Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природные каталитические антитела человека и синтетические аналоги активного центра РНКазы А как инструменты исследования структуры РНК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Власов, Александр Валентинович, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи

ВЛАСОВ АЛЕКСАНДР ВАЛЕНТИНОВИЧ

ПРИРОДНЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА И СИНТЕТИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ АКТИВНОГО ЦЕНТРА РНКазы А КАК ИНСТРУМЕНТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ РНК

03.00.04. - Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.х.н., Г. А. Невинский к.х.н., М. А. Зенкова

Новосибирск 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

1. РИБОНУКЛЕАЗЫ ЧЕЛОВЕКА (Обзор литературы) 8

1.1. Введение В

1.2. РНК-гидролизующие ферменты 9

1.2.1. Семейство РНКазы А 9

1.2.1.1. Субстратная специфичность РНКаз 13

1.2.1.2. Деполимеризация РНК и расщепление циклофосфатов 18

1.2.1.3. Биологические функции 20

1.2.2. РНКазаН 21

1.2.3. РНКаза Ь 22

1.2.4. Лактоферрин 22

1.2.5. РНКаза, специфично гидролизующая двуцепочечные РНК 22

1.2.6. РНКазаР 23

1.2.7. РНКаза Т84 23

1.2.8. РНКаза, специфично гидролизующая поли(А) 23 1.2.9.1-РНКаза 24 1.2.10. Каталитические антитела 24

1.3. Использование РНКаз в диагностике и терапии 30

1.4. Заключение 33

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 34

2.1. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ 34

2.2. МЕТОДЫ 36

2.2.1. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки крови 36

2.2.2. Электрофоретический анализ белков 37

2.2.3. Тестирование нуклеазной активности в полиакриламидном геле, содержащем субстрат

2.2.4. Введение [32Р] метки в РНК

2.2.5. Расщепление РНК и ДНК препаратами антител

2.2.5.1. Гидролиз тРНК препаратами и РНКазами

2.2.5.2. Гидролиз ДНК плазмиды рВК-322 препаратами 1§0

2.2.5.3. Гидролиз тРНК имидазолом

2.2.5.4. Гидролиз тРНК синтетическими соединениями, моделирующими активный центр рибонуклеазы А

2.2.6. Фракционирование антител и РНКазы А на фильтрах СепШсоп-100

2.2.7. Определение термостабильности антител и РНКазы А

3. ПРИРОДНЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА

И СИНТЕТИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ АКТИВНОГО ЦЕНТРА РНКазы А

КАК ИНСТРУМЕНТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ РНК

(Результаты и их обсуждение) 41

3.1. АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАДАЮЩИЕ

РИБОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 41

3.1.1. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки крови человека 41

3.1.2. РНК- и ДНК- гидролизующая активность препаратов антител 43

3.1.3. Доказательство РНК-гидролизующей активности антител 47

3.1.3.1. Фракционирование антител и РНКазы А на фильтрах СеШпсоп-100 48

3.1.3.2. Термическая денатурация антител 48

3.1.3.3. Тестирование РНК- гидролизующей активности препаратов иммуноглобулинов после электрофоретического разделения в

полиакриламидном геле, содержащем субстрат 50

3.1.4. Многообразие рибонуклеазных активностей препаратов антител 52

3.1.5. Влияние ионной силы, катионов двухвалентных металлов и рН на РНК-гидролизующую активность антител 56

3.1.6. Структурная специфичность РНК-гидролизующей активности антител

37

38

38

39

39

40 40 40

3.2. СИНТЕТИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЫ, ИМИТИРУЮЩИЕ АКТИВНЫЙ ЦЕНТР РНКазы А, КАК ИНСТРУМЕНТЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ РНК

3.2.1. Имидазол как простейшая модель активного центра РНКазы А 65

3.2.1.1. Исследование расщепления имидазолом тРНКА8р 66

3.2.1.2. Исследование расщепления имидазолом тРНКРЬе 71

3.2.1.3. Исследование расщепления имидазолом тРНКРЬе в комплексе

с олигонуклеотидами 73

3.2.2. Исследование расщепления РНК конъюгатами на основе олиголизина и гистидина

75

5. ВЫВОДЫ 85

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 86

Трис трис (гидроксиметил) аминометан

вББ додецилсульфат натрия

ЭДТА этилендиамин тетраацетат

ПААГ полиакриламидный гель

СКВ системная красная волчанка

иммуноглобулин класса О

Сложные природные функции РНК реализуются за счет специфических взаимодействий этих молекул с белками и нуклеиновыми кислотами, в которых главную роль играет трехмерная структура молекул, формирующаяся благодаря образованию специфических водородных связей, координации поливалентных катионов и стэкинга гетероциклических оснований. Знание пространственных структур РНК необходимо для понимания механизмов их функционирования, для конструирования полинуклеотидов с заданными свойствами, выбора оптимальных олигонуклеотидных зондов, праймеров и антисмысловых олигонуклеотидов для манипулирования с определенными РНК и воздействия на их функции. С помощью методов рентгеноструктурного анализа и ЯМР в настоящее время определены трехмерные структуры ряда малых РНК. Однако эти методы неприменимы для изучения наиболее важных объектов - высокомолекулярных РНК и сложных РНК-белковых комплексов, поскольку для них требуются большие количества высокоочищенных РНК и кристаллы высокого качества, которые вырастить трудно, а в ряде случаев невозможно. В настоящее время основными методами изучения биологически активной структуры РНК, которая реализуется в растворах определенного состава и для существования которой иногда требуются специфические белковые факторы, являются методы химической и ферментативной модификации в комбинации с теоретическими методами и филогенетическими исследованиями, позволяющими предсказывать варианты укладки РНК. Информативность этих методов определяется набором доступных химических реагентов и рибонуклеаз, обладающих чувствительностью к определенным элементам структуры РНК. Поиск новых химических и ферментативных зондов является актуальной задачей для расширения арсенала средств изучения РЖ в растворе. Наиболее перспективными из таких зондов являются те, которые способны в физиологических условиях расщеплять РНК по участкам, обладающим определенными свойствами, так как расщепление - наиболее легко регистрируемый вид модификации РНК. Проведенные в последние годы исследования привели к появлению двух новых классов соединений, расщепляющих РНК, потенциально пригодных для использования в качестве зондов для структурных исследований.

Недавно в сыворотке крови больных различными аутоиммунными заболеваниями были обнаружены иммуноглобулины, способные расщеплять РНК и ДНК. Предполагается, что это антиидиотипические антитела к первичной сети антител, направленных против различных антигенов-нуклеаз. В соответствии с гипотезой их образования, такие антитела должны имитировать активный центр соответствующих нуклеаз и они могут проявлять различные

виды субстратной специфичности. В последнее время появились работы, направленные на конструирование органических молекул, содержащих ключевые фрагменты каталитических центров рибонуклеаз. Среди синтезированных веществ обнаружены соединения, способные эффективно катализировать расщепление РНК в физиологических условиях.

Целью настоящей работы являлось исследование возможности применения каталитических антител человека и минимальных по размеру аналогов каталитического центра рибонуклеазы в качестве зондов для изучения структуры РНК в растворе. В ходе ее выполнения были выделены и охарактеризованы РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных различными заболеваниями. Было обнаружено, что среди них встречаются антитела, обладающие уникальной чувствительностью к структуре РНК-субстрата. Также исследованы простейшие аналоги каталитического центра рибонуклеазы -имидазол и синтетические конструкции на основе остатков Ь-лизина. Показано, что эти конструкции могут быть использованы для получения информации о вторичной структуре РНК.

1. РИБОНУКЛЕАЗЫ ЧЕЛОВЕКА (Обзор литературы)

1.1. Введение

Большой интерес к специфическим ферментам нуклеинового обмена обусловлен исключительной важностью их субстратов, играющих ключевую роль в процессах воспроизведения и реализации генетической информации. Важным семейством ферментов нуклеинового обмена являются рибонуклеазы, катализирующие расщепление фосфодиэфирных связей в РНК. Каждая молекула РНК претерпевает некоторые превращения, требующие участия фермента - РНКазы. Такие превращения можно разделить на две категории: (1) реакции процессинга РНК и (2) реакции, которые приводят к деградации РНК. Большое число различных реакций первой категории должно обеспечиваться набором высокоспецифичных РНКаз для того, чтобы процессинг проходил с необходимой точностью. Для второй категории реакций, вероятно, требуется только небольшое число неспецифичных ферментов.

Рибонуклеазной активностью обладает широкий спектр белков, причем для одних РНКаз эта активность является единственной известной функцией, а для других известно несколько видов биологической активности. Помимо пищеварительных панкреатических РНКаз, функция которых очевидна, в организме имеется ряд рибонуклеаз, участвующих в процессах репликации и транскрипции, ответственных за посттранскрипционные превращения РНК, играющих важную роль в механизмах противовирусного ответа клетки. Ингибиторы и активаторы этих ферментов, а также сами ферменты рассматриваются в настоящее время как перспективные терапевтические препараты для лечения ряда заболеваний. В настоящем обзоре приводятся данные о распределении в организме, каталитических свойствах и структурных особенностях РНКаз человека. Кратко рассмотрены данные о их биологических функциях и применении.

1.2.1. Семейство РНКазы А

Большинство известных внеклеточных рибонуклеаз высших организмов образует семейство ферментов, наиболее изученным представителем которого является бычья панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза А) [1, 2]. РНКазы этого семейства являются пиримидин-специфичными ферментами, имеют различную степень гомологии с РНКазой А и различаются между собой по массе, заряду, специфичности, антигенным детерминантам и ряду других свойств. Внеклеточные рибонуклеазы являются продуктами шести различных генов, находящихся в 14-й хромосоме [3], однако во всех случаях активный центр ферментов инвариантен. На данный момент установлены аминокислотные последовательности РНКаз из многих видов и изучена их молекулярная эволюция [4]. Многообразие членов суперсемейства РНКазы А является результатом дупликаций общего гена-предка и последующих мутаций, что подтверждает проведенный анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей [5]. Гены РНКаз человека имеют сходную структурную организацию - некодирующий экзон 1/ интрон/ кодирующий экзон 2. Экспрессия РНКаз человека регулируется взаимодействием промотора с энхансером, расположенным в интроне [6].

В соответствии с популярной до недавнего времени системой классификации [7] пиримидин-специфичные РНКазы млекопитающих подразделяли на два класса: секреторные и несекреторные. Находящиеся в секреторных органах РНКазы проявляют оптимальную активность при рН 8.0 и с большей скоростью гидролизуют поли(С), чем поли(Ц). Типичными ферментами этого класса являются панкреатические РНКазы млекопитающих. Несекреторные рибонуклеазы расщепляют РНК наиболее эффективно при рН 6.5-7.0 и находятся, главным образом, в печени, селезенке и лейкоцитах. Они расщепляют поли(и) с большей скоростью, чем поли(С). Ионы металлов, такие, как Си2+ и 2п2+, эффективно ингибируют секреторные РНКазы, но слабо влияют на несекреторные ферменты.

Вышеупомянутая классификация рибонуклеаз оказалась неудачной, поскольку выяснилось, что в некоторых несекреторных тканях (мозг [8], почки [9]) экспрессируется в основном РНКаза секреторного типа. Современная классификация РНКаз основывается на других принципах - сходстве аминокислотных

последовательностей и каталитических свойств [10]. РНКазы, имеющие аминокислотную последовательность и каталитические свойства, сходные с РНКазой А [2], было предложено назвать ферментами панкреатического типа (птРНКазы). РНКазы, имеющие аминокислотную последовательность и каталитические свойства, сходные с РНКазой К2 из почек быка [11], было рекомендовано назвать ферментами непанкреатического типа (нптРНКазы). Рибонуклеазы, которые структурно более сходны с птРНКазами [12-16], но проявляют каталитические свойства, сходные с таковыми и птРНКаз, и нптРНКаз [13-19], было предложено назвать ферментами смешаного типа (пт-нптРНКазы).

В настоящее время детально исследовано пять рибонуклеаз человека.

Аминокислотная последовательность птРНКазы 1 на 70% идентична последовательности РНКазы А (структуры РНКаз приведены на рис. 1) и большинство аминокислотных замен являются консервативными [12, 36]. У этого фермента в зависимости от источника выделения по-разному гликозилированы три сайта Авп-Хаа-ТЬг/Бег (Азп-34, Азп-76 и А$п-88) [12, 36, 37]. Распределение РНКаз в различных органах и тканях человека приведено в табл. 1.

нптРНКаза 2 (ЕБЫ), выделенная из разных тканей, имеет сходный характер гликозилирования [38]. В ее последовательности имеется пять позиций (17, 59, 65, 84, 92), в которых аспарагин модифицирован остатками сахара [39]. Структура этих 14-гликанов [38] отличается от структуры гликанов в птРНКазе 1 [37]. Недавно была обнаружена посттрансляционная модификация данного фермента по второму положению индольного кольца Тгр-7 [40]. Степень гомологии нптРНКазы 2 и птРНКазы 1 составляет лишь 35%. Основными отличиями (по системе нумерации РНКазы А) являются:

1) инсерция 2, 2 и 9 аминокислотных остатков в трех наружних петлях молекулы, соответственно;

2) делеция шести аминокислотных остатков в положениях 17-22 в районе, соответствующем Б - петле РНКазы А;

3) добавление трех аминокислотных остатков на Ы-конце.

Несколько аминокислотных остатков, которые считаются важными для функционирования птРНКаз млекопитающих, такие, как С1у-2, Ьув-бб, Ьуэ-7, А^-Ю, РЬе-120 и Авр-14, замещены неконсервативно. Однако в ферменте сохранены ключевые аминокислоты активного центра: Ив-12, £[¡8-119, Ьуз-41, и ряд аминокислот, которые считаются ответственными за правильную укладку белка [39].

РНКаза А РНКаза 1 РНКаза 2 РНКаза 3 РНКаза 4 РНКаза 5 РНКаза Кб

РНКаза А РНКаза 1 РНКаза 2 РНКаза 3 РНКаза 4 РНКаза 5 РНКаза Кб

РНКаза А РНКаза 1 РНКаза 2 РНКаза 3 РНКаза 4 РНКаза 5 РНКаза Кб

РНКаза А РНКаза 1 РНКаза 2 РНКаза 3 РНКаза 4 РНКаза 5 РНКаза Кб

1 О

901 2345678 ЕРОНМОЗЗТБ ОРОНМОЗОЗв

Р Р

7

2 3 4

1 2 3 4 5 6 7 8 - КЕТАААКР -КЕБРАККР Р О Р Т\Л/А С1\Л/Р РОРТРА СШР

- - оовмуарр

-ООЫЗРУТНР РКЯЬТКАНУР 3 о

890123456789 М0ММКЗРМ1-ТК0РСКР\^ МОМИРКРИМТОвРСКРУИ Т N А М О V I ММУОРЯСКМС^ Т I А М И А I ЫМУЯУУРСК^М МЬММОРРКМПУНСКИРМ Ев I МРРРв ЦБР ■ СКй I N N Я А М Э вIММУТОНСКНС^

6 0 7 0 6 78901234567890

кУсвокнмьскыоат

МУСРОЕКУТСКМСОб МУСбКРММТСРБМКТ N V С й N <2 гIРСРНИРТ Э I С Э Т Т N I оскискм МКМСМСРНЯЕ -ИБ I V С К N Я Я -9 О

7 8 9 0 1 - -Т в 5 Э К - -т n в б и - -Т Т Р Б Р О N I N Р О А О N

0СК0Т688Р--ТСК1 НбвБР - -й С Я 1_ Т - - Б С

2 О

9 0 1 2 3 4 5 6 ААЗЭЗМУС РЗвгвТУС

ЕОН^МТЭОО......С

ЮН i БЬМРРК......С

РОНУНРЕЕТСО-Э О Я У С ТОНУОАКРОбЯ-Б О Я У С

I ОН I ОРЭРЮ......с

4 О О 1

г Р 1_ О - -

5

5 6 7 8 9 0

т Р V Н Е Б

т Р V Н Е Р

т Р итт

т Р ьктт

т Р 1 Н Е Р

т Р 1 Н С N

т Р |_ н

2 3 4 5 6 7

2 3 4 5

А й V О

V О V о

А N V V

А N V V

\л/ n i и

К Я в I К

? О N V А

8 О

- 1

■ N с у О Э у Э

с у к г N э

- N к N N N

8 9 0

тмэ

бмн

СННЗСЗОУР

с н я г я

2 т т

I

- - N С Н Е в V

А I С Е

Я V С э

3 4 5 6

Б С Я Е

о С р* i.

Н С N I.

Н С О I.

- N н N

2 3 4 5 6 7 8

F Я У Р - - V к V т Э Э Р О V т К Р V N М Т

|_ я I г к с н о г г 10 0

901 23456789 УР1ЧСАУКТТ(2АМКН I I V А УРМСАУРТЗРКЕЯН I I V А I ЗМСЯУАОТРАММРУ I V А I ЗМСЯУАОРРСРРРУУУА

- АРМСЯУКА I А Э Т Я Я V V I А

- УРРСОУРАТАбРРМ УУУА КУРОСРУЭАААОУКР Р I V А

1 1 0 1 2 0

0 12 3--- ------ 4 5 6 7 8 9 0 1 23456789

РНКаза А с Ев^- - - ......р у v Р V н р □ а г v----

РНКаза 1 с евз • ■ ■ ......р у v Р V н р оазуеогт

РНКаза 2 с □мкооррорроурууру н 1 йи i i - - - -

РНКаза 3 с й n я р р - яйзррурууру н отт i ----

РНКаза 4 с е с n - - - ......р 0 v Р V н р Об......

РНКаза 5 с е n с--- ........1 Р V н 1 э о э i р я я р

РНКаза Кб с о р р о - - кээррукьуру 1 р г i |_ ----

Рис. 1. Сравнение последовательностей РНКаз человека с последовательностью РНКазы А. Выделены аминокислотные остатки, сохраняющиеся во всех ферментах (по данным [10, 34, 35]).

нптРНКаза 3 (ЕСР) - очень основный белок (р1=10.8), весьма сходный по структуре (70% гомологии) с нптРНКазой 2 [41]. В последовательности этой РНКазы имеется три сайта гликозилирования [41], где присоединены сложные олигосахариды, сходные с таковыми, найденными в нптРНКазе 2 [30]. Рибонуклеазная активность ЕСР гораздо ниже, чем активность нптРНКазы 2; в других отношениях их каталитические свойства схожи [42].

В пт-нптРНКазе 4 единственной посттрансляционной модификацией является присоединение пироглутаминовой кислоты на >}-конце [16]. Последовательность фермента более сходна с последовательностью птРНКазы 1 (43% гомологии), чем с последовательностями нптРНКазы 2 и РНКазы 3 (31% и 30% гомологии соответственно). В этом белке наблюдается уникальная делеция двух аминокислот, соответствующих положениям 77 и 78 РНКазы 1 [16]. Эта РНКаза человека по последовательности на 90% гомологична РНКазам из печени быка и свиньи [16]. Высокая межвидовая консервативность, возможно, свидетельствует о пока неустановленной дополнительной физиологической функции этого фермента.

РНКаза 5 (ангиогенин) по последовательности проявляет некоторое сходство с птРНКазой 1, нптРНКазой 2 и пт-нптРНКазой 4: на 35, 27 и 39% гомологии, соответственно [5, 16, 32, 33, 39]. Фермент обладает уникальной специфичностью к тРНК [43] и проявляет слабую активность по отношению к стандартным субстратам