Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточная РНКаза Acholeplasma laidlawii PG-8

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточная РНКаза Acholeplasma laidlawii PG-8"

*

АКАДЕМИЯ а\Уй УКРАИНЫ Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного

На правах рукописи

Янчияова Зулайха Якфунковна

Внеклеточная РШаза ЛсЬо1вр1азт 1а1сНа>Н1 Рв-в 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание, ученой степени кандидата биологических наук

Киев

19 9 3

Работа выполнена в отделе ылкоплаашлогии Института мк-робиологин и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины

чдея-корреслондент АН Украины,доктор биологических наук Скрип а ль и. Г.

доктор биологических наук, профессор Захарова И. Я

кандидат технических наук Стеяш НЕ ■

Научно-исследовательский институт урологии и нефрологии Ю Украины

Защита состоится IХР ноября 1993 года б 10 ка заседании специализированного Совета Д. 016. Об. 01 при Институте микробиологии и рирусологии ¡ш.,Д. К. Заболотного АН Украины по адресу. 252143, Киев-143, уд. Заболотного, 154

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д К Заболотного АН Украины

Автореферат разослан " ~ " .У-сЬЗч 1993 Г-

Учепый секретарь

специадазированного совета

какдаздат биологических наук оМ^ь? з. А. Коваленко

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ОБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время имеются многочисленные сведения о распространении в природе РНКаз дрожжей, . плесневых грибов и бактерий различных таксономических групп, изучены свойства,установлена их роль в метаболизме нуклеиновых кислот. РНКазы широко применяются в научных я прикладных исследованиях. Выгодно отличаясь от хишотерапев-тических средств специфической направленностью воздействия на строго определенную сторону обмена веществ организма, они находят применение в медицинской практике.

Учитывая возросший интерес к изучении микоплазм и их биологической роли, имеющихся данных о молекулярно-биологических свойствах явно недостаточно для полной характеристики этой важнейшей группы микроорганизмов. Изучение свойств РНКаз мол-ликутов позволит более глубоко понять особенности этого класса микроорганизмов, установить их место в мире микробов и определить фундаментальные основы' биологической активности.

РНКазы малликутоз' в силу своеобразия биологических свойств этих молликутов и трудностей их культивирования на искусственных питательных средах не исследованы. Имеются лишь единичные сведения о проявлении РЯКазяой активности отдельными представителями рода Мусор1азта. Ничего не известно о наличии этих ферментов у представителей других таксонов молли-кутов, в частности у представителей семейства Ас1ю1ер}азт1асеае, а также отсутствует сведения о типах РНКаз, их структуре и нуклеотидной специфичности. Так как многие представители класса Mollicut.es являются возбудителями заболеваний человека, животных и растений, а их РНКазы, вероятно, могут быть одним из факторов агрессии в отношении поражаемых хозяев , то изучение этих ферментов моййт иметь важное значение для выяснения механизма патогеяности данных микроорганизмов. РНКазы иолликугов могут представить также интерес как объект биотехнологии, 'особенно если решить вопрос об их иммобилизации на соответствующих подложках. Все вышеизложен-

нае свидетельствует о целесообразности дальнейшего поиска продуцентов и получения высокоочшценных препаратов РНКаз различной специфичности действия , а также исследования их свойств.

Сель и задачи исследования. Целью настоящей работы было: выделение я очистка внеклеточной РНКазы АсЬо1ер1азш 1а1<Яау/11 РЭ-8 и изучение физико-химических и молекулярно-бй-ологических свойств фермента. Достижение доставленной цели потребовало решения сдедуювдх задач;

- изучить способности некоторых представитетелей класса МоШсиЬеБ продуцировать и выделять в среду РНКазы;

- определить возраст культуры,в котором молликуты наиболее активно продуцируют РНКазу в окружающую среду

- разработать методы очистки РНКазы А. 1аи31ауг11 РС-8;

- определить наиболее характерные основные свойства фермента

Научная новизна Епервые выделена и очищена до гомогенного состояния внеклеточная РНКаза молдшсута Ас1ю1ер1а2ша 1а1с11а\п1 РЗ-8, установлена молекулярная масса фермента Изучены физико -химические и юдекулярно-биологические свойства РНКазы, определены кинетические параметры взаимодействия фермента с субстратом.

Установлены некоторые отличия и сходства РНКазы А. 1а1с)2айгп Рв-В в свойствах с одноименными ферментами из других прокариотических организмов, что частично указывает на филогенетические связи медцу отдельными родами бактерий и молдикутами.

Практическая ценность. Полученные экспериментальные дан-, ные является определенным вкладом в расширение дознания биологических свойств шкоплаам и их биологической активности, приближают нас к пониманию метаболизма нуклеиновых кислот и механизма пагогешюсти молликутов. Разработан метод выделения и очистки РБКазы из культуральной жидкости А.1а1с11а1Ш РЗ-8 .

Апробация работы. Результаты исследований обсуздались на Все&эганойпколе-семинаре молодых ученых (Алушта, 1990), на

конкурсах работ секции молекулярной сиологии института микробиологии и вирусологии т. Заболотного (Киев, 1991,1992).

Публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 4 печатных работах. Планирование и проведение экспериментов осуществлялось при участии кандидата биологических наук Д. П. Грамы, за что мы выражаем ему глубокую благодарность.

Структура и объем диссертации. Диссертация ■ изложена на 114 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков я 4 таблицы. Библиография включает 171 наименование ( из них 54 - отечественных ■ авторов и 117 - иностранных). Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов (4 главы), выводов и списка литературы.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объекты я методы исследования. Объектом исследования служил штамм ЛсЬо1ер1а5па 1а1сОа>ш ГО-8, выращиваемый в жидкой среде СМ ИШЬ72. Микроорганизм этот был выбран, как наиболее часто встречаемый в природе и как предполагаемый предшественник фитопатогенных молликутоэ - возбудителей жлтух растений. Кроне того, неоднократно показана его ассоциация с отдельны),ш заболеваниями человека и животных.

РНКазную активность определяли по методу ЯескН (1975). За единицу активности фермента принимали такое количество фермента, которое вызывало увеличение светопоглощения при 260 им на одну оптическую единицу при инкубировании реакционной смеси при 37 °С в течение 15 минут.

Содержание белка определяли спектроофотометрически при длине волны 280 нм («ЬИакегДЭВО) .

Для выделения и очистки фермента использовали гель-1 фильтрацию на сефадексе 0-50 . ионообменную хроматографию на КМ-сефадексе и аффинную хроматографию на яелтьй А-сефарозе . Гомогенность ферментного препарата определяли методом эдект-

рофореза в полиакрилашдном геле ( ПААГ ) в денатурирующих условиях.

Шлекудярнуо массу очищенной РНКазы определяли двумя методами: гель-фильтрацией на Тойоперле HV-60 и.электрофорезом в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия.

Температурный оптимум фермента определяли, инкубируя стандартную смесь при температуре от 30 до 45 С.

Влияние рН на активность и стабильность РНКазы изучали в диапазоне от 2.5 до 11.5 .

Максимальную скорость гидролиза РНК и константу Ыихаэлиса (Км) определяли, используя уравнение Ыихаэлиса-Ментен в обратных координатах Лайнуивера-Еерка (Виноградова, 1978).

Изучение влияния катионов на РНКаеную активность проводили в интервале концентраций от 10 М до id М солей одно- и двухвалентных металлов в реакционной смеси.

Действие мочевины на шстцвность РНКазы определяли, инкубируя фермент при температуре 23 е С в течение 15 минут в реакционной смеси с различной концентрацией мочевины (1, 2, 4, 6 и 8 М). В качестве основного субстрата при исследовании активности и свойств РНКазы A. latddlawll PG-8 использовали вьюокопояимзризованну» дролоювую РНК (Sigma,США).

При определении специфичности РНКазы были использованы следующие полинукдеотиды : полиадениловая (поли(А).), полиури-диловая (поли(и)) и полицитадиловйя (поли(С)) кислоты (Serva, Германия).

Исследование продуктов гидролиза РНК проводили с помощь» высокожидкостной хроматографии (ЕВО.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУДЦШЕ 1. Изучение динамики накопления РНКазы в клетках и культу-'ральной жидкости молликутов.

С1штез ферментов определяется физиологическими особенностями шкрооганизмов-продуцентов и происходит в определенной фазе их развития. Поэтому после установления факта наличия РНКазы, в первую очередь мы приступили к изучению динамики

образования РНКазы s метках и культуральной жидкости A. laidlawi j PG-8. Дроке того, знание динамики образования РНКааы дает нам возможность определения того оптимального времени культивирования ахолеплазмы, при котором образуется максимальное количество фермента.

При изучении динамики яаколлэяня РНКазы как в клетках, так и в культуральной жщкостл A. Jaidlami Рб-8 мы обнаружили, что максимум РШйзной активности в обоих случаях достигался к 48 часам культивирования (рис. 1). Основной пул РНКази зкскретировался клетками в культуральнуа среду : в 1 л"культуральной жидкости концентрация РНКааы через 43 часов составляла 17 тыс. ед по Кунэтцу, а в 1 г биомассы из 1 л культури - 14Q ед. Для сравнения отметим, что 1 кг мяса цыпленка содержит 50 тыс ед по Кунктцу.

Рис. 1. Влияние продолжительности культивирования штамма АЛаиНаигн ГО-8 на накопление РНКазы 1 - в культуральной жидкости; 2 ~ в клетках. При исследовании в сравнительном аспекте динамика накопления РНКазы у отдельных представителей рода АсЬо1ер1а2!га и

- б -

Мусор] asm наблюдались как сходства, так и отличия. Так, отмечен общий характер накопления РНКазы у штамма A. laidlawu PQ-8 и штатов A. laidlawii тт. 118, A. axantum 5-743 как в клетках, так и в культуральной жидкости. РНКааная активность наблюдалась в первые сутки роста и достигала максимального значения к 48 часам роста, а затем постепенно снижалась. В то же время штамм A. granularum BTS-39 отличался от родственных штаммов тем,что максимальная РНКазная активность наблвдалась к 72-часам культивирования . Точно такая же динамика накопления РНКазы с максимумом активности на третьи сутки культивирования присуща и для штаммов рода рода Mycoplasroa М. capricolum california Kid и M sal i varum PG-20. Также следует отметить, что штаммы отличаются ло уровню РНКааной активности.

РНКазная активность увеличивалась параллельно накоплению биомассы и достигала максимального значения к концу экспоненциальной фазы роста. Это дает основание предполагать, что внеклеточные РНКазы участвует в процессах питания и являются факторами, регулирующие рост микробной популяции. Исследование динамики накопления РННаз является существенны!,! моментом в процессе разработки схемы получения РНКазы юлликутов.

2. Выделение и очистка внеклеточной РНКазы Acholeplasma laidlawii PG-S

На основе установленного нами факта,что основное количество РЯКаз у молликутов вддегяегся клетками в культуральную жидкость, был сделан вывод о целесообразности их выделения из среды культивирования,тем Солее кажется важным, что несвязанный с клетками фермент является транслокабельным и может служить потенциальным фактором патогенное?« микроорганизма.

Для выделения и очистки фермента использовали методы белковой химии: гель-фильтрацию , ионообменную и аффинную хроматографию. Условия выделения фермента выбирались на основе результатов экспериментальной проверки описанных в литературе методов , а также способов, впервые отработанных в процессе .

- 7 -

проведения данного исследования.

Питательная среда СМ ИМВ-72, использованная для культивирования микоплаам, включает высокомолекулярные белки, создающие трудности при очистке фермента. С целью отделения высокомолекулярных белков была применена гель-фильтрация на сефадеюзе G-50.

В таблице 1 приведены некоторые характеристики фермента на различных этапах выделения и очистки. lía первом этапе выделения фермента после гедь-ф:ш>трации на сефадексе G-5Q выход РНКазы составлял 69. 87. .удельная активность возросла в 10 раз по сравнению с активностью в культурадьной жидкости.

далее для очистки РНКазы использовали Щ-еефадекс. В процессе хрогатографлчешгого разделения на КМ-се&зд?кс® Pffito-за элшровалась с ¡солонки практически полностьв при концентрации соли о. 05-0.1. (рис.2). Выход РНКазы составил 54 X от исходного,удельная активность 374,3 ед/мг белка (таб. 1). Хроматография на Ш-сефадексе позволила сконцентрировать фермент и частично избавиться от примесей.

Рис. 2. Хроматография РНКазы Al ai di awu PQ-8 на сефэдетее. 1 - РНКазная активность ( ед/ыл }; 2 - Седок (Аиох10~г ) ;

3 - концентрация КС1 ( М х 10"').

Таблица!. Очистка РйКазы А. 1аШ1а*ц Рб-8

N Этапы очистки

Общая РШазиая Объем активность в мл ед

Обпий белок Удельная Степень Выход иг активность очистки в X

ед/мг

1. Крльтуральяая

жидкость 150 2700

2. Сефздекс <3-50 42 1883

3. КМ-еефадекс 13 1460

4. Желтый А-сефзроза 3 775

235 19.3 3.9 1.2

9.47 97.5 374.3 645. а

1. 10.3 39.5 68.2

100.0 69.8 54.0 га 7

1

со

(

Дальнейшую очистку проводила методом афишей хроматографии на колонке с жэпа.1 А сефароаой. (рис. 3).

Рис.3.. Длинная хроматография РНКазы А. 1з:с!1з'..'11 РЗ-З на коленке с яелтьй А - сефарозсй . 1 - РНКазная активность (йд/ид); 2 - белок (к280 х10"2 ); 3 - концентрация КС1 (!.! х 10" ).

Фракции с максимальной РНКазной активностью после хромата - графин иа колоний, с краситвль-иазричяш геле« исмэдовагш на гомогенность с помощью электрофореза в юлиакриламидноы геле в денатурирущях условиях- В результате бьша выявлена одна белковая полоса, свидетельствующая о гомогенности фермента (рис.4). На основании подвижности РНКазы а шести маркэрних белков с известными молекулярными весами определяла молекулярную массу РНКазы Она составила 12400. дальтон. При определении молекулярной массы фермента с помощью гель-фильтрации на ТОУО РЕДЯ. Ш-60 бия отлучен результат - 13500 дальтон.

ТакиИ образом, использование гель-фильтрации, ионообменной и аффинной хроматографии, позволило получить из сапрофитного игамма А. 1аи31з\«1 РСЬЗ внеклеточную ГНКаэу : препарат был получен н гомогенна« .состоянии с удельной активностью 845.3 ед/мг (таб.1).

« Б"

1 - «у 2-й?

з - <£ ц - **

5 - «

Рис. А. Электрофореграша в ПААГ РНКааы А. 1а1(Да»/П ю-а А. - маркерные белки:

1 - фосфорилаза (94 кД);

2 - бычьий альбумин (67кД);

3 - овальбумин (43 ¡г®;

4 - карбоангидраза (30 кД);

5 - ингибитор химо-

грллсина (20.1 кД);

6 - цитохром С (12.3 кД).

Б - РНКаза А. 1а1с51ак/и Ре-8

Для того, чтобы убедиться, что очищенный нами фермент является именно РНКазой, б качестве субстрата были использованы как РЖ, гак и ДНК (линейная, кольцевая и денатурированная). При инкубировании фермента и РНК при 37°С уже в течение 5 минут субстрат был гидролизовзн полностью, в то время как инкубация фермента с ДЖ в течение 90 минут показала, что ДШ осталась нераецэпленной . Эти результаты подтверждают, что очищенный наш фермент является гомогенно чистой РНКазой без примеси нукпеаз и ДНКаз .

Установлено, что РНКаза А. 1а1с11а»11 Р&-8 является эндонук-леааой,!. е. она.осуществляет одновременно несколько разрывов на веем протяжении полинуклеотидной цепи. Дополнительным подтверждением служит тот факт, что РНКаза не расщепляет денатурированную ДНК.

ШКазиая активность, ед/мл

> Я

к fe

а. Е

р>

в

g

ÍS

ts к

43 n Ф tí a? СП U1

« К .—-

E ■о О

H to о И Р>

OJ Cú » И

к ai О

pj W

я il) Ч. M

Ф о ф

£C о в:

S M to Cl» о

.4

s ¡í ц и о

M Я

ta il- ■та

ф гэ Ей

c> í> ta

й о о 5

en Ы t"

g а

S й M i-'

U1 2 В

л в ■о о.

Ш ta £

о о <0 -Щ

о о ¡S

a ч ч

и

О О 4Î

8 13 ?

•о О № DJ о

Й 8-g

я> a m

ч m

о ч

ЙЗ о

ч о

tí tu и

t¡ g ч

"SS

S

ta a¡

гаКаэная активность, ед /мл

&

а

I

§ ф

о

ta i

ci »

Q I— ta i

tu '

¡Í

¡S

Й. a

■3

- 12 -

Константа ^МихазлисаСКм) для РШааы А. laidlawu PQ-8 составила 2.2x10 кг РНК.

Зависимость активности фермента от концентрации ионов металлов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние катионов на активность РНКааы А. laidlawu PS-8

РНКазная активность ( в %■ от исходной )

Конечная концентрация соли, М

Катион ---------------------------------------

IxlO3 lxlO-2 1x10*

Мп++ 7а о 60.0 55. 7

Мг++ 10Q.0 101.0 105.0

Са++ 49.3 .16.8 40.2

Zn++ 109.3 118.6 144.0

Fe++ заз 6S.3 118. б

Си++ 186. 6 313.3 400.0

К+ 100.0 97.7 96.0

Ма+ 100.0 93.7 99.0

Так, ионы Ып++ в концентрации от до 100 мЫ подавляют активность фермента на 27-44,3 X, .а ионы Са++ от 50.7-59,82. Ионы Ге++ в малых концентрациях {1 и ЮмВД ингибируиг на 30. 7 -66.71, а при увеличении концентрации до 100 Ш активность фермента повышается на 18,6 X - Ионы К+ и практически не влияют на активность фермента. С увеличением концентрации ионов 21++ активность фермента повышалась от 9X до 44Х. Цри наличии в реакционной смеси 1 Ш ионов Си++ активность фермента увеличилась на 86Х.С увеличением концентрации до 10 и 100 ш активность изменилась скачкообразно и достигала 313,3 и 400 % от исходной, соответ - ственно.

- 13 -

Итак, по степени ингибирования фермента катионы можно расположить следующим образом Ге++ > Са++ > Мп++. гп++ и Си++ являются активатора™ фермера. Ионы К+,Ма+ и не влияот на активность фермента .

В результате изучения влияния мочевины на РВКазную активность,было установлено, что в присутствии 1 М мочевины в реакционной смеси наблюдалось возрастание активности фермента на 20 % от исходной. В 2 Ы растворе мочевины сохранялось 40Х, а в А Н - 20 % исходной активности. В 6 и 8 М растворе мочевшш происходила полная инактивация РЯКазы (рис. 7).

Рис.7. Действие мочевины различной концентрации на РНКазную активность А.1а1<Из*и Рв-8

На рис. 8 представлены результаты исследования специфичности РЕКазы А. 1а1(31в«11 РО-8 к "аояцнуклемгидаы.

- н -

Рис. е. Расщепление синтетических полину.'леотвдав 1 г ъ и s s номера внеклеточной РНКазой

дорожек

А. laidlawii PG-8

1 - лоди(А) + РНКаза * ' 2 - поли( С) + РНКаза

3 - полиС U) + РНКаза

4 - полиСА)')

5 - подиСС)>

6 - шли( U)j контроль

Как видно из рис.8, РНКаза А. laidlawii Р6-8 отдает предпочтение поли(С)-последовательностям: высокомолекулярная поди (С) деградирует до ниаксшлекудярнойС дсрожа 2). Шли (А) и поли(и) подверглись незначительному гидролизу .возможно,потому что полис А) и поди (Ü) гадродизуется путем ступенчатого отщепления нуклеотидов с юнца.

Тагам образом, проведенное исследования позволяют нам заключить, что внеклеточная РНКаза А. laidlawii PG-8 обладает С-специфичностью, подвергая •деградации поли(С) в наибольшей степени.

Учитывая своеобразный свойства РВКазы А.-laidlawii PG-8 и особенно ее специфичность к цитидиновш связям , небезинте-ресно было испытан» способность этого фермента гидролиаовать _природные РНК и изучить состав этого гидролиза В качестве субстрата для феризнгативного гидролиза была взята дрожжевая РНК. В качестве источника фермента использовали культуральную жидкость А.laidlawii PG-8,' гаторая представляла собой ферментный препарат в комплексе с белками-кофакторами.

Результаты исследований продуктов гидролиза РНК приведены в таблице 3.

Таблица 3 . Исследование продуктов гидролиза дрожжевой РНК

методом ВЮС

N Наименование Количество веществ

продукта (в X от общего продукта

п/п гидролиза)

1. Урвдина фосфат 3.654

2. ЦИТИДШ! 2.037 а Уридин 33.475

4. . Аденозина фосфат 8.720

5. Гуанозина фосфат 2.198

6. Аденоаин 2.839

7. Гуанозии а 203

Суммарное количество нуклеотидов 51.327

'■ Шидентифицированныз вещества 33.673

Суммарное количество продуктов

гидролиза 100.00

Среди продуктов гидролиза РНК обнаружены производные всех четырех рибонуклеотндов, составляющих РНК. В наибольшем количестве обнаружен уридин (33.4Х) , в наименьием - щшдаш (2. ОЗХ). Высокое аначение урвдина, вероятно, является следствием дезаминирования цитидина, Дня подтверждения нашего предположения мы вносили в реакционную смесь избыток цитидина и наблюдали его дезаминирование, в результате которых было получено свыше 452 уридина Следовательно, в кудьтуралыюй жидкости А. 1а1с11а«и РЗ-8 находятся в активном состоянии ци-тидиядезаминазы» катализирущяе превращение цтидина в уридин.

Среди продуктов гидролиза установлено тагаа более 382 не-

идентифицированных веществ, к который относятся npoueityточные продукты распада РНК : фрагменты олигонуклеотидов, фосфаты и различные циклофосфаты. Это свидетельствует о неполном гидролизе РНК, несмотря на длительную инкубацию фермента л субс- _ трата. Наличка в продуктах гидролиза фргаментов олигонуклео-тидов гакда подтверждает зндонуклеазньй характер РНКазы.

Лучение состава продуктов гидролиза РНК имеет прикладное значение. Культуральная мздкосгь, как источник комплекса ферментов , катализирующих реакций расщепления нуклеиновых кислот в перспективе (при подборе соответствующих условий)модат успешно применяться для гидролиза РНК к получения нуклеотидов и нуклеоаидов для научно-исследовательских целей.

В таблице 4 мы приводим физико-химические свойства РНКазы A. laidlavii Р6-8 в сравнительном аспекте со свойствами РННаз некоторых микроорганизмов. Гак, сравнение свойств показало, что исследуемая наш РНКаза сходна по молекулярной массе с ферментами бактерий рода Bacillus .

Оптимум температуры для всех приведенных РНКаз составляет 38-40ûC, что характерно для РНКаз прокариот и эузсариот.

В отличие от РНКазы А. laldla*! 1 Pß-8 ,которая является кислой РНКазой, у всех остальных РНКаз оптимум pH находится в нейтрально-щелочном диапазоне.

РНКаза A. laidlawii PG-8 активируется ионами Си++ и Zr>++ . Но этому свойству она сходна с РНКазой Lact.obacillus plantarum.

Во специфичности к яолинуклеотодам РНКаза сходна с РНКа-зами Е cereus и Е.coll. Подобно РНКазе А. laidlawii PG-8, они также предпочтительно расщепляют поли(С)-последовательности.

Итак, сравнение свойств РНКаз показало, что имеются как сходства, так и отличия меэду ферментами отдельных микроорганизмов и исследованной нами РНКазы.

Сравнение фермента с изученными РННазами других микроорганизмов дает нам право сделать вывод о том, что РНКаза А. latdiaü'i 5 является оригинальным ферментом, имеющим фундаментальное отличие от РНКаз других микроорганизмов, в том числе и филогенетически близких. Наиболее отличителььым свойством является потребность РНКазы ахолеплазмы в кислой среде для проявления максимальной активности и зависимость ее активности от ионов Си++.

Таблица 4. Ks которое физико-химические свойства РНКзз

мзткросрганизмов и молликута Achaleplasra laidlawü FS-S

H/H Шлекуляркая Условия действия

Продуцент масса Специфичность ---------------------------------------------

РЕКазы кД к полинуклео- термооптимум оптимум pH актива- инги-

тцдам торы бз'торы

1. Bacillus а

subtllis (1) 10.1 поли( I) 33 С 7.5 - Ц>++

2. a thurmgiensis 12.0 поли(в)

var. subtoxicus (2) полис I) 38 С 5.5 - 1

3. В. careus( 3) 12.0 ПОЛИС С) 40=С 7-3 - iör+

• поли( U)

4. Lactobacillus

plantarum (4) 90.0 полк(А) 33 С 8.6 ЭДТА

5. Escherichia coli (5) 27.0 поли(С) 40°С 7.6-9.7 k",Nk£

6. Acholeplasma D

laidlavii PG-8 12.4 поли( С) 3S С 5.6 Си++, ЭДТА

Zn++

Примечание: 1. Reich, 1986

2. Дементьев и др., 1992.

3. Татарская, 1934

4. "Татарская,196-1,Lccard,1978

5. iMeador, 1990

- 18 -в и в о да

1. Впервые выделена и изучена внеклеточная РНКаза Acholeplasira laidlawii PG-8 - представителя семейства Acholeplasmataceae ( класс Mollicutes)

2. РНКаза A. laidlawii PG-8 получена в гомогенном состоянии с удельной активностью 645.8 ед/мг белка

3. Молекулярная масса РНКазы в нативном состоянии составляла 13. 5 кД , в денатурированном состоянии 12. 4 кД.

4. Максимальная ферментативная активность РНКазы A. laidlawii PG-8 проявляется при температуре 38-40° С и оптимальном значении рН Б. 5 .

5. Константа Михазлиса для РНКазы A. laidlawii PG-8 составляет 2.22х20~3ыг РНК.

6. Эффективным активатором РНКазы является ионы Си++ в концентрации 100 ыМ, в присутствии которых активность фермента повышается в 4 раза. Ib степени ингибирования РНКазы катионы можно расположить следующим образом: Fe++>Ca++>Mn++ .

7. Установлено, что среди синтетических полирибонуклеотидов РНКаза A. laidlairil предпочтительно расщепляет поли(С)-последовательности.

8. По специфичности действия на нуклеиновые кислоты РНКаза A.laidlawii PG-8 является эндонуклеазой.

CIMCOK РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Янчшюва а Я., Грама -Д. IL , Скрипаль И. Г. РНКазы молликута Acholeplasma laidlawii PG-8: обнаружение и динамика накопления //Ыикробиол. яурн. -1891. -53, N 5. -С. 26-30.

2. Янчшюва а Я., Грама Д. П., Скрипаль И. Г. Субстратная . специфичность РНКазы Acholeplasma laidlawii PG-8 //Ыикробиол. журн. -1992. -54, Л 1.-С. 58-61.

3. Янчияова З.Я РНКазная активность в микоплазмах различного таксономического положения //Микробиол. яурн. -1992. -54, N 4. -С. 34-36.

4. Янчшюва а Я., Грама ДIL , Скрипаль И. Г. .Бабичев Е Е Очистка и фиаико - химические свойства РНКазы Acholeplasma laidlawii РВ-8 // Микробиол. журн.-1993.-55,

Н а -С 65-69