Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природные иммуноглобулины с нуклеазными активностями

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Природные иммуноглобулины с нуклеазными активностями"

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

На правах рукописи

БУНЕВА ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

ПРИРОДНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ С НУКЛЕАЗНЫМИ АКТИВНОСТЯМИ

03.00.04 - биохимия

Диссертация в виде научного доклада на соискание учёной степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2005 г.

Научный консультант:

доктор химических наук профессор Невинский Георгий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Рубцов Николай Борисович

доктор биологических наук профессор Аутеншлюс Александр Исаевич

доктор химических наук профессор Малыгин Эрнст Георгиевич

Ведущая организация:

Институт клинической иммунологии СО РАМН

р &С

Защита состоится «» 2005 г. в ~ч~

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Диссертация в виде научного доклада разослана «Ж» 2005 г

Ученый секретарь

диссертационного совета д.х.н.

Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммуноглобулины (lg) - специфические белки иммунной системы человека, играют важнейшую роль в его защите от патогенного влияния окружающей среды Антитела (АТ) узнают и связывают антигены (чужеродные организму вещества и микроорганизмы, такие как вирусы, бактерии, белки, ДНК, и др.) с высоким сродством за счет образования большого числа специфических нековалентных связей - электростатических, ван-дер-Ваальсовых и водородных. Еще в 1948 г. Л Полинг, отметив общие черты в механизмах узнавания антигенов антителами и переходных состояний химических реакций ферментами, предположил принципиальную возможность существования lg с функциями ферментов В 1969 г. Б. Дженкс, принимая во внимание максимальную комплементарность активных центров ферментов не самим субстратам, а переходным состояниям химических реакций, высказал гипотезу о том, что АТ против химически стабильных аналогов переходных состояний могут иметь структуру антигенсвязывающего участка, подобную структуре активного центра фермента, и в таком случае должны катализировать реакцию превращения субстрата подобно ферменту.

С помощью гибридомной технологии в 1986 г. были получены первые моноклональные АТ с эстеразной активностью (Tramontano А. et al., Science, 1986, 234, 1566; Pollack S.J. et al., Science, 1986, 234, 1570) и такие антитела-ферменты были названы "абзимами" (ABZYME производное от AntiBody и enZYME). На сегодняшний день уже получены моноклональные абзимы, катализирующие более 100 различных химических реакций (для обзора см. в списке публикаций

В настоящее время известно более 80 различных аутоиммунных заболеваний, некоторые из них относятся к главным медицинским и социальным проблемам современного общества - ими болеют люди активного возраста и молодежь Известно, что аутоиммунные заболевания характеризуются наличием в организме высокого титра аутоантител - АТ к эндогенным антигенам Некоторые вирусные заболевания, такие как иммунодефицит человека, вирусные гепатиты и клещевой энцефалит, не относят к аутоиммунным заболеваниям, но у людей с этими патологиями происходит существенное нарушение иммунного статуса. СПИД - заболевание, вызывающее тяжелый иммунодефицит, обусловленный прогрессирующим снижением Т-хелперов и их функциональной недостаточностью. Выраженный иммунный ответ на вирус служит важнейшим фактором, определяющим медленное прогрессирование ВИЧ-инфекции до стадии СПИД Патогенез гепатита и клещевого энцефалита сопровождается

№.

аутоиммунными гуморальными и клеточными реакциями- в крови больных обнаруживаются ткане-неспецифические и органо-неспецифические аутоантигены

Интересно, что повышение концентрации ДНК и анти-ДНК антител в крови тестируют при большом числе различных аутоиммунных патологий, таких как системная красная волчанка (СКВ), болезнь Грейвса, полимиозит, рассеянный склероз (PC), синдром Сьегрена, а также при лимфопролиферативных и некоторых вирусных заболеваниях. В случае СКВ обнаружены особенно высокие концентрации ДНК и анти-ДНК антител (Shoenfeld, У. et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 1989, 51, 313; Gabibov, A G. et al., Appl Biochem. Biotechnol., 1994, 47, 293; Kozyr, A.V. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, 75, 45).

Природные абзимы впервые были обнаружены в крови больных астмой, они высокоселективно гидролизовали вазоактивный нейропептид (Paul et al., Science, 1989, 244, 1158) Вторым примером природных абзимов были ДНК-гидролизующие IgG, обнаруженные группой А Габибова в крови больных СКВ (Shuster, А М et al, 1992, Science, 256, 665).

Открытие каталитической активности lg из крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями, а также крови и молока здоровых по медицинским показаниям женщин существенно изменило традиционные представления о роли и функции AT и поставило ряд новых вопросов о механизмах функционирования иммунной системы человека. Какие функции выполняют абзимы в организме человека в норме и при патологиях? Есть ли четкие корреляции между тяжестью заболевания и уровнями абзимов и их активности? Каким образом каталитическая активность AT влияет на состав крови, изменяет функционирование клеток, изменяет биологическую функцию других гуморальных факторов? Совпадает ли роль нормальных ферментов клетки с ролью AT, имеющих аналогичную активность, или они имеют абсолютно разные функции в организме? Почему возможно появление абзимов в молоке и крови женщин в период лактации, но не в крови «обычных» людей? В чем сходство или различие свойств абзимов и путей их наработки при аутоиммунных патологиях и у рожениц?

В настоящее время в крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями, а также в крови и молоке женщин во время беременности и лактации обнаружены абзимы, которые гидролизуют пептиды, белки, ДНК, РНК, нукпеотиды и полисахариды. Кроме того, эти AT обладают активностями супероксиддисмутаз, протеин, липид и полисахарид киназ. Успехи, достигнутые в абзимологии, отражены в ряде обзоров [18-19, 24-28, 32, 34]. А высокоактивные абзимы с антиокислительными функциями присутствуют в крови всех исследованных здоровых доноров и

животных В связи с этим встает вопрос о том, не являются ли абзимы дополнительным источником ферментов альтернативного типа, выполняющих специфические функции в защите млекопитающих от воздействия вредных факторов окружающей среды, регулирующих развитие и/или элиминацию определенных клеток организма и т д

Фундаментальные исследования, направленные на решение этой проблемы, являются очень важными и актуальными для развития представлений как о принципах функционирования АТ в живых организмах, так и об альтернативных механизмах создания ферментов в живых клетках. Развитие этих работ со временем может привести к открытию новых путей регуляции жизнедеятельности клеток при различных заболеваниях и созданию лекарственных препаратов на основе каталитически активных антител.

Цель настоящей работы заключалась в детальном анализе и сравнении каталитических свойств и биологических функций антител с РНК- и ДНК-гидролизующими активностями в норме (молоко и кровь здоровых доноров) и при различных аутоиммунных патологиях (аутоиммунные и вирусные заболевания человека, протекающие с развитием аутоиммунных реакций)- рассеянный склероз, системная красная волчанка, аутоиммунный тиреоидит (АИТ), полиартрит (ПА), вирусные гепатиты (ВГ), синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) и клещевой энцефалит (КЭ).

В ходе исследования решались следующие основные задачи.

• Доказательство наличия каталитической активности у иммуноглобулинов крови и молока человека.

• Изучение ферментативных свойств и субстратной специфичности природных абзимов молока и крови здоровых доноров и пациентов с аутоиммунными патологиями (АИП) в сравнении с обычными нуклеазами человека.

• Исследование ДНК- и РНК-гидролизующих активностей абзимов молока и крови, а также динамики изменения нуклеазной активности антител крови женщин во время беременности и лактации.

• Оценка уровня нуклеазной активности абзимов в сравнении с биохимическими, иммунологическими и клиническими специфическими маркерами крови больных с АИП для изучения молекулярных и иммунологических особенностей протекания этих заболеваний, а также для поиска новых подходов к их лечению и оценке эффективности различных лекарственных средств.

• Исследование механизмов образования абзимов у человека в норме и при нарушении иммунного статуса, а также возможной

биологической роли природных абзимов-нуклеаз и их участия в патогенезе АИП.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведено систематическое исследование ферментативных свойств и субстратной специфичности антител с нуклеазными активностями в норме (кровь и молоко здоровых женщин во время беременности и лактации) и при АИП человека (PC, АИТ, СКВ, ПА, ВГ, СПИД и КЭ) Представленные данные являются оригинальными и вносят существенный вклад в решение проблемы структурно-функциональной протеомики иммунной системы человека в норме и при АИП.

Полученные результаты позволяют сформулировать новое представление о свойствах иммуноглобулинов, а также открывают новые возможности в исследовании исключительного многообразия и необычной субстратной специфичности поликлональных абзимов крови человека с нуклеазными активностями, которые являются ферментами с уникальными свойствами. Результаты работы и используемые подходы могут служить базой для создания новых дифференциальных комплексных методов диагностики, профилактики и терапии большого числа заболеваний, ведущих к нарушению иммунного статуса человека, а также для дизайна биокатализаторов с заданными ферментативными свойствами.

Публикации и апробация работы. Автором данной работы опубликовано 55 статей по исследованию абзимов, гидролизующих ДНК, РНК, нуклеотиды и полисахариды, а также фосфорилирующих белки, липиды и полисахариды В диссертацию вошли результаты по исследованию AT, гидролизующих ДНК и РНК, изложенные в 37 статьях и 44 тезисах докладов Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях' «Catalytic Antibodies and Antibody Engineering» (Франция, 1996), «Седьмая научно-практическая конференция врачей» (Новосибирск, 1997), «International Society of Neuroimmunology Fifth International Congress» (Канада, 1998), «Tenth International Congress of Immunology», (Индия, 1998), «Восьмая научно-практическая конференция врачей» (Новосибирск, 1998), «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998), «18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology» (Великобритания, 2000), Объединенная научная сессия СО РАН И СО РАМН "Новые медицинские технологии" (Новосибирск, 2000), "RNA as Therapeutic and Genomics Target" (Новосибирск, 2001), «Опыт введения новейших достижений супрамолекулярной химии в учебные программы средних и высших учебных заведений» (Новосибирск, 2001), III Съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), II Объединенная

научная сессия СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине» (Новосибирск, 2002), «Интегративная Медицина - путь к здоровью человека в сегодняшнем мире» Международного междисциплинарного Конгресса "Progressive Scientific Technologies for Human Health" (Феодосия, Украина, 2003 г.), "Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids" (Новосибирск, 2003), Объединенный иммунологический форум ( Екатеринбург, 2004), "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 2004), Всероссийская конференция «Фундаментальные науки - медицине (Новосибирск, 2005) Международный Междисциплинарного Симпозиума «From Experimental Biology to Preventive and Integrative Medicine» (Судак, Крым, Украина, 2005).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Критерии доказательства принадлежности каталитических активностей антителам. Тестирование нуклеазных активностей иммуноглобулинов различных классов крови и молока здоровых доноров и пациентов с АИП

Для тестирования активности абзимов были получены гомогенные препараты антител (AT) из молока и крови здоровых доноров и пациентов с различными заболеваниями Выделение гомогенных препаратов lg различных классов - IgG, IgM и slgA, проводили согласно разработанным схемам, включающим аффинные хроматографии на Protein A-Sepharose (выделение IgG, IgM и IgA) и/или Protein G-Sepharose (выделение IgG), ионообменную хроматографию на DEAE-Cellulose или CM-Trisacryl (разделение lg по классам); гель-фильтрацию на Toyopearl HW-55 (рН 2.6, "кислотный шок"), Sepharose 6B-CL или Superdex-200 (рН 7 5, разделение lg по классам), DNA-Cellulose (получение фракций с повышенным сродством к нуклеиновым кислотам). Было показано, что разработанные схемы очистки AT обеспечивают получение гомогенных препаратов lg, не содержащих примесей ферментов.

Одной из наиболее важных задач при характеризации и изучении каталитических функций антител является доказательство того, что химические реакции катализируются непосредственно lg, а не примесями ферментов. В настоящее время для однозначного отнесения каталитической активности непосредственно абзимам существует ряд жестких критериев, некоторые из них были опубликованы ранее (Paul et a!., Science, 1989, 244, 1158), а другие разработаны нами в процессе выполнения данной работы (критерии №№ 2. 8. 10. 12. 13) :

I электрофоратическая гомогенность 1д (окраска белков серебром);

2. эффективное разделение смеси гомогенных АТ с экзогенными ферментами, катализирующими ту же реакцию, с помощью протоколов, используемых для очистки абзимов в процессе их выделения из биологических жидкостей;

3. проявление активности 1д крови больных, в то время как АТ крови здоровых доноров ее не проявляют;

4. гель-фильтрация АТ в условиях "рН шока" не приводит к потере каталитической активности АТ,

5. полная адсорбция активности анти-1д сефарозой и элюция 1д с сорбента буфером с низким значением рН,

6. иммунопреципитация абзимов анти-1д-антителами с потерей раствором каталитической активности,

7. выявление ферментативной активности т э^и в геле, содержащем субстрат (после БОБ-электрофореза) в участках геля, занимаемых полосами 1дС, их РаЬ-фрагментами или отдельными цепями.

8 установление различий в термостабильности энзиматических активностей АТ по сравнению с ферментами, катализирующими те же реакции;

9. отличие специфичности действия 1д от специфичности действия соответствующего фермента;

10. высокое сродство 1д к субстрату, сравнимое с таковым для комплексов антиген-АТ;

II каталитическая активность РаЬ фрагментов;

12. выявление активности у изолированных цепей АТ;

13. селективное мечение олигомерных АТ, а также субъединиц абзимов (но не примесных белков) химически активными аналогами субстратов

Следует отметить, что при доказательстве принадлежности каталитической функции непосредственно АТ были использованы препараты наиболее активных 1д в реакциях гидролиза ДНК, так как применение жестких методов обработки АТ, например, гель-фильтрации при рН 2.6 ("кислый шок") или электрофореза в присутствии БОБ приводит к очень сильному снижению удельной активности образцов.

С помощью БОБ-электрофореза с последующей окраской серебром, а также иммуноблоттинга показана электрофоретическая гомогенность нативных препаратов АТ до и после восстановления внутри цепочечных Б-Б связей (критерий 1). В качестве примера приведены данные для 1дС крови больного РС (рис. 1) и для 1дС и э1дА молока здорового донора (рос. 2).

кДа 2051169767433018 -

М I 2 3

т »

те? ъ&Ш

2 3

2 3

Ш\

ig(; (H2i 2)

— Hjl.

— »2

11-цень

L-uciii.

Рис.1. SDS-электрофо-ретический анализ препара-та IgG-PC после хромато-

графии на Protein А-Sepharose в системе Лэммли (5 - 18% градиент ПААГ) а -окраска серебром, б и в - окраска конъюгатом пероксидазы хрена с кроличьими анти-Н и анти-L IgG, соответственно. 1,2-Недиссоции-рующие условия, 3-е предварительным восста-новлением SS связей 2-меркаптоэтанолом, М - белковые маркеры

1 2 3 mm

т Ш

а

4 5 6

7 8 9 kDa

— 1-205 150 92 ■67 42 30

1 2 3

«Да

4 92

« 67

4 42

30

■4 20

4 14.4

Рис. 2. Электрофоретический анализ гомогенности препаратов AT молока в 5-15% SDS-ПААГ (окраска серебром) в недиссоциирующих условиях (а) и 12% SDS-ПААГ в присутствии 2-меркаптоэтанола (б, окраска серебром)- 1 -суммарный препарат AT после хроматографии на Protein A-Sepharose, 2 и 3 -slgA и IgG после разделения на DEAE-Cellulose, 4-6 - реплика геля, окрашенная конъюгатом анти-lgG - щелочная фосфатаза, 7-8 - реплика геля, окрашенная конъюгатом анти-lgA - щелочная фосфатаза

Исследование препаратов AT из крови пациентов с АИП (СКВ, PC, АИТ, ПА, ВГ, СПИД и КЭ) показало, что они обладают как РНК-, так и ДНК-гидролизующими активностями (ДНКазная активность при СКВ обнаружена ранее (Shuster; А М. eta!., 1992, Science, 256, 665).

Эффективность схемы получения гомогенных препаратов абзимов, не содержащих каких-либо примесей белков и ферментов, была проверена с помощью ряда различных подходов Например, к препаратам AT (IgG, slgA или суммарной фракции AT) добавляли ДНКазу I, ДНКазу II и/или РНКазу А, после чего полученную смесь разделяли, используя стандартный протокол выделения. При проведении таких процедур было показано, что эти ферменты эффективно отделяются от AT уже на стадии хроматографии на Protein A-Sepharose (критерий 2) (рис. 3).

При оценке ДНК-гидролизующей активности AT в качестве субстрата использовали суперскрученную (sc) форму плазмидной ДНК ¿ЦНК плазмид pBR-322, pBR-327 и pUC-18), что обеспечивало высокую чувствительность метода детекции Кроме того, в качестве субстратов абзимов крови и молока использовали ДНК фага X и олигодезоксирибонуклеотиды (dON), а РНК-гидролизующей - сСМР, суммарную РНК, ряд природных тРНК и их траскриптов, а также поли- и олигорибонуклеотиды (rON).

а

1 2345

I ¿у^ ^^к

1W ЩГ

«Да

205 150

92 67

42 30 20

Рис. 3. Тестирование ДНКазной активности (in situ, см ниже, критерий 7) в геле, содержащем ДНК, фракций после разделения смеси IgG молока и ДНКазы I на Protein A-Sepharose. 1 - lgG+ДНКаза I до разделения, 2 - не взаимодействующие с

сорбентом белки - ДНКаза I, 5 - фракция IgG.

а - Гель, окрашенный кумасси R250; б - гель, окрашенный бромистым этидием, после ренатурации белков и инкубирования в буфере для выявления активности.

Из данных рис. 4 видно, что удельная ДНК-гидролизующая активность абзимов при рассеянном склерозе, как и при других АИП, варьирует в широких пределах в зависимости от пациента. Одни

препараты АТ вызывают за 2 ч инкубации только одиночные разрывы в обеих цепях плазмидной ДНК (дорожки 1 - 3), что приводит к накоплению кольцевой открытой (со) формы; другие дают множественные разрывы, что приводит к образованию линейной (1.) формы (дорожки 4 - 6) и низкомолекулярных продуктов (дорожки 7 -10).

На первом этапе работы была введена 10-балльная система оценки уровня активности, где 0 соответствует отсутствию активности в выбранных условиях (дорожки К2 и К3), а баллы от 1 до 10 соответствуют номерам дорожек. Позднее относительную активность оценивали по степени гидролиза ДНК (%), подбирая концентрацию АТ такой, чтобы гидролиз ДНК за 2 ч при 37°С не превышал 30-40 % с последующей нормировкой активности на 1 мг АТ.

Необходимо подчеркнуть, что у 50 здоровых доноров достоверно тестируемая ДНКазная активность АТ не детектировалась даже за 12 ч инкубации с плазмидной ДНК, что является дополнительным показателем чистоты образцов и эффективности используемой схемы выделения (критерий 3). В случае больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-перстной кишки и некоторыми формами раковых заболеваний (рак матки, молочной железы, кишечника), протекающими без существенного нарушения иммунного статуса, ДНК-абзимы не обнаружены или их активность не превышала 1-2 баллов даже после инкубации в течение 12 ч.

К, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Кг Кз

Рис. 4. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК плазмиды рВИ322 в 0 8% агарозном геле после ее инкубации с АТ (50 мкг/мл) в течение 2 ч при 37 "С Дор К} - контрольная инкубация ДНК в отсутствие АТ; К2 и К3 -инкубация с АТ крови двух здоровых доноров; 1-10- АТ крови больных РС

Кровь пациентов со всеми исследованными АИП содержала ДНК-гидролизующие АТ с активностью от 0 до 10 баллов, однако относительное число больных с низкой (1-3 балла), средней (4-6 баллов) или высокой (7-10 баллов) активностью сильно зависело от пациента и его заболевания ДНКазная активность АТ была обнаружена в молоке у 100 % рожениц, а также в крови -98 % больных СКВ, -94% пациентов с РС, 68-100 % ВГ, -65% больных с АИТ. Данные для некоторых заболеваний приведены в табл. 1 В целом ДНКазная активность АТ увеличивалась в следующем порядке- гепатиты < АИТ < ПА < КЭ < СПИД < РС < СКВ < молоко.

Таблица. 1. Относительная ДНК-гидролизующая активность препаратов АТ из крови пациентов с различными АИП и здоровых доноров

Заболевание Количество препаратов АТ Количество препаратов АТ с тестируемой активностью Диапазон варьирования, балл (время инкубации) Активные препараты, %

Системная красная волчанка 50 49 0-10(2 ч) 98

Рассеянный склероз 53 50 0-10(2 ч) 94

Аутоиммунный гиреоидит 120 78 0-10(2 ч) 65

Гепатит В 28 19 0-10 (12 ч) 68

Гепатит В+С 22 22 1-10 (12 ч) 100

Молоко здоровых доноров 75 75 1-10 (2 ч) 100

Грипп 22 0 0 (12 ч) 0

Тонзиллит 6 0 0{12 ч) 0

Пневмония 16 4 0-1 (12 ч) 25

Язва 12-перстной кишки 8 2 0-1 (12 ч) 25

Раковые заболевания 15 0 0 (12 ч) 0

Туберкулез 8 2 0-1 (12 ч) 25

Здоровые пациенты 50 0 0 (12 ч) 0

Согласно литературным данным, низкая, но достоверно тестируемая активность обнаруживается у абзимов крови здоровых доноров, гидролизующих некоторые белки и полисахариды (Paul et al., Science, 1989, 244, 1158; Kalaga R. J. Immunol. 1995, 155, 2695; Savel'ev A.N. Clin. Chim. Acta, 2001, 314, 141). Тем не менее, результаты тестирования ДНКазной активности в препаратах AT, выделенных из крови здоровых доноров и больных не с аутоиммунными патологиями, указывают на то, что одним из необходимых условий индукции ' достоверного уровня ДНК-абзимов является протекание в организме

аутоиммунных реакций.

Для всех исследованных препаратов AT как из крови, так и из молока профиль оптической плотности совпадал с профилем ДНК-гидролизующей активности. Аналогичные результаты были получены при проведении "щелочного шока" (pH 10) (критерий 4).

При хроматографии на анти-lgG (IgM) сефарозе нуклеазная активность абзимов крови и молока полностью адсорбировалась на смоле, a IgG (IgM) элюировали буфером с низким значением pH (2 6) (критерий 5).

Добавление сорбента с иммобилизованными моноклональными AT к IgG приводило к исчезновению активности препарата IgG, аналогичный эффект наблюдали в присутствии иммобилизованных анти-lgM антител в реакционной смеси с IgM (рис. 5, критерий 6).

2 3 4

Рис. 5. Ингибирование ДНКазной активности IgG-PC аффинными сорбентами

1 - Контрольная инкубация без добавления сорбента,

2- энти-lgG-Sepharose,

3- Protein G-Sepharose,

4 - энти-lgM-Sepharose,

5 - энти-lgA-Sepharose

Номера реакционных смесей

Выявление ферментативной активности AT разработанным нами методом in situ (критерий 7) является одним из самых достоверных, наглядных и достаточных критериев, поскольку в присутствии SDS происходит наиболее эффективное разделение каких-либо белковых комплексов. Совпадение белковой полосы и выявленной активности в геле однозначно свидетельствует о каталитической функции конкретного белка.

Препараты IgG и slgA разделяли с помощью SDS-электрофореза в ПААГ (в присутствии или отсутствие 2-меркаптоэтанола), содержащем

сополимеризованную высокомолекулярную ДНК или РНК. После электрофореза активность белков восстанавливали, удаляя ЭОЭ инкубацией геля в буфере, и гель дополнительно инкубировали в буфере для расщепления субстрата Как видно из рис. 6, в белковых полосах, соответствующих интактным и Б1дА, а также продуктам из частичного восстановления (их наличие обусловлено тем, что препараты АТ не подвергали кипячению во избежание потери АТ каталитической функции), и в белковой полосе, соответствующей легким цепям 1д (дорожки 2, 4), ДНК гидролизована и гель не окрашивается бромистым этидием. Окрашивание ДНК в других участках геля приводило к равномерной флуоресценции всей поверхности геля.

а

б

кДа <-205

-92

-67

-30

slgA-

h2l2-

s-н-

L+J-

3 4 кДа

-205 -150

-92 -67

-42 -30

20

Рис. в. Тестирование ДНКазной активности IgG (а) и slgA (б) молока in situ после электрофоретического разделения белков в 5-15%-ном SDS-ПААГ, содержащем ДНК в отсутствие (1, 3 - рис. 6, л, 1,2- рис 6, б) и присутствии (2, 4 - рис. 6, а,3,4- рис 6, б) 2-меркаптоэтанола 1, 2 (рис. 6 а) и 1, 2 (рис. 6, б) -гель, окрашенный кумасси R250; 3, 4 (рис. 6, а) и 2, 4 (рис. 6, б) - негатив фотографии геля, окрашенного бромистым этидием.

Следует отметить, что удельные активности природных абзимов составляют от 0,001 до 10 % активности ферментов, расщепляющих ДНК, РНК, белки или нуклеотиды. В то же время, нельзя считать эти активности абзимов истинными, так как оцененные в настоящее время различными исследователями максимальные скорости АТ-зависимого превращения субстратов очень сильно занижены, поскольку пока не найдено методов отделения абзимов от каталитически неактивных АТ, имеющих сродство к тем же лигандам. Кроме того, абзимы теряют также активность при жестких обработках в процессе выделения.

2. Каталитические свойства природных антител-нуклеаз в сравнении с таковыми для обычных нуклеаз крови и молока. Топография активных центров ДНК-абзимов

Для сравнения ферментативных свойств ДНК-абзимов и секреторных ДНКаз были получены гомогенные препараты ДНКаз первого и второго типа из мочи человека. Сравнительное исследование свойств АТ с РНКазной активностью проводили с рибонуклеазами сыворотки крови человека' РНКазой 3 и РНКазой 4 (изоформы РНКазы 1). Выделенные препараты РНКаз сыворотки были гомогенными согласно данным их анализа методом /л вИи

2.1. Зависимость нуклвазной активности антител от рН среды, термостабильность абзимов

Обнаружено, что АТ крови больных РС эффективно гидролизуют плазмидную ДНК в широком диапазоне значений рН, и кривая зависимости ДНКазной активности от рН среды была индивидуальной для каждого из исследованных образцов. На рис. 7, а представлены данные для двух препаратов 1дС-РС, демонстрирующие значительные отличия в характере рН-зависимости

Оптимумы рН РНКазной активности больных аутоиммунными заболеваниями очень сильно зависели от исследуемого заболевания и особенно от индивида и стадии его заболевания, которая характеризуется определенной степенью активности патологического процесса (при СКВ - I, II, и III степени), основанной на диагностических критериях (клинических и лабораторных характеристиках). Чаще всего в дебюте заболевания - I степени патогенеза, можно было обнаружить один оптимум рН (например, рис. 7, б, 1) По-видимому, в процессе заболевания спектр моноклональных АТ, входящих в состав поликлональных абзимов, существенно расширяется и можно наблюдать несколько рН-оптимумов {рис. 7, б, 2) Следует отметить отсутствие четко выраженных оптимумов рН в диапазоне от 6 0 до 9 0 в случае III степени патологии при СКВ (рис. 7, б, 3)

В большинстве случаев максимальный уровень активности абзимов, гидролизующих ДНК и РНК, соответствует нейтральной или слабощелочной области рН, но тем не менее число оптимумов рН и их выраженность зависит от индивида, стадии и типа АИП Полученные данные свидетельствуют об уникальном явлении - чрезвычайном многообразии оптимумов рН у поликлональных АТ с нуклеазными активностями из крови больных АИП.

В отличие от больных АИП, оптимальное значение рН реакционной смеси гидролиза ДНК с помощью (дЭ и э1дА молока, как и для обычных ферментов, было четко выраженным и близким 7 0-7 5.

Рис. 7. а - Зависимость ДНК-гидролизующей активности 2-х препаратов IgG-РС от рН реакционной смеси б - Зависимость РНК-гидролизующей активности IgG больного СКВ от рН реакционной смеси на различных стадиях болезни 1 - I степень, 2- II степень, 3- III степень патогенеза СКВ.

Исследование температурной стабильности ДНК- и РНК-гидролизующих АТ больных АИП, ДНКаз и РНКаз человека показало, что самыми термолабильными являются 1дМ и их РаЬ-фрагменты с рибонуклеазной активностью при СКВ и РС, которые практически полностью денатурировали после инкубации при 55 °С и 45 °С в течение 10 мин, соответственно (табл. 2). Кислая и нейтральная ДНКазы мочи человека инактивировались при 80 и 75 °С, соответственно Рибонуклеазы крови человека продемонстрировали высокую термостабильность В целом, анализ термостабильности абзимов по сравнению с ДНКазами или РНКазами позволяет отличить эти ферментативные активности (критерий 8).

Таблица 2. Термостабильность абзимов и нуклеаз человека

ДНКаза II ДНКаза I, РНКаза 3, РНКаза 4 IgG-PC IgG-CKB IgM-CKB Fab-lgM-CKB

Температура инактивации,0 С, 10 мин 80 75 65 55 45

2.2. Влияние катионов металлов и ионной силы на нуклеазную активность антител

Исследование зависимости гидролиза плазмидной ДНК с помощью 1дС-РС от ионов двухвалентных металлов (5-10 мМ) показало, что их активирующий эффект для большей части препаратов убывал в

последовательности- Мп2+ > Mg2* > Zn2t > Caz+ Для IgG молока активирующее влияние на гидролиз d(pT)10 убывало в порядке- Zn2+ > Mg2+ > Mn2+ > Са2+. Аналогичная зависимость несколько более слабой активации ионами Zn2+, Mg2+, и Мп2+ наблюдалась для slgA молока, но ионы Са2+ полностью ингибировали гидролиз d(pT)10. Ионы Си2+ практически полностью ингибировали гидролиз олигонуклеотида как с помощью IgG, так и с помощью slgA. Гидролиз олигодезоксирибонуклеотидов (dON) абзимами молока протекал с заметной эффективностью и в отсутствие ионов двухвалентных металлов, что является характерной чертой AT молока, отличающей их и от ферментов-аналогов, и от абзимов при АИП Таким образом, по зависимости активности от ионов различных металлов абзимы крови больных с АИП и молока человека существенным образом отличались от известных ДНКаз человека

Известно, что все РНКазы сыворотки крови активируются 50-100 мМ NaCI или 10 мМ MgCI2 и полностью ингибируются ионами Zn2+ Исследование гидролиза г(рА)13 антителами СКВ показало, что ионы Na+ и К* ингибируют реакцию гидролиза Активирующее действие ионов двухвалентных металлов (5 мМ) на гидролиз г(рА)13 уменьшается в ряду Mg2+ > Mn2+ > Zn2+ > Са2+, при этом следует отметить, что активация IgM ионами двухвалентных металлов выше, чем IgG

Рис. 8. Гидролиз 5'-[32Р]-транскриптов TPHKLys с мутацией АЭС, полученных т vitro РНКазой А (а) и AT крови больных АИП (б) а) - 1 - низ-ко солевые условия, 2 - в присутствии 5 мМ MgCfe б) 1-2 и 3-4 -два различных препарата больных АИТ, 5-6 и 7-8 - два препарата боль-ных гепатитом В, 9-10, 11-12 и 1314 - три препарата больных СКВ. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 -гидролиз в низко солевых условиях; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 -гидролиз в присутствии 5 мМ MgCI2, 15 - частичный гидролиз имидазо-лом, 16 - частичный гидро-лиз РНКазой Ti, 17 -контроль (инкубация РНК без AT)

(¿57 Ч II IJ IS I

5552" 433631-

232017-

'HI-

12- Шт* m *

* , i < i * -a m Z

6- SU if' *

Достаточно неожиданным оказалось влияние ионной силы и ионов Мд2+ на специфичность РНКазной активности абзимов Препараты из крови больных СКВ, АИТ и ВГ при гидролизе дрожжевой тРНКры> и тРНК^-транскриптов митохондрий человека проявляли два типа рибонуклеазной активности (рос. 8) Одна из них (при низко солевых условиях) близка по специфичности к РНКазе А, а вторая стимулируется ионами магния В последнем случае гидролиз протекает в условиях полного подавления активности РНКаз человека; наблюдается уникальная, не характерная для нуклеаз, специфичность АТ - гидролиз протекает преимущественно по двухцепочечным участкам тРНК.

Совокупность полученных данных свидетельствует о существенных различиях зависимости абзимов больных с АИП и РНКаз крови человека от ионной силы раствора и их активации ионами двухвалентных металлов.

2.3. Субстратная специфичность абзимов

Гидролиз высокомолекулярных ДНК-субстратов (ДНК плазмид, ДНК фага X) абзимами молока здоровых доноров (1дв и э1дА) и больных АИП (1дС) протекал эффективнее в -3-5 раз, чем расщепление модельных олигодезоксирибонуклеотидов, тогда как для обеих ДНКаз человека эта разница достигала нескольких порядков.

Анализ данных гидролиза с!(рТ)10 (рис. 9) различными препаратами 1дО-РС показал, что в одних случаях образуются продукты с фосфатом на 5'-конце (дор 2, 3), в других - с фосфатом на З'-конце (дор 4), а иногда наблюдается смесь 5'- и З'-фосфатов (дор 1) Известно, что ДНКаза I гидролизует ДНК с образованием олигонуклеотидов с 5'-фосфатом на конце, а ДНКаза II - с образованием З'-олигонуклеотидов (дор 5 и 6). Наблюдаемые отличия специфичности гидролиза олигонуклеотидов обусловлены тем, что в зависимости от больного поликлональные абзимы содержат

моноклональные АТ, которые могут "использовать" различные механизмы гидролиза ДНК

Рис. 9. Радиоавтограф геля после электрофореза продуктов гидролиза [5'- 32Р]с1(рТ)1о препаратами АТ-РС и ДНКаз. К - инкубация ОЫ в отсутствие ферментов, 1-4- различные препараты 1дС-РС, 5 -ДНКаза I, б-ДНКаза II

1 г 3 4 5 6 к

ДНКазы человека не гидролизовали концевые межнуклеотидные связи с1(рТ)10, в то время как практически все препараты АТ обладали заметным уровнем экзонуклеазной активности (рис 9) Более того, в зависимости от пациента ДНК-абзимы проявляют различные активности' З'-экзонуклеазную (дор. 4), 3'- и 5'-экзонуклеазную (дор 2), а также эндо- и экзонуклеэзную (дор. 1, 3).

Абзимы молока и крови больных с аутоиммунными заболеваниями проявляли также и фосфатазную активность - отщепляли 5'-концевой фосфат СМ (как рибо-, так и дезоксирибо-ОЫ). При этом уровень фосфатазной активности АТ молока определялся изотипом абзимов-1дС проявляли минимальный (< 10%) уровень фосфатазной активности, а э!дА - от 10 до 80% от суммарной ОЫ-гидролизующей активности

Таблица 3. Величины относительной удельной активности препаратов 1дС из крови больных различными АИП в сравнении с РНКазой А и РНКазами крови человека в реакциях гидролиза различных полирибонуклеотидов и сСМР

Биокатализатор Относительная удельная активность*, %

сСМР ро!у (и) ро1у (А) ро1у (С) I дрож. РНК

РНКаза А 100 2 (200) 0.01 - 100(10000) 15(1500)

РНКазы крови человека — 3-16 0 100 5-10

АТ-СКВ 35 0.5-0.8 (4) 02 4(20) 5(25)

АТ-РС 4-8 0.6-4.0 (8) 0.1 -0.2 5-7 (43) 10-15(83)

АТ-АИТ 10 0.2 (10) 0.02 10(500) 2 (100)

АТ-Полиартрит 4 0.2 (10) 0.02 14 (700) 3 (150)

АТ-Гепатит В 4-5 0.02 (0 3) 0.06 0 —

Удельная активность оценена в расчете на 1 моль белка Удельная активность РНКазыА в реакции гидролиза поли(С) и сСМР приняты за 100%, удельная активность каждого из биокатализаторов в реакциях гидролиза поли(11), поли(А) и суммарной РНК оценена относительно реакции гидролиза поли(С) РНКазой А В скобках приведена усредненная величина отношения скорости расщепления данного полимера к скорости расщепления поли(А)

Препараты всех изучаемых АТ с высоким уровнем ДНКазной активности обладали также высокой РНК-гидролизующей активностью, и субстратная специфичность как ДНК-, так и РНК-абзимов была

практически индивидуальна для каждого пациента Сравнение активности препаратов антител разных классов из крови одного пациента с СКВ показало, что 1дМ обладают в 4-6 раз большей удельной активностью по сравнению с 1дС.

Данные анализа субстратной специфичности гидролиза различных классических субстратов РНКаз (сСМР, ро1у(1)), ро1у(А) и ро1у(С), дрожжевая РНК) абзимами при различных АИП и РНКазами представлены в табл. 3. Следует отметить, что все 1дС- и 1дМ-абзимы эффективно (при СКВ и РС на порядок лучше) гидролизуют ро1у(А), в то время как РНКаза А и РНКазы крови человека практически не расщепляют этот полимер.

Из табл. 3 видно, что субстратная специфичность АТ уникальна для каждой АИП и существенно отличается по специфичности от РНКаз крови человека и рибонуклеазы А. Например, дрожжевая РНК являлась лучшим субстратом для АТ-РС и АТ-СКВ, ро1у(С) - для препаратов АТ в случае полиартрита и АИТ, ро1у(А) - для АТ крови больных гепатитом.

Как указано выше, обычно абзимы проявляют относительно низкую удельную активность по сравнению с ферментами, проявляющими те же каталитические функции. Следует подчеркнуть, что АТ с РНКазной активностью на настоящий момент являются примером с самой высокой удельной активностью. Так, удельная активность большого числа препаратов АТ больных СКВ и РС в гидролизе РНК достигает 3040% от таковой для одного из наиболее быстродействующих ферментов - панкреатической РНКазы А. Кроме того, нами обнаружено несколько препаратов АТ больных СКВ и РС с удельной активностью составляющей 200-400 % от таковой для РНКазы А.

По совокупности данных АТ-зависимого гидролиза рассмотренных выше субстратов (табл. 3) можно четко идентифицировать (диагностировать) каждую из проанализированных АИП Скорее всего в случае каждой АИП кровь пациентов содержит специфическую фракцию абзимов, характерную для каждого отдельного заболевания (см ниже).

Уровень активности РНК-гидролизующих абзимов, как и в случае АТ с ДНКазной активностью, сильно зависит от индивидуума, но в целом наблюдается тенденция увеличения активности в следующем ряду: гепатит < АИТ < полиартрит < СКВ < РС

Сравнение эффективности расщепления СКВ-абзимами гомологичных олигонуклеотидов рибо- и дезоксирибо-ряда {г(рА)13 и с1(рА)13, (р1))10 и с1(рТ)10, г(рС)ю, рис. 10, а, 6} показало, что 1дС более эффективно (примерно в 10-100 раз) расщепляют рибо-, чем дезоксирибо-ОЫ Следует отметить, что олигоаденилаты являются более эффективно расщепляемыми субстратами по сравнению с другими гомоолигонуклеотидами.

12 1 4 5 6 У 8 9 10

-В*'

б

2 3 4 5 6

тё { тт* тт -

от

Ш <*

т*»

тф тт

т # ^ т

- Ф

я, ф - •

тШ тт

•

т»

Рис. 10. Радиоавтограф геля после электрофореза продуктов гидролиза

а - [5'-32Р]г(рА)1з (1-5) и [5 - 32Р] с1(рА)13 (6-10) абзимами 1дС-СКВ и их РаЬ-фрагментами 1,6- контроли; 2, 7 - 5 мкг/мл 3, 8 - 10 мкг/мл, 4, 9 - 20 мкг/мл РаЬ; 5, Ю - 10 мкг/мл ГдО; 6 - [51- 32Р] г(рС)ю (1-3), [5'- 32Р] (Ри)ю (4-6), [5'- 32Р] г(рА)ю (7-9) абзимами 1дО-СКВ. 1,4, 7- контроли, 2, 5, 8- препарат 1дО-1, 3, б, 9 - препарат \gG-2

Исследование гидролиза различных природных тРНК и их транскриптов абзимами больных АИП показал широкий спектр специфичности РНКазных активностей АТ; некоторые активности АТ проявляются в низкосолевых условиях, а другие - только в присутствии высоких концентраций ионов магния (см. выше) Следует отметить, что АТ из крови больных с различными АИП'демонстрируют различные картины расщепления некоторых природных тРНК с жесткой пространственной структурой, например тРНКРЬв. В то же время при использовании транскриптов тРНК1"^, обладающих лабильной пространственной структурой, в случае каждого пациента с аутоиммунной патологией наблюдался индивидуальный набор продуктов гидролиза субстрата. По-видимому, это связано с тем, что в случае таких тРНК относительные активности некоторых мажорных и минорных субфракций АТ становятся сопоставимыми, минорные субфракции моноклональных АТ каждого типа, входящие в состав поликлональных абзимов, "находят" наиболее оптимальную для них структуру пространственно лабильной тРНК. В целом, варьируя условия реакции (концентрации и тип солей, рН и т.д.) можно выявить

активности не только мажорных, но и минорных фракций абзимов, при этом каждый пациент обладает своим набором РНКазных активностей, некоторые из которых уникальны и не соответствуют ни одному из известных РНК-гидролизующих ферментов млекопитающих. Так, например, абзимы из крови некоторых пациентов обладают субстратной специфичностью, аналогичной таковой для РНКаз ядов кобры или гюрзы, а также некоторых бактерий.

Особенностью РНК-абзимов является то, что они обладают исключительным многообразием функций, включая структурную специфичность' в отличие от известных РНКаз вирусов, про- и эукариот, АТ чувствительны к минимальным изменениям пространственной структуры молекул РНК, а также к минимальным изменениям нуклеотидных последовательностей, включая точечные замены оснований. Таким образом, очевидно, что на основе моноклональных АТ могут быть получены уникальные ферменты нового поколения, которые исключительно перспективны в качестве новых инструментов для исследования структурных особенностей молекул РНК.

Нами впервые показаны уникальные различия в индивидуальных характеристиках наборов субфракций каталитических АТ, входящих в состав поликлональных абзимов, которые могут гидролизовать РНК и ДНК при различных условиях и по разным механизмам. Поликлональные АТ крови больных с АИП обладают уникальной и индивидуальной по сравнению с РНКазами и ДНКазами крови субстратной специфичностью (критерий 9).

2.4. Кинетические и термодинамические характеристики гидролиза нуклеиновых кислот абзимами молока и крови

Сравнение величин Км реакции гидролиза различных с1(рМ)10 и г(рМ)10 абзимами молока показало, что как рибо-, так и сЮЫ имеют близкое сродство к 1д одного класса, но их сродство к 1дС примерно на порядок выше, чем к в1дА (табл. 4). Несмотря на близкое сродство, ЮМ являются лучшими субстратами абзимов молока (за исключением (рА)10 для 81дА).

Величины Км для ряда с1(рМ)15 в случае 1дС-РС варьировали от 0.2 до 0.5 мкМ, сродство <3(рТ) ю к 1дв больных АИП (Км - 0.025 мкМ) было на порядок лучше, чем для 1дв молока. Каталитическая эффективность 1дО-РС при гидролизе всех сЮЫ была на порядок выше таковой для 1дв молока при гидролизе с1(рМ)10. Следует отметить, что ДНКазы человека характеризуются в 10-100 раз более низким сродством как к ДНК, так и к ОЫ Например, у фосфодиэстеразы I величина Км для с1(р1\1)15 равна 50 мкМ, а для ДНКаз I и II мочи человека значения Км также превышают ЮмкМ.

Величина К, для двуцепочечной ДНК, определенная из данных ингибиторного анализа, в случае 1дС-РС равна 0 34 нМ, что в 24 раза ниже значения Км(ДНК) для ДНКазы I

Таблица 4. Кинетические и термодинамические характеристики реакции гидролиза олигонуклеотидов двумя препаратами абзимов молока

Субстрат Км, мкМ кса,Ю3, мин"1 кса./Км-Ю'3, М"1мин"1

1дв сКрА)10 0.44 40.1 91.1

сКрС),о 0.48 37.7 78.5

<№Т),0 0.55 47.5 70.2

(рА)10 0.46 56.8 123.5

(рс)10 0 36 43.0 107 5

(риь 0.25 35.0 140.0

э1дА с1(рА)10 7,63 11,3 1,5

с1(рС)10 6,50 7.0 1,1

сКрЛю 4,61 8,3 1,8

(РА)10 2,72 2,7 1,0

(рс)10 6,94 90,6 13,1

(ри)10 1,42 18,1 12,9

Погрешность измерений не превышала 20-30%

Гетерогенность поликлональных АТ ярко проявилась не только в оптимумах рН, зависимости или независимости от ионов металлов, но также и в кинетических и термодинамических параметрах реакции гидролиза г(рЫ)п, катализируемой препаратами 1дМ и 1дв из крови больных с аутоиммунными заболеваниями. В большинстве случаев график Эйзенталя-Корниш-Боуден имел веерообразный вид с несколькими значениями Км в интервале 10"8-10"7 М {рис. 11, б). Иногда графики не имели точек пересечения, что свидетельствовало об очень большом числе моноклональных абзимов в составе поликлональных АТ, характеризующихся различными значениями величин К„ и \/тах (рис. 11, в).

Только для одного препарата поликлональных АТ (1дМ-П1) обнаружен один оптимум рН (рис. 11, а) и одно значение Км (4.3-10"8 М). Для данного препарата был проведен сравнительный анализ кинетических параметров реакции гидролиза г(рА)13 и с!(рА)13 (табл 5). Оба субстрата характеризовались близкими значениями Км, но скорости гидролиза (\/тах) и константы скорости (к2) различались: для г(рА)13 скорость расщепления была на два порядка выше.

Рис. 11. Зависимость начальной скорости гидролиза [5'-32Р]г(рА)13 тремя препаратами 1дМ (а, б, в) из крови различных больных СКВ от концентрации ОМ

Величины к2 расщепления г(р1М)п с помощью 1дМ-СКВ имеют одинаковый порядок независимо от нуклеотидного состава субстрата. В противоположность этому, при сопоставлении значений кинетических характеристик реакции гидролиза олиго(гА) и олиго(и) РНКазами 3 и 4 сыворотки крови человека можно увидеть {табл. 3), что величины Км для этих олигонуклеотидов имеют одинаковый порядок, в то время как значения к2 различаются на три порядка.

Константа скорости гидролиза олигоуридилата с помощью 1дМ по сравнению с аналогичной величиной для РНКаз сыворотки на порядок ниже, но, с другой стороны, эффективность катализа (отношение к2/Км) реакции расщепления олиго(и) антителами и сывороточными РНКазами в целом сравнима

Необходимо подчеркнуть, что кажущиеся значения кса, (к2) рассчитывали, исходя из общей концентрации АТ в реакционной смеси без учета доли РНК- и ДНК-абзимов в общем пуле 1д, которая обычно не превышает нескольких процентов, и, таким образом, рассчитанные величины к2, скорее всего, существенно занижены. Найденные величины Км абзимов как молока, так и крови больных с аутоиммунными заболеваниями в реакции гидролиза РНК и ДНК лежат в диапазоне 10'9 - 10"6 М, что характерно для взаимодействий типа "антиген-антитело", и их сродство к нуклеиновым кислотам на 1 - 2 порядка выше такового для всех известных секреторных РНКаз и ДНКаз человека (критерий 10).

Известно, что в организме человека содержится немного секреторных нуклеаз: две ДНКазы и пять РНКаз, и лишь одна из последних незначительно отличается по специфичности от РНКазы А Кроме того, РНКазной и ДНКазной активностями обладает один из мажорных белков молока - лактоферрин

Таблица 5. Кинетические и термодинамические характеристики реакции гидролиза олигонуклеотидов 1дМ-абзимами СКВ и РНКазами

Субстрат Препарат Км, мкМ к2Ю2, мин"1 к2/Км-10'5, М"1-мин'1

d(pA)i3 1дМ-П1 0.054 2.7 5.0

г(рА)13 1дМ-П1 0.043 150 340

1дМ-П2 0.087 180 210

0.102 320 310

РНКаза А 3.4 22 0.064

РНКаза 3 4.9 1.7 0 035

РНКаза 4 7.2 5.2 0.072

r(pU)10 1дМ-П1 0.13 580 450

РНКаза 3 2.1 3700 180

РНКаза 4 5.6 2600 46

*[Е] ■ 1.0 х 10 * М Погрешность измерений не превышала 20-30%

Обнаруженное многообразие РНКазных и ДНКазных активностей АТ невозможно объяснить тем, что в зависимости от заболевания в крови пациентов происходит изменение набора нуклеаз Полученные данные свидетельствуют о том, что спектр РНК- и ДНК-гидролизующих активностей АТ в крови пациентов с различными заболеваниями может варьировать в широких пределах в зависимости от индивида и подтверждают, что обнаруженные нами уникальные каталитические свойства АТ являются их собственным свойством.

Таким образом, данные исследования каталитических свойств АТ молока здоровых и крови больных с АИП свидетельствуют о том, что несмотря на то, что природные абзимы крови и молока катализируют те же реакции гидролиза нуклеиновых кислот, что и известные нуклеазы, они существенно отличаются от последних по многообразию ферментативных и физико-химических свойств и особенно субстратной специфичностью и высоким сродством к субстратам.

Абзимы при всех АИП и особенно при СКВ и РС, в отличие от абзимов молока, проявляют значительную гетерогенность пулов АТ по термодинамическим и кинетическим характеристикам (сродство к

субстратам, относительная специфическая активность), а также оптимальным условиям гидролиза (наличие и тип иона металла, ионная сила, рН и ряд других характеристик). Как известно, иммунная система человека способна вырабатывать на один и тот же антиген примерно 106 различных АТ По-видимому, в ходе развития различных АИП происходит наработка все большего и большего числа различных АТ к ДНК, РНК и их комплексам с белками, а также антиидиотипических АТ к активным центрам ферментов, что при прогрессировании заболевания приводит к появлению все большего и большего разнообразия АТ, гидролизующих ДНК и РНК.

2.5. Топография активного центра ДНК- и РНК-гидролизующих абзимов

Важной задачей при изучении абзимов является исследование топографии их активного центра, что позволяет оценить вклад легких и тяжелых цепей АТ в его организацию. Одним из способов исследования топографии активного центра 1д - сложных олигомерных структур, является расщепление АТ с помощью папаина с образованием РаЬ-фрагментов, в состав которых входят легкая цепь и фрагмент тяжелой цепи, содержащие антиген связывающие вариабельные домены

Одним из весомых критериев наличия каталитических свойств у АТ является сохранение ферментативных функций их РаЬ-фрагментами Тестирование выделенных электрофоретически гомогенных препаратов РаЬ-фрагментов 1д из крови больных АИП, а также 1дв и в1дА молока показало, что РаЬ- фрагменты сохраняют каталитические функции (критерий 11). они могут быть менее активными, сопоставимыми или даже выше по активности, чем исходные иммуноглобулины.

а б

Рис. 12. Тестирование ДНКазной активности 1дО-РС, РаЬ-фрагмента и ДНКаз после электрофоретического разделения белков в 5 - 18% ПААГ (система Лэммли), содержащем радиоактивно меченную ДНК (3 нг/мл) а - окраска серебром, М - белковые маркеры, 1 - 1дС, 2 - 1дв + 10 мМ ДТТ б - радиоавтограф геля, 1 - 1дС, 2 -РаЬ-фрагмент, 3 - 1дЭ + 0 5 мМ ДТТ, 4 - ДО + 10 мМ ДТТ, 5 - ДНКаза I человека, б - бычья ДНКаза I, 7 -чДНКаза I + 10 мМ ДТТ, 8 - бДНКаза I + ЮмМДТТ

Так, РаЬ-фрагменты 1дв-РС гидролизовали ДНК в 2 раза более эффективно, чем исходные 1дС (рис. 12, б, дор 2). Более высокой РНКазной активностью обладали РаЬ-фрагменты, обладающие сродством к апй-Ьс-ЗерЬагоэе (рис. 12).

Тестирование нуклеазных активностей /л эПи всех исследованных препаратов абзимов показало, что активность легких цепей была, как правило, выше активности нативных АТ (критерий 12) (рис. 12, дор 3, рис. 6, а и б, дор. 4).

Как известно, легкие цепи 1д человека подразделяются на два типа к-1_ и А-1_. Значительный интерес представляет установление вклада АТ с легкой цепью того или иного типа в суммарную активность ДНК-абзимов. Хроматографическое разделение 1дС-РС по типу легкой цепи с помощью аффинной хроматографии показало, что 20 - 30% суммарной активности абзимов принадлежит А типу легкой цепи 1д (А-Ь), а 70 - 80% - к-1_-цепи. РНКазной активностью обладают преимущественно к-Ь цепи 1дС-СКВ и их РаЬ-фрагментов. Определение типа Ьцепей ДНК- и РНК-гидролизующих абзимов молока показало, что 90-95 % активности принадлежат к-Ьцепям как в случае 1дС, так и э1дА антител, также как и в случае их РаЬ-фрагментов.

Следует отметить, что при РС вклад А-АТ в суммарную активность абзимов значительно выше, чем при других АИП Увеличение доли А-АТ в составе пула ДНК-абзимов при РС может указывать на увеличение спектра активных центров и реализуемых абзимами гидролитических механизмов.

Показано, что в случае $1дА молока высоким сродством к ДНК обладают каталитически неактивные тяжелые цепи, а активность АТ ассоциирована с легкими цепями в1дА. Химически активные аналоги ОМ модифицировали как легкие, так и тяжелые цепи з1дА (критерий 13). На основании полученных данных сделан вывод, что активные центры формируются с участием обоих типов цепей При этом участок связывания расположен в основном в вариабельных участках тяжелых цепей, а каталитически активные группы - на легкой цепи АТ.

Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что активный центр 1д класса О как молока, так и АИП, а также 1дМ больных АИП расположен на легких цепях молекулы АТ, которые принимают основное участие и в связывании, и в катализе гидролиза субстрата. В случае в1дА молока организация каталитического центра более сложная и в его образовании участвуют аминокислотные остатки как легкой, так и тяжелой цепей.

3. Динамика нуклеазной активности антител крови и молока женщин во время беременности и лактации

Анализ нуклеазных активностей АТ в крови здоровых женщин в период беременности и лактации показал, что, в то время как в крови здоровых доноров (мужчин и женщин) тестируемой каталитической активности АТ не обнаружено, АТ крови беременных женщин обладают активностью в гидролизе ДНК и РНК, и их относительная активность может варьировать в широких пределах. Показано, что динамика изменения ДНКазной активности АТ крови женщин в ходе беременности носит индивидуальный характер для каждой женщины. При этом наблюдается тенденция повышения активности АТ в первый и/или третий триместр беременности Как видно из данных рис. 13, относительная ДНКазная активность абзимов крови повышается в 4-5 раз после родов сразу с началом лактации, и особенно высокая активность (выше примерно в 5-10 раз) наблюдается у абзимов из молока рожениц.

Старт

1 2 Я 4 К, Кг 1 2 Я 4 К, К

1 ^г

Рис. 13. Сравнение ДНКазной активности АТ в крови одних и тех же женщин до (а) и после родов (б) (ДНК плазмиды ЕНиевспрЬ негатив)

Номера дорожек

соответствуют номерам препаратов АТ здоровых доноров /О - ДНК, инкубированная в

отсутствие АТ, К2 - АТ молока донора 2.

Активность абзимов сохраняется примерно в течение 3-6 месяцев, а затем начинает снижаться. Полученные данные свидетельствуют о том, что начало лактации является ключевым моментом в "запуске" наработки абзимов, гидролизующих нуклеиновые кислоты в крови и молоке рожениц Сравнение относительной активности препаратов и 1дМ крови здоровых женщин и женщин с АИТ (14 доноров), индуцированным беременностью, показало, что активность АТ здоровых женщин в 3 - 5 раз ниже, чем у пациенток с АИТ (табл. 6)

Таким образом, обострение аутоиммунных процессов, вызванное индуцированным беременностью АИТ, приводит к увеличению наработки субфракций поликлональных АТ с каталитической активностью. Это согласуется с литературными данными о том, что при

Таблица 6. Относительная ДНК-гидролизующая активность 1дС и 1дМ крови женщин третьего триместра беременности

№ Относитель- Среднее Относитель- Среднее

препа ная значение ная значение

рата Доноры активность* актив ноет активность* активности

IgG, % и IgG, % IgM, % IgM, %

1 Здоровые 0,26 -

2 беременные 0,46 -

3 0,025 0,3±0,2 21,0 15,0±6,0

4 0,44 -

5 0,5 9,0

1 Беременные 2,5 100

2 с индуциро- 1,7 93

3 ванным во 0,84 76

4 время 1,2 82

5 беремен- 2,0 92

6 ности АИТ 0,55 64

7 1,05 1,2±0,5 50 68,6±21,6

8 0,9 91

9 0,12 15

10 0,5 35

11 0,7 44

12 0,6 53

13 0,9 79

14 1,0 87

'Активность выражена в % по отношению х активности контрольного препарата АТ из молока человека (100 %)

беременности в организме женщин запускаются иммунные процессы, сходные с таковыми у больных с АИП, но в отличие от последних они исчезают к концу лактации (Mohan С. et al. J. Exp. Med., 1993, 177, 1367).

4. Анализ корреляции уровней ДНКазной активности и биохимических, иммунологических и клинических специфических маркеров конкретной аутоиммунной патологии

Удельные активности ДНК-гидролизующих АТ при любой АИП сильно возрастают в период ее обострения, особенно у пациентов с продолжительным хроническим течением заболевания, как это видно из данных табл. 7 для больных вирусными гепатитами. При этом

увеличение активности АТ часто коррелирует с ярко выраженным расширением спектра АТ, гидролизующих нуклеиновые кислоты, и, как показано нами, других ферментативных активностей (гидролиз нуклеотидов, белков, полисахаридов).

Таблица 7. Относительная ДНКазная активность препаратов 1дв при различных формах вирусного гепатита

Гепатит Число пациентов ДНКазная активность, балл

А 3 2.3 ± 0.58

В 11* 7.8 ± 1.33

17 3.4 ± 1.12

С 2* 9.0 ± 1

4 38 ± 0.5

В + С 22 4.2 ± 2.6

'обострение хронического заболевания

ДНК-гидролизующие АТ крови обнаружены у 50 из 53 пациентов с РС (94%). При этом, удельная ферментативная активность АТ из спинно-мозговой жидкости сравнима с таковой для 1дв из крови больных РС.

Относительная активность каталитических АТ в реакции гидролиза ДНК зависела от фазы РС, его стадии и проводимого лечения. Следует подчеркнуть, что относительное количество больных РС и СКВ в стадии обострения, активность АТ которых близка к максимальной, существенно выше, чем при других АИП. Интересно, что ДНКазная активность обнаруживается у пациентов с РС в начальной стадии заболевания, когда еще отсутствуют томографические индикаторы заболевания - много-очаговые изменения в мозге. Следовательно, анализ абзимов может быть использован для диагностики ранних стадий РС. Нами показано, что активность АТ-нуклеаз в целом коррелирует с глубиной аутоиммунных процессов и увеличивается при увеличении продолжительности заболевания в случае всех исследованных АИП. Особенно детально этот вопрос исследован в случае АИТ.

|Анализ корреляций уровня гидролиза ДНК антителами крови больных АИТ и нетоксическим узловым зобом (НУЗ) с клинико-лабораторными данными показал, что абзимы с относительной активностью (6±1) баллов обнаружены у 59 % больных аутоиммунным

тиреоидитом, в то время как активность АТ у 38% пациентов с НУЗ составляла (3±1) балла и только у пациентов с ярко выраженными нарушениями (гипофункцией) щитовидной железы

Исследование корреляции относительного уровня каталитической активности 1дв-абзимов в гидролизе ДНК и концентрации АТ к тиреоглобулину в крови больных АИТ показало, что эти показатели параллельно возрастают.

х" 2

1 X

п

<8

о 2

а

I '

§ .

я

С

(Тиреотропный гормон], МЕ/л

Рис. 14. Зависимость относительного количества пациентов с АИТ, кровь которых содержала ДНК-гидролизующие АТ, от концентрации тиреотропного гормона (а) и тироксина (б)

{Тироксин], нМ

Относительное число пациентов, кровь которых содержит абзимы, почти линейно возрастает с повышением концентрации тиреотропного гормона (рис. 14, а) и уменьшением в крови концентрации тиреоидных гормонов (рис. 14, б) Лечение пациентов тироксином, широко используемым в терапии заболеваний щитовидной железы, приводит лишь к временной нормализации концентрации этого гормона и общего состояния больных, но не влияет на уровень аутоиммунных процессов

и, как следствие, на уровень АТ с ДНКазной активностью в крови и на течение АИП (табл. 8).

Таблица 8. Влияние лечения тироксином на уровни гормонов, белков и ДНК-гидролизующих АТ

Гормоны", Аутоиммунный Нетоксичный узловой

тиреоидит ** зоб ... Норма

белки До лечения После лечения До лечения После лечения

ТЗ, нМ 1.3 + 0.2 2.1 ±0.1 2 2 ± 0.2 2 3 ± 0 2 1.3-2.75

Т4, нМ 96 ±3 115 ± 4 116 ± 5 128 ±5 54.0-156.0

ТТН, мкМЕ/мл 6.7 ± 0.5 3.8 ± 0.3 3.0 ±0.3 2.8 ±0.1 0.4-4.0

АТ к Тд, МЕ/мл 228.2 ± 12.6 212.5 ± 14.5 60.4 ±8.1 54.7 ±9.5 <40

ДНКазная активность, балл, (данные для пяти пациентов) 3 4 7 9 10 3 4 7 9 9 1 2 3 4 6 1 2 3 4 6 0

ДНКазная активность, балл 3.6 ± 0.4* 3.5 ±0.3 2 2 ± 0.3" 2.2 ±0.4 0

"Сокращения ТЗ - трийодтиронин, Т4 - тироксин, ТТН - тиреотропный гормон, Тд - тиреоглобулин, * *30 пациентов с АИТ; ***26 пациентов с НУЗ

Таблица 9. Влияние лечения плаквинилом на уровни ДНК-гидролизующей активности АТ и других компонентов крови пациентов с АИТ (30 чел )

Тестируемые характеристики До лечения После лечения через:

1 мес. 3 мес. 6 мес.

ДНКазная активность, балл 3.7± 0.3 3.0± 0.3 2 1±0.3 1.1± 0 3

АТ к Тд, МЕ/мл 229± 12 302± 20 219± 20 154± 25

ТЗ, нМ 1.3±0.2 1.7± 0.4 1.8± 0.4 2.0± 0.4

Т4, нМ 96±3 109± 7.0 112± 6.0 114± 7.0

В то же время лечение пациентов с АИТ плаквинилом ведет к значительному снижению уровня активности каталитических AT параллельно со снижением в крови больных концентрации AT к тиреоглобулину (табл. 9). При этом также происходит повышение практически до нормы концентрации тиреоидных гормонов, что коррелирует с улучшением функции щитовидной железы и общего состояния больного.

Полученные данные свидетельствуют о том, что анализ относительной ДНКазной активности AT у больных АИТ (и другими АИП) может служить дополнительным критерием для диагностики этого заболевания, а также может быть использован для оценки понижения функции щитовидной железы у больных с нетоксическим узловым зобом. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о перспективности анализа активности AT для выбора новых эффективных препаратов при лечении АИП

5. Механизмы образования каталитически активных антител у человека и возможная роль абзимов-нуклеаз у здоровых доноров и в этиологии и/или патогенезе аутоиммунных процессов

Повышенные концентрации ДНК и анти-ДНК антител обнаружены в крови пациентов с большим числом различных АИП. Анти-ДНК AT являются биохимическим маркером СКВ. При этом AT крови больных с АИП обладают каталитическими активностями. В настоящее время существуют две гипотезы возникновения природных абзимов Абзимы могут образоваться в результате генерации AT к переходному состоянию химической реакции (например, ДНК в "активной конформации" или в комплексах с белками) или возникнуть как антиидиотипические антитела - вторичные AT к активному центру фермента, несущие его «внутренний образ», согласно модели антиидиотипической сети Эрне (Jeme, N. К. Ann Immunol, 1974, 125, 373).

Как видно из полученных результатов, одни и те же препараты IgG и IgM крови больных с АИП, а также IgG и slgA молока гидролизуют как ДНК, так и РНК Известно, что РНКазы высших животных не гидролизуют ДНК и, наоборот, ДНКазы - РНК.

Исключительно интересными в плане установления природы нуклеазных активностей поликлональных AT оказались результаты по исследованию взаимодействия моноклональных мышиных СКВ-антител к различным формам ДНК (В и Z) с различными рибо- и дезоксирибо-ON. Все моноклональные антитела к ДНК в B-форме гидролизовали как рибо-, так и дезоксирибо-ON. Из данных рис. 15 видно, что все антитела к B-форме ДНК гидролизуют г(рА)п существенно быстрее, чем d(pA)n Аналогичная картина наблюдалась и для других гомо-ON. Тем

не менее, способность моноклональных антител к В-форме ДНК расщеплять как ДНК, так и РНК оказалась достаточно неожиданной.

12345 12345 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

•1

<•» 1 " *» ' ». W»* «а* 1 -f

а б в г

Рис. 15.

Радиоавтограф геля после электрофореза продуктов гидролиза [5'-

РОДрАЬз (а, 6) и [5'-32Р]г(рА)13 (в, г) с помощью

моноклональных AT в присутствии (а, в) или в отсутствие (б, г) ионов магния. 1 - контроль (инкубация без AT) или в присутствии

моноклональных AT: 2 -2С10, 3 - Н241, 4- Н143, 5-AD8

Вопрос о природе абзимов при АИП остается пока в существенной степени открытым. Тем не менее, в ряде работ сделано предположение об антиидиотипической природе ДНК-гидролизующих СКВ-антител.

Нами показано, что в случае каждого пациента отдельные небольшие субфракции абзимов имеют сродство к иммобилизованным AT против ДНКазы I и ДНКазы II Кроме того, достаточно большая фракция AT больных АИП (25-50 %) связывается с ДНК-целлюлозой Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что спектр ДНК- и РНК-гидролизующих AT существенно расширяется и за счет того, что AT как против ДНК, так и против РНК гидролизуют и РНК, и ДНК Тем не менее, наши данные свидетельствуют в пользу того, что оба пути возникновения абзимов в крови больных АИП реализуются параллельно и в случае каждого отдельного пациента поликлональные абзимы представляют собой специфический "коктейль" из моноклональных абзимов к нуклеиновым кислотам и к ферментам с нукпеазными активностями.

До сих пор не совсем понятна роль абзимов в этиологии и патогенезе аутоиммунных патологий Анализ литературных данных показал, что абзимы при астме (Paul, S. Appt. Biochem. Biotechnol., 1998, 75, 13) и СКВ (Kozyr, A.V. et al. Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, 75, 45) служат дополнительным источником патологических поражений, а при АИТ напротив, участвуют в элиминации

аутоагрессивного антигена - тиреоглобулина (Li, L. et al J Immunol, 1995, 154, 3328). To есть, не исключено, что абзимы при одних заболеваниях могут играть положительную, а при других -отрицательную роль. Недавно обнаружено, что основным компонентом бляшек мозга и спинно-мозговой жидкости больных PC являются высоко аффинные антитела к ДНК (Willamson R.A et al PNAS, 2001, 98, 1793), а иммунизация мышей анти-ДНК AT приводит к индукции у мышей системной красной волчанки (Shoenfeld Y. et al. Clin. Immunol. Immunopathol., 1989, 51, 313). Нами показано, что ДНК-гидролизующие slgA молока и IgG крови больных PC и некоторыми другими АИЗ также цитотоксичны. Таким образом, обнаруженные цитотоксические и иммуногенные свойства ДНК-абзимов при АИП могут указывать в пользу как нового механизма действия каталитических AT в патогенезе - их комплемент независимой цитотоксичности (Kozyr, A.V et al. Appl Biochem. Biotechnol., 1998, 75, 45), так и непосредственного их участия в индукции и развитии аутоиммунных процессов.

Наши данные по исследованию AT с нуклеазной активностью из молока рожениц могут свидетельствовать в пользу возможной защитной биологической функции абзимов молока человека. Уровень абзимов в крови беременных женщин относительно низкий, но он резко возрастает с началом лактации, что коррелирует с высоким титром абзимов женского молока. Оказалось, что уровень абзимов и их активность в молоке возрастает на порядки, если женщины в период беременности болели вирусными или аллергическими заболеваниями Иначе говоря, беременные женщины характеризуются особым типом "иммунного ответа" на всевозможные "внешние" антигены, поступающие в их организм с пищей или в результате контакта с вирусами или бактериями.

Известно, что кровь женщин в первый и третий триместры беременности, как и кровь больных АИП, содержит ДНК в повышенных концентрациях (Mohan С. et al. J. Exp. Med., 1993, 177, 1367; Казаков В.И. и др. Цитология, 1995, 37, 232). В последний триместр наблюдается повышенный, как при АИЗ, апоптоз клеток (Levin J.S. and Koh J.S. Sem. Nephrol., 1999, 19, 34), а кровь беременных содержит клетки эмбриона (Herzenberg L.A Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1979, 76, 1453; Михайлов В. M и др. Цитология, 199, 34, 67; Fetal Cells and Fetal DNA in Maternal Blood (Hahn S., Holzgreve W. eds., 2001, Karger, 136 p.). Таким образом организм женщины подвергается во время беременности как внешней иммунизации, так и "внутренней скрытой" аутоиммунизации. При этом "иммунопамять" беременных женщин аккумулирует в течение последних трех месяцев беременности данные о всех возможных вредных для организма ребенка антигенах, а в период начала лактации генерирует различные AT, включая абзимы молока и крови.

Известно, что ДНКазы и РНКазы эффективно используют наружно в качестве лекарственных средств при различного рода вирусных и бактериальных инфекциях' ДНКазы и РНКазы очищают слизистые человека при различных заболеваниях. Увеличение уровня рибонуклеаз в молоке коррелирует с повышением устойчивости женщин к заболеванию раком молочной железы (Глухое Б. М. и др. Журн неврол. и психиат., 1968, 10, 361) Поскольку анти-ДНК АТ могут не только связывать, но и гидролизовать чужеродную ДНК, а также индуцировать апоптоз клеток, не исключено, что абзимы молока человека могут выполнять положительную функцию в защите новорожденного от вирусных и бактериальных инфекций.

Основная защитная функция молока связана с функционированием АТ, которые ответственны за пассивный иммунитет ребенка в первые месяцы его жизни. В связи с этим разумно предположить, что "специфическая предиммунизация" женского организма программирует наработку АТ, которые могут не только связывать компоненты патогенных вирусов или бактерий, но, при наличии у них гидролизующих активностей еще и расщеплять чужеродные РНК и ДНК и, следовательно, могут играть положительную роль в защите организма ребенка от любых ксенобиотиков

Нельзя исключить, что каталитическая активность АТ является запасной формой ферментативных возможностей организма, которые проявляются в специфических условиях, таких как беременность и аутоиммунные патологии.

* * *

Настоящая работа представляет собой первое систематическое исследование ферментативных активностей антител с нуклеазными активностями и их субстратной специфичности в норме (кровь и молоко здоровых доноров) и при аутоиммунных патологиях человека (рассеянный склероз, аутоиммунный тиреоидит, системная красная волчанка, полиартрит, вирусные гепатиты). Полученные данные вносят *

существенный вклад в решение проблемы структурно-функциональной протеомики иммунной системы человека в норме и при АИП Кроме того, результаты работы могут служить базой для создания новых •

дифференциальных комплексных методов диагностики, терапии, профилактики и лечения заболеваний, ведущих к нарушению иммунного статуса человека.

выводы

1. Получены и исследованы электрофоретически гомогенные препараты иммуноглобулинов различных классов из крови и молока здоровых доноров, а также пациентов с аутоиммунными и другими заболеваниями.

• Показано, что антитела крови больных с аутоиммунными патологиями (системной красной волчанкой (СКВ), рассеянным склерозом (РС), аутоиммунным тиреоидитом (АИТ), полиартритом (ПА), вирусными гепатитами (ВГ)) обладают РНК- и ДНК-гидролизующими активностями.

У здоровых доноров, а также пациентов с большим числом различных заболеваний, протекающих без существенного нарушения иммунного статуса, нуклеазных активностей АТ не обнаружено.

• Обнаружено, что 1дв и в1дА молока здоровых рожениц катализируют гидролиз ДНК и РНК, что коррелирует с развитием у них специфических аутоиммунных процессов.

• С помощью ряда общепринятых и разработанных нами новых критериев установлено, что нуклеазные активности являются собственным свойством АТ из крови пациентов для всех исследованных АИП, а также из крови и молока рожениц.

2. Изучены каталитические свойства природных антител-нуклеаз в сравнении с нуклеазами крови и молока и топография их активных центров.

• Показано, что сродство субстратов к АТ на 1-2 порядка выше, чем к нуклеазам, 1дМ, как правило, обладают более высокими нуклеазными активностями по сравнению с 1дС. Для АТ молока характерна существенно более высокая активность по сравнению с большинством известных абзимов при АИП.

• Установлено, что у больных РС и СКВ в зависимости от индивидуума и заболевания образуются РНК- и ДНК-гидролизующие поликлональные 1дв и 1дМ с различной степенью гетерогенности: они могут содержать легкие цепи как к-, так и X-типа, проявлять максимальную активность при различных значениях рН, обладать разным сродством к субстратам, эндо- и экзонуклеазной активностями, различной зависимостью активности от ионов одно- и двухвалентных металлов, а также несколькими значениями Км и Утах. При этом каталитические и термодинамические характеристики абзимов больных с АИП существенно отличаются от таковых для нуклеаз человека

Показано, что ДНК и РНК-гидролизующие 1дв и в1дА молока имеют близкие оптимумы рН, а также термодинамические и каталитические характеристики.

• Уровень активности как РНК-, так и ДНК-гидролизующих абзимов существенно зависит от индивидуума, но в целом нуклеазная активность возрастает в следующей последовательности заболеваний: гепатит < АИТ < полиартрит < СКВ < РС.

• Показано, что нуклеазный центр 1дв- и 1дМ-абзимов больных АИП,

а так же 1дв абзимов молока расположен на легких цепях молекул '

иммуноглобулинов, причем преимущественно к-типа В организации каталитического центра в1дА-абзимов молока участвуют как легкие, так и тяжелые цепи АТ. 1

3. Обнаружено, что динамика изменения ДНКазной активности АТ крови в ходе беременности носит индивидуальный характер для каждой женщины. Сравнение уровней ДНКазной активности 1д<3 и 1дМ из крови беременных женщин без патологий и с явно выраженным аутоиммунным тиреоидитом показало, что при индуцированной беременностью патологии активность АТ в 3-5 раз выше, чем в крови здоровых беременных женщин. Относительная активность существенно повышается после родов сразу с началом лактации Наиболее высокая активность характерна для абзимов из молока рожениц

4. Проведен анализ взаимосвязи определенного в настоящей работе уровня ДНКазной активности и биохимических, иммунологических и клинических специфических маркеров конкретной аутоиммунной патологии.

• Установлена зависимость уровня ДНКазной активности АТ крови больных аутоиммунным тиреоидитом и нетоксичным узловым зобом (НУЗ) от клинических показателей щитовидной железы и состояния больного. Антитела с ДНКазной активностью обнаружены у 65 % больных с АИТ и только у 38 % пациентов с НУЗ, в последнем случае уровень активности абзимов значительно ниже в 2,5 раза).

Показано, что относительный уровень ДНКазной активности 1дС-абзимов, как правило, возрастает с изменением уровней гормонов щитовидной железы и других параметров, характерном для *

развития аутоиммунного процесса.

• Лечение плаквинилом пациентов с АИТ практически приводит в

норму большинство показателей заболевания, что коррелирует с *

улучшением функции щитовидной железы и общим улучшением состояния больного без дополнительного гормонального лечения

• Показано, что уровень нуклеазной активности АТ может служить критерием оценки степени тяжести заболевания и одним из новых методов диагностики АИП, а также оценки эффективности действия лекарственных средств на состояние пациентов.

5. Впервые показано, что моноклональные СКВ-иммуноглобулины класса в к различным В-ДНК способны гидролизовать как ДНК, так и РНК, при этом эффективность гидролиза РНК в 40-100 раз выше, чем ДНК.

Анализ полученных данных по исследованию механизмов образования абзимов и возможной роли природных абзимов-нуклеаз у здоровых доноров и у больных аутоиммунными патологиями позволил сделать следующие заключения:

• При АИП и беременности в крови, а также в молоке женщин, могут осуществляться два пути наработки ДНК- и РНК-гидролизующих абзимов. Эти абзимы могут быть как АТ против нуклеиновых кислот и их комплексов с белками, так и антиидиотипическими АТ против активных центров ферментов в качестве антигенов.

• Абзимы с ДНКазной активностью из крови больных с АИП и из молока здоровых доноров обладают ярко выраженной цитотоксичностью и иммуногенностью и могут играть важную роль в этиологии и патогенезе АИП, вызывая необратимые изменения при системном аутоиммунном процессе (РС, СКВ)

• Организм женщины во время беременности подвергается иммунизации как «внешней» (пища, вирусы и бактерии), так и «внутренней» (повышенная концентрация ДНК, апоптоз клеток и др.), и эта специфическая "иммунопамять" женского организма способна программировать синтез АТ, не только связывающих, но и расщепляющих экзо- и аутоантигены На основании полученных данных сделано предположение, что, в отличие от абзимов пациентов с АИП, абзимы женского молока могут усиливать иммунитет новорожденных.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1 Бунева В.Н., Андриевская O.A., Романникова И.В , Гололобов ГВ, Ядав Р.П., Ямковой В.И., Невинский ГА. Взаимодействие каталитически активных антител с олигорибонулеотидами. Молекуляр. биология. 1994. Т. 28. С. 738-743.

2. Kanyshkova T.G., Semenov DV., Khlimankov DYu., Buneva V.N., Nevinsky G.A. DNA -hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers. 1997. FEBS Lett. V 416. P. 23-27.

3. Барановский А.Г., Матюшин В Г, Канышкова Т.Г., Власов А В,, Забара В. Г., Наумов ВА, Жьеже Р., Бунева В H ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита. Биохимия 1997. Т 62 С. 1598-1607

4 Власов А В., Андриевская OA., Канышкова ТГ„ Барановский А.Г, Наумов В.А., Бреусов А.А., Жьеже Р., Бунева В.Н , Невинский ГА. РНК-гидролизующие антитела из крови больных системной красной волчанкой. Биохимия. 1997. Т. 62. С. 556-562.

5 Канышкова Т.Г., Семенов Д.В., Власов А.В., Хлиманков Д.Ю., Барановский А Г, Шипицын М.В., Ямковой В.И., Бунева В.Н., Невинский Г. А, ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из молока человека и их возможная биологическая роль Молекуляр биология

1997. Т. 31. С. 1086-1096.

6. Андриевская О.А., Канышкова Т.Г., Ямковой В.И., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Моноклональные антитела к ДНК лучше гидролизуют РНК, чем ДНК. Доклады РАН. 1997 Т 355. С. 401-403.

7. Buneva V.N., Kanyshkova T.G., Vlassov А V., Semenov D.V., Khlimankov D Yu., Breusova LR, Nevinsky G.A.. Catalytic DNA - and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers. Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V 75 P. 63-76.

8. Vlassov A V , Florentz С , Helm M , Naumov V A., Buneva V N., Nevinsky G.A., Giege R. Catalytic antibodies from human serum with RNase activity New tools for investigation of RNA structure. Nucleic Acids Res.

1998. V. 26. P. 5243-5250.

9. Барановский А Г , Канышкова Т.Г., Могильницкий A.C , Наумов B.A , Бунева В.H., Бойко А H., Фаворова О.О., Невинский Г.А. Поликлональные антитела из крови больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют РНК И ДНК. Биохимия. 1998. Т. 63. С. 14591469.

10. Власов А.В., Барановский А.Г., Канышкова Т.Г.. Принц А.В., Забара В.Г , Наумов В А , Бреусов А. А , Жьеже Р., Бунева В Н., Невинский Г А. Субстратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител из крови больных полиартритом и аутоиммунным тареоидитом Молекуляр. биология 1998. Т. 32. С. 559-569.

11 Андриевская О.А, Бунева В.Н., Забара В.Г., Наумов В.А., Ямковой

B.И , Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса M из сыворотки крови больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК. Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 908-915.

12 Семенов Д.В., Канышкова Т.Г., Кит Ю.А., Хлиманков Д.Ю., Акимжанов A.M., Горбунов Д.А., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса G человека гидролизуют нуклеотиды. Биохимия. 1998. Т. 63.

C. 1097-1106.

13 Vlassov A.V., Helm M., Florentz C., Naumov V.A., Breusov A A , Buneva V.N., Giege R., Nevinsky G A Variability of substrate specificity of serum antibodies obtained from patients with different autoimmune and viral diseases in reaction of tRNA hydrolysis. Russian J. Immunol 1999. V 4 P. 25-32.

14 Власов А В., Хельм M., Наумов В.А, Бреусов А.А., Бунева В.Н., Флоренц К., Жьеже Р., Невинский Г А Особенности гидролиза тРНК аутоантителами из сыворотки крови больных некоторыми аутоиммунными и вирусными заболеваниями Молекуляр биология 1999.Т. 33. С. 866-872.

15. Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. FEBS Lett. 1999. V. 451. P. 235-237.

16. Nevinsky G.A., Kanyshkova T.G., Semenov D V., Vlassov A.V., Gal'vita A. V., Buneva VN, Secretory immunoglobulin A from healthy human mothers milk catalyzes nucleic acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. V. 83. P. 115-130.

17 Andrievskaya O.A., Buneva V.N., Naumov VA , Nevinsky G A. Catalytic heterogeneity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgM from sera of patients with lupus erythematosus. Med. Sci Monit 2000. V. 6. 460-470

18. Невинский Г.А, Семенов Д.В., Бунева В Н Каталитически активные антитела (абзимы), индуцированные химически стабильными аналогами переходных состояний (обзор). Биохимия 2000 Т 65 С 1459-1472.

19 Невинский Г.А, Канышкова Т.Г., Бунева В.Н. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии (обзор). Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1473 -1487

20. Невинский Г.А., Барановский А.Г., Могельницкий А.С., Доронин Б.М., Бунева В.Н ДНК-гидролизующие антитела в диагностике рассеянного склероза. Консилиум. 2000. Т. 5. С. 19-24.

21. Baranovskii A.G., Ershova NA., Buneva V.N., Kanyshkova T.G., Mogelnitskii A.S., Doronin B.M., Boiko A.N., Gusev E.I., Favorova O.O., Nevinsky G.A. Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis. Immunol. Lett 2001. V. 76. P. 163-167.

22. Nevinsky G.A., Breusov A. A., Baranovskii A G , Prints A. V., Kanyshkova T. G., Gal'vita A V., Naumov V A., Buneva V N Effect of different drugs on the level of DNA-hydrolyzing polyclonal IgG antibodies in sera of patients with Hashimoto's thyroiditis and nontoxic nodal goiter. Med Sci Monit. 2001. V.7. P. 201-211.

23. Breusov A A , Gal'vita AV., Benzo E.S , Baranovskii AG., Prints A V, Naumov V A , Buneva V N , Nevinsky G.A Comparison of the level of DNA-hydrolyzing polyclonal IgG antibodies in sera of patients with Hashimoto's thyroiditis and nontoxic nodal goiter. Rus J Immunol 2001 V. 6. P. 17-28.

24. Невинский Г. А., Канышкова Т. Г., Семенов Д. В., Бунева В. Н. Каталитически активные антитела и их возможная биологическая функция. Вестник РАМН. 2001. Т. 2. С. 38-45.

25 Канышкова Т.Г., Бунева В.Н., Невинский ГА. Лактоферрин и его биологические функции. Биохимия. 2001 Т. 66. С. 5-13.

26. Nevinsky G.A., Favorova О.О., Buneva V.N. Catalytic antibodies: New characters in the protein repertoire. Protein-protein interactions. A molecular cloning manual. Ed. E Golemis Cold Spring Harbor Lab. Press. Cold Spring Harbor. New York. 2002. P. 523-534.

27. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies. J. Immunol. Methods. 2002. V. 269. P. 235-249.

28. КанышковаТ.Г., Бунева B.H., Невинский ГА Биологические функции молока человека и его компонентов. Успехи соврем, биол. 2002. Т. 122. С. 259-271.

29 Andrievskaya О.А., Buneva V.N , Baranovskii A.G., Gal'vita A.V., Benzo E S., Naumov V.A., Nevinsky G.A. Catalytic diversity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgG antibodies from the sera of patients with systemic lupus erythematosus. Immunol. Lett. 2002. V. 81. P. 191-198

30. Бунева B.H , Канышкова Т.Г., Барановский А Г, Горбунов Д А , Матюшин В.Г., Гальвита А.В., Ершова НА., Кудрявцева А.Н., Невинский ГА Природные иммуноглобулины с ферментативными активностями. Горячие точки супрамолекулярной химии Издательство НГУ. Новосибирск. 2002. С. 105-124.

31 Бунева В Н., Кудрявцева А.Н., Гальвита А.В., Дубровская В.В., Хохлова О.В., Калинина И.А., Галенок В.А., Невинский Г.А. Динамика уровня нуклеазной активности антител крови женщины во время беременности и лактации. Биохимия. 2003 Т. 68. С. 1088-1100

32. Невинский Г.А., Барановский А.Г., Ершова Н.А., Полосухина Д.И., Гармашова Н.В., Бунева В.Н. Каталитически активные антитела в диагностике аутоиммунных заболеваний. Наука производству. 2003. Т. 3. С. 14-19.

33. Nevinsky G.A., Buneva V N Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral pathologies J Cell. Mol Med 2003 V. 7. P. 265-276.

34 Baranovskii A. G., Odintsova E. S., Buneva V. N., Doronin В. M., Nevinsky G. A. Comparison of enzymatic properties of DNA-abzymes and human DNases. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V. 23 P. 1053-1056.

35. Барановский А.Г., Бунева B.H., Невинский Г.А. Дезоксирибонукпеазы человека (обзор). Биохимия 2004. Т. 69. С. 725-742.

36. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Is there an answer? IUBMB Life. 2004. V. 56. P. 565-567. -

37. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Natural catalytic antibodies - abzymes. In "Catalytic antibodies". Ed. E. Keinan). WILEY-VCH Press. Weinheim. 2005. P. 505-569.

Бунева Валентина Николаевна

Природные иммуноглобулины с нуклеазными активностями

Диссертация в виде научного доклада на соискание учёной степени доктора биологических наук

Подписано в печать 21.11.05. Формат 60 х 84 1/16. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 2,5. Тираж 120 экз. Заказ № 553

Лицензия ЛР № 021285 от 6 мая 1998 г. Редакционно-издательский центр НГУ 630090, Новосибирск-90, ул. Пирогова, 2

РЫБ Русский фонд

2006-4 29850