Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пептидергическая модуляция сна

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Пептидергическая модуляция сна"

Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

Р Г Б ОД

9ДК 812.821.7+612.8.015

КОВЙЛЬЗОН Владимир Матвеевич

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ МОДНЛЯЦИЯ

СНА

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук '

Москва, 1994 г.

Работа выполнена в Институте эволюционной морйологии и экологии животных им. А.Н.Северцова Российской Академии наук

(г. Москва)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: академик РАМН, доктор биологических наук, профессор И.П.Ашмарин доктор медицинских наук, профессор Я.И. Левин доктор биологических наук, профессор Ю. Б. Мантейфель

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится "28" ноября 1994 г. в 15 час 30 мин на заседании специализированного совета Д. 053. 05.35 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Биологическом факультете Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, Биофак МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ им. А.М.Горького.

Автореферат разослан " 28 " октября 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета.

кандидат биологических наук Б.А.Умарова

Памяти отца (1913-1992)

"...сон же. по-видимому, принадлежит по своей природе к такого рода состояниям, как, например, пограничное между жизнью и не жизнью, и спящий ни не существует вполне, ни существует..." (Аристотель, И в. до н.э.)

"Ученые, признающие' сон за остановку или диастолу мозговой деятельности, ошибаются, так как во время сна мозг вовсе не спит, не бездействует весь целиком, а засыпанию подпаЭают только те части его, которые составляют анатомическую основу, анатомический субстрат сознания." (М. М.Манасеина, 1892)

"Ясное дело. что наш дневная работа представляет сумму раздражений, которая обуславливает известную сумму'истощения, и тогда эта сумма истощения; дошедшая до конца, и вызывает автоматически, внутренним гуморальным путем (подчеркнуто мной, КБ), тормозное состояние, сопровождаемое сном." (И.П.Павлов. 1935)

"Я сплю, я вижу сны - следовательно, я существую!" .(Мивеяь. Жуве, 1992)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема сна остается одной из наиболее загадочных в современной физиологии. Несмотря на огромные усле хи, достигнутые в изучении сна во второй половине нашего столетия, ответа на основной вопрос - "какова функция сна, дл; чего он нужен организму?" - до сих пор не получено. Об акту алъности этой проблемы можно судить по формированию в послед ние годы мультидисциплинарной "науки о сне", многочисленны: национальных и региональных научных обществ по изучению сна объединенных с 1991 г. во Всемирную Федерацию (WFSRS), прове дению ежегодно различных конференций и симпозиумов по сну публикации двух международных периодических журналов ("Sleep и "Journal of Sleep Kesearch") и справочно-библиографическог и реферативного ежегодника ("Sleep Research", BIS/BRI, UCLA Los Angeles, CA). Согласно этому справочнику, количество еже годно публикуемых научных сообщений по проблеме сна составляе около двух тысяч (!) названий. Это вызвано естественным инте ресом к пониманию этого базисного состояния организма со сто роны фундаментальных наук.

С другой стороны, научной и медицинской общественность сейчас осознано, что небольшие хронические нарушения сна бодрствования, столь характерные для современного урбанизиро ванного человечества, хотя к не представляют, по-видимому опасности для здоровья, чреваты, тем не менее, серьезными пос ледствиями в производственной сфере, на транспорте и т.п. Оь даже могут быть одной из важнейших причин (скрывающихся за не

определенный термином "человеческий фактор") целого ряда инцидентов и катастроф. Специальная общественная комиссия США "Сон, катастрофы и социальная политика" пришла к выводу в 1988 г.. что характер производственной деятельности человека в условиях научно-технической революции диктует необходимость строгого соблюдения жестких требований гигиены сна. в то время как его образ жизни плохо согласуется с этими требованиями. Эта коллизия продолжает обостряться, что заставляет принимать срочные меры в промышленно передовых странах. В частности, в США по всей стране развернуто более 500 центров по коррекции нарушений сна. в рамках Национального Института Здоровья (КIН) создается специальный Институт по изучению сна. разработаны новые безлекарственные методы лечения и т.п. Одним из важнейших направлений в этой области является создание эффективных и безвредных лекарственных препаратов нового поколения. Для решения всех этих проблем необходимым условием является изучение фундаментальных физиологических механизмов сна человека.

Прямое микрофизиологическое, нейрохимическое и гистологическое изучение нейронных систем, вовлеченных в регуляцию сна-бодрствования, проведенное в последние годы, позволило сформулировать важное положение относительно пассивной природы медленного сна. возникающего вследствие периодического спонтанного ослабления тонических активирующих воздействий на кору со стороны нейронных систем ретикулярной формации ствола, заднего гипоталамуса, базальных отделов переднего мозга, области синего пятна и ядер шва. использующих в качестве медиаторов глутамат. ацетилхолин. норадреналин, серотонин и гистамин. с одновременным растормаживанием ГАМК-эргических тормозных ней-

ронов таламуса и базальных отделов переднего мозга; в результате этого переработка информации в таламо-кортикальной системе резко ослабляется (Steriade, 1992).

В то же время доказана активная природа парадоксального сна, имеющего четко выраженные морфологически (дорзальная покрышка моста) и нейрохимически (ацетилхолин, глутамат) исполнительные механизмы (Barbara Johns, 1991); активация этих механизмов сопровождается полным прекращением импульсации моноами-нергических нейронов мозга. При этом происходит интенсивная переработка информации, хранящейся в мозге, на Фоне подавления афферентного притока и полного отключения эффекторного выхода. Эти процессы находят свое выражение в сновидениях (у человека) и так наз. "онейрическом поведении" у кошек с разрушениями в области синего пятна (Jouvet et al., 1965; Henley, Morrison, 1974).

Практически неизвестным, однако, остается тот механизм (очевидно, гуморальный, поскольку речь идет о медленно протекающих процессах), посредством которого происходит по-перемен-ное вовлечение тех или иных нейронных систем, их переключение, •определяющее наступление и циклическое чередование обеих фаз сна. На эту роль требуются вещества, обладающие более длительным сроком жизни в организме, чем "классические" нейромедиато-ры, менее специфичные по отношении к рецепторам, способные переносится током ликвора и диффундировать по межклеточной жидкости, оказывая воздействия на более обширные области в мозге, иногда довольно удаленные от места выброса. .Такие вещества стали известны сравнительно, недавно - это регуляторные пептиды. продукты прицельного протеолиза белков, эволюционно древ-

ние передатчики, широко распространенные в мозге и организме и играющие важную роль в целом ряде физиологических процессов (И. П. Ашмарин и соавт.* 1986-1994; А.А.Замятнин, 1987-1994). Однако роль пептидов в регуляции сна пока мало изучена (Коваль-зон, 19В6, 1994; Borbely, Tobler, 1989; Graf, Kastin, 1984. 1986; Inoue, 1989; Inoue, Borbely, 1985; Inoue. Krueger, 1990; Inoue. Schneider-Helmert, 1988). Настоящая работа представляет собой попытку 'заполнить этот пробел.

■ Научная новизна и теоретическая значимость. Данное экспериментальное исследование состоит из двух основных частей. Первая часть, выполненная на крысах, посвящена изучению некоторых физических воздействий на физиологическое и поведенческое состояние животных. Впервые обнаружена тесная связь между механизмами регуляции стресса и сна: нарушение нормального функционирования системы сна-бодрствования (депривация парадоксального сна методом пробуждающих раздражений ретикулярной формации) приводит к разрегулированию системы стресса (гипоплазия надпочечников), а нарушение деятельности системы стресса (адреналэктомия) приводит к разбалансу системы сна-бодрствования (увеличение медленного сна после кратковременного умеренного эмоционального стресса).

Анализ имеющейся по этому вопросу литературы привел нас к заключению, что эта интимная связь между механизмами сна и стресса может осуществляться через посредство некоторых пептидов мозга, важнейшим среди которых является, по-видимому, DSIP: единственный, выделенный из организма как специфический "пептид сна", и обладающий трофотропными и стресс-протективны-ми свойствами. С целью изучения свойств этого, а также другого

- в -

из немногочисленных известных гипногенных факторов - мура-мил-пептида - была выполнена на крысах и кроликах вторая часп исследований, посвященная изучению некоторых биохимически; воздействий (внутрижелудочковые инъекции и инфузии растворо; пептидов) на физиологические показатели цикла сон-бодрствование.

Однако попытка промоделировать действие DSIP в качеств! "гормона сна" (выделяющегося в определенных нейросекреторны ядрах гипоталамуса и диффундирующего по спинномозговой и межк леточной жидкости) путем его прямого введения в желудочки моз га крыс и кроликов в "физиологичных" дозах выявила неожиданны сложности. По-видимому, при введении извне этот пептид слишко быстро распадается под воздействием специфической аминопепти дазы.

Работая с обширной группой структурных аналогов DSIP частично защищенных от протеолиза химическим путем, мы показа ли, что в некоторых случаях отмечаются необычные, ранее н описанные эффекты на сон крыс и кроликов, значительно отличак щиеся от действия барбитуратов, бензодиазепинов и друга •"снотворных" веществ. Модулирующие гипногенные эффекты аналс гов DSIP проявлялись в виде пульсирующих (в большинстве случг ев значительно отстоящих от_момента введения) изменений почг совой процентной представленности медленного и/или парадо! сального сна. Феноменология этих эффектов, продемонстрирова; ная в виде разнообразия "профилей сна", свидетельствует о boi лечении вводимых аналогов в каскадные пептидергические npouei сы в мозге. Кроме этого, неожиданностью явилась обнаружена нами тесная связь между структурой аналогов DSIP и характер

их гипногенной активности. Такое структурно-функциональное взаимоотношение отражает, по-видимому, особенности конформаци-онного взаимодействия молекулы с гипотетическим рецептором/рецепторами.

Что касается гипногенного действия мурамил-пептидов. то здесь, по-видимому, важнейшую роль играет путь, которым эти экзогенные вещества проникают в организм хозяина. Если они попадают прямо в кровь в результате инфекции, то приводят к тяжелым "гиперсомническим" состояниям, характерным для лихорадки. Нормальное же их поступление из кишечника, вполне возможно. является необходимым элементом в общей системе модулирующих влияний со стороны пептидов мозга на нейронные механизмы сна-бодрствования. В целом полученные нами данные заставляют по-новому взглянуть на всю проблему гуморальной регуляции сна.

Практическая значимость. Практическая значимость данной работы для медицины и фармакологии определяется несколькими факторами. Во-первых, наши исследования по депривации парадоксального сна и ее воздействию на систему стресса и эмоциональное поведение позволяют лучше понять механизм формирования невротических и психосоматических заболеваний (В. С. Ротенберг, В. М. Ковальзон. В.Л.Цибульский. 1986). Во-вторых, работало воздействию эмоционального стресса на адреналэктомированных крыс открывает новый подход к изучению и поиску новых средств лечения депрессии (Севр^Ио, ЛоиуеЪ еЬ ¿1.. ' 1990-1994). 3-третьих, изучение пептида и его аналогов создает основу для создания принципиально новых лекарственных препаратов снотворного действия. Соответствующий проект с участием иссле-цователей Института, биоорганической химии РАН и некоторых дру-

гих научных учреждений находится в стадии реализации. Для трех исследованных аналогов, структура которых не раскрывалась при публикациях, подготавливается заявка на патентование. Что касается мурамил-пептидов. то наши данные об их воздействии на сон представляются весьма существенными, поскольку эти вещества уже нашли свое применение в иммунологической и онкологической клинической практике, и лечащим врачам необходимо знать о возможных побочных последствиях. Разработанный нами метод автоматизированной идентификации состояний в цикле сон-бодрствование может найти применение при исследовании сна человека, в том числе и в клинике. В настоящее время нами совместно с одной научно-медицинской фирмой разрабатывается оригинальный автоматический анализатор■сна человека. .

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих национальных и международных конференциях: на IY (г. Тиргу-Муреш, Румыния, 1978), YII (г.Мюнхен, ФРГ, 1984), YIII (г.Сегед, Венгрия, 1986), X (г.Страсбург, Франция, 1990), XI (г.Хельсинки. Финляндия, 1992) и XII (г.Флоренция, Италия, 1994) Европейских конгрессах по изучению сна; на XIII съезде Всесоюзного физиологического общества в г. Алма-Ата в 1979 г.; на III и IY Всесоюзных конференциях по физиологии и биохимии медиагорных процессов в г.Москве в 1980 и 1985 гг.: на IY и Y Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ в г. Риге в 1981 и 1983 гг.; на международном симпозиуме "Поисковая активность, мотивация и сон" в г.Баку в 1981 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" в г. Риге в 1982 г.; на IX Всесоюзной конференции по биохимии

нервной системы в г.Ереване в 1983 г.; на симпозиуме "Сон как фактор регуляции функционального состояния организма" в г.Паланге в 1983 г.; на симпозиуме "Система мозговых и внемозговых пептидов" в г.Ленинграде в 1984 г.; на I Всесоюзной конференции "Нейропептиды: их роль в физиологии и патологии" в г.Томске в 1985 г.: на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы физиологии и патологии сна" в г. Москве в 1985 г. ; на международном симпозиуме "Нейробиология цикла бодрствование-сон" в г.Тбилиси в 1986 г.; на международном симпозиуме "Peptide Research" в г. Сегеде, Венгрия, в 1987 г. ; на симпозиуме "Физиология пептидов" в г.Ленинграде в 1988 г.; на IX Всесоюзной конференции по нейрокибернегике в г. Ростове-на-Дону в 1989 г. ; на международном симпозиуме "Molecular basis of action of bloactlve substances on behavior" в г.Таллинне в 1989 г.; на ежегодных симпозиумах международной группы по фармако-ЭЭГ в 1990 (г.гетеборг, Швеция) и 1991 (г.Амстердам. Голландия) гг.; на ежегодной конференции Американского общества по изучению сна в г.Миннеаполисе. США, в 1990 г.; на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов в г.Риге в 1990 г. ; на симпозиуме "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" в г.Ленинграде в 1990 г.; на I Всемирном конгрессе обществ по изучению сна в г.Канн. Франция, в 1991 г.; на XIII Международном конгрессе по нейрохимии в Австралии в 19Э1 г. ; на рабочем совещании "Дельта-Сон Индуцирующий Пептид: теоретические и прикладные аспекты" в г.Ростове-на-Дону.в 1992 г.; на Международной конференции "Клеточные последствия сна" в г.Мауи. Гавайи. США. в 1993 г.; на I Международном конгрессе польского общества по изучению сна в Варшаве в 1994 г.; на YII Международном конгрессе по психофизиологии в г. Салоники. Греция, в 1994 г.

- 10 -

В качестве приглашенного докладчика автор представлял свои результаты на научных семинарах и коллоквиумах: на кафедре физиологии Медицинского университета им. Альберта Сент-Дь-брди (г.Сегед, Венгрия) в 1986 и 1987 гг.; в Институте медицинской и стоматологической инженерии при Медицинском и стоматологическом университете <г-Токио, Япония) в 1988 г.; в Институте наук о жизни Мицубиши-Касей (г.Токио, Япония) в 1988 г.; в лаборатории экспериментального и клинического изучения сна Института фармакологии при Университете (г.Цюрих, Швейцария) в 1989 г.; в лабораториях фирмы Хофманн-Ля Рош (г.Базель, Швейцария) в 1989 г.; в медицинском центре "Мариаштайн" (г.Базель, Швейцария) в 1989 г.; в Институте психиатрии при Университете (г.Женева, Швейцария) в 1989 г.; на кафедре экспериментальной медицины Университета им. Клода Бернара (г.Лион, Франция) в 1985 и 1992 гг.

Структура работы. Основу работы составляют 5 глав, содержащие краткое изложение собственных исследований и их обсуждение.

Глава 1. О функции сна (обзор).

Глава 2. Взаимосвязь между парадоксальным сном, стрессом i .. эмоциональным поведением - экспериментальное исследованш на крысах.

Глава 3. Взаимосвязь между медленным сном и эмоциональны)

стрессом - исследование на адреналэктомированных крысах. Глава 4. Модуляция сна пептидом DSIP и его. аналогами.

4.1. DSIP как гипоталамический гормон (обзор).

4.2. DSIP как "пептид сна".

4.2.1. Исследование на крысах путем внутрижелудочковой ин1

- И -

екций.

4.2.2. Исследование на крысах путем внутрижелудочкобой инфу-зии.

4.2.3. Исследование на кроликах путем внутрижелудочковой и внутривенной инъекции.

4.3. Обсуждение.

Глава 5. Модуляция сна мурамил-пептидами - исследование на кроликах путем внутрижелудочковых, внутривенных и парентеральных введений.

Работу предваряет краткое Введение, содержащее некоторые исторические сведения, определение сна и краткую информацию, необходимую для понимания отдельных глав диссертации. В завершающем разделе - Заключении отражены перспективы дальнейших исследований в данной области и возможности практического применения результатов. Сформулированы также Выводы, завершающие диссертационную работу. Всего 175 стр., 43 рис., 3 табл. Библ. 50 русск. и 130 иностр. назв.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Взаимосвязь между парадоксальным сном, стрессом и эмоциональным поведением - экспериментальное исследование

на крысах.

В середине 60-х гг. Jouvet с сотр. был впервые применен метод депривации парадоксального сна, при котором подопытное животное (мышь, крыса или кошка) помещается на небольшой ост-

рсвок, возвышающийся над ванной с водой (часто для этой цели служит донышко перевернутого цветочного горшка). Животное приспосабливается спать на этом островке медленным сном, но при наступлении парадоксального сна сваливается в воду из-за полного расслабления мышц, характерного для этой фазы. Однако эта процедура депривации вызывает сильный стресс у животного вследствие иммобилизации, падений в воду, намокания, охлаждения и других побочных факторов. Для того, чтобы отделить эффекты собственно лишения парадоксального сна от сопутствующего стресса, контрольную группу животных помещают на островки большего диаметра. Считается, что степень лишения парадоксального сна при этом значительно меньше (примерно 4035). а стресс примерно такой же, как на малой площадке. Однако адекватность такого контроля представляется весьма сомнительной по некоторым соображениям, в частности из-за взаимодействия эффектов стресса и депривации, невозможности отделить таким образом эмоциональную реакцию страха и пр. (Albert, 1975; Mendelson et al., 1974; Murisen et al.. 1982; Onlanl, lortklpanidze, 1985; Vogel, 1975)..

Несмотря на эти возражения, "метод островков" из-за простоты и доступности получил чрезвычайно широкое распространение и использовался в сотнях работ. Было показано, что пребывание на островках в течение нескольких суток вызывает общее растор-маяивание эмоционально-мотивационного поведения экспериментальных животных (Vogel, 1975), в частности, повышение частоты самораздражения латерального гипоталамуса (Цибульский, Коваль-зон, 1977; Sielner, Ellman, 1972). повышение двигательной (ориентировочно-исследовательской) активности и снижение эмо-

циональной реактивности (страха) в тесте открытого поля (Ogllvle. Broughton, 1976). усиление агрессивности (Hlcks et al., 1979; Morden et" al., 1968). Отсюда били сделаны далеко идущие выводы о роли парадоксального сна в процессах регуляции мотивационного поведения, эмоционального уравновешивания, переработки информации мозгом, обучения, памяти, которые получили широкую известность (Кругликов и соавт.. 1975; Hennevln. Leconte, 1977; Vogel, 1-975, 1979).

Мы попытались разобраться в этом вопросе, отделив по возможности эффекты собственно депривации парадоксального сна от эффектов сопутствующего стресса.

Методика. Исследование проведено во второй половине 70-х гг. в Лаборатории эволюции сенсорных систем млекопитающих ИЗ-ГШ РАН (заведующий - доктор биологических наук, профессор А.Я.Супин) совместно с В.Л.Цибульским. Опыты проведены на 80 взрослых белых крысах-самцах Вистар. Животных разделили на S групп таким образом, что крыс каждой последующей группы подвергали какому-либо новому воздействию в дополнение к предыдущим: 1) интактный контроль; 2) оперированный контроль; 3) деп-ривация парадоксального сна методом пробуждающих раздражений ретикулярной формации (11 крыс с предварительно вживленными электродами в течение 4 суток под непрерывным полиграфическим контролем - ЭЭГ новой коры и гиппокампа, ЗМГ - пробуждали при каждом наступлении парадоксального сна, унилатерально раздражая ретикулярную формацию током слегка надпороговой интенсивности; 4) ограничение доступа к пище и воде; 5) иммоЗи-лизационный стресс; 6) холодовой стресс; 7) 4-суточное пребывание на большом островке (диам. 15 см); 8) пребывание на ост-

ровке среднего размера (диам. 11 см); 9) пребывание на малом островке (диам. 6.5 см).

Измерение стресса проводилось по морфологическим признакам (классическая триада Селье): весу надпочечников и тимуса, изъязвлению слизистой желудка. Животных ежедневно взвешивали. Эмоциональность оценивали в двух тестах: открытого поля и самораздражения латерального гипоталамуса.

Результаты исследований. Депривация парадоксального сна. Во время депривации с помощью пробуждающих электрораздражений ретикулярной формации (группа 3) суточная представленность медленного сна снижалась на 10%, а парадоксального - на 70% по сравнению с фоном. Животным удавалось сохранить около 30% парадоксального сна за счет его дробления на короткие частые эпизоды длительностью от одной до нескольких секунд. Периоды активного бодрствования (преобладающие ночью, как в фоне) чередовались с периодами медленного сна и нарастающими попытками перехода в парадоксальный сон. Число таких попыток и, соответственно, вызываемых экспериментатбром пробуждений нарастало ото дня ко дню; происходило также постепенное повышение порога пробуждения. Никаких заметных нарушений общего состояния, внешнего вида и поведения животных во время депривации не отмечалось. Масса тела сохраняла нормальный прирост (около 9 г в сутки). Полиграфическая регистрация восстановительного сна в первые 30 ч по окончании депривации выявила компенсаторное увеличение парадоксального сна в среднем на 50% по сравнению с фоном.

Морфоконтроль показал, .что кончики раздражающих электродов располагались в ростральном отделе ретикулярной' формации

зреднего мозга, в непосредственной близости от красного ядра и медиальной петли.

Измерение стресса по Селье. Депривация парадоксального сна методом пробуждений (группа 3) приводила к небольшому, но достоверному уиерьшеуию веса надпочечников (р<0,05) при тенденции к увеличению веса тимуса по сравнению с группой 2 (контроль) и отсутствию язв желудка. Во время депривации масса тела возрастала, как у контрольных животных - в среднем на 9 г в сутки.

Ограничение доступа к пище и воде у группы 4 вызывало небольшую потерю массы (в среднем на 5 г), недостоверную тенденцию к увеличению веса надпочечников по сравнению с группой 2 без изменений веса тимуса и образование нескольких (в целом по группе) язв желудка. Эти изменения можно интерпретировать как отсутствие выраженного стресса.

Воздействие иммобилизации и холода (группы 5 и 6), а также пребывание на островках всех трех диаметров (группы 7. Си 9) вызывало сильный стресс-синдром у животных. Происходило значительное и достоверное увеличение веса надпочечников и уменьшение веса тимуса по сравнению с группой 4 (р<0.01). а также патологические изменения эпителия желудка (образование язв). Развитие стресса сопровождалось снижением массы тела более чем на ЮЖ.

Тестирование в открытом поле. Среди всех групп крыс в целом не обнаружено значимой корреляции между исследовательской активностью и весом надпочечников (уровнем стресса): г=0,21; 0,05<р<0,1; п*=69. У крыс, лишенных парадоксального сна методом пробуждений (группа 3), не отмечалось значимых сдвигов ни по

одному из показателей по сравнению с группой 2. Значительное повышение эмоциональной реактивности происходило у крыс группы 4 (ограничение пищи) по сравнению с животными группы 2 (р<0,05). У животных групп 5 и 6 (стресс) не отмечалось достоверных изменений поведения по сравнению с группой 4. После пребывания на островках всех трех диаметров (группы 7, 8 и 9) происходило значительное снижение эмоциональной реактивности, или страха (р<0,01) и повышалась исследовательская активность.

Тестирование самораздражения. Депривация парадоксального сна методом пробуждений (группа 3) и холодовой стресс (группа 6) не влияли на.самораздражение. Уже после первых суток пребывания крыс на островке (группа 9) происходило значительное повышение частоты самораздражения, нараставшее в последующие сутки. Однако порог самораздражения не менялся.

Морфоконтроль показал, что кончики стимулирующих электродов располагались преимущественно в медиальной части латерального гипоталамуса, захватывая также точки, расположенные между сводом и мамиллоталамическим пучком.

Эмоциональное напряжение и сон: изучение у адреналэктомированных крыс

Согласно недавно выдвинутой гипотезе, подтвержденной рядом экспериментальных данных, в регуляции цикла сон-бодрствование принимает участие следующая последовательность событий (СезрадИо, Лоиуе1ега1.. 1991-1994). В бодрствовании происходит активация серотонинергических нейронов .ядер шва и усиленный выброс медиатора в проекционных зонах, в частности, в области полукружного ядра гипоталамуса. Эта активация и, еле-

довательно, выброс серотонина тем выше, чем выше эмоциональное напряжение в бодрствовании. Выделившийся серотонин, в свою очередь, вызывает усиленное образование гипотетических "Факторов сна". В числе возможных кандидатов в подобные факторы рассматриваются пептиды, выщепляющиеся из белка ПОМК: дез-аце-тил-а-МСГ (АКТГ1.13) и CLIP (АКТГ18.39), а также пептиды VIP и DSIP; возможно участие и других, еще не идентифицированных факторов.

Таким образом, согласно этой гипотезе, повышение эмоционального напряжения в бодрствовании должно приводить к удлинению последующего сна. Однако в реальном эксперименте этого не наблюдается. Острый эмоциональный стресс у крыс либо не влияет на последующий сон, либо вызывает небольшое увеличение процентной представленности парадоксального сна. т.е. изменение структуры сна (Rampln et al.. 1991). Создается впечатление, что в вышеприведенной схеме не хватает одного звена, системы отрицательной обратной связи, поддерживающей состояние относительного равновесия в системе бодрствования-сна. Логично предположить. что эту роль могут играть кортикостероиды. которые выделяются в _ ответ на стресс, беспрепятственно проникают сквозь гемато-энцефалический барьер и клеточные мембраны, и связываются с рецепторами в цитозоле и на поверхности ядра, оказывая, по-видимому, непосредственное воздействие на синтез белка генетическим аппаратом нейронов. С целью проверки данной гипотезы была задумана серия экспериментов с адреналэктомиро-ванными крысами.

Методика. Работа выполнена в 1992 г. во время 7-месячной стажировки автора на кафедре экспериментальной медицины Лионе-

кого Университета им. Клода Бернара (при финансовой, поддержке С^/МЯТ и ШБЕЙМ) совместно с д-ром Р.Сеспульо (Л. СеэривИо). а также заведующим кафедрой, профессором М.Жуве (М.Лоцуеи и сотрудниками. Опыты проведены на 18 взрослых крысах-самцах Вистар с предварительно удаленными (в лабораториях фирмы игга-Сгебо. Лион, Франция) надпочечниками и вживленными электродами (ЭКоГ. ЭМГ). После адаптации животных к условиям регистрации проводили контрольные записи сна-бодрствования в течение 12 ночных часов. По окончании контрольных записей проводили 1-часовую иммобилизацию крыс в тесных пеналах, начало которой совпадало с наступлением темного ("ночного") периода в камере. В этот период регистрация полиграммы продолжалась. Затем животным предоставлялся 1-недельный период для отдыха и восстановления, после чего вся процедура (контроль-иммобилизация) повторялась. При этом у половины животных перед повторной иммобилизацией производили подкожную инъекцию 1 мг/кг синтетического кортикостероида дексаметазона. По окончании опытов животных забивали и брали образцы плазмы крови для контроля уровня кортикостероидов.

Полиграммы обрабатывали визуально, по общепринятым критериям. Результаты вводили в персональную ЭВМ для вторичной обработки и статистического анализа с помощью специальной программы.

Результаты. Предварительная обработка показала, что контрольные показатели сна адреналэктомированных крыс существенно не отличаются от таковых у нормальных крыс. Однако, в отличие от нормальных животных, 1-часовая иммобилизация у крыс с удаленными надпочечниками вызывала резкое увеличение медленного

сна, начинавшиеся через 1 час после окончания иммобилизации. Т.е. в III час ночного периода в камере, и сохранявшееся на протяжении последующих 5 часов; еще один "всплеск" отмечался в предпоследний, XI час темного периода. Суммарное увеличение медленного сна составляло около 1,5 часа, или 38% по сравнению с' контролем. Достоверных изменений парадоксального сна не наблюдалось. Повторная иммобилизация давала тот же эффект, что и первая; никаких признаков габитуации. привыкания животных к процедуре иммобилизации, по воздействию на сон не отмечалось.

Если же перед повторной иммобилизацией животным вводили дексаметазон. то увеличения медленного сна не происходило; в этом случае сон после стрессорного воздействия у адреналэкто-мированных животных был таким же (по продолжительности и структуре), как у нормальных животных.

Модуляция сна пептидом DSIP и его аналогами

Delta Sleep-Inducing peptide (DSIP) - нонапептид. имеющий уникальную аминокислотную последовательность

Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu, был выделен из венозной мозговой крови кроликов, подвергнутых низкочастотной ("гипно-генной") электростимуляции интраламинарных ядер таламуса (так называемых "трофотропных зон" по В. Гессу). группой Schoenenberger-Monnler из Базеля в 1977 г. Интенсивные исследования, предпринятые в последующие.годы в различных лабораториях мира, показали, что DSIP или какой-то близкий к нему по строению пептид (пептиды) присутствует в свободном и связанном виде в ряде структур головного мозга, в первую очередь гипота-

ламусе н лимбической системе, а также в гипофизе и различных периферических органах, тканях и жидких средах организма, и локализуется совместно с некоторыми пептидными и непептидными медиаторами. Так. в гипоталамусе крыс, морских свинок, кроликов, кошек и человека DSIP локализуется совместно с пептидными гормонами люлиберином (гонадолиберином) и окситоцином/нейрофи-зином-I, в гипофизе млекопитающих - с CLIP, АКТГ/а-МСГ и тире-отропином, в мозговом веществе надпочечников - адреналином и норадреналином. Биохимические исследования in vivo и in vitro показали, что молекула DSIP крайне лабильна и при введении извне быстро разрушается под воздействием в первую очередь специфической аминопептидазы с отщеплением N-концевого остатка триптофана и последующего аланина. так что период ее полужизни не превышает нескольких минут. Физико-химическое изучение обнаружило. а теоретические расчеты подтвердили, что молекула DSIP в водных растворах принимает свернутую подковообразную конформацию, которая распадается после отщепления N-концевого остатка триптофана, что приводит, видимо, к инактивации пептида. Эндогенный DSIP существует в организме главным образом в комплексе с защитным белком-носителем, предохраняющем пептид от деградации, либо в составе по меньшей мере трех высокомолекулярных предшественников. ..причем он может находиться как в нативной форме, так и фосфорилированной и гликозилированной. Нто позволяет говорить о семействе DSIP-подобных пептидов.

Несмотря на довольно крупные размеры,- амфифильная молекула DSIP способна проникать через гемато-энцефалический барьер; предполагается, что это происходит с помощью специфического механизма переноса в области дна IY желудочка. Проницаемость

меняется в связи с циркадными ритмами и, возможно, зависит от функционального состояния организма.

Все это указывает на то. что эндогенный ВБТР (или 031Р-подобный пептид) является типичным регуляторным пептидом и должен, по-видимому, играть важную роль в процессах эндокринной регуляции (Ашмарин. Каменская, 1988; Ашмарин, Обухова. 1986; Ашмарин и др.. 1989; Замятнин. 1987. 1989. 1991). И действительно, показано, что Б31Р: (1) снижает базальный уровень кортикотрошна, а также блокирует его выброс, вызванный введением кортиколиберина; (2) стимулирует секрецию лвтеинизи-рующего гормона; (3) стимулирует выброс соматолиберина и соча-тотропина и тормозит секрецию соматостатика. Эндокринные же функции 031Р определяют, видимо, по крайней мере отчасти, его роль в обширном спектре физиологических и патологических реакций: стрессорных, где ОЭГР выступает в роли ранее не известного антистрессорного фактора (Айрапетянц и др.. 1983; Коплик и др., 1982; Неерсон и др.. 1984; Сухих и др.. 19.4; Бибакоу еь а1.. 1983); иммунных, где он может выполнять функцию иммуномодулятора и противоопухолевого агента (Шмалько, Михалева, 1988);_ терморегуляторных; кардиотропных и вазомоторных да1Р способен нормализовывать кровяное давление и сократительную деятельность сердца) (Ульянинский и др., 1990); болевых. где Б31Р оказывает анальгетическое воздействие, усиливая связывание мет-энкефалина с опиатными рецепторами; в регуляции циркадной ритмики;в формировании алкогольной и опиоидной зависимости (на чем основано применение его в клинике с целью снятия влечения к алкоголю и облегчения абстинентного синдрома) (Буров и др., 1986); в противосудорожных эффектах (Прудченко и

др., 1993); в анти-оксидантных эффектах (Кричевская и др., 1986) и др.

Резюмируя все эти разрозненные и противоречивые данные, можно высказать предположение, что эндогенный DSIP (или DSIP-подобный пептид/пептиды) представляет собой ранее не известный гуморальный регулятор организма, выполняющий многообразные функции, в числе которых - роль "трофотропного гормона" гипоталамуса {см. обзоры: В.М.Ковальзон, 1986, 1994), Мы приступили к изучение "первичного" - сомногенного - действия DSIP в конце 70-ых гг., сразу после того, как этот пептид поступил в распоряжение физиологов. За прошедший 15-летний период проведено изучение также и обширной группы из 25 химических производных DSIP, так называемых структурных аналогов. Все исследованные пептиды синтезированы группой химиков Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, а также В.Н. Калихевичем и С.И.Чуркиной (НИИ Химии при С.-Петербургском Гос. Университете). Изучение проведено в трех тест-системах: на крысах путем инъекции пептидов в боковой желудочек; на крысах путем 10-часовой инфузии пептидов в III желудочек; на кроликах путем инъекции пептидов в боковой желудочек. а также в вену.

Исследование на крысах путем внутрижелудочковой инъекции

Работа выполнена на кафедре физиологии Сегедского медицинского университета им. Альберта Сент-Дьерди (заведующий -профессор Д.Бенедек) в середине 80-ых гг. совместно с Ф. 00а-лом мл., П. Алфёлди и другими сотрудниками.

Hemdvxa. Опыты проведены на взрослых крысах-самцах Вис-

тар о предварительно вживленными электродами для экоГ и канюлями (по одной) в боковой желудочек мозга. Контроль расположения канюли и свободного тока ликвора по системе внутренних полостей мозга проводили с помощью прижизненного ангнотензинопо-го теста: возникновению питьевой реакции в течении 2 минут после введения через канюлю 0.1 рг ангиотензина-П, растворенного в 1 /in искусственного ликвора. что характеризует проникновение вводимого раствора через монроево отверстие в III желудочек. Исследовали пептид DSIP и 7 его аналогов: [D-Trp11DSIP. (D-Trp1 ]DSIPj_6, [D-Tyr1 ]DSIP, [D-Va]2]DSIP. [NMeAla8 ]DSIP, 4MWTO-(Gly-DSIP) и mHUio-(Gly-[D-Ala2]DSIP). Пептиды вводили в дозе 7 нМ/кг внутрижэлудочково (в/ж) в объеме 3-4 pi через канюлю. Вначале проводили контрольную регистрацию после введения 3-4 /ш искусственного ликвора. Введение проводили за 15 мин до выключения света в камере. На следующий день в это же время производили введение одного из пептидов тем же животным и регистрацию повторяли. Регистрировали 5Кс1' и двигательную активность животных. При изучении DSIP п части аналогов использовали запись на бумаге в течение 10-24 чассв и последующий визуальный анализ стадий бодрствования, медленного и парадоксального сна в соответствии с общепринятыми критериями по 40-секундным эпохам. Чтобы исключить субъективные ошибки. применяли слепой контроль: пептиды были зашифрованы под номерами, их формулы не были известны экспериментаторам. Другую часть аналогов изучали путем 24-часовой регистрации с помощью автоматического анализатора сна. В добавление, первые 3 часа после введения проводили также обычную запись на бумаге-электроэнцефалографа с последующей визуальной обработкой.

Результаты. Через 6 часов после однократной в/ж инъекции крысам 7 нМ/кг пептида 031Р возникало снижение (достоверное) процентной представленности медленного и парадоксального сна по сравнению с проведенным накануне аналогичным введением растворителя (искусственный ликвор) тем же 11 животным, кото- . рое сохранялось до конца 10-часовой ночной записи. При введении аналога [О-Тгр1]ВБ1Р И крысам достоверное увеличение медленного сна происходило в первый час записи и затем в 4-7-й (р<0,02) и 11-12-й часы (р<0.05). Увеличение медленного сна происходило за счет снижения бодрствования, причем максимальный эффект наблюдался в 7-й час записи, когда происходило также достоверное увеличение парадоксального сна. Сильная тенденция к увеличению медленного сна отмечалась за весь 12-часовый ■"ночной" период записи в целом (0,05<р<0.1). Введение аналога [0-ТугЧ031Р 9 крысам вызывало достоверное увеличение медленного сна за счет снижения бодрствования во 2-й, 3-й и 8-й часы записи. Максимальный эффект приходился на 8-й час. Парадоксальный сон достоверно возрастал во 2-й и 8-й часы. В целом за 12 часов отмечалось высокодостоверное увеличение и'медленного, и парадоксального сна (р<0,01). Выборочный детальный анализ полиграмм показал, что увеличение сна после введения аналогов [С-Тгр1 ]031Р и [О-Туг1]Б51Р. происходило за счет учащения периодов сна при строгом сохранении цикличности. Никаких изменений ЭЭГ и поведения вследствие введения пептидов не отмечалось. Гексапептид СО-Тгр']031Рг_6 при введении 9 крысам вызывал достоверное снижение медленного сна в 1-й и 2-й часы записи, а также по сумме первых трех, часов (р<0,01). Представленность парадоксального сна не изменялась. В последующе часы досто-

верных изменений сна не отмечалось. Сомногенный эффект введения пептида [0-Уа12]031Р 7 крысам проявлялся в увеличении медленного сна на 15-20% в 8-ой и 10-ый часы, а также во вторую половину ночи в целом (с 6-го по 12 час, р<0.05). В целом за весь 12-часовый ночной период отмечалась тенденция к увеличению медленного сна (0,05<р<0,1). После введения циклического аналога цикло-(С1у-Б31Р) 9 крысам отмечалось высокодостоверное' снижение медленного сна, приуроченное к 1-му часу после введения. а затем вторичный спад во вторую половину ночи (с 6-го по 12-й чао, р<0.05). В целом за 12 ночных часов отмечалась сильная, хотя и недостоверная, тенденция к снижению медленного сна (0.05<р<0.1). Другой циклический аналог, цикло-(С1у-[Г>-А1аг]031Р), также демонстрировал явную тенденцию к снижению медленного сна в 12-часовый ночной период записи у 5 крыс, хотя только в 11-й час это тенденция достигала уровня, близкого к достоверности (0,05<р<0.1).

Исследование на крысах путем внутрижелудочковой инФузии

Работа выполнена в отделе биокибернетики Института медицинской и стоматологической инженерии Токийского медицинского и стоматологического университета (Япония) совместно с д-рами М. Кимурой-Такеучи, К. Хонда и заведующим отделом, профессором Ш. Иноуэ во второй половине 80-х гг.

Методика. Изучены гипногенные свойства пептида Б31Р и 10 аналогов: Ш-Тгр1 ЗШ1Р, [О-Туг1 ] В51Р, [0-А1аг)051Р,

£0-А1аг ] ОБГР, _6, (С-Туг1.Е>-А1аг]1ШР. Ю-АХаМуг^ВЗГР. [0-Уа1г]031Р, цикло-(С1у-Ю31Р), цикло-(С1у-[0-А1аг]1)31Р) и др.

Опыты проведены на взрослых линейных крысах-самцах с предварительно вживленными электродами для ЭКоГ и ЭМГ. а также канюлями (по одной) в III желудочке мозга. Животные находились в условиях свободного поведения в экспериментальной камере с искусственным климатом, будучи постоянно подключенными к отводящему кабелю и гибкой трубочке для инфузии. Свет в камере выключался в 20 и включался в 8 ч. Спустя неделю после операции начинали постоянное введение в желудочки мозга с помощью микронасоса физ. р-ра со скоростью 20 мкл/ч, близкой к естественной продукции ликвора. Через несколько суток, когда животные адаптировались к инфузии, начинали 3-суточную полиграфическую регистрацию, которая проводилась следующим образом: I сутки -контрольная запись; И сутки - за 1 час до наступления темного периода в камере, т.е. в 19 ч, физ. р-р заменяли раствором тестируемого пептида в конц. 2,5 нМ в 0,2 мл (примерно соответствующей дозе в 7 нМ/кг, оптимальной для в/ж инъекций), который вводили в течение 10 ч, т.е. до 5 ч утра, после чего продолжалась инфузия физ. р-ра; III сутки - регистрация последействия и восстановления. Анализ полиграмм проводили визуально, по общепринятым критериям.

Результаты. Выраженные гипногенные эффекты, отсутствовавшие у исходного ' пептида DSIP, отмечались у его аналогов [D-Tyr1 ]DSIP и. в особенности, [D~Alae]DSIP. При этом аналог Ш-А1аг]DSIP вызывал увеличение парадоксального сна, начиная с IY часа и до конца ночного периода записи, достоверное в Y и YIII часы (р<0,05). а медленного сна - в течение второй половины ночи (достоверно в XI час, р<0,01). В целом за 12 часов медленный сон увеличивался примерно на 1/3 (р<0.05). а пара-

доксальный - в 2 раза (0.05<р<0,1) за счет учащения, а не удлинения отдельных эпизодов. Что касается действия другого аналога - [D-Tyr1JDSJP, то этот пептид вызывал достоверное возрастание только медленного сна в IY и XI часы записи (р<0,05). В целом за 12 часов медленный сон увеличивался на 30% (тенденция: 0,05<р<0,1), а парадоксальный - на 40% (недостоверно). В последующий 12-часовый дневной период, а также на III сутки: регистрации никаких изменений сна по сравнению с I (контрольными) сутками не отмечалось. Несколько иной характер носил гипногенный эффект дизамещенного аналога [D-Ala2, Туг6] DSIP, который оказался приуроченным к начальному периоду регистрации (1-4-й чч, возрастание медленного и парадоксального сна). В последующие часы, несмотря на продолжавшуюся инфузию, достоверных изменений сна не отмечалось.

Обращала на себя внимание реципрокность в проявлении активности двух оптически изомерных аналогов: lD-Tyr1)DSIP = [D-Tyr1, L-Alaz]DSIP и [D-Tyr*, D-Ala2]DSIP. Первый из них обладал способностью удлинять, а второй - укорачивать среднюю продолжительность отдельного периода парадоксального сна. Такой же антагонизм, хотя и в меньшей степени, можно видеть между исходным пептидом DSIP и его циклическим структурным аналогом цикла-(Gly-DSIP). Что касается пептида CD-Val23DSIP, то он проявлял свойство одновременно учащать и укорачивать эпизоды медленного сна, так что суммарное его количество за весь 12-часовый ночной период не менялось.

Исследование на кроликах путем внутрижелудочковых и внутривенных инъекций

Методика. Изучение гипногенной активности пептидов проведено в хронических опытах на взрослых кроликах-самцах шиншилла с предварительно вживленными электродами для регистрации биоэлектрической активности коры мозга, обонятельной луковицы, глаз и мышц шеи. а также с канюлями (по одной) в боковом желудочке мозга. Точность локализации канюли и сохранность тока ликвора по системе внутренних полостей мозга проверяли с помощью прижизненного барбитурового теста: возникновение нистагма после введения через канюлю 0.25 мл 2% р-ра мединала указывает на проникновение вводимого раствора на уровень сильвиево-го водопровода. Пептиды в дозе, близкой к 7 нМ/кг, растворяли в объёме 60-80 мкл физ. р-ра и вводили через канюлю в течение 4-6 мин. DSIP и некоторые аналоги были изучены и в других, меньших и больших дозах. Часть пептидов изучалась и при внутривенном (в/в) введении (в краевую вену уха) в объеме 0.5 мл и оптимальной дозе 30 нМ/кг, а также в меньших и больших дозах, фосфорилированный аналог P-DSIP изучали в дозе 1,4 нМ/кг в/ж.

Исследование DSIP и 7 его аналогов - (D-Trp1'] DSIP, [D-Trp1]DSIP,.6, [D-Tyr1 ]DSIP, [D-Alaz]DSIP, [D-Ala2]DSIP,.6, [DrValz]DSIP, UHicno-(Gly-DSIP) - выполнено в конце 70-х - 80-х гг. в Лаборатории эволюции сенсорных систем ИЭМЭЖ РАН. Тестирование самого DSIP выполнено совместно с В.Л.Цибульским. Пептиды изучали в опытах с обычной регистрацией полиграммы с последующей визуальной обработкой. В этой серии регистрация начиналась Через 30 мин после введения и длилась 3-6 ч. При этом

кролики находились в условиях свободного поведения в небольшой экспериментальной камере, разделенной на 2 индивидуальных отсека, к которой они были заранее приучены. Регистрацию проводили в дневное время, начиная их в 11-12 ч. Каждому животному вводили по несколько пептидов, чередуя их (с интервалами не менее двух суток) с контрольными введениями физ. р-ра. Таким образом, каждое животное служило контролем самому себе.

Большая часть аналогов DSIP (14 шт.) изучена в опытах с автоматической регистрацией сна. Среди них были аналоги с заменами во II положении - [NMeAla2]DSIP, [ß-Ala2]DSIP. [D-Phe2 JDSIP. [D-Ser^DSIP. [D-Leuz] DSIP и др.. ди-замещенные аналоги - [Туг1 ,D-Ala2] DSIP, [Туг1, Pro2 ] DSIP.

[D-Ala2,Pro6]DSIP, фосфорилированньй аналог [Ser7H2P03lDSIP, ацетилированный аналог NAcDSIP. Эта работа проведена в 90-х гг. в группе поведения морских млекопитающих (руководитель -ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук Л.М.Му-хаметов) ИЭМЭЖ РАН совместно с М.В. Кунцевич и Я. Г.Гершовичем; в работе принимала участие также стажер-исследователь, из Вьетнама До Тхи Луинь. В этой серии запись проводили одновременно у 4 кроликов, помещенных в индивидуальные камеры, к которым они заранее адаптированы. Каждая камера представляет собой бокс наружным размером 60x60x90 см,, электрически- и звукоизолированный, снабженный источником "белого шума", освещением регулируемой яркости и панорамным глазком для наблюдений за поведением животных. С помощью гибких кабелей животных подключают ко входу 16-канального электроэнцефалографа "Медикор" (Венгрия). Для предотвращения закручивания кабелей применяются специальные 10-канальные коллекторные устройства и система

вертикальной балансировки с помощью противовесов. Проводится 3 типа опытов: (1) фоновая регистрация сна-бодрствования без введений; (2) введения растворителя (физ. р-р) в объёме 60-80 мкл в боковой желудочек мозга через канюлю, либо в объеме 0,5 мл в/в, после чего проводится регистрация; (3) аналогичные введения тестируемого пептида.

Во время регистрации усиленные биоэлектрические сигналы с выхода электроэнцефалографа (по 4 сигнала от каждого кролика: ЭЭГ коры и обонятельной луковицы. ЭОГ, ЭМГ) подаются на вход микро-ЭВМ "МЕРА-КАМАК-665" (Польша) через посредство стандартного набора модулей (мультиплексор, усилитель, АЦП, генератор тактовых импульсов, таймер, ЦАПы, индикатор магистрали, контроллер крейта). Сигналы ЭКоГ (по одному от каждого кролика) подвергаются частотному анализу в 6-, в- и б-диапазонах с помощью цифровых фильтров, созданных с использованием математического метода установленных коэффициентов. Специально разработанный оригинальный блок программ позволяет проводить в режиме реального времени преобразование, анализ и накопление поступающей биологической информации в виде последовательности чисел, .отражающих частотные (для ЭЭГ) и амплитудные (для трех других параметров) характеристики сигнала в каждую эпоху анализа для каждого из 4 объектов. Длительность такой эпохи может быть выбрана самим экспериментатором в широком пределе; обычно она устанавливалась в пределах 16-20 сек.

Другая часть программного обеспечения позволяет производить как в режиме реального времени, так и в режиме off-line автоматическую идентификацию состояний (активное бодрствование, спокойное бодрствование, медленный сон, парадоксальный

сон) у 4 подопытных животных одновременно. Эта методика (дискриминатор + анализатор) реализована на вычислительном комплексе "Силезия" (Польша), представляющем собой микро-ЭВМ "МЕ-РА-685" и персональную IBM PC/turbo-XT, объединенные в сеть системой KERNET. Идентификация производится на основе сопоставления визуального и машинного анализа небольших фрагментов фоновой регистрации (обычно 3-4 часа), записанных на бумаге электрознцефалографа. по особой методике, предложенной нами впервые. (Автоматический анализатор сна, (с) А.И.Минаев и В.М.Ковальзон, 1991). Программа демонстрирует на экране дисплея результаты такого сопоставления и позволяет экспериментатору легко и быстро заполнить матрицу, содержащую пороговые значения переходов и их алгоритм, с помощью которой и производится автоматическое стадирование. При этом достигается высокое (порядка 90%) совпадение результатов визуального и автоматизированного анализа. Поскольку каждая матрица составляется по данным фоновой регистрации, а применяется для анализа парного , тестирования "контроль-пептид", то при этом исключается внесение субъективного элемента в результаты.

В этой серии регистрация проводилась в течение 7-12 чч в дневное время, начиная с 9-10 часов. Всего в обеих сериях (с аналоговой или. цифровой регистрацией физиологических характеристик цикла сон-бодрствование и последующей визуальной или автоматизированной обработкой, соответственно) исследованы 21 аналог DSIP. В обеих сериях перед началом каждого введения физ. р-ра или пептида, а также по окончании регистрации проводили измерение ректальной температуры кроликов с помощью электротермометра.

- 32 -

Результат, а) исходный пептид: пептид DSIP не оказывал воздействия на количество медленного и парадоксального сна в 3-часовой записи ни после в/ж введений в дозах 6 нМ/кг и 60 нМ/кг, ни в/в введений в дозах 30 нМ/кг и 300 нМ/кг. Температура тела возрастала на 0,5°С.

б) аналоги с заменой в I положении: аналог [D-Trp1 ]DSIP в дозе В нМ/кг вызывал достоверное увеличение медленного сна во II и III часы 3-часовой записи без изменений парадоксального сна. за счет снижения бодрствования. В целом за 3 часа прирост сна составлял около 2555 и был высоко достоверен при всех трех использованных дозах: 0.6; 6 и 60 нМ/кг (р<0. 01). Не меньший эффект оказывало и в/в введение этого аналога в узком диапазоне доз (30-70 нМ/кг; р<0,01).* Здесь повышение дозы до 100-300 нМ/кг приводило к исчезновению эффекта. Температура тела повышалась при в/ж, но не при в/в введениях примерно на 1° С. После в/ж инъекции кроликам пептида (D-Tyr'ÎDSIP происходило достоверное возрастание процентной представленности медленного сна Bin III-IY часы 5-часовой дневной записи; процент парадоксального сна при этом не менялся. В целом за 5 часов прирост сна был высоко достоверен (рч0,01). Выборочный детальный анализ полиграмм показал, что при введении обоих вышеприведенных аналогов происходило удлинение и учащение периодов медленного сна без нарушений цикличности. Гексапептид [D-Trpl]DSlPi.6 не оказывал заметного влияния на сон в 3-часовой записи (р>0.1).

в) аналоги с заменой во II положении: пептид [D-Ala?]DSIP не вызывал изменений сна в 6-часовой записи, однако его укорочение с С-конца на 3 остатка (пептид [D-Ala2]DSIP,_6) приводило к появлению г.лногенного эффекта, причем увеличение медлен-

ного сна отмечалось в 1-й и 5-й, а парадоксального - в 3-й и 5-й часы 6-часовой записи. Увеличение сна отмечалось и после в/в введения этого гексапептида. Введения пептида [NMeAla2]DSIP вызывало достоверное увеличение медленного сна в I и У часы (р<0.05) 12-часовой регистрации; при этом прирост медленного сна становился достоверным уже после Y часа и нарастал до конца регистрации. Изменений температуры тела не вы~: явлено. Пептид [ß-Ala2]DSIP вызывал уменьшение медленного сна. имевшее наибольшую выраженность в I и YI часы после иньекции пептида (р<0.05 и р<0.01, соответственно). Происходило уменьшение и суммарного количества медленного сна за весь 12-часо-вый период регистрации. Отмечено также достоверное (р<0.01) повышение температуры тела через 12 часов после введения пептида.

При изучении пептида [D-Val2]DSIP увеличение медленного сна отмечалось в YII-IX часы, а парадоксального - в YIII час. В этот же час отмечалось увеличение обеих фаз сна при в/в введении. При в/ж введении этот пептид вызывал также.снижение температуры тела. Введение пептидов [D-Ser®]DSIP, [D-Leu2]DSIP и [D-Phez)DSIP не оказывало воздействия на сон и температуру тела кроликов.

г) дизамешенные_аналоги:_введения аналога

[Туг1 ,D-Ala23 DSIP привело к увеличению медленного сна в Y час 12-часовой регистрации (р<0,05). Однако суммарного изменения количества сна за весь период регистрации не выявлено. Изменений температуры тела не обнаружено. Введения аналога [Туг1,Pro2]DSIP привело к небольшому увеличение медленного сна в IY и Y часы 7-часовой регистрации (0,05<р<0,1); суммарного

изменения количества сна за весь период регистрации не наблюдалось. Температура тела не изменялась. Аналог CD-Ala2.Pro6]DSIP не изменял сна, но повышал температуру тела кроликов.

д) циклический аналог: пептид цикло-CGly-DSIP) в дозе 6 нМ/кг в/ж вызывал увеличение медленного сна во II и III часы 3-часовой записи без изменения представленности парадоксального сна. Прирост возникал за счет сокращения бодрствования и учащения эпизодов сна без нарушения цикличности, и достигал 20% от контроля. Меньшие (0,6 нМ/кг) и большие (60 нМ/кг) дозы в/ж также были эффективны. Температура тела достоверно не изменялась.

е) ФосФорилированный аналог [ Ser7 НРР0э] DSIP. Введение аналога P-DSIP в дозе 1.4 нМ/кг в/ж приводило к достоверному (р<0,05) увеличению медленного сна в 5-й и 7-й часы записи. В 7-й час наблюдалась также сильная тенденция к увеличению пара-' доксального сна. Однако по сумме 10-часовой регистрации достоверного эффекта на сон не отмечалось.

ж) ацетилированный аналог NAcDSIP вызвал увеличение медленного сна в IX-XI чч регистрации; температура тела не изменялась.

Модуляция сна мурамнл-пептндамн - исследование на кроликах путем внутрижелудочковых, внутривенных и парентеральных инъекций

Мурамил-пептиды - гликопептиды, синтезируемые ферментативным (вненатричным) путем в клетках бактерий и других низших

организмов. Они представляют собой- мономерные "строительные блоки", формирующие пептидогликан - каркас клеточной стенки грамположительных бактерий. Классический мурамил-дипептид

(МДП) состоит из остатка сахара - мурамовой кислоты (И-ацетил-«

мурамоил) и двух аминокислотных остатков - аланина и 0-изоглу-тамина. в отличие от обычных пептидов - продуктов протеолиза белков - мурамил-пептиды часто содержат в своем составе остат-' ки О-аминокислот, что делает их весьма устойчивыми к пептида-зам высших животных. В организме млекопитающих мурамил-пептиды появляются в результате жизнедеятельности сапрофитной кишечной микрофлоры и, кроме того, при попадании бактерий в кровь в результате инфекции; при этом мурамил-пептиды выделяются макрофагами в ходе поглощения бактерий. Концентрация мурамил-пепти-дов в различных органах млекопитающих, включая мозг, составляет примерно 0,1 нМ/г свежей ткани. Мурамил-пептиды обладают способностью проникать через гемато-энцефалический барьер и оказывать в весьма малых дозах мощные воздействия на различные процессы в организме. Эти воздействия можно разделить на два типа: кратковременные и длительные. Последние, длящиеся сутками и неделями, связаны с иммуно-адьювантной активностью и в настоящем исследовании не затрагивается. Что же касается кратковременных, собственно физиологических процессов, длительность которых измеряется часами, то главные из них - это воздействие на сон-бодрствование и температуру тела; история открытия гипногенного действия мурамил-пептидов подробно описана в обзорах (Ковальзон, 1986; Крюгер, Ковальзон, 1994).

Методика. Мы провели изучение гипногенной и пирогенной активности группы мурамил-пептидов при различных дозах и спо-

собах введения. Вещества были синтезированы Т.М.Андроновой с сотр. (Лаборатория химии пептидов Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, г.Москва). Проведено 3 серии опытов. Первая серия выполнена в 80-е гг. в Лаборатории эволюции сенсорных систем млекопитающих ИЭМЭЖ РАН (зав. лаб. - д.б.н., проф. А.Я.Супин); часть пептидов изучена в перекрестном "слепом" тестирование совместно с проф. Дж. Крюгером и сотр. (каф. физиологии и биофизики Университета штата Теннеси. г.Мемфис, США). Среди исследованных веществ были как естественные, присутствующие в организме млекопитающих - МДП и его глюкозоаминильнне производное ГМДП, так и искусственные - диаминосахаридный . и дипептидный фрагменты ГМ и ДП, оптически изомерные аналоги ГМДП-ЬЬ и ГМДП-СО, аналоги с удлиненной пептидной или сахаридной цепочкой ГМ(ДП)г. ГМ(ДП)3 и (ГМ)2(ДП)2. Опыты проведены кроликах с предварительно вживленными электродами для ЭЭГ, ЭОГ и ЭМГ и канюлями (по одной) в' боковом желудочке мозга по методике, аналогичной той, которая применялась при изучении пептида 031Р (см. выше). Регистрацию проводили в течение 3-6 ч в дневное время. Фоновые записи (без введений) чередовали с аналогичными записями после в/ж или в/в инъекций физ. р-ра (контроль) и растворов исследуемых веществ одним и тем же животным. Интервалы между двумя последовательными введениями (контроль-пептид) составляли не менее двух суток. Полиграммы обрабатывали вручную, по общепринятым критериям. Вторая и третья серии опытов проведена в 90-е гг. в группе поведения морских млекопитающих (рук. - в.н.с., к. б.н. Л.М Мухаметов) ИЭМЭЖ РАН совместно с Н. В.Кунцевич и Я.Г.Гершо-вичем. В этих сериях регистрацию проводили в автоматическом

режиме, как это изложено выше при описании тестирования аналогов DSIP. Во второй серии изучены при в/ж введении слёдувщие пептиды: ГМДП, ГМДП-ОН. (ГМДП-0Н)г. ГМДП-Lys. {ГМДП-Ьуз)г_. ГМДП-OBu. МДП-ОВи. Регистрация проводилась в течение 8-10 чч в дневное время, начиная с 9-10 часов. В третьей серии опытов изучали последствия хронического системного введения пептида ГМДП на сон и температуру тела кроликов. Процедура при этом' была следующей: 1-й день - 12-часовая фоновая регистрация сна-бодрствования у 4 животных так, как описано выше для аналогов DSIP; 2-й день - аналогичная регистрация после перораль-ного (п.о.) введения (через гибкий зонд) 20 мл дистиллированной воды (контроль); 3-й день - регистрация после п.о. введения ГМДП, растворенного в 20 мл дистиллята, в дбзе 170 ¡.кг на кролика, соответствующей терапевтической дозе для человека; 4-й - 9-й дни - ежедневное однократное введение той же дозы пептида без последующей записи; 10-й день - введение ГМДП с последующей записью, как в 3-й день. В остальном - то же, что и во II серии. Во всех опытах перед началом каждого введения физ. р-ра или пептида, а также по окончании регистрации, проводили измерение ректальной температуры кроликов с помощью электротермометра.

Результаты исследования. Природные мурамил-пептиды МДП и ГМДП в дозе о,1 нМ'кролика в/ж вызывали увеличение медленного и подавление парадоксального сна, а также повышение температуры тела. При этом увеличение медленного сна (происходившее за счет удлинения, а не учащения отдельных его эпизодов) отмечалось в конце периода записи; в целом за 6 часов медленный сон увеличивался от 4935 (контроль) до 6535 (по сумме последних 3

часов различие достоверно, р<0,05). В этот же период отмечалось и подавление парадоксального сна; в среднем он снижался от 855 (контроль) до 2% (р<0.01). Температура мозга и тела повышалась на 2°С (р<0.01).

При увеличении дозы до 0,3-1 нМ в/ж возникали токсические эффекты: подъем ректальной температуры на 3-4°С, одышка, ано-рексия, диурез, дефекация, снижение потребления воды, нарушение поведения и общего состояния животных, выпадение парадоксального сна, частичное подавление медленного сна и нарушение цикличности. Динамика воздействия ГМДП в дозе 1 нМ на представленность медленного сна носила двухфазный характер: первичное подавление, затем восстановление к 4-му часу и вторичное подавление. Полное восстановление наблюдалось не ранее, чем через 2 суток и лишь у части животных. У другой части животных на 1-П сутки после однократного введения МДЛ и ГМДП в повышенных дозах развивался паралич задних конечностей и. наступала гибель.

При в/в введении МДЛ и ГМДП в дозе 25 мкг/кг наблюдались эффекты (небольшое увеличение медленного и подавление парадоксального сна), сходные с.таковыми после в/ж иньекции 0,1 нМ; однако заметного увеличения температуры мозга и тела не отмечалось. При повышении дозы до 0,1 мг/кг в/в возникали длительные периоды синхронизации ЭЭГ. занимавшие до 90% времени во II и III часы 3-часовой записи; при этом парадоксальный сон полностью исчезал и нормальная сонная ритмика была нарушена. Развивалась одышка, но фебрйльные реакции отсутствовали и общее . состояние животных заметно не ухудшалось. Полное восстановление происходило обычно через 2 суток.

- 39 -

Структурно близкий к дисахарид-дипептиду ГМДП дисаха-рид-тетрапептид ГМ(ДП)г, полученный путем добавления дипептид-ного фрагмента Ala-D-lsoGln к Tf-карбоксилу остатка IsoGln, оказался неактивным в дозах 0,1 и 0,3 нМ в/я: небольшое снижение процентной представленности медленного сна во II час записи (р<0, 05) компенсировалось его увеличением в последующий час (0,05<р<0,1).. Изменений температуры мозга и тела не происходи^ ло. Дисахарид-гексапептид ГМ(ДП)3 вызывал уже в минимальной дозе 0,1 нМ в/ж явное подавление медленного сна в последние два часа записи (О,05<р<0,1). а также тенденцию к подавлению и парадоксального сна. Температура тела не менялась. Что касается тетрасахарид-тетрапептида (ГМ)г(ДП)2, то это вещество в пороговой дозе О,1 нМ в/ж вызывало снижение бодрствования и увеличение суммарного времени сна (медленный + парадоксальный сон), которые были приурочены к III часу (0.05<р<0,1). так что общее время медленного и парадоксального сна за весь 6-часовый период записи не менялось. Температура тела повышалась незначительно (на 0.3°). Все прочие вещества - дисахарид ГМ и пептиды ДП. ГМДП-LL и ГМДП-DD в дозах 0.1 и. 0.3 нМ в/ж не оказывали заметного воздействия на сон и температуру тела кроликов в дневное время.

Среди исследованных в 10-часовом тесте при в/ж инъекции в дозе 0.3 нМ шести мурамил-пептидов ни один не оказывал существенного воздействия на сон. Лишь у пептида ГМДП-ОН отмечалась тенденция к увеличению медленного сна в 3-й и 5-й чч записи, а у пептида ГМДП-ОВц - к его снижению в 6-й ч. Пептиды ГМДП-ОН и ГМДП-Lys вызывали подъем температуры тела до субфебрильных значений (на 0,5 и 0,8°. соответственно), а пептиды (ГМДП-0Н)2

и (ГМДП-Ьуэ)2 - снижение температуры (на 0,7 и 0,4°, соответственно). Пептиды МДП-ОВи и ГМДП-ОВи не вызывали существенного изменения температуры тела. Пептид МДП-ОВи продемонстрировал чрезвычайно высокую токсичность: • половина животных погибла в течение 24 часов после его в/ж введения в дозе 0,3 нМ.

Пероральное введение 170 мкг ГМДП вызывало двухфазное увеличение медленного сна: вначале в 3-4-й час записи, а затем с 7-го по 11-й чч. В промежутке, в 5-6-й часы, отмечалось небольшое уменьшение представленности медленного сна, так что в целом достоверное увеличение сна происходило во вторую половину 12-ч периода регистрации. Существенного изменения представленности парадоксального сна не происходило. Температура тела не изменялась. Регистрация сна на 7-е сутки ежедневного приема пептида показала, что двухфазный гипногенный эффект ГМДП сохранялся, хотя и снижался по амплитуде. Никаких нарушений внешнего вида и поведения, а также температуры тела, в ходе хронического п.о. приема ГМДП не зафиксировано.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод "мягкой" депривации парадоксального сна у подопытных животных (белых крыс) с помощью легких пробуждающих раздражений ретикулярной формации среднего мозга (через предварительно вживленные электроды) в самом начале каждого периода парадоксального сна. Депривация, вызванная этим методом, не только не вызывала стресс-реакций у крыс (по морфологическим признакам), но. наоборот, приводила к снижению веса надпочечников при тенденции к увеличению веса тимуса. Ни депривация парадоксального сна без стресса, ни стресс (холоде-

вой или иммобилизационный) без депривации не приводили к рас-тормаживанию эмоционального поведения животных в тестах 'открытого поля и самораздражения. Только взаимодействие депривации парадоксального сна и стресса при использовании метода "островков" приводило к резкому повышению эмоциональности животных.

3. Кратковременный эмоциональный стресс умеренной: интенсивности (1-часовая иммобилизация) не вызывал значительных изменений сна у нормальных крыс, однако у адреналэктомиро-ванных животных происходило резкое увеличение продолжительности медленного сна в последующие 12 часов. Этот эффект полностью устранялся после предварительного введения синтетического кортикостерона (дексаметазона).

4. Очевидна тесная связь между механизмами сна и стресса: экспериментальное подавление сна (депривация парадоксального сна) приводило к подавлению системы гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников (снижение веса надпочечников); искусственное растормаживание гормональной оси стресса (адреналэктомия) приводит к гиперактивности системы сна (увеличение медленного сна после кратковременного эмоционального стресса). Взаимодействие между системами сна и стресса.осуществляется, по-видимому, через посредство, нейро-гуморальной регуляторной цепочки, включающей в себя серотонин, кортикостероиды и некоторые пептиды, такие как фрагменты ПОМК: ШТ,_39, АКТГ,.13 (дез-а-МСГ) и АКТГ18_з9 (СЫР); имеются серьезные основания полагать, что ключевую роль в этих процессах играет эндогенный Б31Р (031Р-подобный пептид/пептиды).

5. Однако прямое введение синтетического ОБГР в желудочки

мозга и в организм подопытных животных (крыс, кроликов) не вызывало у них увеличения сна; более того, в одной из тест-систем обнаружено даже уменьшение сна в определенные часы после введения, В то же время при некоторых структурных модификациях молекулы DSIP. направленных на повышение ее устойчивости к разрушающему действию определенных ферментов организма при сохранении необходимой конформации, гипногенная активность у аналогов действительно появлялась.

6. Проведено изучение структурно-функциональных взаимосвязей при воздействии на сон DSIP и группы из 25 его аналогов в трех тест-системах: (а) на крысах при инъекции в боковой желудочек мозга; (б) на крысах, при 10-часовой инфузии в III желудочек; (в) на кроликах при инъекции в боковой желудочек и в вену. Обнаружено, что гипногенную активность проявляют некоторые аналоги с заменами остатков в I или II положении, обладающие, очевидно, повышенной устойчивостью к аминопептидазам и адекватной конформацией; каждый такой аналог имеет свой собственный "профиль" гипногенной активности в виде пульсирующего увеличения (или уменьшения) почасовой представленности медленного и/или парадоксального сна. Имеется определенная закономерность в распределении "профилей" гипногенной активности, отражающая, по-видимому, особенности конформационного взаимодействия молекулы с предполагаемым рецептором (рецепторами).

7. Гипногенная активность аналогов DSIP носит модулирующий, вероятностный характер и опосредуется, вероятно, через гипоталамо-гипофизарные пептиды из группы гормонов роста и стресса, с которыми эндогенный DSIP связан морфологически и/или функционально. Это позволяет по-новому рассмотреть проб-

- 43 -

-чему гуморальной регуляции сна.

8. Впервые удалось показать, что такой сложной и базисной Функцией организма, как регуляция сна-бодрствования, в которой принимает участие множество гуморальных агентов различной химической природы (аминокислоты и их производные - ацетилхолин и моноамины, олиго- и полипептиды, нуклеозиды. простагландины. стероидные гормоны), можно управлять, манипулируя структурой: одной-единственной исходной молекулы.

9. Проведено изучение воздействия на сон группы мура-мил-пептидов и их фрагментов при введении в боковой желудочек мозга, в вену и перорально кроликам. Обнаружено, что гипноген-ная активность этих пептидов носит совершенно иной характер, чем у аналогов П51Р; важную роль при этом играет-тот путь, которым природные мурамил-пептиды проникают в организм млекопитающих. При попадании прямо в кровь, а тем более в желудочки мозга, легко возникают патологические и токсические эффекты. При пероральном поступлении возможны модулирующие гипногенные воздействия. Эти эффекты, по-видимому, опосредуются рецепторами серотонина, интерлейкином-1 (полипептидом из группы цитоки-нов), а также гормонами стресса и пептидами - фрагментами АКТГ и БЭ1Р.

10. Модулирующая гипногенная активность аналогов Б31Р и их способность проникать через гемато-энцефалический барьер создает определенные предпосылки для создания в недалеком будущем на их основе принципиально новых лекарственных препаратов.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Tslbulskl V.L.. Kovalzon V.M.. latash L.P. The REM sleep deprivation effect on self-stlmulatlon//Sleep Research/ Ed. M.H.Chase et al. Los Angeles, CA: BIS/BRI, UCLA. 1975. V.4. P. 155. 1975.

Ковальзон В.M. Эмоциональное подкрепление и его нейрофизиологические механизмы//Физиология человека и животных. Т.15. Физиология эмоций. (Итоги науки и техники). М.: ВИНИТИ. 1975. С.5-29.

Латаш JL П., Ковальзон В.М. Сравнительно-физиологический подход к изучению функций сна//Ж. эвол. биохим.физиол. 1975. Т.Н. Ко. 1. С. 11-19.

Ковальзон В.М. Эволюционные и экологические аспекты сна//Усп. совр. биол. 1976. Т.81. No.3. С. 381-398.

Цибульский В.Л;, Ковальзон В.М. Влияние депривации фазы "быстрого" сна на самораздражение гипоталамуса и перегородки у белых крыс//Ж. высш. нервн. деят. 1977. Т.27. No.4. С.792-800.

Ковальзон В.М., Цибульский В. Л. Депривация "быстрого" сна раздражением ретикулярной формации у крыс//Физиол. ж. • СССР. 1978. Т. 64. .N0.8. С. 1082-1088.

Kovalzon V.M.. Tslbulsky V.L. REM sleep deprivation without stress In rats//Sleep 1978/Ed. L.Popovlclu et al. Basei:Karger. 1980. P.411-414.

Ковальзон В.M., Цибульский В. Л. Имеются ли гипногенные свойства у синтетического "пептида, вызывающего дель-та-сон"?//Ж. высш. нервн. деят. 1980. Т.30. No.5. С.1064-1066. Ковальзон В.М. Парадоксы парадоксального сна//Природа.

1982. N0.8. С.74-79.

Ковальзон В.М. Поиски "гормона сна"//Природа. 1983.'No.4. С.13-21.

Kovalzon V.M.. Tslbulsky V.L. REM-sleep deprivation, stress and emotional behavior in rats//Behav. Brain Res. 1984. V. 14. No. 3. P. 235-245.

Ковальзон В.M.. Цибульский В.Л. Лишение парадоксального: сна. стресс и эмоциональность у крыс//Ж. высш. нервн. деят. 1985. Т. 35. N0.1. С. 117-124.

Kovalzon V.M.. Kallkhevlch V.N.. Obal F. (Jr.), Klelnlogel H. Hypnogenlc effects of the peptide [D-Trp-UDSIP in rabbits and rats//Sleep '84/Ed. W.P.Koella et al. Stuttgart:Fischer. 19S5. P.218-219.

Ковальзон В.М., Цибульский В.Л. Особенности парадоксальной фазы сна у лабораторного кролика//Сон как фактор регуляции функционального состояния организма. Л. 1985. С.70-75.

Ковальзон В.М., Михалева И.И. Гипногенная активность циклического структурного аналога Дельта-Сон Индуцирующего Пепти-да//Докл. АН СССР. 1986. Т. 286. No. 1. С. 230-232.

Obal F. (Jr.). Kovalzon V.M., Kallkhevich V.N. et al. Structure-activity relationship in the effects of delta sleep-inducing peptide (DSIP) on rat sleep//Pharmacol. Blochem. Behav. 1986. V.24. No. 4. P. 889-894.

Ковальзон В. M., Калихевич B.H., Чуркина С.И. Активный аналог неактивного "пептида сна"//Бюлл. эксп. биол. мед. 1986. Т. 101. N0.6. С. 707-709.

Ковальзон В.М. К чему приводит длительное лишение сна?//Природа. 1986. No. 4. С. 97-98.

- 46 -

Ковальзон В. М. Гуморальная регуляция сна//Физиология человека и животных. Т.31. Механизмы сна. (Итоги науки и техники). ВИНИТИ: М. 1986. С. 3-58.

Цибульский В.Л.. Ковальзон В.М. О функциональной роли парадоксальной фазы сна//Поисковая активность, мотивация и сон. "Элм": Баку. 1986. С. 168-176.

Klmura М., Honda К.. Kovalzon V.M.. Inoue S. Effects of DSIP analogues on sleep In unrestrained rats//Rep. Inst. Med. Dent. Eng. 1986. V. 20. P. 47-51.

Ковальзон В. M.. ОбалФ. (мл.). Калихевич B.H. Пептидерги-ческая модуляция сна: сравнительное изучение аналогов пептида DSIP//JK. эвол. биохим. физиол. 1986. Т. 22. Ко. 5. С. 483-488..

Kovalzon V.M.. Obal F. (Jr.), Sary G. et al. Peptidergic modulation of sleep//Sleep '86/Ed. W.P.Koella et al. Stuttgart:Fischer. 1988. P. 172-174.

Kovalzon V.M. Modulation of rodent sleep by DSIP analogs/ZNeuroblology of Sieep-Wakefulness Cycle/Eö. T.N.Onlanl. Tbilisi:Metsnlereba. 1988. P.399-404.

Torok A., Penke В., Kovalzon V.M. et al. Structure-activity. studies o)i the delta sleep-inducing peptide (DSIP)//Peptides/Ed. B. Penke. A. Torok. Berlin:Gruyter. 1988. P. 369-372.

Kovalzon V.M. Las functlones del sueno//Avances en la Investigación del Sueno y sus Trastornos/Ed. G.Buela-Casal, J.F.Navarro. Madrid:Siglo Velntuno. 1990. P.3-12. (исп.)

. Klmura-Takeuchi M.. Kovalzon V.. Inoue S. Delta Sleep Inducing Peptide and Its analogs: structure-activity relationship for sleep modulation In rats//sieep Research/Ed.

M.H.Chase et al. Los Angeles, CA:BIS/BRI. UCLA. 1990. V. 19. P. 68.

Kovalzon V.M.. Mlnaev A.I., Kuntsevlch M.V. Universal automatic sleep analyzer for experimental anlmals//Sleep Research/Ed. M.H.Chase et al. Los Angeles, CA:BIS/BRI. UCLA. 1991. V. 20. P. 502.

Kovalzon V.M., Kuntsevlch M.V.. Obal F. (Jr. ) et al. : Modulatory action of metabollcally stable DSIP analogs on subsequent sleep in rodents/ZSleep Research/Ed. M.H.Chase et al. Los Angeles. CA:BIS/BRI, UCLA. 1Э91. V.20. P. 112.

Kovalzon V.. Kuntsevlch M., Mlkhaleval., Prudchenko I. Novel DSIP analogs: hypnogenlc activity In rabbits//J.Sleep Res. 1992. V. 1. Suppl. 1. P. 120.

Иноуэ Ш., Кимура-Такеучи M., Ковальзон В.M. и др. Сомно-генные эффекты структурных аналогов пептида дельта-сна//Ж. высш. нервн. деят. 1992. Т. 42. Но. 3. С. 600-603.

Ковальзон В.М., Обал Ф.(мл. ), Алфелди П. и др. Гипноген-ные эффекты аналогов дельта сониндуцирующего пептида. (DSIP): сравнительное изучение у кроликов и крыс//Ж. эвол. биохим. фи-зиол. 1992. Т. 28. No. 4. С. 467-471.

Ковальзон В.М., Кунцевич М.В., Алфелди П. и др. Сомногён-ные эффекты аналога пептида дельта-сна с повышенной устойчивостью к протеолизу//Докл. РАН. 1993. Т. 329. No. 1. С. 103-105.

Kovalzon V., Kuntsevlch M., Gershovlch Y. et al. Peptidergic mechanisms of sleep//Sleep Research/Ed. M.Chase et al. Los Angeles, CA:BIS/BRI, UCLA. 1993. V.22. P.481.

Ковальзон В.М. О функции сна//Ж. эвол. биохим. физиол. 1993. Т. 29. No.5-6. С. 655-660.

- 48 -

Иноуэ Ш., Кимура-Такеучи М.. Ковальзон В.М. и др. Действие некоторых аналогов пептида DSIP на сон крыс при внутриже-лудочковой инфузии//Бюлл. эксп. биол. мед. 1994. Т.117. No.l. С.56-58.

Johannsen L.. Obal F. (Jr.). Kapas L., Koval2on V.. Krueger J.M. Somnogenlc Activity of Muramyl Peptlde-Derlved Immune Adjuvants//Int. J. Immunopharmac. 1994. V.16. No. 2. P.109-116.

Крюгер Д.М.. Ковальзон B.M. Вещества сна: иллюзии и ре-альность//Наука и человечество. 1992-1994. Международный ежегодник. "Знание":М. 1994. С. 50-57.

Ковальзон B.M. DSIP - пептид сна или неизвестный гормон гипоталамуса?//!, эвол. биохим. физиол. 1994. Т. 30. No. 2. С.112-119.

Marinescos., CespuglloR., Kovalzon V., Ponte., Jouvet M. Effects of glucocorticoids upon tue sleep rebound observed In rats after a .1 hour Immobilization stress//J.Sleep Res. 1994. V.3. Suppl.l. P. 158.

Kovalzon V.M., Kuntsevlch M.V.. Gershovich Y.G. et al. The study of synthetic DSIP analogs: from molecular structure to sleep proflle//J.Sleep Res. 1994. V.3. Suppl.l. P.130.

. Ковальзон B.M., ОбалФ. (мл.), йоханнсен Л. и др. Мура-мил-пептиды и сон//Физиол. ж. РАН. 1994. Т.80. N11.

Kovalzon V.M., Alfoldl P., Mlkhaleva I.I., Prudchenko I.A. Effects of the Delta Sleep-Inducing Peptide (DSIP) and some of Its analogs on rat з1еер//Нейрохимия. 1994.

FECI QUOD POTUI, FACI ANT MELIOJiA POTENTES!