Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой"

л ■

и на правах рукописи

АНДРИЕВСКАЯ ОЛЬГА АНА ТОЛЬЕВНА

РНК-ГИДРОЛИЗУЮЩИЕ АНТИТЕЛА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ,

03.00.04 - Биохимия /

/7Н-1

и

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1998

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Нсвпнскнй Г. А. кандидат химических наук Бунсва В. Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Загребельнып С. Н. кандидат биологических наук Кит К). Я.

Ведущая организация:

Институт биоорганпческой химии

им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, г. Москва.

в Новосибирском институте биоорганпческой химии СО РАН по адресу: 630090, Новоснбнрск-90, пр. акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганпческой химии СО РАН.

/

Автореферат разослан "

м

1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук

Федорова О. С.

ОКЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЬОТЫ.

Актуальность проблемы. Классической функцией иммуноглобулинов (1§) ¡вляется способность к образованию прочных комплексов с антигеном, являющимся гричпной их возникновения. Полингом Л. (1948 г.), а позднее Дженксом В. (1969 г.) >ыла высказана гипотеза, согласно которой антитела, комплементарные структуре гереходного состояния химической реакции, должны катализировать эту реакцию, 'скоряя достижение переходного состояния. Экспериментальное подтверждение эта тгпотеза получила в 1986 году, когда двумя группами исследователей при гммунизации животных стабильными аналогами переходных состоянии химических )еакций были получены антитела, катализирующие эти реакции. В настоящее время !звестно более 60 каталитически активных антител (абзимов), способных сатализпровать химические превращения, для многих из которых не существует фиродных ферментов

В 1989 году Полом С. и соавт. в сыворотке крови больных астмой были ¡первые обнаружены природные каталитически активные антитела, обладающие ¡ысокоселективной нентид-гндролпзующей активностью. 13 1991-92 гг. в сыворотке сровп больных системной красной волчанкой (СКВ) были найдены антитела к ДНК : дезоксирибонуклеазной активностью. Эти антитела проявляют каталитические :войства. отличные от свойств известных про- и эукариот ических ДНКаз.

Открытие природной ферментативной активности антител существенно вменило традиционные представления о роли и функции иммуноглобулинов в гммунной системе организма, гак как ранее считалось, что антитела не способны сатализпровать химические превращения антигена.

Появление каталитических аутоантител у человека, как правило, связано с тутонммунной патологией, что дает основание предполагать участие каталитически тктнвггы.х антител в патогенезе заболевания. В последнее время ДНК-чтдролизующие антитела (АТ) были обнаружены в сыворотке крови больных тейкемией, СПИД, при лучевой болезни (ИМБ, РАН), аутоиммунном тиреоидите, юлиартрнте, рассеянном склерозе (НИБХ СО РАН). Очевидно, что появление гбигмов является общей тенденцией ответа иммунной системы организма при тяжелых поражениях.

Системная красная волчанка - заболевание, отличительной особенностью соторого является продукция антител к нативной двуцепочечной ДНК, кроме этого 5 организме образуется широкий спектр антител к различным аутоантигенам, что определяет большое разнообразие клинических проявлений СКВ. Для СКВ •¡арактерна более высокая, по сравнению с другими аутоиммунными нарушениями, 3,НКазная активность поликлональных АТ, опубликованы данные об обнаружении в грепаратах полнклональных СКВ-1§0 протеолитической, гиалуронидазной, тероксидазной активностей. На сегодняшний день крайне мало известно о Зиологической роли каталитически активных антител, об их участии в патогенезе 1утоиммунных заболеваний, о механизмах их генерации. Исследование природных тбзимов является актуальным с фундаментальной точки зрения, так как позволяет расширить представления о роли и функции антител в процессах жизнедеятельности

человека в корме и при патолог ии, а пак же может иметь и практическую иеиноетт поскольку может привести к созданию новых методов диагностики и терашн аутоиммунных заболеваний.

Цель Ii задачи исследования. Целью настоящей работы было исследовани РНК-гидролизующих антител из сыворотки крови больных СКВ:

- доказательство наличия рибонуклеазной активности у Ig;

- установление расположения активного центра на субъединицах молеку. иммуноглобулинов;

- определение субстратной специфичности Ig и кинетических параметро реакции расщепления модельных субстратов;

- сравнение эффективности растепления дезокси- и рибоолигонуклеотидов; -сравнение рибонуклеазной активности антител разных классов и РНКа

сыворотки крови человека.

Научил» ноииша и практическая ценность работы. Впервые показано, что иммуноглобулины классов G и М из сыворотки крови больных СКВ обладают РНК-гпдролпзующей активностью. Приведены доказательства рибонуклеазной активности СКВ-антител в соответствии с рядом классических и разработанных нами критериев. Определены закономерности субстратной специфичности и оптимальных условий рибонуклеазной активности антител классов М и G. Показано, что lgM обладают более высокой РНКазноп удельной активностью по сравнению с IgG. В работе детально исследованы закономерности взаимодействия РНК-гидролизутошпх антител и рибонуклеаз сыворотки крови человека с модельными субстратами (физико-химические и кинетические характеристики катализируемых реакций). Полученные данные свидетельствуют о ряде уникальных свойств РНК-гидролизующих иммуноглобулинов, отличающих их от сывороточных РНКаз.

Результаты проведенного исследования могут найти применение в исследовании механизмов индукции п развития аутоиммунных патологий, разработке новых методов диагностики и терапии аутоиммунных заболеваний, получении биокатализаторов с уникальной специфичностью.

Анробпппя работы. Результаты работы были представлены на следующих научных симпозиумах и конференциях:

1. The 3-d International Meeting '"Ribonncleases: Chemistry, Biology, Biotechnology". Capri, Italy, 9-13 May, 1993.

2. The First International Conference " Catalytic antibodies and Antibody Engineering", Moscow, Russia. June 6-11, 1993.

3. The X Russian-German Symposium "Structure and Function of Genome", Suzdal, Russia. 25-28 August. 1993, 33.

4. The 4-th International Meeting " Ribonncleases: Chemistry, Biology, Biotechnolog; Groningen, Netherlands. 14- 18 July, 1996.

5. 17'1' International tRNA Workshop, Kazusa Akademia Center. 1997, May 10-15.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов п методов, результатов и их обсуждения.

включения, выводов п списка цитированной .ипературы. Работа изложена на 126 :границах, содержит 32 рисунка и 7 таблиц. Ьнблиография включает 187 штературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Одной из наиболее важных задач при изучении каталитических функций штител является доказательство того, что химические реакции катализируются теиосредственно иммуноглобулинами, а не какими-либо совыделяющимися фимесями ферментов. В настоящее время разработан ряд достаточно строгих ;ритериев для однозначного отнесения каталитической активности гомогенных фепаратов антител непоредственно к абзимам. Эти критерии включают: i) совпадение профилен поглощения белка и ферментативной активности при гель-|)ильтрацип в кислых или щелочных условиях или в присутствии хаотропных центов, б) адсорбцию активности антител in раствора иммобилизованными анти-[нтителами, в) проявление активности препаратами Fab-фрэгментов антител или сдельными целями антител, г) выявление ферментативной активности антител юсле ренатурацнн в геле, д) сравнение субстратной специфичности, сродства :убстрата и кинетических характеристик реакции катализируемой аиттелами и ферментами с аналогичной активностью.

Выделение иммуноглобулинов m сыворотки крови человека.

Для исследования нуклеазноп активности иммуноглобулинов из ыворотки крови больных СКВ в первую очередь необходимо было получить омогеиные препараты антител без примесей ферментов-аналогов. Для решения той задачи была разработана схема выделения препаратов IgG и IgM (рис. /).

Выделение иммуноглобулинов из сыворотки крови больных СКВ фоводили с помощью аффинной хроматографии на Protein A-Sepharose. Тротеин А из Staphiloccocus aureus обладает высоким сродством к Fc-учаеткам 1ммуноглобулинов подклассов Gl, G2 и G4, а так же к консервативным участкам :аЬ-фрагментов некоторых подклассов IgM и IgA, что позволяло, во-первых, юбиться количественной сорбции антител на аффинном носителе даже при их шзкой концентрации, во-вторых, проводить селективную элюцию компонентов 1ммунных комплексов (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) в условиях с ювышенной ионной силой или в присутствии неионных детергентов, не атрагивая при этом комплексов Ig с протеином А.

Суммарный препарат антител, выделенный с помощью аффинной роматографии из сыворотки крови больных СКВ, обладал РНК-гидролизующей ктивностыо, причем профиль относительной активности фракций совпадал с роматографическим профилем белка. Препарат Ig после хроматографии на 'rotein A-Sepharose, согласно данным электрофоретического анализа и езультатам иммунодиффузии с моноспецнфнческими антисыворотками против азных классов антител человека, содержал как IgG, так и IgM.

Рис. 1. Выделение ^С п 1«М из сыворотки крови

сыворотка крови

осаждение 50%-ным сульфатом аммония

I

осаждение 6%-ным ПЭГ-6000 выделение 1дМ ^^^ ^выделение 1дй

Аффинная хроматография осаждение 11%-ным ПЭГ

на Protein A-Sepharose ■!

Аффинная хроматография

Гель-фильтрация на Toyopearl HW-60 на Protein A-Sepharose

рН 2.6 ("кислый шок") ^

^ Гэль-фильтрация наТоуореагI HW-55

Аффинная хроматография рН 2.6 ("кислый шок")

на ДНК-целлюлозе ^

^ Аффинная хроматография

Ионообменная хроматография на ДНК-целлюлозе

на ДЕАЕ-целлюлозе |

Ионообменная хроматография на CM-Trisacril

Анализ относительной РНКазной активности фракции, полученных гель фильтрацией суммарных AT, показал более высокую гидролит ическук активность IgM по равнению с IgG. Эта особенность была характерна для все? исследованных препаратов СКВ-АТ, содержащих заметные количества IgM. [ связи с этим были разработаны методы выделения гомогенных препаратов IgM i IgG пз крови одного и того же больного с целью последующего сравнения и: энзпматических характеристик.

Учитывая возможную конкуренцию IgM и IgG за связывание с Protein А Sepharose, на первой стадии сывороточные белки разделяли фракционированием i помощью 6% ПЭГ-6000. При этом IgM и иммунокомплексы осаждалиа полностью, a IgG присутствовали в осадке в следовых количествах. Поел! адсорбции обогащенного IgM препарата антител на Protein A-Sepharose, сорбец промывали буфером, содержащим неионный детергент Triton Х-100 разрушающий неспецифнческие комплексы белков, п AT элюировали кислыл буфером (рН 2.6). Согласно данным электрофореза, полученные после этой стадш препараты AT не содержали тестируемых по окраске серебром каких-либо други: белков кроме IgG и IgM.

Нековалентные комплексы AT (даже очень прочные) диссоциируют npi низких значениях рН: инкубация AT в буфере с рН 2.6 и их последующая гель фильтрация в кислом буфере используется в качестве общепринятой доказательства каталитической активности AT. Этот подход был применен дл очистки Ig. Смесь IgG и IgM, элюированная кислым буфером Protein A-Sepharose. была подвергнута гель-фильтрации при низких значениях р! (рис. 2. и). После SDS-электрофореза фракций IgG и IgM, восстановлении

2-меркаптоэтанолом, были идентифицированы только две белковые полосы. :оответствуюгцие по молекулярным массам их I,-цепям (20-22 кДа) и Н-иепям (50 кДа или 70 кДа, в зависимости от класса АТ) {¡тс. 2, б). ,1-цепь обладает электрофоретической подвижностью, близкой к подвижности легкой цепи

100

Рис. 2. Профиль хромагографи-ческого разделения 1цМ и на

колонке со смолой Тоуореаг! НХУ-бО в условиях 'кислого шока' (я), и анализ гомогенности полученных препаратов АТ после обработки 2-меркаитоэта-по.юм с помощью электрофореза в 5-15"о КПЯ-ПААГ (6). а) ( )-

поглощение белка при 280 нм. (—) -от носительная рибонук.геазная

активность фракций А'1. и) Дорожки: . 1 - |£М. 2 - ^О и М - маркернме_ белки.

60 70 Объем, мл

иммуноглобулинов. Время выхода РНК-г идрол1иующеп активности совпадало с временем выхода белковых пиков, соответствовавших АТ классов М (- 970 кДа) (пик I) и в (~ 150 кДа) (пик 2). Удельная акт1твпость в гидролизе РНК превышала таковую для примерно в 5-10 раз для всех исследованных препаратов АТ. Следует особо отметить, что и 1§М из сыворотки кроим 12 здоровых доноров, а также пациентов с заболеваниями неаутоиммунного характера (пневмония, грипп и т.д.) не обладали тестируемым уровнем ДНКазной и РНКазной активности.

Совпадение времени выхода пиков РНК-гидролизующей активности со временем выхода иммуноглобулинов в ряде хроматографических разделений, а гак же электрофоретическая чистота препаратов АТ свидетельствовали о том, что обнаруженная активность являлась собственным свойством иммуноглобулинов.

Дополнительную очистку АТ, обладающих сродством к НК, проводили их аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе. Было обнаружено, что 40- 70% АТ не имели сродства к ДНК (пик 1, рис 3, а). РНКазной {рис 3, а,) и ДНКазной (рис 3, б) активностями обладали фракции (2-4) с относительно низким сродством к ДНК-целлюлозе, в то время, как фракции с высоким сродством, элюированные в жестких условиях (кислый буфер или хаотропные агенты), обладали низкой гидролитической активностью по отношению к РНК и ДНК. Это можно объяснить тем, что антитела, способные эффективно катализировать реакцию гидролиза нуклеиновых кислот, образуют относительно менее прочные комплексы с ДНК, чем ДНК-связываютцие иммуноглобулины без активности, характеризующиеся более низкими значениями

б к 1 2 34 56

а

0.5

rt Z

1.0

100 i?

0.5

Рис. 3. (а) 11рофи.'п> хромате)! ра-фичсского разделения CKB-IgG ма ДНК-целлюлозе. PIIK-гплролизуюшая активное) ь

(¡¡ракций хроматографии представлена в виде гистограммы.

(6) Электрофоретическии анализ гидролиза ДНК pBR 322 мри инкубации с фракциями IgG после аффинном хромат Ol рафии на ДНК-целлюлозе.

<

0

10 12 Объем, мл

Одним m показателей, подтверждающих наличие РНКазноП активности у IgM или IgG, является уменьшение или полное исчезновение ферментативной активности в препаратах антител после инкубации с аффинными сорбентами (Protein G - Sepliarose, анти-IgG-Sepharose, aimi-lgM-Sepharose).

Результаты аффинной рехромаюграфип IgG на Protein G - Sepliarose (белок G эффективно связывает Fc-участкн IgG всех подклассов) показали, что рпбопуклеазная активность количественно сорбируется на носителе, и элюнруется с IgG. Кроме того, предынкубация реакционной смеси, содержащей IgG. с Protein G-Seplmrose приводила к исчезновению рпбонуклеазнон активности из раствора (jmc. 4, а).

а

б

5, 6 4

3

Время, ч

10 20 30 40

Время, мин

Рис. 4. (а) Кинетика гидролиза |'Н|г(рЛ)|, иод действием IgG (1) в присутствии 5 мкл (2), 10 мкл (3). 15 мкл (4) Protein G-Sepliarosc: 5 - кошрольный гидролиз в отсутствие анпнел. 6 - гидролиз IgG здорового донора, (о) Кинетические кривые гидролиза [5'-'"Р]г(рА)|1 к присутствии IgM (I), IgM и airrn-lgG-Scpliarose (2), IgG (3), IgG и анти-IgM-Sephurose (4), IgM и amTi-IgM-Scpharose (5). IgG и амти-IgG-Sepluiiose (6). / - контроль.

Предварительная инкубация препаратов антиген с сорбентом с [ммобшппованными моноклональными антителами к lgG человека приводило к 1счезновению активности в реакции гидролиза рибо-ON (рис. 4), аналогичный 'ффект наблюдали в присутствии иммобилиюванных анги- IgM антител в >еакционной смеси с IgM.

Рнбонуклеазная активность Fab-фрагментов антител.

Одним из доказательств кагатигической активности антител является .охранение энзиматнческих свойств их РаЬ-фрагментов. в состав которых входят 1егкая цепь и часть тяжелой цепи, содержащие агптгген-связывающие ¡ариабельные домены. При выделении Fab-фрагментов IgG из папаинового •идролизата использовали последовательно несколько хроматографии: 1) фоматографию на Protein A- Sepharose - на этой стадии происходило отделение гапапна и РаЬ-фрагмента IgG от исходного IgG и Fc-фрагментов антител; 2) шггообменную хроматографию на CM-Trisacril - для разделения Fab фрагмента и тапапна; 3) аффинную хроматографию на anti-Ьк- и anti-LA.-Sepharose для разделения Fab-фрэгментов по типу легкой цепи. При определении

каталитической активности Fab-фрагментов оказалось, чго более высокой РНКашой активностью обладали Fab-фрз! менты с L.K-цепыо. Fab-фрагменты IgM получали по упрощенной схеме, включающей только исчерпывающий гидролш иммуноглобулинов папаином с последующей аффинной хроматографией на anti Lk- гг на anti LA-Sepharose. Как гг в случае IgG антител, каталитической активностью обладали в основном Fab-фрзгменты IgM с легкой цепыо к-типа (рис.5).

Сравнение степени гидролиза олигонуклеотидов Fab-фрагментами антител и собствено иммуноглобулинами показало, что несмотря на сохранение каталитических функций, Fab-фрэгменты все же менее активны в реакции гидролиза НК. что. видимо, связано с участием константных доменов тяжелой цепи в формировании наиболее оптимальной для катализа конформации каталитического центра таких абзимов. ч. соотистеткенно.

I 2 3-4 5 6 7

• ~ с? от

Рис. 5. Радиоавтограф электрофоретичес-<oi'o разделения продуктов гидролиза [5"-':Р]г(рА)|з в присутствии IgM и их |>рагмешои. / - контроль; 2. 3 - Fab(k): 4, 5 ■ I-'ah(A): 6. 7 - IgM; время инкубации 0.5 и

Тестирование РНК- п ДНК-гпдролнтическпх aicTiiBiiocici препаратов иммуноглобулинов в геле.

Надежным и наглядным методом идентификации ферментативной функци белков является тестирование их активности в геле после электрофоретическог* разделения фермента в условиях разрушения белковых комплексов в присутстви SDS. Для доказательства НК-гидролизующей активности IgG применяли SDS электрофорез в ПАА-геле, содержащем высокомолекулярную ДНК пли РНК После электрофореза белки ренатурировали путем удаления SDS и определял активность in situ. Как видно из рис.6, в местах положения полипептпдоЕ соответствующих молекулярной массе -150 кДа (IgG) и -20 кДа (L-цепь IgG ДНК {¡тс. 6, /, и, дорожки / и 2) или РНК (рис.6. II, а, дорожки 3 и 4) был гидролизованы и не окрашивались бромистым этиднем. Окрашивание НК в други участках геля приводила к равномерной флуоресценции всей поверхности гел> Таким образом. РНК- и ДНК- гидролнзующая активность антител подтвержден одним из наиболее достоверных методов. Следует отметить, что IgG существенн активнее отдельных L-цепей в реакции гидролиза РНК и ДНК.

I

I

I

кДа

94 Ы 42

30

II

I

•в»

Рис. 6. Элсктрофоретическос разделение белков в ПАЛГ (5-15%). содержащем ДНИ (I) или РНК (II). а) Негатив фотографии геля, окрашенного бромистым тшдием после ренатурации белков, б) Гель, окрашенный кумасси R-250.

I.a)/- IgG + D I T; 2 - IgG: 6) I - IgG + DTT: 2 - lgG : 3 - маркеры.

II. a) 1 - IgG + D I T: 2 - IgG: 3 - РНКаза 4; 4 - РНКаза 3 сыворотки крови человека. б) 1 - IgG + DTT: 2 - IgG: 3 - маркеры.

На основе вышеперечисленных результатов можно сделать вывод наиболее вероятной локализации НК-гидролизующих центров IgG и IgM на I цепи к-типа. При этом следует отметить, что тяжелые цепи Ig, по-видпмом\ вносят существенный вклад в формирование активных центров этих абзимов.

К!

Cyfici р;п пая специфичность антител и РНклз сыворот ich кроки.

Согласно полученным результатам, некоюрые препараты антител плролизонали ро1у(Л). Из известных секретируемых рибонуклеаз человека только НКазы 1-ю типа способны с низкой '.ффеьтивностыо расщеплять polyfА). 1релстан11ялось необходимым провести сравнение особенностей гидролиз РНК нтнгеламн п рнбонуклеазами сыворотки крови человека. Для этих целей спользовали РНКазу 3 и РНКазу 4 (июформы РИКазы I). так как зги белки меют молекулярные массы (20 и 16 кДа. соответственно), наиболее близкие к ассе легкой цепи иммуноглобулинов и, вследствие этого, ,\ioiyr быть отенцнальными примесями препаратов AI. иедекшруемыми при определении лектрофоретической чистоты препаратов AI. Препараты рибонуклеаз ? и '-I бытн ыделены нами из сыворотки крови доноров, они были энзиматнчгч ки омогенными согласно данным по определению ферментативной активное]и поске лектрофоретического разделения и ренатурапнп этих нуклеаз в РНК-содержашем еле (juic. 6, II а\ дорожки 3 и 4).

При определении субстратной специфичности РНК-гидролизующих антител спользовали классические субстраты РНКаз - суммарную дрожжевую РНК. oly(A). poly(U), pol\(C). Субстратная специфичность AT была индивидуальна рактически в случае каждого пациента, но тем не менее сохранялась обитая ендешшя уменьшения относительной скорости растепления в порядке' РНК > oly(U) > poly(A) » poly(C) (табл. I).

При сравнении активности препаратов анимел. выделенных из сыворотки рови одного пациента, можно было отметин,, что IgM обладали в 4-6 раз большей дельной активностью по сравнению с IgG.

В табл.1. суммированы результаты определения субстратной пецифичности гидролиза полимерных субстратов AT, сывороточными .РНКазами и 4 человека, а также бычьей панкреатической РНКазой А. Из представленных аттных видно, РНКазы 3 и 4 являются пиримидин-специфичными и не проявляют естируемой в условиях эксперимента активности по отношению к poly(A). В тлнчие от рибонуклеаз. препараты IgM и IgG, как правило, эффективно асщепляли poly(A) п относительно медленно деполимеризовали лучший для НКаз субстрат - poly(C). Следует так же отметить, что рибонуклеазы. тносящиеся к одному типу (имеется ввиду тип РНКазы 1), проявляют одинаковую убстратную специфичность независимо от источника выделения. Субстратная пецифичность абзимов обычно была более вариабельна, несмотря на общую етодику выделения из сыворотки различных индивидов, что также может видетельсгвовать в пользу рибонуклеазной активности сотчвенно ммуноглобулинов.

Таблица 1. Удельная РНКазнан активность препаратов антител и рибонуклеаз при гидролизе полинуклеотпдов и РНК.

Удельная активность, ед/мг*

пол и (А) поли (С) поли (и) РНК

Я/** 120 30 170 100

-О 200 140 150

ПЗ 100 60 90 110

1цМ ПО* ~0 ~0 ~0 ~0

1цМ П1 420 100 500 620

1цМ П2 200 100 700 800

1цМ ПЗ 140 40 500 440

/«Л/ П4 ~0 380 700 900

РЛКта3 ~0 4000 200 1200

РП Ки т 4 ~0 4300 200 970

РНКи ш А ~0 5800 300 1300

* За единицу активности принимали количество белка, способное перевеси в кислоторастворпмую форму 0,1 А^о субстрата за 10 мин при 37°С. ** П1 - П4 - пациенты 1 - 4. " 1«М из сыворотки крови здорового донора.

Ошибка эксперимента не превышала 20%.

Для изучения особенностей субстратной специфичности нуклеазно! активности антител было проведено исследование характера расщеплени: модельных субстратов - олигорибонуклеотидов (г01Ч) 1 олигодезоксирибонуклеотидов (<ЮМ). Скорость реакции гидролиз; олигогомодезокспрнбонуклеотидов не зависела от нуклеотидно! последовательности субстрата, но в то же время в случае гетерогенных по состав; субстратов можно было отметить преимущественные сайты гидролиза, но общи: закономерностей специфичности расщепления установить не удалось. По мер увеличения длины субстрата наблюдали увеличение степени гидролиза от 5% дл тетрануклеотида до 80% для тетрадекануклеотида.

Анализ характера гидролиза показал, что 1« можно отнести

неспецифическпм рибонуклеазам, причем 1§0 гидролпзовали ЮЫ со сравнимым: скоростями независимо от нуклеотидного состава субстратов {¡тс. 7). Антител эффективно расщепляли олигорибоаденилаты. что не характерно для известны

Рис. 7. Радиоавтограф геля после электрофоре! ического разделения продуктов ппролиза [5'-':P]rON с помошыо СКВ-ls(i (лорожки 2. 5. 8) и РНКадш 3 из сыворотки крови человека (3. 6 9). Дорожки 1. 4. 7 - контроль. rOM: I, Л 3 - г(рС),<,. 4, 5. 6 - (pU)in. 7. 9 - r(pA)i j.

рибонуклеаз высших организмов. В пределах одного

олигогетерорибонуклеотила. как и в сл\чае с dON, можно было выделить преимущественно расщепляемые сайты. При сравнении скорости расщепления антителами гомологичных iON и dON оказалось. что СКВ-АТ на I 2 порялока эффеект ивнее расщепляли

метить. что как деюксн . ! и к и рибоолшоаденп.таты являлись лучшими субстратами по сравнении) г трут ими гомоолш онуклеотидами.

Оптимальные условии гидролиза субстратов антителами и РНКатами сыворотки крови.

Для определения оптимальных условии гидролиза и кинетических параметров реакции, катализируемой AT, был выбран г(рА)|-,. гак как этот субстрат, как было показано, эффективно расщеплялся каталитически активными иммуноглобулинами и с очень низкой эффективностью тпдролизовался рибонуклеазами сыворотки крови человека (рис. 7)

Зависимость активности А Т от рН в реакции расщепления ON.

При изучении оптимальных условий гидролиза олигорибоаденилата было обнаружено, что Ig проявляют широкий диапазон оптимальных значений рН. Для иммуноглобулинов класса G рН-оптимум находился в щелочной области и форма кривой имела 1 или 2 пика в зависимости от донора (рис. 8, а). Относительная активность IgG в реакции расщепления г(рА)ц была максимальной, как правило, в интервале значений рН 7.2-8.4. Особенно ярко индивидуальные особенности препаратов антител из сыворотки крови разных пациентов проявились при анализе зависимости РНКазной активности IgM от рН реакционной смеси. Зависимость относительной активности IgM щ рН раствора для каждого пациента была индивидуальной: в качестве примера на рис. S. в приведены данные для трех препаратов AT. Как правимо, для IgM, гидролпзуюшнх r(pA)i;, оптимальное значение рН находилось в диапозоне от 6.2 до 8.8.

а

100 -

с с

¿Г

H с_> О

m

н

< 50 '

6.0 6.5 7.0 7.5 8 8.5 9 9.5 рц 5.0 (1 о 7.0 8.0 9.0 рЦ

Рис. 8. Зависимость относительной активности препаратов CKB-lgCI 111 ( —). 112 (—) в

реакции гидролиза ['11]г(р/\)|- (а) и препаратов CKB-lgM III (---). 112 (.....) и 113 (—) в

реакции гидролиза [5'-"'"P|r(pA)u (о) от pi I реакционной смеси. В качесте контроля приведена pl (-зависимость рибоп_\ клеазпой активности нренараюп leM ir IgG здоровых допоров (-------).

Тем не менее, для одного из препаратов были выражены максимумы активности при рН около 7.8 и 8.7. в другом препарате преобладали IgM, расщеплявшие r(pA)|-, с оптимальным значением pli в интервале 8.2 - 0.0. а третий - не имел выраженных оптпмумов. Такое ярко выраженное многообразие оптимальных условий для катализа реакции расщепления можно объяснить гетерогенностью составляющих компонентов пулов каталитических IgM или IgG. Разные клоны РНК- гпдролизующих антител могли различаться, с одной стороны, по принципу организации каталитического центра, с другой стороны, по вариациям в микроокружении инвариантного каталитического центра. И в том, п в другом случаях картина зависимости каталитической активности разных препаратов поликлональных антител могла изменяться в зависимости от удельной доли тех или иных типов в объединенном пуле AT.

Влияние ионной силы и двухвалентных металлов на РИК-гидралтующую активность антител.

NaCl эффективно ингибировал гидролиз г(рА)п с помощью AT даже при низких концентрациях {¡тс. 9, а), что, возможно, указывало на существенный вклад электростатических взаимодействий в образование комплекса IgM с субстратом. Гидролиз, катализируемый IgM, активировался ионами Mg" или Mir'; ионы CV практически не влияли на скорость реакции (рис. 9, о), а добавление EDTA приводило к существенному ингибированию. Ионы двухвалентных металлов проявляли аналогичное влияние и на активность IgG.

Важная роль ионов двухвалентных металлов в катализе реакции расщепления РНК иммуноглобулинами может являться следствием несовершенства организации каталитического центра, в результате чего функция

= 100

§ 50 -

50 100 150 200

[NaC'l]. мМ

24

[Mc: ! mM

Рис. 9. Мтияние коннешрации NaC'l (и) ионии M»2' (/). Mir (2). Ca2+ (i) <(>) па ornocHie.iumt) акшиюсп. 1цМ н реакции гидролиза [5'-'Т|г(рЛ)п.

некоторых недостающих

элементов (например,

аминокислотных остатков,

входящих в активный центр, организованный по типу РНКазы А: одного из гистидинов и Lys) может быть перенесена на

координированный ион метапла. Кроме того, ионы металла могут являться кофакторами

гидролитической реакции. что обусловлено особенностями

организации активного центра КААТ.

При изучении оптимальных условий гидролит [5'-'"Р]т(рЛ)|1 РНКазамп 3 и 4 оказалось чго они имели близкие шаченпя рН-оптнмумов в интернале 7.2 -7.4. NaCI в фнзиоло!ической концентрации (0 15 М) в реакционной смеси практически не влияла на активность

сывороточных рибонуклеаз. а ингибированпе наблюдали при повышенной ионной силе (0.3 М ЫаС1), ионы Mg" так же практически не оказывали существенного влияния на активность сывороточной РНКазы 4. Таким образом, оптимальные условия реакции гидролиза олигоаденилатов РНКазамп сыворотки крови человека и 1«М существенно отличались.

Одним из широко известных свойств рибонуклеаз семейства панкреатической РНКазы А является их высокая термостабильность: по литературным данным сывороточные РНКазы человека сохраняют от 50 до 90% активности после инкубации при 65°С. Было проведено сравнение устойчивости к нагреванию РНКаз 3 и 4 сыворотки крови человека и иммуноглобулинов С и М, а гак же РаЬ-фрагментов ^М (рис. 10). Сывороточные РНКазы полностью инактивировались после предынкубацни в течение 15 мин при 75°С. Рибонуклеазная активность антител оказалась менее устойчива к нагреванию. Инкубация 1»М-абзимов при 55ПС, а РаЬ-фрагментов 1§М при 45°С приводила практически к полной инактивации их РНКазной активности. Нативные сохраняли рибопуклеазные свойства в более широком, по сравнению с 1цМ, температу рном интервале - инактивировались при 65°С.

Рис. 10. Влияние температуры предынкуба-ции на активность ^М (1). РаЬ-фрагмснта 1рМ. содержащего легкие цепи к-гипа (2). ^О (3) 1! реакции гидролиза |5'-:,:Р]г(рЛ)|з.

Кинетические характеристики реакции гидролиза О!4

иммуноглобулинами класса М н РНКазами сыворотки крови человека.

Величины констант Михаэлиса (Км) и максимальных скоростей (У11т реакции гидролиза г(рА)|3 различными препаратами 1»М анализировали I помощью методов Иди-Хофсти, а также Эйзенталя и Корниш-Боуден. Наиболе! точным п наглядным оказался последний подход.

Рис. 11 Зависимость начальной скорости расщепления [5'-':Р]г(рА)|3 ^М. выделенными из сыворотки крови различных больных СКВ от концентрации ОЫ в координатах Эйзенталя и Корниш-Боуден.

В большинстве случаев график имел веерообразный вид с нескольким значениями Км в интервале 10"8—10"7 М {рис. II, б, в). Это свидетельствовало том, что препараты содержали несколько типов абзимов, имевших различно сродство к субстрату. Только в случае одного препарата поликлональных АТ (1§1\ П 1) было определено одно значение Км (4.3 • Ю"8 М). Для данных АТ был проведе сравнительный анализ кинетических параметров реакции гидролиза г(рА),3 с1(рА)|3, представленных в табл. 2.

Оба субстрата имели практически одинаковое значение Км, но скорости идролиза (VmaJ и константы скорости (kcat) различались, для г(рА)1:, эти величины ia два порядка выше. Необходимо отметить, что приведенные кажущиеся начения кса1 рассчитывали, исходя из обшей концентрации Ig в реакционной меси без учета неполного разделения НК-связывающих и НК-гидролизующих нтител, и, таким образом, величины кса| имели, скорее всего, заниженное качение.

Следует подчеркнуть, что во всех исследованных случаях значения Км для iT варьировали в диапазоне 10"8 - 10"7 М. Такое сродство xapaKTepiTO для запмодеиствий типа 'антиген-антнтело'. оно на 2-3 порядка выше сродства писанных в литературе рибонуклеаз.

Константа скорости реакции растепления олигорибонук.пеотидов нтителами класса M имеет одинаковый порядок независимо от нуклеотидного остава субстрата. В противоположность этому, при сопоставлении значении инетических характеристик реакции гидролиза олшоОА) и олиго(1!) РНКазами 3 4 сыворотки крови человека можно увидеть (табл. 2), что величины Км для ггнх лигонуклеотидов имеют одинаковый порядок., в то время как значения Vmax и kL.„ азличаются на три порядка.

Таблица 2. Кинетические п термодинамические характеристики еакцин гидролиза d(pA)|3, г(рА),з и p(lJ)m 1<»М-абзнмамп, РНКазами 3 и i ut ыворотки крови человека и панкреатической Р H Казни Л.

■уйстраш препарат A',,, M ^ /нал > M-muii 1 к,,,,, мин'1 SI, i\T - мин

<1(рА)п IgM ni 5.4x10 8 4.3x10"' 2.7x10" 5.0x105

r(pA)n IgM m 4.3x10"8 1.5x10 8 1.5 3.4xl07

IgM П2 8.7x10-8 1.8x10 8 1.8 2.1xI07

I.02xl0"7 3.2x10 8 3.2 3.1 xlO7

РНКаза A 3.4x10"6 2.7x10"'" 2.2xl0"2 6.4xl0J

РНКаза 3 4.9x10"6 3.8x10 1U 1.7xl0"2 3.5xl03

РНКаза 4 7.2x10"6 1.5x10"' 5.2x10"2 7.2xl0J

p(U)m IgM ni 1.3xl0~7 5.8x10 8 5.8 4.5xl07

РНКаза 3 2.1xl06 3.7xl07 37 1.8xl07

РНКаза 4 5.6x10"л 2.6x10"7 26 4.6xl06

Е] ~ 1.0 х 10s M

эгрешность измерений не привышала 30%.

Скорость расщепления (Vmax) олпгоуридилата IgM по сравнению аналогичной величиной для РНКаз сыворотки на порядок ниже, но, с друго стороны, эффективность катализа (отношение кса1/Км) реакции расщеплени олиго(и) антителами и сывороточными РНКазами в целом сравнима. Такш образом было показано, что, в отличие от сывороточных РНКаз, поликлональны IgM не дискриминируют олигоаденилаты и олигоуридилаты, но тем не мене оставалось неясным, являлось ли отсутствие субстратной специфичност свойством AT одного клона, или же в реакции расщепления олиго(и) и олиго г(А участвуют IgM разных клонов.

Взаимодействие моноклональных мышиных СКВ-антител олигонуклеотндамн.

Как было показано выше, одни и те же препараты CKB-IgG гидролпзоват как ДНК, так и РНК. Аналогичный результат получен и в случае IgM - абзимо Данные по анализу специфичности IgM - и IgG- абзимов, тестированию HI гидролизующей активности AT в геле, а так же анализ сродства субстратов к А-однозначно свидетельствовали о катализе реакции гидролиза антителами, а i какими-либо примесями рибонуклеаз. Известно, что РНКазы высших животных i гидролизуют ДНК и, наоборот, ДНКазы - РНК. Наличие у антител одновремеш ДНК- и РНК- гидролизующей активности может быть обусловлю

существованием нескольк! типов антител, специфичен реагирующих и расщепляют! только ДНК или только РНК, так же перекрестнс

ферментативной активность антител (т. е. антитела мог; обладать функция\

неспецифических нуклеаз).

Чтобы ответить на вопро обладают ли абзим

перекрестной активностью, бьи проведено сравнен:

ферментативных активност< CKB-IgG человека и мышинь моноклональных СКВ-антител B-форме ДНК (клоны 2С1 Н143 и Н241) и к Z-форме (кл< AD8). Все моноклональщ антитела к ДНК в В-форг гидролизовали как дезокси-, т; и рибо-ON.

/ 2 .5 4 5 12 } 4 .5 1 2 .> 4 л 12 i 4 .1

BF

-

* 4M» —

а Г) а

Рис. 12. Радиоавтограф гель-электрофореза продуктов гидролиза [З'-^Р^рА),, (а, о) и [5'-':Р]г(рА)|з (в, г) с помощью моноклональных антител в присутствии (а, а) или в отсутствие (6, г) ионов магния. / - контроль, инкубация без ;штитч-;т- ? - 7Г10- ? - 11?41 • 4 - И143- 5'-ДГ)8

Ъ данных рис. 12 мил но, что все моноклональные антнтела к В-форме ДНК тдролизовали олпгорибоаденилат в 50-100 раз быстрее, чем дезоксирибоаденипат, риче.м ионы магния заметно замедляли реакцию рсащепления рнбоаденилата. налогичную картину наблюдали и в случае олигоуридилатов и лиготнмидилатов. Следует отметить, что в отсутствие ионов магния эффективнее бразовывались более короткие олигорибонуклеотиды (2-5 звеньев), в то время как их присутствии -- r(ON) длиной 6-12 звеньев. В то же время, моноклональные нтитела к ДНК в Z-форме практически не расщепляли ни рибо-, ни дезокси-ON. »тсутствие НК-птдролизующей активности у антител к Z-форме ДНК являлось бъяснимым фактом - в данном случае имело место несоответствие ространственной структуры ON со связывающим участком airni-Z-flHK-lg. >днако способность антител к В-форме ДНК расщеплять как РНК, так п ДНК казалась неожиданной. Можно предположить, что в результате взаимодействия а.харофосфатного остова НК с положительно-наряженным участком вариабельною егиона Ig происходило искажение пространственной структуры субстрата, и в лучае наличия в непосредственной близости к напряженной фосфодиэфирной вязи гистидпна (эта аминокислота является медиатором кислотно-основного аталпза во многих ферментах) возможен гидролиз фосфодиэфирной связи.

В настоящее время существуют две птпотезы возникновения катлитически ктнвных антител. Лбзимы могут появляться в результате генерации антител к ереходным состояниям химических реакций или возникнуiь как нтиидиотипические антитела против антител к активным центрам ферментов, •опрос о механизме 1енерации абзимов при аутоиммунных заболеваниях о<дается ока открытым, в ряде работ сделано предположение об am ни дно типической рнроде ДНК-гидролизующпх СКВ-антител (Sinister et al.. 1992, Ciahibov et al.. 994, 1995, Puccetti et al., 1995). С другой стороны, иммунизация лабораторных сивотных вазоактивным тнттсстиналытым пептидом (ВИП) приводила к генерации аталнтнческого иммунного ответа - были получены моноклональные антитела с >ИП-гндрол1тзующей активностью (Paul et al., 1992). Нами так же показано, что юноклональные антитела, полученные в результате иммунизации животных ДНК различной последовательностью, могут расщеплять нуклеиновые кислоты. Таким бразом, на основе приведенных фактов можно предположить два нуги генерации [НК- и РНК-гидролнзулощих антител в случае больных СКВ: как против А Г к ктивным центрам ферментов (т.е. антиидиотипические КААТ), гак и против уклеиновых кислот.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые показано, что электрофоретпческн гомогенны иммуноглобулины классов й и М из сыворотки крови больных системной красно волчанкой (СКВ) обладают РНК-гидролизующей активностью. Препарат! поликлональных и ^М сохраняют РНКазную и ДНКазную активности процессе всех хроматографических стадий очистки, обработки кислыми буферам или хаотропными агентами, разрушающими нековаленгные взаимодействи белков, а также после электрофореза в денатурирующих условиях.

Нуклеазные центры абзимов расположены на легких цепях антител (ЛТ которые активны вне нативных молекул иммуноглобулинов.

2. Проведено сравнение субстратной специфичности, а также кинетически и термодинамических параметров взаимодействия ^М-, ^С-абзимов. РНКа сыворотки крови человека и панкреатической рпбонуклеазы А с олиго-полирибонуклеотидами. Полученные данные свидетельствуют о существенны различиях этих характеристик в случае исследованных абзимов и рибонуклеаз. 1 то время, как сродство субстратов к А'Г па 1-2 порядка выше, чем к рпбонуклезау отношение величин констант скорости реакции гидролиза РНК-субстрато абзимами к сответствующпм величинам (кса,) рибонуклеаз варьирует пределах 0.1-100.

3. Показано, что субстратная специфичность, кинетические параметры 1цМ а также диапазон рН-оптпмума в реакциях гидролиза субстратов антителам

являются индивидуальными характеристиками пациента. При этом, однакс сохраняется ряд общих закономерностей: изменение скорости расщепления исследуемом ряду РНК-субстратов, влияние попов одно- п двухвалентны металлов на нуклеазную активность абзимов п др.

4. Впервые показано, что моноклинальные СКВ-иммуноглобулины класса С против В-ДНК различной последовательности способны гидролизовать как ДНК так и РНК, в то время как антитела к 7-форме ДНК не обладают ни РНКазной, н ДНКазной активностью. Несмотря на то. что эти абзимы являются АТ против ДНК они гидролизуют рибо-субстраты на 1-2 порядка эффективнее, чег дезоксирибоолигонуклеотиды.

5. Анализ полученных результатов п литературных данных позволяе предположить, что при аутоиммунных заболеваниях могут реализоваться два пут1 образования ДНК- п РНК-гидролизуюших АТ: как против нуклеиновых кислот, та и антиидиотипичеекпе (вторичные АТ к активным центрам ферментов), несущи "внутренний образ" активного центра.

Основные результаты диссертации содержатся в следующих 1уолпкацпях:

I. Nevinsky G.A.. Buneva V.N., Lopaeva О.A. (Andrievskaya О.A.), Gololobov G.V. RNA-hydroIyzing autoantibodies. Proceedings of the First International Conference "Catalytic antibodies and Antibody Engineering" , Moscow, Russia, June 6-11. 1993, P. 26.

I. Buneva V.N., Lopaeva O.A.( Andrievskaya O.A.). Gololobov G.V.. Nevinsky G.A. Ribonucleic catalytic activity of autoimmune antibodies from blood sera Proceedings of the X Russian-German Symposium "Structure and Function of Genome". Suzdal. Russia. 25-28 August. 1993. P. 33.

Buneva V.N., Lopaeva O.A.( Andrievskaya O.A.). Nevinsky G.A. Ribonuclucleic catalytic activity of autoimmune antibodies from blood sera . Proceedings of the 3-d International Meeting "Ribonucleases: Chemistry Biology, Biotechnology". Capri, Italy, 9-13 May. 1993. P. 58.

4. Бунева В. П.. Андриевская О. А., Ромашшкова И. В., Г'ололобов Г. В.. Ядав Р. П., Ямковой В. И.. Невинский Г. А. Взаимодействие кагалшичсски активных анипел с олнгорибонуклеотидами. ' Молекчляр. бнолошя. 1994. I 28. вып. 4. С. 738-743.

5. Buneva V.N.. Andrievskaya О.A., kanyshkova I.G.. Vlassov A.V. Baranovsky A.G. Nevinsky CJ.A. The peculirities of ribonucleic activity of various natural cataly tic antibodies . Proceedings of the 4-th Intel national Meeting " Ribonucleases: Chemistry. Biology. Biotechnology.". Groningen. Netherlands. 1418 July, 1996. P. 7

3. Андриевская О. А. Канышкова Т. Г.. Ямковой В. И., Бунева В. П.. Невинский Г. А.. Моноклональные антитела к ДНК лучше гидролируют РНК. чем ДНК. // Доклады РАН. 1997. Т. 355. N. 3. С. 401-403.

7. Андриевская О.А.. Бунева В.Н.. Забара В.Г., Наумов В.А.. Бреусов А.А.. Невинский Г.А. Иммуно!лобулины класса М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой обладают РНК-гидролизующей активностью. // Актуальные вопросы современной медицины (сборник статей). Новосибирск. 1997. Т. 2. С. 16-17.

8. Андриевская О.А., Бунева В.Н., Забара В.Г.. Наумов В.А., Бреусов А.А.. Невинский Г.А. Взаимодействие иммуноглобулинов класса М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой с РНК. Актуальные вопросы современной медицины (сборник статей). Новосибирск. 1998. С. 310. Андриевская О.А.. Бунева В.Н., Забара В.Г, Наумов В.А.. Ямковой В.И., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК. /■' Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. N. 5. С. 908-915.