-0,10 мМ Это показывает, что связывание ионов цинка с РНКазами в присутствии нуклеождов с К-гидроксимочевиной в З'-положении рибозы определяется структурой их активных центров, а не общим зарядом молекулы белка

Схема 1 предполагает, что связывание иона цинка реализуется при участии в качестве лигандов двух групп белка. В случае РНКазы 8а ими должны быть карбоксильная группа боковой цепи остатка 01и54 и имидазольное кольцо остатка Шэ85 Для подтверждения способа связывания ионов ципка в активном центре РНКазы мы исследовали ингибирование рТ-З'-М-гидроксимочевиной в присутствии ионов 7л2* активности мутанта РНКазы За, в котором остаток С1и54 заменен на остаток глутамина.

В случае С1и5401п мутанта РНКазы Б а константа ингибирования комплексом I Хп2+ примерно на порядок хуже, чем для РНКазы 8а, и практически совпадает по величине с константой ингибирования рТ-З'-М-гидроксимочевиной в отсутствие цинка (К,'=1,15мМ) Это свидетельствует о значительном снижении сродства комплекса ионов цинка с рТ-З'-Ы-т идроксимочевиной к активному центру РНКазы ва при замене остатка 01и54 па остаток глутамина.

Таким образом, уменьшение связывания ионов цинка в присутствии рТ-З'-Х-гидроксимочевины в активном центре мутанта 01и5401п но сравнению с нативной РНКазой Яа подтверждает реализацию механизма хелатирования ионов цинка, представленного на схеме 1.

Сходство структур активных центров РНКаз позволяет считать, что производные нуклеотидов с Гч'-гидроксимочениной в З'-положении рибозы являются универсальными ингибиторами РНКаз, эффективность действия которых усиливается в присутствии двухвалентных ионов цинка.

3. Изучение вклада остатков активпого центра РНКазы ва в конформационную стабильность фермента

Известно, что активный центр является местом инициации разворачивания белковой глобулы при денатурации, и замена аминокислотных остатков в нем может привести к изменению термостабильности молекулы (Т5ои, 1993) Гипотеза о балансе между стабильностью и функцией фермента была сформулирована в следующем виде: остатки белка, которые отвечают за каталитическую активность или за связывание лиганда, не оптимальны для его стабильности В соответствии с этой гипотезой, замена функционально важных остатков, которая уменьшает ферментативную активность, может приводить к увеличению стабильности белка Такая корреляция между стабильное 1ью и активностью была обнаружена, например, при заменах некоторых остатков в активных центрах лизоцима фага Т4 и барназы.

Мы ставили задачу проверки этой гипотезы на примере РНКазы За Для выявления остатков в активном центре РНКазы Яа, не являющихся оптимальными для стабильности, были измерены термодинамические параметры тепловой денатурации мутантов РНКазы 8а, содержащих замены остатков в активном центре - 01п38А1а, 01и41Ьу5, 01и5401п, А^65А1а и Н1я8501п. а также мутанта 01и741л'<;.

На рис 5 приведены температурные зависимости парциальной теплоемкости РНКазы Ба и ее мутантов, а в табл. 4 суммированы значения параметров тепловой денатурации этих ферментов. Замены 01п38А1а и 01и74Ьу8. приводящие к уменьшению активности РНКазы Яа (см табл 1), сопровождаются повышением ее температуры плавления на 3,5°С и 3,1°С, соответственно Согласно данным рентгеноструктурного анализа, боковая цепь остатка 01п38 экспонирована в растворитель и пе образует водородных связей Замена С1п38 на остаюк аланина приводит к возникновению

гидрофобных взаимодействий бокового радикала с белковым окружением, что определяет повышение температуры плавления мутанта С1и381,у5.

Боковая цепь остатка 01и74 в ферменте дикого типа также не имеет контактов с белковым окружением Однако боковая цепь замещающего Ои74 лизина может образовывать солевой мостик с боковой цепью оешка 01и78, что, наиболее вероятно, и

20 30 40 50 60 70 Температура, °С

Рис. 5. Зависимость парциальной молярной теплоемкости РНКазы ва (1) и ее мутантов ап38А1а (2), С1и5401п (3), Агё65А1а (4), Н1з8501п (5), 01и41Ьуз (6) и Сг!и74Ьуз (7) от температуры при рН 7,0

определяет

возрастание

мутанта

Температура

мутанта

отношению

заметное стабильности аи74Ьу5 плавления 01и41Ьу8 по к РНКазе 8а

дикого 1ипа понижается на2,5°С. Понижение

температуры плавления может быть обусловлено электростатическим отталкиванием положительно заряженных боковых цепей замещающего 01и41 осга!ка лизина и остатка А^40

Замены в РНКазе За ка1алитических остатков 01и54 на глутамин и Аг£б5 на аланин также сопровождаются понижением температуры и энтальпии плавления белка (табл 4) Остатки 01и54 и А^65 расположены во внутренней области молекулы белка и образуют между собой солевой мостик Поэтому замены этих остатков, элиминирующие их электростатическое взаимодействие, приводят к дестабилизации РНКазы За.

Замена каталитического остатка 111585 на ьчутамин существенно не меняет температуру и энтальпию плавления РНКазы За (табл 4) Отсутствие влияния этой замены на термодинамические параметры плавления РНКазы За указывает на экспонированность боковой цепи остатка №з85 в растворитель

Таблица 4. Параметры тепловой денатурации РНКазы 8а и ее мутантов при рН 7,0

РНКаза 8а Та(°С) ДТ/(°С) АНса! (ккал/моль) ДНе(г(ккал/моль) Ы6

Дикий тип 49,0 - 92 103 0,89

01п38А1а 52,5 3,5 109 110 0,99

01и41Ьу5 46,5 -2,5 90 100 0,90

01и54Ст1п 43,1 -5,9 81 87 0,93

А^65А1а 45,6 -3,4 81 90 0,90

01и74Ьуз 52,1 3,1 101 113 0,89

Ш58501п 49,1 0,1 90 89 1,01

°ДТ,1 = Та (мутант) - Та (дикий тип).

= ДНса]/АНе{г

Таким образом, обнаружено, что среди аминокислотных остатков, определяющих каталитическую активность РНКазы Ба, два остатка не являются оптимальными для стабильности Это остаток 01и38, участвующий в связывании субстрата, и остаток 01и74. С другой стороны, замена каталитических остатков 01и54 и А^65 в РНКазе 8а приводит к понижению термостабильности белка, а замена каталитического остатка Шв85 не влияет на его температуру плавления. Из этого следует, что гипотеза, связывающая вклад 01 дельных остатков в стабильность и функцию белка, не является абсолютной. Остатки, входящие в состав активного центра, можно разделить на участвующие в каталитическом акте, в связывании субстрата и/или в структурной организации активного центра Очевидно, что связывающие субстрат остатки не полностью комплементарны белковому окружению Вследствие этого, можно ожидать, что замена таких оста!ков, элиминирующая их способность связывать лиганд, приведет к повышению стабильности белка, что мы и наблюдали для мутанта 01и38А1а РНКазы Эа Аналогичные результаты получены нами для белкового ингибитора барназы, барстара А. Замена в барстаре А функциональных аминокислотных остатков А5р35, Аэр39 и 01и76. необходимых для образования комплекса с барназой, на остатки аланипа приводит к существенному увеличению термостабильности белка, но ухудшает его связывание с барназой.

Для ряда других белков также были получены резулыа!ы. покрывающие, чю замены аминокислотных остатков, элиминирующие их функцию связывания субстрата или лиганда, приводят к повышению стабильности белка

Таким образом, можно заключить, что аминокислотные остатки в молекуле белка, участвующие в связывании лиганда, не являются оптимальными для стабильности пшбулы.

4. Цитотоксические свойства РНКазы ва, ее близких гомологов и мутантов с обращенным зарядом

Некоторые РНКазы токсичны для клеток млекопитающих, особенно для опухолевых клеток. Для проявления цитотоксического эффекта рибонуклеаза должна проникнуть в клетку-мишень и разрушить РНК. Токсичность РНКаз вызывается как нарушением регуляторной роли расщепляемого субстрата, так и регуляторными эффектами появляющихся продуктов ею 1идролиза. К настоящему времени показано, что (1) каталитическая активность существенна, но недостаточна для возникновения токсичности; (2) возможность избежать действия цитозольного ингибитора РНКаз -одно из условий цитотоксичнос I и РНКазы, (3) цитотоксичность коррелирует как с конформационной стабильностью, так и с устойчивостью к протеолизу. Другие стороны механизма индуцированной РНКазами цитотоксичности не ясны.

В нашей работе мы исследовали цитотоксические свойства РНКазы Ба и ее мутантов с обращенным зарядом ЗК и 5К, а также природных гомолоюв РНКаш За, РНКаз Ба2 и 8аЗ Для выявления детерминант, обусловливающих цитотоксичность РНКаз, мы изучали и сравнивали молекулярные характеристики РНКаз, проявляющих различную ци го токсичность по отношению к клеткам млекопитающих.

4.1. Изменение общего заряда молекулы с отрицательного на положительный делает РНКазу ва цитотоксичной

Интернализация является, вероятно, основной стадией, лимитирующей цитотоксичность РНКаз Проникновению положительно заряженных молекул белка в клетку может способствовать связывание с отрицательно заряженными группами на внешней поверхности цитоплазматической мембраны Известно, что неопластические клетки, в отличие от нетрансформированных аналогов, содержат на внешней поверхности значительно больше кислых фосфолипидов и гликопротеинов Поэтому реальным путем усиления токсичности РНКаз по отношению к опухолевым клеткам является конструирование катионных мутантов

Па рис 6 представлены резутьтаты токсического действия РНКазы ва и ее мутантов ЗК и 5К на клетки фибробластов МНЗТЗ и фибробластов, трансформированных онкогеном \-ras Выживаемость клеток оценивалась с

Рис. 6. Выживаемость нормальных фибробласюа NIH3T3 (белые столбики) и фибробластов NIH3T3, трансформированных онкогеном v-ras (черные столбики), обрабо!анных в течение 24 часов РНКазой Sa и ее ЗК и 5К мутантами в концентрации 50 мкМ Величины выражены в процентах от выживаемости контрольных клеток, выращенных в отсутствие РНКазы

помощью WST-реагента, позволяющего детектировать активность митохондриальньгх де1Идрогеназ в цветной реакции Из приведенных на рис. 6 даппкх видно, что 5К мутант РНКазы Sa значительно более токсичен для клеточных линий фибробластов, чем РНКаза Sa или мутант ЗК При концешрадии 50 мкМ мутант 5К снижал жизнеспособность фибробластов NIH3T3 на 76% В тех же условиях жизнеспособность фибробластов, трансформированных онкогеном v-ras, снижалась на 97%. Это говорит о юм, что последние более чувствительны к действию мутанта 5К. Вариант ЗК оказывал слабое токсическое действие на фибробласты, трансформированные онкогеном v-ras, и не влиял на жизнеспособность фибробластов NIH3I3 РНКаза Sa была нетоксична для обеих клеточных линий фибробластов (рис. 6).

Избирательность токсического действия по отношению к нормальным и опухолевым клеткам - важнейший параметр терапевтического использования РНКаз Мы показали, что фибробласгы, трансформированные онкогеном v-ras, оказались более чувствительны к действию 5К варианта РНКазы Sa, чем нормальные фибробласты Сходные результаты были получены для биназы и онконазы (Smith et al, 1999) Избирательное действие РНКаз на клетки, трансформированные онкогеном

Контроль Sa ЗК 5К РНКаза (50 мкМ, 24 ч.)

v-ras указывает на ктючевую роль медиатора Ras для цитотоксического ответа в фибробластах Таким образом, мы показали, что клетки теплокровных, экспрессируюгцие ohkoi en ras, являются мишенями цитотоксичных РНКаз

100-

Ш

О -

SK

J_I_L

}

-8-4 0 4

Общий заряд белка

Рис. 7. Выживаемость фибробласюв ¥-га5-Ы1НЗТЗ, обработанных в течение 24 часов РНКазой За и ее ЗК и 5К мутантами в концентрации 50 мкМ, в зависимости от общего заряда молекул ферментов при рН 7,0.

Наши результаты показывают, что пиготоксические свойства РНКазы Эа коррелируют с изменением общею заряда молекулы с отрицательного на положительный (рис 7) Катионизация позволяет РНКазе 5К более прочно связываться с отрицательно заряженными гликолипидами и гликопротеинами на внешней поверхности цитоплазматической мембраны по сравнению с РНКазой За и ЗК Это стимулирует проникновение фермента в клетку Наши результаты согласуются с данными Ршагш е1 а1 (2001). показывающими, что цитотоксичность и способность связываться с клетками химически модифицированных РНКазы А и РНКазы 1 коррелируют с их общим положительным зарядом Таким образом, получение мутангных рибонуклеаз с увеличенным положительным зарядом может повысить их цитотоксичность

4.2. Роль активируемых кальцием калиевых (Кся) каналов в преодолении цитотоксичности, индуцированной РНКазами

Функциональная активность ионных каналов отличается в нормальных и трансформированных клетках "Больные" клетки характеризуются дисфункцией ионных каналов- это тибо нерегулируемый ток ионов в опухолевых ктстках, либо б локирование ионньгх каналов в некротических ктетках Известно, что Кг¿-каналы в

фибробтастах активируются митогенами, тогда как в клетках, трансформированных геном ras, они постоянно активны Важно установить, какую роль играют ионные каналы в проявтяемой РНКазами питотоксичности Мы изучили дейс1вие 5К и ЗК мутантов РНКазы Sa, а также самой РНКазы Sa и ее близких гомологов РНКаз Sa2 и Sa3, на клетки эмбриональной почки человека (НЕК), в норме не содержащие Кса-каналов, и клетки НЕК. трансфецированпые вектором, несущим ген Кса-каналов (HEKhSK4) Разница в цитотоксической реакции данной пары линий клеток выявит роль Kca-каналов в механизме токсичности РНКаз

Практически все клетки HEKCV

чР

04

J»

I-о О

г

0)

s

5

*

-О

ш

1 10 [РНКаза], мкМ

Рис. 8. Выживаемость клеток НЕКСУ (А) и НЕКЬЯК4 (Б), обработанных в течение 72 часов при 37°С РНКазой 8а (кружочки) и ее мутантами ЗК (треугольники) и 5К (ромбы) Величины выражены в процентах от выживаемости контрольных клеток, выращенных в отсутствие РНКазы.

(контрольные клетки НЕК, трансфецированные вектором не несущим ген Кса-каналов) погибаю!, если концен грация мутанта 5К РНКазы Ба в растворе больше 30 мкМ (рис. 8А) В то же время жизнеспособность клеток НЕКЬ8К4, экспрессирующих Кса-каналы, в присутствии 50 мкМ муталта 5К уменьшается только на 70% (рис. 8Б). Для мутанта 5К коэффициент Ю50 (концентрация РНКазы, при которой погибает 50% клеток) составляет 1,2 ±0,3 мкМ для клеток ПЕКСУ, тогда как для клеток НЕЮ18К4 этот коэффициент почти в 12 раз выше (14 + 3 мкМ) Это говорит о том, что клетки НЕК с Кса-каналами менее чувствительны к токсическому действию мутанта 5К РНКазы Ба.

РНКаза 8а нетоксична для клеток НЕКЬ8К4 и НЕКСУ в концентрации ниже 50 мкМ. Значения ГС-зо для мутанта ЗК

составляют 13 ± 2 мкМ для клеток HFKCV и 29 ± 5 мкМ для клеток HEKhSK4 РНКаза Sa2 в концентрации 50 мкМ слабо юксична, в ее присутствии выживаемое гь клеток HEKCV уменьшается приблизительно на 40%. В то же время, РНКаза Sa3 обладает значительной циютоксичностью Значения 1С50 в случае РНКазы Sa3 составляют 3,7 ± 0,6 мкМ и 7 ± 1 мкМ для клеток HEKCV и HEKhSK4, соответственно

Поскольку клеточные линии HEKhSK4 и HEKCV различаются только наличием Kca-каналов, это позволяет определить их участие в процессе проявления цитотоксичности рибонуклеазами. Наши экспериментальные данные показывают существенно более низкую чувствительность к РНКазам клеток, экспрессирующих Кса-каналы, по сравнению с клетками, лишенными этих каналов Таким образом, наличие функционально активных Kca-каналов связано с пониженной чувствительностью клеток к цитотоксичным микробным РНКазам. Результаты, полученные на клетках фибробласюв, согласуются с этим выводом Действительно, фибробласты NIH313 с хорошо регулируемыми Kca-каналами не чувствительны к мутанту ЗК и менее чувствительны к высокотоксичному мутанту 5 К по сравнению с трансформированными онкогеном ras фибробластами, содержащими разрегулированные Ка-каналы.

Эти данные юворят о том, что клетки без активности Ко-кавалов или с разрегулированной активностью этих каналов не могут противодействовать токсическому действию РНКаз. Этим можно объяснить высокую почечную токсичность онконазы, биназы и барназы и преобладающую чувствительность злокачественных клеток к цитотоксичным РНКазам

4.3. Положительный заряд является основной детерминантой цитотоксичности микробных РНКаз

Молекулярные характеристики исследованных РНКаз приведены в табл 5 РНКаза Sa не цитотоксична для клеток эмбриональной почки человека С другой стороны, катионный вариаш 5К РНКазы Sa с заменами пяти остатков лизина на остатки аспарагиновой и глутаминовой аминокислот является одной из наиболее цитотоксичных прокариотических рибонуклеаз

Анализ данных табл 5 указывает на 01сутствие корреляции между каталитической активностью или термостабильностью РНКаз и их цитотоксичностью Идентичность трехмерных структур РНКазы Sa, Sa3 и мутанта 5К также не позволяет объяснить различия в их цитотоксичности

Таблица 5. Цшотоксичность РНКазы Ба, ее изозимов и мутантов в сравнении с молекулярными характеристиками РНКаз

РНКаза Молекулярные характеристики РПКаз 1С50б,мкМ

Р1 Т/(°С) при рН 7 Каталитическая активность при рН 7, % НЕКСУ ПВКЬ8К4

Ба 3,5 47,2 100 не токсична не токсична

Эа2 5.3 41,1 14 >50 не определяли

ЗК 6,4 40,7 82 13+2 29+5

ваЗ 7,2 47,2 13 3,7+0,6 7±1

5К 10,2 47,3 14 1,2+0,3 14±3

а Температура денатурации.

6 Концентрация РНКазы, при которой погибает 50% клеток.

Из наших данных следует, что катионизация РНКазы является эффективной стратегией для придания ей цитотоксических свойств. Именно увеличение положительного заряда РНКазы 8а заметно повышает ее цитотоксичность (табл. 5) Наблюдается прямая корреляция между значением изоточки и величиной коэффициента цитотоксичности 1С50 на клетках НЕК, лишенных Кса-каналов.

выводы

1 Установлена функциональная роль остатков Gln38, Glu41, Glu54, Arg65 и His85, принадлежащих активному центру гуанилепецифичной РНКаш Sa, и определены вклады Э1их остатков в каталитическую активность фермента. Обнаружено, что в отличие от других гуанилепецифичных РНКаз специфичность РНКазы Sa реализуется без взаимодействия белка с иминогруппой гуанинового основания субстрата. Показано, что катионизация молекулы РНКазы Sa не приводит к существенным изменениям активности фермента

2 Предложен подход к созданию ингибиторов РНКаз на основе производных нуклеотидов, содержащих N-гидроксимочевину в 3'-положении рибозы. В присутствии ионов цинка связывание такого ингибитора в активном центре РНКазы Sa и биназы существенно возрастает за счет образования хелатных связей между ионом цинка, остатком гидроксимочевины и каталитическими группами белка.

3 Установлено, что аминокислотные остатки, отвечающие за связывание лшанда, не оптимальны для стабильности белковой глобулы Данное заключение основано на изучении термостабильности мутантов РНКазы Sa с заменами остатков в активном центре и мутантов внутриклеточного ингибитора РНКаз барстара с заменами в сайте связывания с РНКазой

4 Обнаружено, что повышение положитетьного заряда молекулы РНКазы Sa вызывает возрастание ее цитотоксичности Показано, что преимущественной мишенью действия токсичного мутанта РНКазы Sa с обращенным зарядом являются клетки, экспрессирующие онкоген ras. Установлена существенно более низкая чувствительность к циготоксичным РНКазам клеток, экспрессирующих К<а-каналы, по сравнению с ктетками, лишенпыми этих каналов

Список публикаций по теме диссертации

I Ihnskaya O.N., Dreyer F., Mitkevich V.A., Shaw К L., Pace C.N. and Makarov A A. (2002) Changing the net charge from negative to positive makes ribonuclease Sa cytotoxic Protein Sci, 11,2522-2525

2. Yakovlev G I, Mitkevich V.A., Shaw К L, Trevino S , Newsom S., Pace C.N and Makarov А.Л ("2003) Contribution of active site residues to the activity and thermal stability ofnbonuclease Sa Protein Sci, 12,2367-2373.

3 Mitkevich V A , Schulga A A., Ermolyuk Y S , Lobachov V A , Chekhov V О . Yakovlev G.I., Hartley R.W, Pace C.N, Kirpichnikov M.P. and Makarov A.A (2003) Thermodynamics of dcnaturation of complexes of barnase and binase with barstar Biophys Chem, 105, 383-390

4. Higgin J J , Yakovlev GI, Mitkevich V A , Makarov A A. and Raines R T (2003) Zinc-mediated inhibition of a ribonuclease by an N-hydroxyurea nucleotide Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 13,409-412

5. Mitkevich V A., Ihnskaya О N , Dreyer F., Pace С N. and Makarov A A (2004) How to create a cytotoxic ribonuclease? In Advances in Molecular Cell Biology. Moscow, Russia, 17-18 June, pp 137-148.

6 Ilinskaya O.N., Koschinski A., Mitkevich V A, Repp H, Dreyer F., Pace С N. and Makarov A.A (2004) Cytotoxicity of RNases is increased by cationiVation and counteracted by Kca channels Biochem Biophys Res Commun , 314, 550-554

7. Makarov A.A., Yakovlev G I., Mitkevich V.A., Higgin J J and Raines R T (2004) Zmc(II)-mediated inhibition of ribonuclease Sa by N-hydroxyurea nucleotide and its basis. Biochem Biophys Res Commun, 319,152-156.

8 Корчуганов Д С , Шульга A A , Ермолкж Я С , Митькевич В А , Рейбарх М.Я , Нольде С.Б , Макаров А.А , Арсеньев А С. и Кирпичников М.П. (2004) Мутация I87E препятствует димеризации барстара. Биоорганическая химия, 30, 638-644,

9 Mitkevich V.A, Ilinskaya O.N., Shaw K.L., Grimsley G.R., Dreyer F , Yakovlev G.I., Makarov A A and Pace С N (2002) The effect of net charge on the activity, stability, and cytotoxicity of ribonuclease Sa Proceedings of the 6th International Conference on Ribonucleases Bath, UK, 19-23 June, p. 126.

10 Makarov A A , Mitkevich V.A., Schulga A.A., Ermolyuk Y S., Lobachov V M., Yakovlev G I., Hartley R W , Pace С N and Kirpichnikov M M (2002) Stability of barnase and binase complcxed with barstar mutants Proceedings of the 6th International Conference on Ribonucleases. Bath, UK, 19-23 June, p.37.

II Yakovlev GI, Mitkevich V.A, Shaw K.L, Trevmo S., Newsom S, Pace CN and Makarov A A (2002) Contribution of active site residues to the enzyme activity and thermostability of ribonuclease Sa. Proceedings of the 6th International Conference on Ribonucleases. Bath, UK, 19-23 June,p.l43.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 25.05 2005 г. Формат 60x90 1/16 Усл.печ л 1,5.Тираж 100 экз. Заказ 338 Тел 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

«M 2 6 5 б

РНБ Русский фонд

2006-4 11532

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Митькевич, Владимир Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. РИБОНУКЛЕАЗА SA, РОДСТВЕННЫЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ ИНГИБИТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Принципы классификации нуклеаз

1.2. Механизм каталитического действия циклизующих рибонуклеаз

1.3. Структура и свойства РНКазы Sa и подобных ей РНКаз

1.3.1. Структура и механизм действия РНКазы Sa

1.3.2. Каталитические свойства РНКазы Sa и ее гомологов

1.3.3. Термостабильность РНКазы Sa, ее гомологов и мутантов

1.4. Влияние остатков активного центра на стабильность белка

1.5. Ингибиторы рибонуклеаз

1.5.1. Низкомолекулярные ингибиторы РНКаз

1.5.2. Белковые ингибиторы РНКаз

1.5.2.1. Барстар

1.5.2.2. Цитоплазматический ингибитор рибонуклеаз животного происхождения

1.6. Цитотоксичность РНКаз

1.6.1. Токсическое действие РНКазы на клетку

1.6.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности РНКаз

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты и материалы

2.1.1. Бактериальные рибонуклеазы

2.1.2. Барстар А и его мутанты

2.1.3. Получение З'-Ы-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфата

2.1.4. Использованные реагенты

2.2. Методы исследований

2.2.1. Измерение каталитических параметров реакций гидролиза субстратов РНКазами

2.2.2. Определение жизнеспособности клеток в присутствии РНКазы

2.2.3. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК)

2.2.4. Круговой Дихроизм (КД)

2.2.5. Измерение констант связывания

2.2.6. Определение концентраций

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Структурно-функциональный анализ активного центра РНКазы Sa

3.1.1. Роль остатков GIn3 8 и GIu41 в связывании субстрата

3.1.2. Функциональная роль остатков GIu54, Arg65, His85 и GIu

3.1.3. Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Sa на ее активность

3.2. Конструирование ингибиторов РНКазы Sa и родственных ферментов

3.2.1. Ингибирование РНКаз металлохелатами

3.2.2. Ингибирование активностей РНКазы Sa и биназы З'-М-гидроксиуреидо-З1-дезокситимидин 5-фосфатом в присутствии цинка(Н)

3.2.3. Ингибирование активности Glu54GIn мутанта РНКазы Sa

З'-Ы-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5-фосфатом в присутствии цинка(П)

3.3. Изучение вклада остатков активного центра РНКазы Sa в конформационную стабильность фермента

3.4. Цитотоксические свойства РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с измененным зарядом

3.4.1. Изменение общего заряда молекулы с отрицательного на положительный делает РНКазу Sa цитотоксичной

3.4.2. Роль активируемых кальцием калиевых (Кса) каналов в преодолении цитотоксичности, индуцированной РНКазами

3.4.3. Положительный заряд является основной детерминантой цитотоксичности микробных РНКаз

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы Streptomyces aureofaciens"

Рибонуклеазы (РНКазы) являются традиционными объектами исследования молекулярной биологии, поскольку они участвуют в ключевых процессах реализации генетической информации и представляют собой важнейшие ферменты клеточного метаболизма [1-5]. Биологические функции РНКаз заключаются в трансформации РНК от первичных генных транскриптов до функциональных компонентов трансляционной системы, продукции малых регуляторных РНК и деградации определенных типов РНК. В настоящее время большое внимание уделяется функциям РНКаз, связанным с регуляцией экспрессии генов, ростом и дифференцировкой клеток, защитой от патогенов, индукцией апоптоза. Эти ферменты находят широкое применение в генной инженерии, биохимии и медицине. Кроме того, они являются удобными объектами для изучения механизмов реализации высокой специфичности ферментов. Поэтому изучение молекулярного механизма действия РНКаз представляет собой важную задачу не только для энзимологии ферментов нуклеинового обмена, но и для понимания процессов клеточной регуляции.

В последние годы вырос интерес к созданию эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКаз как потенциальных противораковых средств, подавляющих активность ангиогенина, а также как противоаллергических препаратов, ингибирующих активность РНКаз эозинофилов человека [6]. Потребность в эффективных ингибиторах РНКаз связана и с необходимостью блокирования активности примесных РНКаз при биохимических работах с РНК-содержащими препаратами. Понимание молекулярного механизма действия этих ферментов и изучение структуры их активных центров важно для создания эффективных ингибиторов РНКаз.

Было обнаружено, что некоторые РНКазы семейства РНКазы А токсичны для клеток млекопитающих, особенно для опухолевых клеток [7-9]. В ряде случаев они избирательно атакуют злокачественные клетки, запуская апоптозную реакцию, и поэтому могут рассматриваться как альтернатива классическим химиотерапевтическим препаратам. Так, РНКаза из ооцитов лягушки Rana pipiens, онконаза, в настоящее время проходит клинические испытания для лечения мезотелиомы легких. Бактериальные РНКазы составляют важное семейство РНКаз, некоторые представители которого также обладают цитотоксическими свойствами. Одним из важных факторов цитотоксичности микробных РНКаз по отношению к клеткам млекопитающих является их невосприимчивость к действию цитоплазматического ингибитора РНКаз, присутствующего практически во всех тканях человека и блокирующего каталитическую активность экзогенных РНКаз животного происхождения. Несмотря на большой интерес исследователей к цитотоксичным РНКазам, факторы, определяющие их цитотоксичность, до сих пор недостаточно изучены.

Настоящая работа посвящена установлению молекулярного механизма действия и определению цитотоксических свойств РНКазы Sa из Streptomyces aureofaciens. Выбор этого фермента обусловлен тем, что РНКаза Sa является одним из наименьших ферментов, состоящим из 96 аминокислотных остатков. Ее пространственная структура хорошо изучена как в кристалле, с разрешением 1 А [10], так и в растворе методом Я MP [11], а небольшой размер молекулы позволяет в значительной степени варьировать свойства белка внесением минимальных изменений в его последовательность. Поэтому РНКаза Sa представляет собою удобную модель как для изучения взаимоотношений между белковой структурой и функцией, определяющих эффективность действия фермента, так и для исследования факторов, влияющих на конформационную стабильность белков в растворе.

В задачи работы входило: 1) определение функциональной роли остатков активного центра РНКазы Sa и их вкладов в каталитическую активность фермента;

2) конструирование эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКазы Sa;

3) изучение влияния замен остатков активного центра РНКазы Sa на конформационную стабильность фермента; 4) исследование цитотоксических свойств РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с обращенным зарядом, оценка влияния отдельных клеточных компонент на цитотоксические эффекты, проявляемые РНКазами.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Митькевич, Владимир Александрович

выводы

1. Установлена функциональная роль остатков Gln38, Glu41, Glu54, Arg65 и His85, принадлежащих активному центру гуанилспецифичной РНКазы Sa, и определены вклады этих остатков в каталитическую активность фермента. Обнаружено, что в отличие от ранее изученных гуанилспецифичных РНКаз специфичность РНКазы Sa реализуется без взаимодействия белка с иминогруппой гуанинового основания субстрата. Показано, что катионизация молекулы РНКазы Sa не приводит к существенным изменениям активности фермента.

2. Предложен подход к созданию ингибиторов РНКаз на основе производных нуклеотидов, содержащих N-гидроксимочевину в З'-положении рибозы. В присутствии ионов цинка связывание такого ингибитора в активном центре РНКазы Sa и биназы существенно возрастает за счет образования хелатных связей между ионом цинка, остатком гидроксимочевины и каталитическими группами белка.

3. Установлено, что аминокислотные остатки, отвечающие за связывание лиганда, не оптимальны для стабильности белковой глобулы. Данное заключение основано на изучении термостабильности мутантов РНКазы Sa с заменами остатков в активном центре и мутантов внутриклеточного ингибитора РНКаз барстара с заменами в сайте связывания с РНКазой.

4. Обнаружено, что повышение положительного заряда молекулы РНКазы Sa вызывает возрастание ее цитотоксичности. Показано, что преимущественной мишенью действия токсичного мутанта РНКазы Sa с обращенным зарядом являются клетки, экспрессирующие онкоген ras. Установлена существенно более низкая чувствительность к цитотоксичным РНКазам клеток, экспрессирующих Кса-каналы, по сравнению с клетками, лишенными этих каналов.

Благодарности

В заключение я хочу выразить глубокую признательность своим научным руководителям А.А. Макарову и Г.И. Яковлеву за поддержку, чуткое руководство работой и неоценимую помощь в написании и редактировании данной диссертации, а также О.Н. Ильинской, И.Ю. Петрушанко, В.О. Чехову и В.М. Лобачеву за помощь в работе, плодотворные научные дискуссии, дружеское отношение и участие. N

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Митькевич, Владимир Александрович, Москва

1. Dunn J.J., and Studier F.W. T7 early RNAs and Escherichia coli ribosomal RNAs are cut from large precursor RNAs in vivo by ribonuclease III // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973. V.70, p.3296-3300.

2. Young R.A., and Steitz J.A. Complementary sequences 1700 nucleotides apart from a ribonuclease III cleavage site in Escherichia coli ribosomal precursor RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978. V.75, p.3593-3597.

3. Ohtsuki K., Groner Y., and Hurwitz J. Isolation and purification of double-stranded ribonuclease from calf thymus И J. Biol. Chem., 1977. V.252, p.483-491.

4. Grummt I., Hall S.H., and Crouch R.J. Localisation of an endonuclease specific for double-stranded RNA within the nucleolus and its implication in processing ribosomal transcripts И Eur. J. Biochem., 1979. V.94, p.437-443.

5. Xu Y., Petersen-Bjorn S., and Friesen J.D. The PRP4 (RNA4) protein of Saccharomyces cerevisiae is associated with the 5' portion of the U4 small nuclear RNA //Mol. Cell Biol., 1990. V. 10, p.l217-1225.

6. Russo A., Acharya K.R., and Shapiro R. Small molecule inhibitors of RNase A and related enzymes // Methods Enzymol, 2001. V.341, p.629-648.

7. Leland P.A., and Raines R.T. Cancer chemotherapy ribonucleases to the rescue // Chemistry and Biology, 2001. V.8, p.405-413.

8. Makarov A.A., and Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets // FEBS Lett., 2003. V.540, p. 15-20.

9. Ильинская O.H. и Макаров A.A. Почему рибонуклеазы вызывают гибель раковых клеток // Молекулярная Биология, 2005. Т.39, с.1-11.

10. Sevcik J., Lamzin V.S., Dauter Z., and Wilson K.S. Atomic resolution data reveal flexibility in the structure of RNase Sa //Acta. Cristallogr., 2002. V.58, p.1307-1313.

11. Laurents D., Perez-Canadillas J.M., Santoro J., Rico M., Schell D., Pace C.N., and Bruix M. Solution structure and dynamics of ribonuclease Sa // Proteins, 2001. V.44, p.200-211.

12. Barnard E.A. Biological function of pancreatic ribonuclease // Nature, 1969. V.221, p.340-344.

13. Richards F.M., and Wyckoff H.W. Bovine pancreatic ribonuclease. In "The Enzymes" (P.D. Boyer, ed.) V.4, p.647-805. Academic press, New York, 1971.

14. Findlay D., Herries D.G., Marhias A.P., Rabin B.R., and Ross C.A. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease // Nature, 1961. V.190, p.781-784.

15. Deavin A., Mathias A.P., and Rabin B.R. Mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease II Nature, 1966. V.211, p.252-255.

16. Raines R.T. Ribonuclease A // Chem. Rev., 1998. V.98, p. 1045-1065.

17. Steyaert J. A decade of protein engineering on ribonuclease Ti // Eur. J. Biochem., 1997. V.247, p.1-11.

18. Hartley R.W. Barnase and barstar. In "Ribonucleases: structures and functions" (D'Alessio G. and Riordan J.F., ets) p.51-100, Academic Press, New York, 1997.

19. Bacova M., Zelinkova E., Zelinka J. Exocellular ribonuclease from Streptomyses aureofacience // Biochim. Biophys. Acta., 1971. V.235, p.335-342.

20. Hartley R.W. Homology between prokaryotic and eukaryotic ribonucleases // J. Mol. Evol., 1980. V.15, p.355-358.

21. Hebert E.J., Grimsley G.R., Hartley R.W., Horn G., Schell D., Garcia S., Both V., Sevcik J., and Pace C.N. Purification of ribonucleases Sa, Sa2, and Sa3 after expression in Escherichia coli II Protein Express. Purificat., 1997. V.l 1, p. 162-168.

22. Sevcik J., Urbanikova L., Dauter Z., and Wilson K.S. Recognition of RNase Sa by the inhibitor barstar: structure of the complex at \.lk resolution II Acta Cristallogr., 1998. V.54, p.954-963.

23. Sevcik J., Dodson E., and Dodson G.G. Determination and restrained least-squares refinement of the structures of ribonuclease Sa and its complex with З'-guanyIic acid at 1.8 A resolution // Acta Crystallogr., 1991. V.47,240-253.

24. Sevcik J., Dauter Z., Lamzin V.S., and Wilson K.S. Ribonuclease from Streptomyces aureofaciens at atomic resolution // Acta Crystallogr., 1996. V.52, p.327-344.

25. Sevcik J., Urbanikova L., Leland P.A., and Raines R.T. X-ray structure of two crystalline forms of a streptomycete ribonuclease with cytotoxic activity // J. Biol. Chem., 2002. V.277, p.47325-47330.

26. Polyakov K.M., Lebedev A.A., Okorokov A.L., Panov K.I., Schulga A.A., Pavlovsky A.G., and Dodson G.G. The structure of substrat-free microbial ribonuclease binase and its complexes with 3'GMP and sulfat ions II Acta Crystallogr., 2002. V.58, p.744.

27. Голубенко И.А., Лещинская И.Б., Карпейский М.Я. и Яковлев Г.И. Изучение функциональной роли гистидина-101 рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р // Биоорганическая химия, 1982. Т.8, с.1108-1118.

28. Yakovlev G.I., Moiseyev G.P., Bezborodova S.I., Both V., and Sevcik J. A comparative study on the catalytic properties of guanyl-specific ribonucleases // Eur. J. Biochem., 1992. V.204, p.187-190.

29. Ami R., Heinemann U., Tokuoka R., and Saenger W. Three-dimensional structure of the ribonuclease TI 2'-GMP complex at 1.9-A resolution И J. Biol. Chem., 1988. V.263, p.15358-15368.

30. Follmann H., Wieker H.J., and Witzel H. On the mechanism of the ribonuclease reaction. 2. The pre-ordering in the substrate as the accelerating factor in dinucleoside phosphates and analagous compounds // Eur. J. Biochem., 1967. V.l, p.243-250.

31. Day A.G., Parsonage D., Ebel S., Brown Т., and Fersht A.R. Barnase has subsites that give rise to large rate enhancements // Biochemistry, 1992. V.31, p.6390-6395.

32. Buckle A.M., and Fersht A.R. Subsite binding in an RNase structure of a barnase tetranucleotide complex at 1.76-angstrom resolution // Biochemistry, 1994. V.33, p.1644-1653.

33. Shaw K.L., Grimsley G.R., Yakovlev G.I., Makarov A.A., and Pace C.N. The effect of net charge on the solubility, activity and stability of ribonuclease Sa // Protein Sci., 2001. V.10, p.1206-1215.36