Биотехнологические аспекты разработки методов диагностики сахарного диабета типа I

Першина, Альбина Сабирьяновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические аспекты разработки методов диагностики сахарного диабета типа I
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические аспекты разработки методов диагностики сахарного диабета типа I"

На правах рукописи

ПЕРШИНА АЛЬБИНА САБИРЬЯНОВНА

Биотехнологические аспекты разработки методов диагностики сахарного диабета типа I

03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 14.03.09-клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАЙ 2011

Уфа-2011

4847891

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ГОУ ВПО Башкирский государственный университет

Научные руководители

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор биологических наук, Гарипова Маргарита Ивановна доктор биологических наук, профессор Киреева Наиля Ахняфовна доктор биологических наук, профессор Вахитов Венер Абсатарович доктор биологических наук, профессор Црйпикман Вадим Эдуардович Институт биохимии и биофизики Казанск НЦРАН

Защита диссертации состоится 17 июня 2011 г. в -jtf-CO часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002Л 36.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, д. 69, тел.: 235-53-62, e-mail: ib@anrb.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра Российской академии наук и на официальном сайте http://www.anrb.ru/inbio/dissovet/index/htm

Автореферат разослан « _/£_» мая 2011 г.

Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук

Р.В. Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В 2000-х годах были уточнены механизмы транспорта гормонов в крови человека, в частности механизмы транспорта инсулина. Рядом авторов показано, что в транспорте инсулина принимают участие 2 системы транспорта: эритроцитарная и сывороточная (Касаткина, 1996, Сандуляк, 1972; Картун и др., 2000; Запорожан и др., 2001; Gerhard et. al., 2004; Гарипова, 2007). Установлено, что в сыворотке крови инсулин включается в транспортный комплекс, ядро которого формируют транспортные белки, имеющие достаточно широкую специфичность, за счет чего они способны осуществлять транспорт широкого спектра как гидрофобных, так и гидрофильных гормонов, в том числе таких белковых гормонов как инсулин, причем концентрация этого комплекса снижается в плазме крови больных сахарным диабетом (Гарипова, 2007). Показано, что при сахарном диабете типа I наблюдается достоверное увеличение вклада эритроцитарной системы в доставку инсулина к периферическим тканям и, соответственно снижение роли сывороточного транспорта гормона. Из новых данных вытекают новые диагностические возможности выявления нарушений транспорта инсулина при формировании сахарного диабета. Представляет интерес изучение возможности использования в качестве показателей, отражающих степень нарушений транспорта инсулина, концентрации связывающих инсулин белков крови и коэффициента распределения инсулина между плазмой и эритроном.

Цель работы - создание комплекса методов для эффективной диагностики сахарного диабета, включающего оценку степени нарушения транспорта инсулина в крови пациентов и определение интегрального уровня гликемии за длительный период, а также исследование особенностей биологического действия двух транспортных форм инсулина, присутствующих в крови человека.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи исследования:

1. Разработать метод синтеза аффинного сорбента для

количественного определения гликозилированной формы гемоглобина, отличающийся от имеющихся аналогов повышенной стабильностью.

2. Оценить стабильность и применимость для диагностических целей эритроцитарных диагностических систем с ковалентным связыванием инсулина с поверхностью эритроцитов и возможность использования количества связывающих инсулин белков крови в качестве показателя нарушения транспорта инсулина.

3. Сравнить значения коэффициентов распределения инсулина между эритроном и плазмой крови в крови здоровых доноров и больных диабетом с различной степенью тяжести заболевания и сделать вывод о возможности использования этого показателя для диагностики нарушений транспорта инсулина.

4. Сравнить гипогликемические эффекты действия двух транспортных форм инсулина.

5. Изучить иммуномодулирующие свойства белков, формирующих комплекс с инсулином в норме и при сахарном диабете.

Научная новизна

Предложен комплекс методов для эффективной диагностики сахарного диабета. Комплекс включает определение концентрации гликозилированной формы гемоглобина и оценку нарушения транспорта инсулина в крови пациентов.

Показано, что определение концентрации связывающих инсулин белков крови и коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и эритроном может быть использовано для диагностики нарушений транспорта гормонов кровью, происходящих при сахарном диабете. Установлены пределы нормальных значений предложенных показателей. Доказано, что определение коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и эритроном является более информативным, так как позволяет дифференцировать компенсированное и декомпенсированное течение заболевания.

введенным в той же дозе в присутствии белков плазмы крови. Экспериментально доказано, что транспортные белки крови, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров, способны снижать интенсивность иммунного ответа в: транспортируемым молекулам.

Практическая значимость работы

Предложен новый метод синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой,

отличающийся от известных аналогов повышенной стабильностью:-

Разработан метод получения стабильного эритроцитарного диагностикума для определения связывающих инсулин белков плазмы крови.

Предложен метод оценки нарушений транспорта инсулина в крови человека, основанный на использовании двух показателей: концентрации связывающих инсулин белков крови и коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и эритроном.

Основные положения, выиоснмые на защиту

1.Использование в качестве матрицы аффинного сорбента для определения гликозилированной формы гемоглобина силикагеля, позволяет увеличить стабильность сорбента и повысить кратность его использования.

2.Для оценки нарушений транспорта инсулина более информативным является определение коэффициента распределения инсулина, позволяющее дифференцировать компенсированную и декомпенсированну ю стадии заболевания.

3.Две транспортные формы инсулина достоверно различаются по выраженности гипогликемического эффекта.

4. Белки плазмы крови, формирующие комплекс с инсулином в норме, обладают иммуносупрессорным действием.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и

пути их решения» (Саранск, 2008), ХШ международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новсоибирск.-2008), 12-ой международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов» (Уфа, 2009).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 13 печатных работах, в том числе в четырех статьях в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах, содержит 8 рисунков, 8 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 354 работы.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность научным руководителям - д.б.н. Маргарите Ивановне Гариповой, профессору, д.б.н. Наиле Ахняфовне Киреевой за консультации и ценные советы, способствовавшие совершенствованию работы; за ценные консультации профессору, д.б.н. Станиславу Юрьевичу Веселову и всем моим коллегам, оказавшим неоценимую помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Формирование группы здоровых доноров, .проводили на основании заключения эндокринолога об отсутствии отклонений от нормы в регуляции углеводного обмена и величины показателя, отражающего средний уровень гликемии за 2 месяца, предшествующие взятию пробы - процентного содержания гликозилированного гемоглобина (%Ггб) в капиллярной крови человека. Для определения коэффициента распределения инсулина, количественного определения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 100 здоровых добровольцев 20-25 лет с содержанием Ггб от 4 до 7,5%, что соответствует нормальному уровню гликемии.

В исследовании использованы пробы крови 100 больных сахарным диабетом типа I, находившихся на стационарном лечении в эндокринологических отделениях больниц г.Уфы, с процентным содержанием в капиллярной крови гликозилированной формы гемоглобина от 8 % до 18,6 %.

Определение % Ггб проводили с использованием аффинной диагностической системы, содержащей микроколонки с сорбентом, представляющим собой мета-аминофенилбороновую кислоту, иммобилизованную на модифицированном силикагеле, полученным по авторскому методу.

Хроматографическое выделение связывающих инсулин белков сыворотки человека проводили на сорбенте, представляющем собой инсулин, иммобилизованный на Поливинале из расчета 5 мг/мл (Гарипова, 2005).

Определение концентрации связывающих инсулин белков

проводили с использованием эритроцитарных диагностикумов с ковалентно иммобилизованным инсулином, полученных на основе формалинизированных эритроцитов барана авторским методом.

Для определения коэффициента распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови (1С,/,,,,) получен инсулин, меченный пероксидазой, по методу Fare и Nakane (Farr, Nakane, 1981). Принцип предложенного метода определения Ку,ш, заключается в определении соотношения пероксидазной активности, связанной с поверхностью эритроцитов, к активности пероксидазы в плазме крови

после инкубации с исследуемой пробой крови рабочего разведения коньюгата инсулина с пероксидазой, выполняющей роль маркерного фермента. Для приготовлении коньюгата инсулина и пероксидазы использован генно-инженерный инсулин человека ХУМУЛИН Р производства фирмы Lilly France S.A. Для исследования использовались пробы крови без признаков гемолиза.

Исследование иммуномодулирующих свойств связывающих инсулин белков крови проведено на модели иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. Проведена иммунизация трех групп белых лабораторных мышей: двух опытных и контрольной. Мышей всех групп трехкратно иммунизировали дифтерийным анатоксином. В опыте 1 мышей иммунизировали анатоксином с добавлением инсулинсвязывающих гликопротеидов, выделенных из сывороток крови здоровых доноров, в опыте 2 - при добавлении аналогичной фракции из крови больных сахарным диабетом. Иммунизацию проводили по 1мл анатоксина на каждую мышь в 4 точки подкожно вдоль позвоночника. Вторую иммунизацию проводили через 6 недель также подкожно в области позвоночника по 0,5 мл на мышь. Последнюю, третью иммунизацию, провели через 2 недели после предыдущей с использованием той же схемы и доз при введении анатоксина. Через 5 дней после 3-й иммунизации был проведен забор крови. Полученные антисыворотки к дифтерийному анатоксину были оттитрованы в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с диагностикумом, представляющим собой формалинизированные эритроциты барана, сенсбилизированные дифтерийным анатоксином при помощи хлорида хрома (III), выявляющим антитела к дифтерийному анатоксину.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка метода иммобилизации мета-аминофенилбороновой кислоты на силикагеле

В данном исследовании для увеличения стабильности аффинного сорбента с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой в качестве носителя использован пористый силикагель фирмы "Serva" марки SP-500, модифицированный глицерилпропилсиланом.

Активацию силикагеля, модифицированного

глицерилпропилсиланом, эпихлоргидрином проводили по

известной методике (Дин и др., 1988). Схема активации приведена на рисунке 1.

-ОН+С1-СН2-СН-СН2 __ -0-СН2-СН-СН2+НС1

\ / * \ /

о о

Рисунок 1 Активация силикагеля, модифицированного

глицерилпропилсиланом, эпихлоргидрином.

Затем активированный носитель промывали

дистиллированной водой и 0,1 М карбонатным буфером связывания рН 9,5, добавляли м-АФБК из расчета 20 мг/мл носителя и встряхивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Схема реакции связывания приведена на рисунке 2. ■ ОН I I

в^о р о- сн2 сн2-сн2осн2- сщон)-сн2-а сн2 снсн2 ! он чо/

+ ЫН2-РЬВ(ОН)2 _^

I 9Н

10-8Ю-СН2-СН2-СН2-0-СН2 СН(0Н)-СН2-0- СНг-СН СН2-КНР11В(ОН)2

! | I

1 ОН он

Рисунок 2. Реакция связывания м-АФБК с активированным

носителем.

Отмытый от избытка м-АФБК сорбент применен для количественного определения Ггб. Для иммобилизации использовали м-АФБК, синтезированную сотрудниками лаборатории стереорегулярных полимеров Института органической химии Уфимского научного центра РАН. Элементный анализ 20 проб полученного сорбента показал, что содержание бора в нем составляет 0, 16+0,08 %. Микроколичественное определение бора и других элементов в сорбентах проведено в аналитической лаборатории Института органической химии Уфимского научного центра РАН.

Определен элементный состав полученного аффинного сорбента. Вычислено %: С-59,26; Н - 6,53%; В - 3,88%. Найдено %: С-58,76%; Н-6,87%; %, В. - 0,12 %, что соответствует степени замещения 3,09%.

Таблица 1

Оптимизация условий иммобилизации м-АФБК на ПВС-носителе

Концентрация м-АФБК рН буфера Среднее содержание бора в сорбенте (%)*

1 8,0 0,02±0,009

5 8,0 0,04±0,010

10 8,0 0,065±0,011

15 8,0 0,09±0,015

20 8,0 0,10±0,013

25 8,0 0,12±0,011

15 7,0 0,08±0,014

15 7,5 0,09±0,015

15 8,0 0,11±0,010

15 8,5 0,10±0,009

15 9,0 0,11±0,010

15 9,5 0,11±0,013

• вычислено при четырехкратной повторности определения содержания бора в сорбенте и доверительной вероятности 95%.

Получено 8 серий аффинного сорбента с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой с содержанием бора от 0,01 до 0,2%. Сорбенты использованы для количественного определения гликогемоглобина в капиллярной крови пациентов. Использована методика определения, рекомендованная фирмой Pierce Chemical Company с некоторыми изменениями. Установлено, что для количественного определения гликогемоглобина в пробах пригодны сорбенты с содержанием бора не менее 0,05%, что согласуется с данными более ранних исследований (Гарипова и др., 2002, Гарипова и др., 2004). Показано, что количество определений Ггб, которое может быть проведено на одной порции сорбента, составляет 20 при содержании бора в сорбенте не менее 0,1%, что превышает число

определений, рекомендованных фирмой Pierce Chemical Company на сорбенте Glyco-Gel. Таким образом, результаты лабораторных исследований свидетельствуют о том, что предложенный аффинный сорбент с иммобилизованной м-АФБК обладает высокой стабильностью и достаточной специфической емкостью для использования в аналитических целях.

Разработка диагностических систем, использующих эритроциты, сенсибилизированные ковалснтио связанным

инсулином

На первом этапе исследований для постановки РПГА использовали классический метод получения эритроцитарного диагностикума, в котором связывание лиганда, в нашем случае инсулина, с поверхностью стабилизированных формалином эритроцитов осуществляется через ионы трехвалентного хрома (Weinbach, 1958). Однако, из-за небольшой стабильности время использования диагностикума, полученного этим методом не превышает 10 дней, а задачи нашего исследования требовали получения результатов в течение более длительного периода времени. В связи с этим, для предотвращения отщепления инсулина от поверхности эритроцитов было предложено использовать метод ковалентного связывания инсулина с альдегидными группами углеводов поверхности эритроцитов (Гарипова и соавторы, 2005). Альдегидные группы формировали за счет окисления гетерополисахаридов поверхности эритроцитов солями перийодной кислоты. В качестве прототипа метода ковалентного связывания инсулина с поверхностью эритроцитов использован метод получения конъюгата пероксидазы с иммуноглобулинами по Fare и Nakane (1983). Реакцию связывания инсулина с поверхностью эритроцитов проводили за счет реакции между альдегидными группами поверхности эритроцитов и аминогруппами инсулина. Образовавшиеся основания Шиффа восстанавливали добавлением боргидрида натрия при комнатной температуре. Полученную 2% взвесь эритроцитов, сенсибилизированных инсулином из расчета 0,4 мг инсулина на 1 мл эритроцитов, использовали для количественного определения связывающих инсулин белков крови человека в реакции пассивной гемаггл юти нации (РПГА).

Таблица 2

Вариабельность определения связывающих инсулин белков в РПГА в диагностических системах, полученных разными методами

День определен ия логарифм концентрации ИСБ при четырехкратной повторности

диагностикум 1 диагностикум 2

1 8,5 9,25

3 9,25 10,25

5 8,75 9,75

7 9,25 9,25

9 8,5 9,5

11 4,75 10,25

13 4,5 9,75

15 4,0 9,25

17 3,75 10,25

19 - 10,5

21 - 10,25

23 - 10,0

25 10,25

27 9,75

29 11,25

Среднее значение 6,8±1,27 9,96+0,46

*диагностикум 1- сенсибилизация эритроцитов с использованием хлорида хрома (III); **диагностикум 2 -сенсибилизация за счет ковалентной иммобилизации инсулина

На основании приведенных в таблице 2 данных сделан вывод о том, что достоверное количественное определение ИСБ в реакции РПГА в системе с ковалентной пришивкой эритроцитов возможно более длительное время, чем при использовании классического диагностикума.

С использованием предложенного диагностикума исследована зависимость концентрации связывающих инсулин

белков крови от степени тяжести течения сахарного диабета типа I. Обследовано четыре группы добровольцев: 1 группа 30 здоровых доноров 25-35 лет, 2 группа пациентов (30 человек), не страдающих сахарным диабетом (находились на стационарном лечении с другими диагнозами, 3 группа больных сахарным диабетом, с удовлетворительной компенсацией нарушений углеводного обмена (значения гликемии не превышают 8,0 ммоль/л), 4. группа больных сахарным диабетом в стадии декомпенсации. Показано, что среднее значение log2 ИСБ в первых двух группах практически совпадает и составляет соответственно 8,60±0,7. и 8, 62±0,72, в то время как в 3 и 4 группах значение показателя было достоверно ниже: 3.82±0,42 в группе с удовлетворительной компенсацией диабета и 3,98±0,38 в группе больных в стадии декомпенсации (рисунок 3).

Ь^ИСБ

; 8,6±0,7 8.62+0,72 ,82+0,42 3,98+0,38

О^^^штттв^шшшшвштяшшяштшяшт 12 3 4

Рисунок 3. Концентрации связывающих инсулин белков крови 1- в группе 30 здоровых доноров 25-35 лет; 2 - в группе пациентов (30 человек), не страдающих сахарным диабетом; 3 - в группе больных сахарным диабетом, с удовлетворительной компенсацией нарушений углеводного обмена; 4 - в группе больных сахарным диабетом в стадии декомпенсации.

Обращает на себя отсутствие различий в концентрации ИСБ в группах больных диабетом с разной степенью тяжести заболевания. Вероятно, это объясняется невозможностью восстановления

нормального транспорта инсулина за счет обычной заместительной терапии.

Методом корреляционного анализа показано отсутствие достоверной зависимости между концентрацией связывающих инсулин белков и %Ггб (г= 0,21, р <0,05). Вероятно, отсутствие этой взаимосвязи является результатом нормализующего действия на углеводный обмен терапии инсулином, снижающей средний уровень гликемии независимо от длительности заболевания и эффективности доставки инсулина к тканям.

Методом корреляционного анализа (программа Statistica for Windows 5,5) установлена достоверная обратная зависимость (г=-0,58, р<0,05) между количеством связывающих инсулин компонентов и сроком заболевания сахарным диабетом. Достоверной зависимости между титром ИСФ и возрастом обследованных не выявлено (г=0,15, р<0,05).

Таким образом, инсулинсвязывающая активность сыворотки больных сахарным диабетом первого типа достоверно ниже этого показателя у здоровых доноров, причем количество связывающих инсулин белков (ИСБ) продолжает снижаться при увеличении срока заболевания. Установлены пределы нормальных значений логарифма концентрации связывающих белков крови. Минимальное значение показателя в крови здоровых доноров составило 5,2 максимальное -11. Вероятно, что эти значения могут быть рекомендованы в качестве пределов нормальных значений концентрации связывающих инсулин белков в крови человека при использовании предложенного метода определения. Достоверного различия показателя в группах больных диабетом с разной степенью тяжести заболевания не выявлено, следовательно, метод не может быть использован в качестве дополнительного при оценке степени тяжести течения сахарного диабета.

Ранее было показано (Гарипова и др. 2009), что одно из нарушений транспорта инсулина при сахарном диабете заключается в изменении соотношения вклада в транспорт гормона двух транспортных систем: эритроцитарной и сывороточной, было установлено, что роль эритроцитарного транспорта возрастает. Мы предположили, что в качестве дополнительного показателя, отражающего степень нарушения транспорта инсулина при сахарном диабете типа I, может быть рекомендован метод определения

коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и эритроном.

Таблица 3

Значения коэффициентов распределения инсулина меяеду плазмой крови и эритроном

Группа обследованных Поверхность эритроцитов Плазма Коэффициент распределения эритроциты/ плазма

Здоровые доноры (п=30) 33,03±1,66% 66,97±1,56% 0,49±0,0132

Больные

диабетом в

стадии компенсации 35,80±1,25%* 65,17±1,56%* 0,54±0.0159

заболевания

(п=30)

Больные

диабетом в

стадии декомпенсации 41,96±1,84% * 58,04 ±1,42%* 0,73±0,0165

заболевания

(п=30)

Проведено экспериментальное сравнение коэффициентов распределения инсулина между плазмой крови и эритроном в крови здоровых доноров и больных диабетом в стадиях компенсации и декомпенсации. Среднее значение коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой в пробах крови больных диабетом составило 0,73±0,0065, то есть было достоверно выше аналогичного показателя, определенного в пробах крови здоровых доноров (таблица 1, 1=2,176, р=0,036). С поверхностью эритроцитов было связано в норме от 25% до 34% инсулина, что соответствует критериям нормы для коэффициента распределения от 33% до 51%. Заслуживает внимания факт достоверного различия средних значений показателя в группах с компенсированным (I) и декомпенсированным (II) заболеванием (таблица 3). На основании

сравнения использования для оценки нарушений транспорта инсулина при помощи двух показателей - концентрации связывающих инсулин белков и коэффициентов распределения инсулина, был сделан вывод о большей информативности второго показателя. Возможно, полученный результат объясняется более медленным падением концентрации ИСБ по сравнению с процессом изменения состава белков транспортирующего инсулин комплекса, зависящим от присутствия в крови пациента белков острой фазы воспалительной реакции, которые с большей долей вероятности присутствуют в крови пациентов с некомпенсированным заболеванием, при котором часты различные осложнения, сопровождающиеся развитием воспалительной реакции. Ранее установлено (Гарипова и др., 2009), что транспортирующие инсулин белки плазмы крови при физиологических значениях рН формируют транспортный комплекс, ядро которого в норме формируют альбумин, а- фетопротеин и трансферин. Показано, что при сахарном диабете первого типа альбумин и а- фетопротеин замещаются в транспортирующем инсулин комплексе сыворотки крови белком острой фазы воспалительной реакции кислым аг гликопротеином. Возможно, при компенсации сахарного диабета в связи со снижением риска развития воспалительных процессов снижается концентрация аг гликопротегча в сыворотке крови, что приводит к нормализации состава транспортных белков в инсулинтранспортирующем комплексе и восстановлению нормального значения коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и эритроном. Причем это восстановление происходит ранее восстановления нормальных концентраций инсулинтранспортирующего комплекса сыворотки крови (по данным, приведенным выше, концентрация связывающих инсулин белков достоверно не различается при разных степенях тяжести течения сахарного диабета типа I).

Оценка иммуномодулирующих свойств компонентов сыворотки, связывающих инсулин

Выявление в составе связывающих инсулин белков а-фетопротеина и орозомукоида (Гарипова и др., 2008) послужило основанием для изучения иммуномодулирующих свойств

Таблица 4

Концентрации противодифтерийных антител в опытной и контрольной группах мышей

Результат титрования в РПГА

Контроль Опыт 1(к^2) Опыт 2(^2 )

5 3 5

6 3 5

7 3 5

8 3 5

6 3 5.

7 3 5

8 3 5

6 4 8

7 4 7

7 4 6

8 4 6

6 4 7

7 4 5

7 4 6

6 7

5 4 8

5 5 7

8 5 6

7 5 6

6 5 5

6,44±0,39 3,76±0,31 6,20±0,34

»,= 10,55, р< 0,05 (2 =1,43 Р=0,159

11- значение критерия Стьюдента при сравнении контроля и опыта 1; величина критерия Стьюдента при сравнении контроля и опыта 2

связывающих инсулин белков здоровых доноров и больных . сахарным диабетом.

Исследование проведено на модели иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. Проведена иммунизация трех групп белых лабораторных мышей: двух опытных и контрольной. Мышей всех групп трехкратно иммунизировали дифтерийным анатоксином. В опыте 1 мышей иммунизировали анатоксином с добавлением инсулинсвязывающих гликопротеидов, выделенных из сывороток крови здоровых доноров, в опыте 2 - при добавлении аналогичной фракции из крови больных сахарным диабетом. Полученные антисыворотки к дифтерийному анатоксину оттитрованы в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом, выявляющим антитела к дифтерийному анатоксину. Результаты представлены в таблице 4. Как следует из приведенных данных, среднее значение титра антител к дифтерийному токсину в опыте 1 достоверно ниже этого показателя, определенного в контроле.

Среднее значение титра в опыте 1 составило 3,76±0,31, в контроле - 6,44±0,39 (различие достоверно с р< 0,05, 1= 10,55). Можно предположить, что состав транспортных молекул, формирующих комплекс с гормоном в плазме крови, определяет реакцию иммунной системы на инсулин и определяет вероятность развития аутоиммунной реакции на этот гормон. Доступность инсулина для связывания с клеточными рецепторами клеток-мишеней и длительность его присутствия в сыворотке, очевидно, также могут определяться свойствами гликопротеидов, входящих в состав транспортного комплекса. Концентрация

противодифтерийных антител в опыте 2 составила 6,20±0,34 по сравнению с 6,44±0,39 в контроле ^ =1,43, р=0,159). Следовательно, достоверного влияния связывающих инсулин белков крови больных сахарным диабетом на концентрацию антител к дифтерийному анатоксину не выявлено. На основании экспериментальных данных сделан вывод об отсутствии у связывающих инсулин белков крови больных сахарным диабетом способности подавлять иммунный ответ к транспортируемым гормонам. Однако, вопрос о наличии у ИСБ больных сахарным диабетом свойств, влияющих на поведение гормона в процессе его транспорта в крови и представления чувствительным клеткам, заслуживает дальнейшего изучения.

Полученные данные позволяют предположить, что в норме транспортные белки выполняют функцию защиты инсулина от распознавания клетками иммунной системы и контролируют его взаимодействие с клетками-мишенями, что предотвращает развитие аутоиммунных реакций на инсулин.

Исследование гипогликемических эффектов двух транспортных форм инсулина

В связи с существованием двух транспортных форм инсулина: гормона, транспортируемого в составе сывороточного комплекса транспортных белков и гормона, связанного с рецепторами поверхности эритроцитов, представляет интерес исследование вопроса о степени выраженности гипогликемического эффекта, вызываемого инсулином в каждой их указанных фракций.

Проведено экспериментальное сравнение действия инсулина в каждой из транспортных форм на уровень гликемии белых лабораторных мышей. Исследование проводили на трех группах животных, в каждую из которых входило по 50 мышей весом 20-25 г. Определены значения концентрации глюкозы в венозной крови контрольной группы животных, не получавших инъекцию инсулина, и двух опытных групп. В опытной группе №1 животным вводили по 1 единице инсулина (человеческий генно-инженерный инсулин ХУМУЛИН Р производства фирмы Lilly France S.A.), в 0,5 мл 50% взвеси мышиных эритроцитов, в опытной группе №2 - такую же дозу инсулина в комплексе с белками 0,5 мл гепаринизированной плазмы мышиной крови. Взятие крови и определение глюкозы проводили через 30 минут после инъекции. В контрольной группе мышей среднее значение гликемии составило 6,72±0,74 ммоль/л. Концентрация глюкозы в крови мышей, получавших инсулин в комплексе с эритроцитами, составила 2,85±0,057 ммоль/л, в группе мышей, получавших инсулин в комплексе с белками мышиной плазмы - 1, 93±0,064 ммоль/л (рисунок 4).

6,721 0. 74

2,85+ 0,05

1,93+0,06

Контрольная опытная группа № опытная группу группа 1 №2

Рисунок 4. Влияние двух транспортных форм инсулина на уровень гликемии.

Таким образом, уровень гликемии в группе мышей, получавших ту же дозу инсулина в комплексе с эритроцитами, был достоверно выше (р=0,034), чем у мышей, получавших инсулин с белками плазмы мышиной крови. Возможно, это связано с более медленным освобождением инсулина из эритроцитарного депо. Вероятно, более выраженная гликемия в группе №2 может объясняться также меньшей емкостью сывороточного деЪо, приводящей к более высокой концентрации свободного гормона при инъекции.

•к-к А А*

модификация аффинного метода определения гликозилированной формы гемоглобина позволяет снизить себестоимость определения этого показателя за счет увеличения кратности

использования порции аффинного сорбента. Методы оценки состояния системы транспорта инсулина в крови обследуемых применимы как при первичной постановке диагноза, так и при определении риска возможных осложнений, обусловленных нарушениями доставки инсулина к периферическим тканям. Таким образом, методы определения концентрации связывающих инсулин белков плазмы крови и определения коэффициента распределения инсулина между плазмой и эритроном наряду с определением гликозилированной формы гемоглобина предоставляют лечащему врачу дополнительную информацию, позволяющую оптимизировать лечение пациентов и ускорить постановку первичного диагноза.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод синтеза аффинного сорбента для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина на основе силикагеля, отличающийся от сорбентов на основе Сефарозы, полиакриламида и поливинилового спирта повышенной стабильностью.

2. Показано, что эритроцитарные диагностикумы с ковалентной пришивкой инсулина позволяют достоверно определять концентрацию связывающих инсулин белков крови в течение 30 дней, и могут быть рекомендованы для использования в клинических лабораториях.

3. Установлены, пределы нормальных значений концентрации связывающих инсулин белков в крови человека (при использовании метода РПГА - от 5 до 11), достоверного различия показателя в группах больных диабетом с разной степенью компенсации заболевания не выявлено.

4. Показано, что значения коэффициентов распределения инсулина между эритроном и плазмой крови достоверно различаются как при сопоставлении значений в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом, так и при сопоставлении больных в стадии компенсации и декомпенсации. Установлены пределы нормальных значений предложенного показателя (31% - 51%).

5. Показано, что гипогликемическое действие инсулина менее выражено при его введении лабораторным животным в

комплексе с эритроцитами, по сравнению с применением гормона в комплексе с белками плазмы, что, вероятно свидетельствует о значительной буферной емкости эритроцитарного депо инсулина. 6. Установлено, что белки, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров оказывают иммуносупрессорное действие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Елисеева О.С., Киреева H.A., Першина A.C., Буторина О Л., Бикбу-латова С.М., Гарипова М.И. Исследование природы взаимодействий инсулина с поверхностью эритроцитов и состава гормонтранспортирующе-го комплекса плазмы крови человека./Вестник Оренбургского государственного университета.- 2009.-№6.-С.476-478.

2. Першина A.C., Киреева H.A., Елисеева О.С., Гарипова М.И. Изучение эритроцитарного транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа./Вестник Оренбургского государственного университета.- 2010.-№ 2. - С. 141 -143.

3. М.И. Гарипова, Т.В. Моругова, H.A. Киреева, Р.И. Ибрагимов, А.С.Першина, О.С. Елисеева, М.В. Баранова. Аффинное выделение и изучение состава связывающих инсулин белков сыворотки крови человека. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. -2010. -№ 8.- С.40-44.

4. Гарипова М.И., Киреева H.A., Баранова М.В., Елисеева О.С., Першина A.C., Набиуллина P.P. Аффинное выделение связывающих инсулин сывороточных гликопротеидов человека и изучение их разнообразия в норме и при сахарном диабете. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова.- 2007.-т.З.-№1 .-С 27-32.

Статьи, материалы, тезисы

5. Першина A.C., Елисеева О.С., Гарипов О.С., Киреева H.A., Гарипова М.И. Влияние условий современного промышленного города на соотношение эритроцитарного и сывороточного транспорта инсулина. / Материалы международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения».- Саранск.-2008.-С.318-319.

6. Елисеева О.С., Першит A.C., Киреева H.A., Гарипова М.И. Влияние экологических условий промышленного города на состав связывающих инсулин транспортных белков крови человека. // Материалы международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их реше-ния».-Саранск.-2008.-С.303-305.

7. Першина" A.C., Елисеева О.С., Гарипова М.И. Транспорт инсулина в крови человека эритроцитарной системой. / Материалы ХШ международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий».- Новосибирск.-2008.-С. 157-158.

8. Елисеева О.С., Першина A.C. Состояние инсулинсвязывающего белкового комплекса крови человека в условиях промышленного города. / Материалы ХШ международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий».- Новосибирск.-2008.-С.158-159.

9. Першина A.C., Гарипова М.И., Киреева H.A., Елисеева О.С. Особенности транспорта инсулина в крови человека. / 12-ая международная пу-щинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века».-Пущино.-2008.-С.101-102.

10. Елисеева О.С., Першина A.C., Гарипова М.И., Киреева H.A. Транспорт инсулина в сыворотке крови здоровых людей и больных сахарным диабетом первого типа. / 12-ая международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века».-Пущино.-2008.-С.84.

11. Першина A.C., Гарипова М.И., Моругова H.A., Киреева H.A., Елисеева О.С. Аффинные методы в исследовании транспорта инсулина в крови человека./Вестник биотехнологии. Оригинальные статьи,- Москва,-2007.-№3,-С. 33-34.

12. Гарипова М.И., Киреева H.A., Моругова НА., Елисеева О.С., Першина A.C. Аффинное выделение связывающих инсулин сывороточных гликопротеидов человека и изучение их состава в норме и при сахарном диабете первого типа./Вестник биотехнологии. Оригинальные статьи.-Москва.-2007.-№3,- С. 27-32.

13. Гарипова М.И. О.С. Елисеева, A.C. Першина Инсулинтранспорти-рующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа // Материалы Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов».-т.2.-2009.-с.69-72; Уфа РИЦБашГУ.-2009

ПЕРШИНА Альбина Сабирьяновна

Биотехнологические аспекты разработки методов диагностики сахарного диабета типа I

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР №021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 13.05.2011 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,38. Уч.-изд. л. 1,44. Тираж 100 экз. Заказ 283.

Редакционно-издательский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Першина, Альбина Сабирьяновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы диагностики сахарного диабета 10 1.1.1 .Показатели, используемые для постановки первичного диагноза 11 1.1.2.Методы оценки степени компенсации нарушений углеводного обмена 18 больных сахарным диабетом

1.2. Особенности транспорта инсулина в крови человека

1.3. Диагностические системы на основе стабилизированных эритроцитов

1.4. Аналитические системы на основе аффинных сорбентов

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объекты исследований, реактивы и материалы

2.1.1. Принципы формирования групп добровольцев при изучении системы 43 транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете типа I

2.1.2. Основные реактивы для синтеза аффинных сорбентов

2.1.3. Реагенты белковой природы и иммунологические препараты

2.2. Методы исследований 44 2.2.1. Химические методы

2.3. Формалинизация эритроцитов 47 2.3.1. Получение эритроцитарного диагностикума с использованием хлорида 47 хрома (III)

2.4. Хроматографические методы

2.4.1. Приготовление гемолизатов

2.4.2. Хроматографическое выделение гликогемоглобина на сорбенте, 50 содержащем дигидроксиборильные группы

2.4.3. Проведение хроматографического выделения связывающих инсулин белков сыворотки человека

2.5. Оценка иммуномодулирующих свойств компонентов сыворотки, 52 связывающих инсулин

2.6. Определение коэффициента распределения инсулина между 55 поверхностью эритроцитов и плазмой крови

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка метода иммобилизации мета-аминофенил-бороновой 58 кислоты на силикагеле

3.2. Оценка достоверности и воспроизводимости количественного 62 определения гликозилированного гемоглобина на полученном сорбенте

3.3. Разработка диагностических систем, использующих эритроциты, 68 сенсибилизированные ковалентно связанным инсулином

3.4. Применение коэффициента распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови в качестве показателя, 74 отражающего степень нарушения транспорта инсулина при сахарном диабете типа I

3.5. Оценка иммуномодулирующих свойств компонентов сыворотки, 76 связывающих инсулин

3.6. Исследование гипогликемических эффектов двух транспортных форм 83 инсулина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические аспекты разработки методов диагностики сахарного диабета типа I"

Актуальность исследования. В 2000-х годах были уточнены механизмы, транспорта гормонов в крови человека, в частности механизмы транспорта инсулина. Рядом авторов показано, что -в транспорте инсулина принимают участие 2 системы транспорта: эритроцитарная и сывороточная (Касаткина, 1996, Сандуляк, 1974; Картун и др., 2000; Запорожан и др., 2001; Gerhard et. al., 2004; Гарипова, 2007). Установлено, что в сыворотке крови инсулин включается в транспортный комплекс, ядро которого формируют транспортные белки, имеющие достаточно широкую специфичность, за счет чего они способны осуществлять транспорт широкого спектра как гидрофобных, так и гидрофильных гормонов, в том числе таких белковых гормонов как инсулин. Показано, что концентрация этого комплекса снижается в плазме крови больных сахарным диабетом (Гарипова, 2007). Показано, что при сахарном диабете типа I наблюдается достоверное увеличение вклада эритроцитарной системы в доставку инсулина к периферическим тканям и, соответственно снижение роли сывороточного транспорта гормона. Из новых данных вытекают новые диагностические возможности выявления нарушений« транспорта инсулина при формировании сахарного диабета. Представляет интерес изучение возможности использования в качестве показателей, отражающих степень нарушений транспорта инсулина, концентрации связывающих инсулин белков крови и коэффициента распределения инсулина между плазмой и эритроном.

Цель работы — создание комплекса методов эффективной диагностики сахарного диабета, включающего оценку степени нарушения транспорта инсулина в крови пациентов и определение интегрального уровня гликемии за длительный период времени, а также исследование особенностей биологического действия двух транспортных форм инсулина, присутствующих в крови человека.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи исследования:

1. Разработать метод синтеза аффинного сорбента для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина, отличающийся от имеющихся аналогов повышенной стабильностью.

2. Оценить стабильность и применимость для диагностических целей эритроцитарных диагностических систем с ковалентным связыванием инсулина с поверхностью эритроцитов, и возможность использования количества связывающих инсулин белков крови в качестве показателя нарушения транспорта инсулина.

4. Изучить зависимости концентрации связывающих инсулин белков и коэффициента распределения инсулина от длительности заболевания и возраста испытуемых.

5. Сравнить гипогликемические эффекты действия двух транспортных форм инсулина.

6. Изучить иммуномодулирующие свойства белков, формирующих комплекс с инсулином в норме и при сахарном диабете. Научная новизна

Предложен комплекс методов для эффективной диагностики сахарного диабета. Комплекс включает определение концентрации 6 гликозилированной формы гемоглобина ил оценку нарушения транспорта инсулина в крови пациентов.

Показано, что определение концентрации связывающих инсулин белков крови и коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и эритроном может быть использовано для диагностики нарушений транспорта гормонов кровью, происходящих при сахарном диабете. Установлены пределы нормальных значений предложенных показателей. Показано, что определение коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и эритроном является более информативным, так как позволяет дифференцировать компенсированное и декомпенсированное течение заболевания.

Показано, что транспортные формы гормона обладают особенностями биологического действия: инсулин, связанный с поверхностью эритроцитов вызывает более медленное снижение концентрации глюкозы в крови, по сравнению с гормоном, введенным в той же дозе в присутствии белков плазмы крови. Экспериментально доказано, что транспортные белки крови, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров, способны снижать интенсивность иммунного ответа к транспортируемым молекулам.

Практическая значимость работы Предложен новый метод синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой, отличающийся от известных аналогов повышенной стабильностью.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование в качестве матрицы аффинного сорбента для определения гликозилированной формы гемоглобина силикагеля, позволяет увеличить стабильность сорбента и повысить кратность его использования.

2. Для оценки нарушений транспорта инсулина более информативным является определение коэффициента распределения инсулина, позволяющее дифференцировать компенсированную и декомпенсированную стадии заболевания.

3. Две транспортные формы инсулина достоверно различаются по выраженности гипогликемического эффекта.

4. Белки плазмы крови, формирующие комплекс с инсулином в норме, обладают иммуносупрессорным действием.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения» (Саранск, 2008), XIII международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск.-2008), 12-ой международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2008), Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов» (Уфа, 2009).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Першина, Альбина Сабирьяновна

выводы

1. Разработан метод синтеза аффинного сорбента для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина на основе силикагеля, отличающийся от сорбентов на основе Сефарозы, полиакриламида и* поливинилового спирта повышенной стабильностью.

3. Установлено, что концентрация связывающих инсулин белков в крови здоровых достоверно выше, чем в крови больных сахарным диабетом. Рекомендуется внедрение этого показателя для выявления нарушения сывороточного транспорта инсулина. Пределы нормальных значений от показателя при использовании метода РПГА-от 1о&5 до 11.

5. Установлено, что белки, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров оказывают иммуносупрессорное действие.

6. Показано, что гипогликемическое действие инсулина менее выражено при его введении лабораторным животным в комплексе с эритроцитами, по сравнению с применением гормона в комплексе с белками плазмы, что, вероятно свидетельствует о значительной буферной емкости эритроцитарного депо инсулина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние два десятилетия арсенал методов диагностики сахарного диабета был расширен за счет интегральных методов, позволяющих оценивать средний уровень гликемии за промежутки времени от 4 дней- (определение гликозилированной формы, фибриногена), до 2-3 месяцев (определение гликозилированной формы гемоглобина) и даже до нескольких лет (определение степени гликозиоирования кератина волос) (Elmendorf, 2004). Ранее показано, что наиболее полное количественное определение гликозилированных форм гемоглобина возможно при использовании аффинного определения с использованием иммобилизованной аминофенилбороновой кислоты, так как в этом случае, в отличие от метода ионообменной хроматографии, определяются все фракции гликозилированного гемоглобина (Гарипова, 2009). Однако, широкому распространению аффинного метода определения гликозилированных форм диагностически значимых белков препятствует низкая стабильность сорбентов с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой, связанная как с постепенным расщеплением самой м-АФБК, так и с деградацией матрицы сорбента и расщеплением связи между матрицей и м-АФБК. С этим связана необходимость разработки метода получения аффинного сорбента с более прочной «пришивкой» фенилбороновой кислоты к носителю. Известно, что эпоксидные группы формируют наиболее прочные связи с аминогруппами белка (Туркова, 1980). В данной работе в качестве носителя использован силикагель фирмы "Serva" марки SP-500, модифицированный глицерилпропилсиланом, содержащий плотно расположенные гидроксильные группы, привитые на поверхность силикагеля в результате модификации и доступные для взаимодействия с эпихлоргидрином. В результате активации эпихлоргидрином получены эпоксидные группы, формирующие стабильные связи с м-АФБК за счет взаимодействия с аминоргруппой. Предложенный метод позволил получить сорбент с иммобилизованной м-АФБК с химически более прочным связыванием лиганда. В результате повышения прочности связывания м-АФБК стало возможным проводить не менее 25 достоверных определений процентного; содержания гликогемоглобина на одной порции сорбента и снизить себестоимость определения по сравнению с аналогами ("Glyco-Gel" фирмы Pierce 4-8 определений, Поливиналь - 20 определений). Однако, лабораторные испытания предложенного' сорбента показали, что он обладает худшими по сравнению с Поливиналем колоночными свойствами и может быть использован лишь в микроколонках. Предварительные испытания предложенного сорбента для определения гликозилированной формы гемоглобина в клинических лабораториях подтвердили его большую стабильность.

Несмотря на введение в практику здравоохранения интегральных методов оценки гликемии, по-прежнему актуальной является проблема оценки эффективности терапии сахарного диабета: Ранее установлено, что при сахарном диабете первого типа происходит достоверное снижение концентрации связывающих инсулин белков плазмы крови (Гарипова, 2008).

Для повышения достоверности количественного определения концентрации связывающих инсулин белков в реакции пассивной гемагглютинации, предложен новый метод получения эритроцитарного диагностикума с ковалентной пришивкой инсулина на поверхности стабилизированных эритроцитов барана. Новый метод позволяет достоверно определять концентрацию связывающих инсулин белков крови в течение 30 дней. Установлены пределы нормальных значений концентрации связывающих инсулин белков плазмы человека, составившие от log2 5 до 11. Рекомендуется внедрение этого показателя для оценки нарушения транспорта инсулина при первичной постановке диагноза «сахарный диабет», так как показано, что значение концентрации связывающих белков достоверно выше в крови здоровых доноров, чем в крови больных диабетом типа I.

Для оценки эффективности терапии сахарного диабета, возможно, более целесообразным является использование другого показателя; отражающего состояние системы транспорта инсулина - значения коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой крови. При сопоставлении? значений, коэффициента распределения инсулина в крови< здоровых доноров5 и больных сахарным диабетом, показано; что-величина этого показателя отражает степень нарушения системы транспорта инсулина и позволяет дифференцировать, компенсированные и декомпенсированные (по уровню гликемии) состояния. Установлены пределы нормальных значений предложенного показателя (31% - 51%).

На модели иммунизации лабораторных мышей дифтерийным анатоксином, показано, что добавление к антигену связывающих инсулин белков крови здоровых доноров приводит к достоверному снижению интенсивности гуморального ответа на введенный антиген. В эксперименте показано достоверное снижение концентрации антител к дифтерийному токсину в крови мышей, иммунизация котрых проводилась на «фоне» связывающих инсулин белков крови здоровых доноров по сравнению с контролем (3,76±0,31 по сравнению с 6,44±0,39 в контроле, Т=10,55, р< 0,05). На основании данных эксперимента высказано предположение о существовании иммуносуппрессирующих свойств у транспортирующих инсулин белков крови здоровых доноров.

В' эксперименте на лабораторных мышах проведено исследование гипогликемического действия инсулина в двух транспортных формах, присутствие которых в крови было показано ранее (Гарипова, 2007): в комплексе с эритроцитами мыши и в комплексе с белками мышиной плазмы. Установлено, что гипогликемическое действие инсулина менее выражено при его введении лабораторным животным в комплексе с эритроцитами, по сравнению с применением гормона в комплексе с белками плазмы. В контрольной группе мышей среднее значение гликемии составило 6,72±0,74 ммоль/л. Концентрация глюкозы в крови мышей, получавших инсулин в комплексе с эритроцитами, составила 2,85±0,057 ммоль/л, в группе мышей, получавших инсулин в комплексе с белками мышиной плазмы - 1, 93±0,064 ммоль/л. На основании данных эксперимента сделано предположение о том, что инсулин медленнее освобождается- из эритроцитарного депо, в результате чего происходит «более плавное» снижение гликемии. Полученные данные могут служить основанием для дальнейшего продолжения, исследований особенностей биологического действия двух транспортных форм инсулина.

Предложен комплекс методов диагностики сахарного диабета, позволяющий наряду с определением интегральных уровней глюкозы за длительный период выявить также нарушение транспорта инсулина в крови пациентов: Этот комплекс включает определение процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина на сорбенте с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой с повышенной, по сравнению с аналогами, стабильностью, а также определение концентрации инсулинсвязывающих белков сыворотки крови и коэффициента распределения инсулина между плазмой крови и поверхностью эритроцитов. Новая модификация аффинного метода определения гликозилированной формы гемоглобина позволяет снизить себестоимость определения этого показателя за счет увеличения кратности использования порции аффинного сорбента. Методы оценки состояния'системы транспорта инсулина в крови обследуемых применимы как при первичной постановке диагноза, так и при определении риска возможных осложнений, обусловленных нарушениями доставки инсулина к периферическим тканям. Таким образом, методы определения концентрации связывающих инсулин I белков плазмы крови и определения коэффициента распределения инсулина между плазмой и эритроном наряду с определением гликозилированной формы гемоглобина предоставляют лечащему врачу дополнительную информацию, позволяющую оптимизировать лечение пациентов и ускорить постановку первичного диагноза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Першина, Альбина Сабирьяновна, Уфа

1.Аристархов, Балаховский Влияние глюкозы на инфракрасный спектр' воды (К вопросу о бескровном определении глюкозы в крови методом фотометрии тканей) // Клиническая, лабораторная диагностика.- N4.-1998.- с. 18-22;

2. Балаболкин М.И. Эндокринология: Учебное пособие. -М.: 1998.

3. Балашова' Т. С., Голега Е. Н., Рудько И. А., жд М.И., Кубатиев A.A. Влияние биосинтетического инсулина на перекисное окисление липидов мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом I типа. // Проблемы эндокринологии.-1994,-т. 4.- № 3:- с. 12-15.

4. Балаховский Флюоресцентные исследования in. vivo // Клиническая лабораторная диагностика.- 2000.- 2000.- с.З -8;

5. Басченко И.А., Зарудий Ф.Х., Гарипова М.И., Давлетов Э.Г. Разработка аффинного метода определения гликозилированного гемоглобина в крови человека. / Здравоохранение Башкортостана.-1997.-№6.-С.55-57.

6. Беляков H.A., В.И.Мазуров. Ожирение. Руководство для врачей Ред. СПб., 2003.

7. Берштейн Л.М. Что изучает топоэндокринология? // Природа.- 1991.-№7.- С.72-76.

8. П.Гарипова М.И., Леплянин Г.В., Антонова Л.Ф., Хавкин Ю.А.-Способ получения иммобилизованных белков.// Авторское свидетельство № 1500670.-1989.

9. Гарипова' М.И'., Басченко И.А., Сысоева Л.Б. Аффинные сорбенты на основе'поливинилового, спирта./ Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа.-1991.-С.95.-(а).

10. Гарипова М.И., Басченко И.А., Монаков Ю.Б. Иммуносорбент на основе поливинилового спирта./ 1 съезд иммунологов России.-Новосибирск.-1992.-с.86. -(а).

11. Гарипова М.И., Басченко И.А., Еркеева И.А., Шигапова А.И. Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений.//Авторское свидетельство.- № 1789532.- 22 сентября 1992.-(б).

12. Гарипова М.И.', Фролова И.С., Клеева О.Б., Кузнецов В.П. // Новый иммуносорбент на основе поливинилового спирта для очистки интерферона.- Доклады академии наук России.-1993.- Т.328.-№6.-736-739.

13. Гарипова М.И., Фролова И.С., Клеева О.Б., Монаков Ю.Б. Кузнецов В.П. //Иммуносорбент для очистки интерферона.// Вопросы вирусологии.-1993 .-Т.38.-№3 .-С. 129.-132.

14. Гарипова М.И., Калимуллина Л.Б. Разработка аффинной диагностической системы для определения гликогемоглобина в капиллярной крови человека. / Сб. «Современные проблемы эволюционной морфологии и физиологии».-Уфа.-1996.-С.59-63, (а).

15. Гарипова М.И. Аффинные сорбенты повышенной стабильности и их использование в биотехнологии и медицинской диагностике. / Сб.

16. Гарипова М.И: Информативность и методы определения гликозилированного гемоглобина при состояниях, не связанных с сахарным диабетом. / Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета. -1997.-е. 101 -103 (б).

17. Гарипова М.И. В.Ю., Умнова, Л.И Штыкова, Пиндюрина Т.Е Инсулинсвязывающий компонент сыворотки человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа.//Вестник Башкирского университета.-2005.-№4.- с.44-46.-(а).

18. Гарипова М.И., Баранова М.В., Розова О.П. Аффинное выделение инсулинсвязывающего компонента сыворотки крови человека и изучениеего биохимической природы. //Вестник Башкирского университета.-2005.-№2.-С 46-48.-(б).

19. Гарипова М.И. Транспорт инсулина в крови человека. — Уфа.- РИЦ БашГУ.-2007.-127 С.(б)

20. Гарипова М.И., Ибрагимов Р.И., Умнова В.Ю., Розова О.П., Шлыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки крови человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа. // Клиническая и лабораторная диагностика -2008.-№4.-с. 44-45.

21. Грачева Н.К., Князева А.П., Старосельцева Л.К.-В кн.: Актуальные проблемы физиологии биохимии и патологии эндокринной системы. М.-1972.- 328 С.

22. Грачева Н.К., Харитоненков И.Г. Изучение «связанного инсулина» сывороток крови доноров и больных сахарным диабетом методом кругового дихроизма. // Лабораторное дело.-1977.-стр.8-13.

23. Голенок В.А., Гостинская Е.В., Диккер В.Е. Гемореалогия при нарушениях углеводного обмена. Новосибирск: Наука, 1987. - 262с.

24. Дедов И.И. Сахарный диабет у детей и подростков, М. : ГЭОТАР-Медиаю- 2007.- 340 С.

25. Демидова Т.Ю., Иванова Л.П., Круглова Е.Л. Динамика гормонального статуса у пациентов с ожирением на фоне длительного непрерывного комбинированного лечения.М: 2008.-с.2^4.

26. Дин П., Джонс У., Мидл Ф. Аффинная хроматография. Методы.-М.: Мир.-1988.-с. 142-152.

27. Доломатов С.И., Пишак В.П., Слипенюк Т.С., Мещишен И.Ф., Окопная Т.В. Способность эритроцитов депонировать тиреоидныегормоны: регулятоная рольфизико-химических факторов in vitro// Вопросы медицинской химии.- №6.- 1999.-С. С. 572-577 .

28. Ефимов A.C., Скробонская H.A. Клиническая диабетология.— К.: Здоровья, 1998.—320 с.

29. Запорожан. В.Н., Гоженко А.И., Доломатов С.И: Влияние физико-химических. факторов in vitro на гормондепонирующую способность эритроцитов человека.- Проблемы эндокринологии.-2001.-т. 47.-№ 5.-С. 41-43.

30. Иголкина JI. Руденская Ю., Руденская F. Аффинные сорбенты на основе хитозана для выделения протеолитических ферментов.// Вестник Московского университета.- Сер.2. Химия.- 2000,-т. 41.- № 6.- с. 398-401.

31. Каминский A.B., Коваленко А.Н. Сахарный диабет и ожирение: клиническое руководство по диагностике и лечению / Каминский A.B. — 1. — Киев: Издательство, 2010. — 256 С.

32. Картун- JI.B., Ходосовская Е.В., Чумаков В.Н. К оценке различий плазменного и сывороточного уровня половых стероидных гормонов и кортизола в свете данных о гормондепонирующей функции эритроцитов //Вопросы медицинской химии.-№9.-2000.-С. 23-30.

33. Касаткина Э.П. Сахарный диабет у детей и подростков.- М.: Медицина.- 1996.- 240 С.

34. Кирдей Е.Г., Дмитриева JI.A. — Характер и условия сорбции эритроцитами биологически активных веществ. // Сибирский медицинский журнал.-1995.-№ 2.-е. 23-2 5.

35. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. 2-е изд. — Мн.: Беларусью- 1982. - 366 С.

36. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике. — Элиста: АШТ'Джангар".- 1998 255С.

37. Коноваленко O.A., Громакова И. А., Эритроциты как модель исследования инсулин-связывающей активности тканей // Вопросы медицинской химии.-1997.-№7.-с.30-31.

38. Котов C.B., Калинин А.П., Рудакова И.Г. Диабетическая ретинопатия . -М.: Медицина.- 2000.-c.150 -209.

39. Кузовлева О.Б. Выделение индивидуальных белков при помощи новых иммуносорбентов, способных присоединять большие количества антигена. // Доклады Академии наук СССР.-1972.-т.203.-№ 5.-С.1193-1195.

40. Кон P.M., Рот К.С. Ранняя диагностика болезней обмена веществ. -М.¡Медицина, 1986. 639с.

41. Лябах H.H. Сахарный диабет: мониторинг, моделирование, управление.- СПБ: Питер.- 2004.- 237 С.

42. Мазовецкий А.Г., Беликов В.К. Сахарный диабет. -М.: Медицина, 1987.-288с.

43. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека.- М.: Мир.-2 т, 1993-С.247-263.

44. Машковский М.Д. Лекарственные средства.-М.:Медицина, 1993.-2т.

45. Меньшиков В.В. Справочник лабораторных методов исследования в клинике. — М.: Медицина, 1987. — 364 С.

46. Мельникова О.Г. Британское проспективное исследование сахарного диабета (UKPDS) результаты 30-летнего наблюдения больных сахарным диабетом 2 типа. Сахарный диабет.- №4 - 2008. - с.90-91.

47. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов. М.: Медицина, 1985.-314С;

48. Петренко Ю. М., Матюшин А. И., Титов В. Ю., Владимиров Ю. А. Эритроцитарный путь метаболических превращений половых гормонов. //Экспериментальная и клиническая фармакология. 1995.-т. 58.-№4.-С. 36 —42.

49. Покровский В.М. Коротько Г.Ф. Физиология человека М:2007.

50. Плохая A.A., Воронцов A.B., Новолодская Ю.В., Бутрова С.А., Дедов И.И. Антропометрические и гормонально-метаболические показатели при абдоминальном ожирении.-М: 2003, с. 18-22.

51. Покрышкин В.И., Тихонова Ю.В. Препараты моноинсулина в лечении сахарного диабета//Новые лекарственные препараты. — 1984. — №9. — С. 8—15.

52. Пухальский А.Л., Шмарина Г.В., Лютов А.Г. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины — 2001 т. 131 — с.564-567.

53. Решетников С.С. Иммуноферментный анализ альфа-фетопротеина, использование в диагностике заболеваний человека //Новости «Вектор-Бест».- 1997.- N 6.- С. 12-16.

54. Розенберг М.Э. Полимеры на основе винилацетата //Ленинград. Хим.-1983.-С. 161.

55. Ройт А. Основы иммунологии. — М.: Мир, 1991.-320с.

56. Ройт А., Бростофф Дж., Мейбл Д. Иммунология.- М:.- 2000.- 327с.

57. Сальникова Л. А., Мусатова Н.В. Действие инсулина на антиокислительные ферменты и перекисное окисление липидов в эритроцитах. // Проблемы эндокринологии.-1990.-т. 36.- № 2.-е. 32-34.

58. Сакодынский К., Бражников В., Волков С. Аналитическая хроматография.-М.:Химия.- 1993.-463 С.

59. Сандуляк Л.И. Эритроциты как депо и система транспорта инсулина // Доклады Академии наук С С С Р.-1974.-Т. 219.-№ 4.-е. 1020 1021;

60. Сандуляк Л.И, Ковалёв В.П. Иммунофлуоресцентный метод выявления инсулина в эритроцитах. - Проблемы эндокринологии.-1978.-т. 24.-№5.-с. 77 - 78.

61. Сергеева Н.А. электрофарез в современном диагностическом процессе// Клиническая лабораторная диагностика.- 1999.-N2 с. 25 - 32;

62. Старкова Н.Т. Заболевания островкового аппарата поджелудочной железы. // Руководство по клинической эндокринологии.-1996.-СПБ: Питер.- 544 С.

63. Старосельцева Л.К. Современные вопросы эндокринологии.- М., Медицина.-1972.- т. 4.- с. 123-132.

64. Старосельцева, Л. К. Содержание инсулина и глюкагона при различных формах сахарного диабета: тер. архив / Л. К. Старосельцева и др.-1981.-№8.-С. 60.

65. Старосельцева Л.К. Гормоны поджелудочной железы в патогенезе сахарного диабета.// Вестник АМН СССР.-1983.-№2.-С.28-33.

66. Теппермен Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы: Пер. с англ. — М: Мир, 1989 — 656 С.

67. ТурковаЯ. Аффинная хроматография.- 1980.-347 С.

68. Уоткинс П. Сахарный диабет. Издательство: Бином.- 2000. -96 с.

69. Ушаков С.Н. Поливиниловый спирт и его производные.- М:1960,-245С.

70. Федорович Е.И., Демидчик Ю.Е., Свиридов О.В. Биомедицинские аспекты взаимодействия тиреоидных гормонов с эритроцитами при раке щитовидной железы.-АОЗТ "Издательский дом "ОГОНЁК".-Москва, 2001.-96 С.

71. Филлипович Ю.Практикум по биологической химии.- М: 1975.- 293 С;

72. Фримель X. Иммунологические методы М. 1979.-С.38-65.

73. Храмов В.А.,Папичева В.В. Простой способ определения глюкозы в кожных экскретах человека// Клиническая и лабораторная диагностика.-2000.- с.14-15;

74. Холодова Е.А. Справочник по клинической эндокринологии- Минск: Беларусь.- 1996.-510 С.

75. Ягудина Р.И., Куликов А.Ю., Аринина Е.Е. Фармакоэкономика сахарного диабета второго типа // М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2011. 352С.

76. Aberkromby D., Allenmark С., Агате С. Some alternative coupling chemistries for affinity chromatography// Mol. Biotechnol. 1994. - N 2. - p. 157-178.

77. Akerstrom B. ,Logdberg, L. Lipocalins // Scand. J. Immunol.-1981.-v. 24.-p. 575-581.

78. Akerstrom B. and Logdberg, L. Microglobulin сц //Trends in Biochem. Sci.-1990,-v. 15.-p. 240-243.

79. Akerstrom B. and Enghild J. Alphai-microglobulin //J. Biol. Chem.1995.-v. 270.-p. 4478-4483.

80. Akerstrom, B. ai-Microglobulin: a yellow-brown lipocalin.// Biochim. Biophys. Acta.-2000.-v. 1482, 172-184.

81. Akerstrôm В., Maghzal G., Winterbourn C., Kettle A. The lipocalin alphar microglobulin has radical scavenging activity. // J. Biol. Chem. 2007.-v.282.- N 43.- p. 31493-31503.

82. Alpert E., Drysdale J., Isselbacher K., Schur P. Human a-Fetoprotein. Isolation, characterization, and demomstration of microgeterogenity. // J. Biol. Chem.-1972.-v. 247.- p: 3792 3798.

83. Andersen, J.F., Weichsel, A., Balfour, C.A., Champagne, D.E., Montfort, W.R. The Crystal Structure- of Nitrophorin 4 at 1.5 Angstrom. Resolution: Transport of Nitric Oxide by A Lipocalin-Based Heme Protein. Structure 6: 1315-1327, 1998.

84. Andrews G., Dziadek M., Tamaoki T. Expression and methylation of the mouse alpha-fetoprotein gene in embryonic, adult, and neoplastic tissues. // J. Biol. Chem.-1982.-v. 257.- p. 5148-5153.

85. Aoyagi Y., Takahashi Y., Odani S., Ogata K., Ono T., Ichida F. Inhibitory effect of alpha-fetoprotein on protein synthesis in a-reticulocyte lysate cell-free system. // J. Biol. Chem.-1982 .- v. 257.- p.9566 9569:

86. Aizawa P, Winge S, Karlsson G. Large-scale preparation of thrombin from human plasma. // Thromb Res. -2008.- N 37.- p. 54-59.

87. Astrom A., Pettersson U., Voorhees J. Structure of the human cellular retinoic acid-binding protein II gene. Early transcriptional regulation by retinoic acid. // J. Biol. Chem.-1993.- v. 267.- N 35.- p. 25251-2525.

88. Arnaud P., Miribel, L. and Roux, A. F.// Methods Enzymol. -1988.-V. 163 .-p. 418-431.

89. Bach J. Insulin-dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease.-Endocr. Rev.- 1994.-V. 15.-p.516-542.

90. Bagshaw S., Bellomo R. Early diagnosis of acute kidney injury. // Curr. Opin. Crit. Care.- 2007.-V. 13.-N 6.-p. 638-644.

91. Bajaj I.- Insulin and Metabolism. Amsterdam.-1977.-p.86-91.

92. Basset C., Dedieu A., Guerin P., Quemeneur E., Meyer D., Vidaud C. Specific capture of uranyl protein targets by metal affinity chromatography. // J. Chromatogr.-2008.- v. 28.-N 2.-p. -233-240.

93. Bell G. I. Molecular defects in diabetes mellitus. Diabetes.- 1991.- V. 40.-P. 413-422.

94. Beilby O., Home C., Milne G., Parkinson C. Alpha-fetoprotein, alpha-1-antitrypsin, and transferrin in gonadal yolk-sac tumours. // J. Clin. Pathol.-1979.- v. 32.- p. 455-461.

95. Berde C., Nagai M., Deutsch H. Human alpha-fetoprotein. Fluorescence studies on binding and proximity relationships for fatty acids and bilirubin. // J. Biol. Chem.-1979.- v. 254.-p. 12609 12614.

96. Blundell T.L., Humbel R.E. Hormone families: pancreatic hormones and homologous growth factors.// Nature.- 1980.-V. 287.-p.781-787.

97. Blouqui Y ., Calvi M., Chen-Marote J. Purification of human erythrocyte phosphoglycerate kinase by dye ligand affinity chromatography.- J. Chromtogr.v.258.-1983 .-p. 213-222.

98. Boguski M., Peitsch M. The first lipocalin with enzymatic activity. // Trends Biochem. Sci.-1991.-v. 16.- N 10.- p.361-363.

99. Boysen R., Hearn M. HPLC of peptides and proteins: standard operating conditions.//Curr.Protoc.Mol.Biol.-2001.-Chapter 10.-Unit 10.13.

100. Bratt T. Retinoic acid binding protein // Biochim.biophys.acta. 2000 -N. 1482.-p.318-326.

101. Breborowicz J., Tamaoki T. Detection of Messenger RNAs of a-Fetoprotein and Albumin in a Human. Hepatoma Cell Line by in Situ Hybridization. // Cancer Res.- 1985,-v. 45.-p. 1730 1736

102. Briand, L. 2002 Evidence of an odorantbinding protein in the human olfactory mucus: location, structural characterization, and odorant-binding properties. //Biochemistry.-2002,-v. 41.-p. 7241-7252 .

103. Brownlee M., Vlassara H., Cerami A. Measurement of glycosylated amino acids and peptides from urine of diabetic patients using affinity chromatography. //Diabetes.-1980.- v. 29.-p. 1044-1047.

104. Buamah P., Harris R., James O., Skillen A. Lentil-lectin-reactive alpha-fetoprotein in the differential diagnosis of benign and malignant liver disease. // Clin. Chem.-1986.-v. 32.-p. 2083 2084.

105. Cabré A.,Lázaro I., Girona J., Manzanares J., Marimón F., Plana N., Heras M., Masana L. Retinol-binding protein 4 as a plasma biomarker of renal dysfunction and cardiovascular disease in type 2 diabetes. // J.Intem.Med.-2007.-v.262.- N 4.- p. 496-503.

106. Campbell D.H., Luecher E.L., Lerman L.S. Immunological adsorbents. Isolation of antibody by means of a cellulose protein antigen// Proc. Nat. Acad. Sci.U.S.-1951.-V. 37. -N9.-p.575-578.

107. Camper S., Tilghman S. Postnatal repression of the alpha-fetoprotein gene is enhancer independent. // Genes and Dev.-1989.-v. 3.-p. 537 546.

108. Carrel S., Barandum S. Protein-conteining polyacrylamide gels: their use as immunosorbents high capacity. // Immunochem. .- 1971.- v. 8.- N1.- p. 3948.

109. Castano L., Eisenbarth G. Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse and rat. // Annu.Rev. Immunol.-1990.- v. 8.- p. 647-679.

110. Chassin D. , Laurent A., Janneau J.L., Berger R. , Bellet D. Cloning of a new member of the insulin gene superfamily (INSL4) expressed in human placenta. // Genomics.-1995 .-v. 29.-p. 465-470;

111. Chan T., Chen H., Chen Y., Lee C., Chou F., Chen IJ., Chen S., Jong S., Tsai E. Increased serum retinol-binding protein 4 concentrations in women with gestational diabetes mellitus. // Reprod Sci.- 2007.V.14.- N 2.-p. 169-174.

112. Chang X, Jorgensen AM, Bardrum P, Led JJ (August 1997). «Solution structures of the R6 human insulin hexamer,». Biochemistry 36 (31): 9409-22.

113. Chaudhuri B., Kleywegt G., Broutin-L'Hermite I. Structures of cellular retinoic acid binding proteins I and II in complex with synthetic retinoids. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.-2000.- v. 55,- N11.- p. 1850-1857.

114. Chen X., Tordova M., Gilliland G. Crystal structure of apo-cellular retinoic acid-binding protein type II (Rll 1M) suggests a mechanism of ligand entry. // J. Mol. Biol. -1998.- v. 278.- N 3.-p. 641-653.

115. Coies, M., Diercks, T., Muehlenweg, B., Bartsch, S., Zolzer, V., Tschesche, H., Kessler, H. // The Solution Structure and Dynamics of Human Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin. Journal of Molecular Biology, 289: 139-157, 1999.

116. Colquitt J., Royle P., Waugh N. Are analogue insulins better than soluble in continuous subcutaneous insulin infusion? Results of a meta-analysis. -DiabetMed.- 2003,-v. 20.-p. 863-866.

117. Coppack S.W. Pro-inflammatory cytokines and adipose tissue // Proc. Nutr. Soc. -2001. -Vol. 60.- P. 349-356.

118. Gowan S.W., Newcomer, M.E., Jones, T.A. Crystallographic Refinement of Human Serum Retinol'Binding- Protein at 2 angstroms Resolution; Proteins-Structure Function and Genetics. 8: 44-61, 1990.

119. Cuatrecasas P. Protein purification by Affinity Chromatography // J. Biological Chemistry.-1970.-v.245.-N12.-p.3059-3065.

120. Dabeva M., Laconi E., Oren R., Petkov P., Hurston E., Shafritz D. Liver Regeneration and -Fetoprotein Messenger RNA Expression in the Retrorsine Model for Hepatocyte Transplantation. // Cancer Res.-1998.-v. 58.- p. 5825 -5834.

121. Day J., Ingebretsen C., Ingebretsen W., Baynes J. Thorpe. Nonenzymatic glucosylation of serum proteins and hemoglobin: response to changes in blood glucose levels in diabetic rates. // Diabetes.- 1980.- v. 29.- p.524-527.

122. Dean P., Brown A., Bouriotis J. U.K. Patent. 1980.-N 2024829.

123. Dean P., Leatherbarrow R. Biochem. J. 1980. - v. 189. - p.27-34

124. Deng L., Xu Y., Huang J. Developing a double-antigen sandwich ELISA for effective detection of human hepatitis B core antibody. // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.- 2008.-V. 31p. 182-189.

125. Despouy G., Bastie J., Deshaies S. Cyclin D3 is a cofactor of retinoic acid receptors, modulating their activity in the presence of cellular retinoic acid-binding protein II. // J. Biol. Chem. -2003.- v. 278.- N 8.- p. 6355-6362.

126. Diez J. J., Iglesias P. The role of the novel adipocyte-derived hormone adiponectin in human disease // Eur. J. Endocr. -2003. -Vol. 148. -P. 293-300.

127. Duncan B., Heiss G; Nonenzymatic glycosylation of proteins a new tool for assessment of cumulative Hyperglycemia in epidemiologic studies, past and future.- Am. J. Epidemiol.-1984,-v. 120.-p. 169-189.

128. Ekstrom B., Berggárd II, Human alplial-microglobulin: Purification". procedure, chemical and.physiochemical properties. // J. Biol. Chem. 1977.- v. 252.-N22.- p. 8048-8057. .

129. Ei'chinger A., Nasreen A., Kim H., Skerra A. Structural' insight: into the: dual ligand specificity and' mode of high density lipoprotein; association* of apolipoprotein D; // J. Biol. Chem.- 2007.-V. 282.- N 42.- p.31068-31075.

130. Eksinck J., Cooms J., Williams R. Studies in Vitro of the Transport of the A and B Chains of Insulin in Serum. // J. of Immunological Invest. 1964.- v. 239.-N 10.-p. 3372-3381.

131. Elmendorf J. Fluidity of insulin action. // Molecular Biotechnology.-2004.- v. 27.-N 2.- p. 127-138:

132. Enghild J., Salvesen G., Hefta S. Chondroitin 4-sulfate covalently crosslinks the chains of the human blood protein pre-alpha-inhibitor. // J. Biol: Chem.-1991.-v. 266,-N 2.-p. 747-751.

133. Erickson J., Paucker K. Purification, of acid ethanol-extracted human lymphoid interferons by Blue Sepharose chromatography. Anal. Biochem. 1979.-v. 98.-p. 214-218.

134. Espe K.,Galler A., Raila J., Kiess W., Schweigert F. High-normal C-reactive protein levels do not affect the vitamin A transport complex in serum of children and adolescents with type 1 diabetes. // Pediatr.Res.-2007.-v.62.-N 6,-p. 741-745.

135. Farr A.G., Nakane P.K. Cells bearing la antigens in the murine thymus: an ultrastructural study. Am. J. Pathol. 1983. - v.l 1 l.-pi88.

136. Fisher E.A. in: Affinity Chromatography and Related Techniques. -Elsvie.- Amsterdam.- 1982,- POSTER A 15.

137. Festa A., D'Agostino R., Howard G. et al. Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome: the Insulin Resistance Atherosclerosis Study (IRAS) // Circulation.- 2000. -Vol. 102. -P. 42-47.

138. Fleischer A., Kurtz A., Wapner R., Ruch D., Sacks G., JeantyP., Shah D., Boehm F. Elevated alpha-fetoprotein and a normal fetal sonogram: association with placental abnormalities. // Am. J. Roentgenol.- 1988,-v. 150.-p. 881 883.

139. Flower, D. R., Sansom, C. E., Beck, M. E. and Attwood, T. K. (1995) Trends Biochem.Sci. 20, 498-499

140. Flower D. R. The lipocalin protein family: structure and function. // Biochem. J. -1996,-v. 318.- p. 1-14.

141. Forest J., Verreault F., Pouliot M. Measurement of alpha-fetoprotein in maternal serum: three commercial radioimmunoassay kits and two noncommercial radioimmunoassays compared.// Clin. Chem.-1982.-v. 28.-p. 339 -343.

142. Frengen J., Schmid R., Kierulf B., Nustad K., Paus E., Berge A., Lindmo T. Homogeneous immunofluorometric assays of alpha-fetoprotein withmacroporous, monosized particles and flow cytometry. // Clin. Chem.-1993.-v. 39.- p. 2174-2181.

143. Frolund B., Keiding K. Implementation of an HPLC polystyrene divinylbenzene column for separation of activated sludge exopolymers. // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - v. 41'.- N 6. - p.708-716.

144. Fournier T., Medjoubi N., Porquet D. // Biochim.biophys.acta. 2000 -V.1482. - P1157-171.

145. Frolund B., Keiding K. /Implementation of an HPLC polystyrene divinylbenzene column for separation of activated sludge exopolymers.//Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - 41, N 6. - C. 708-716.

146. Garipova M.I., Kalimullina L.B. Estimation of tissue metabolism damage and approach to it's correction./ 33 International Congress of Physiologica Science.-St.Petersburg.-1997.-p.543.

147. Garlick R., Mazer J. The principal site of nonenzymatic glycosylation of human serum albumin in vivo. // J. Biol. Chem.- 1983.-V.258.-6142-6146.

148. Garlick R., Mazer J., Higgins P., Bunn H. Characterization of glycosylated hemoglobins.-J. Clin.-Invest.- 1983.-v. 71.-p. 1062- 1072.

149. Gamson K., Chia S., Jovanovic L. The safety and efficacy of insulin analogs in pregnancy. -J. Matern. Fetal Neonatal. Med.- 2004.-v. 15 (1).- 26-34

150. Gasymov O., Abduragimov A., Glasgow B. Characterization offluorescence of ANS-tear lipocalin complex: evidence for multiple-bindingtmodes. //Photochem. Photobiol.- 2007,-v. 83.-N 6.-p. 1405-1414.

151. Gerhard D., Wagner L., Feingold E. The status, quality, and expansion of the NIH full-length cDNA project: the Mammalian Gene Collection (MGC). // Genome Res. -2004.- v. 14.- N 10B.- p. 2121-2127.

152. Gitlin D., Perricelli A., Gitlin G. Synthesis of a-Fetoprotein by Liver, Yolk Sac, and Gastrointestinal Tract of the Human Conceptus. // Cancer Res.-1972.-v. 32.-p. 979 982.

153. Giuliani M., Ricci S., Ratti G., Pucci P., Marino G., Malorni A., Ceccarini

154. C., Terrana B., Tecce M. Synthesis and characterization of a recombinant107fragment of human a-fetoprotein with antigenic selectivity versus albumin. // Protein-Eng.-1989.-v. 2^- p: 605 610;

155. Gluszek J., Szszesniak, L., Banaszak, P., Tykarski, A.R. and Rychlewski, T. (1990) Pol. Arch. Med.r 101, 191-196. ' , i

156. Godbout R:, Tilghman S. Configuration of the alpha-fetoprotein regulatory domain during development. // Genes and Dev.-1988.-v. 2.-p. 949 956.

157. Goodman, W.S (1984) in The Retinoids (Spom, M. B., Roberts, A. B. and Goodman, W. S, eds.).-v. 2, pp. 41-88; Academic Press, New York.

158. Gould B., Hall P., Cook J. Measurement of glycosylated hemoglobin using an affinity chromatography method: // Clin. Chim. Acta .-1982.- v. 125.-p.41-48.

159. Godovac-Zimmermann J. The structural motif of beta-lactoglobulin and retinol-binding protein: a basic framework for binding and transport of small, hydrophobic molecules? // Trends Biochem. Sci. -1988.- v. 13 .-N 2.- p. 6466.

160. Govin R., Roth J. Insulin-binding erythrocyte receptors. // Proc. Nat. Acad; Sci. U.S.A.-1972.-v.69.-N 3.-p.747-751.

161. Grubb A., Mendez, E., Fernandez-Luna, J. L., Lopez, C., Mihaesco, E. and Vaerman, J.-P. // J. Biol: Chem. -1986.-v.281.- p. 14313-14320.

162. Gruenwedel D., Fu J: Mercurated dextran column chromatography for fractionating mononucleotides. // Proc. Nat. Sci. USA.-1971.- v. 68.- p.2002-2005.

163. Gupta K.,Shukla M., Cowland J., Malemud C., Ilaqqi T. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin is expressed in osteoarthritis and forms a complex with matrix metalloproteinase 9. // Arthritis. Rheum.-2007.-v.56. -N 10.- p: 3326-3335.

164. Gutierrez S., De Paul A., Petiti J. The regulatory action of estradiol in interaction with insulin on the secretory and proliferative lactotroph cell. // Steroids.-2008.-v.73.-N 5.-p. 515-527.

165. Guthrow C., Morris M., Day J., Thorpe S., Baynes J. Enhanced nonenzymatic glucosylation of human serum albumin in diabetes mellitus. // Proc. Nat. Acad Sci. USA.- 1979.-v.76.-p.4258-4261.

166. Havel P.J. Control of energy homeostasis and insulin action by adipocytehormones: leptin, acylation stimulating protein and adiponectin // Curr. Opin. Lipidol.- 2002. Vol. 13. -P. 51-59.

167. Higgins P., Garlick R., Bunn H. Glycosilated haemoglobin in human and animal red cells.// Diabetes.-1982.-v.31.-p.743-748.

168. Hirsch I. Insulin analogues. -N. Engl. J. Med.- 2005.-V 352.- 174-183

169. Holden, H.M., Rypniewski, W.R., Law, J.H., Rayment, I. the Molecular-Structure of Insecticyanin from the Tobacco Hornworm Manduca-Sexta L at 2.6 A Resolution. Embo Journal. 6: 1565-1570, 1987.

170. Hom F., Ettinger B., Lin M. Comperison of serum fructosamine and glycohemoglobin as measures of glycemic control in large diabetic population. // Acta Diabetologica.-1998,-v. 35.- N l.-p. 48-51.

171. Hubbuch A. Separation of glycosylated haemoglobins using immobilized phenylboronic acid. Effect of ligand concentration, column operating conditions and comparison with ion-exang and isoelectric-focusing. // Biochem J.-1983 .-v.209.-N 3 .-p.771 -779.

172. Humbel R.E. Insulin-like growth factors I and' II. // Eur. J. Biochem. -1990.-v.l90.-p.445-462;

173. Huynh H'., Larsson C., Narod S. Pollak M. Tumor suppressor activity of the gene encoding mammary-derived growth inhibitor. // Cancer Res. 1995.-V.55.-N ll.-p. 2225-2231.

174. Hulsmeier A., Paesold-Burda P., Hennet T. N-Glycosylation Site Occupancy in Serum Glycoproteins Using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. // Mol. Cell. Proteomics. -2007.-v. 6.-p. 2132-2138.

175. Ikeda K., Sakamoto Y., Kawasaki Y., Miyake T., Tanaka K., Urata T., Katayama Y., Ueda S., Horiuchi S. Determination of glycated albumin by enzyme-linked boronate immunoassay. // Clinical Chemistry.-1998.-v. 44.- N 2.-p.256-263.

176. Kahn C. The molecular mechanism of insulin action. // Annu. Rev. Med.-1985.-v.36.-p. 429-432.

177. Kaikaus R., ChanW., Ortiz de Montellano P., Bass N. Mechanisms of regulation of liver fatty acid-binding protein. // Mol. Cell. Biochem. -1993.-V.123-.-N 1-2.-p. 93-100.

178. Kaumeyer J., Polazzi J., Kotick M. The mRNA for a proteinase inhibitor related to the HI-30 domain of inter-alpha-trypsin inhibitor also encodes alpha-1-microglobulin (protein HC. // Nucleic Acids Res.-1986.- v. 14.- N 20.- p. 7839-7850.

179. Keen J., Caceres I., Eliopoulos E., Zagalsky P., Findlay J. Complete sequence and model for the A2 subunit of the carotenoid pigment complex, crustacyanin. // Eur. J. Biochem. 1991.- v. 197.- N 2. - p. 407-417.

180. Kim D., Garcia A. Retention behavior of amino acids using immobilized Ag (I) chromatography// Biotechnol. Progr. 1995. - 11, N 4. - C. 465-467.

181. Kitao S., Yamada T., Ishikawa T., Madarame H., Furuichi M., Neo S., Tsuchiya R.,Kobayashi K. Alpha-fetoprotein in serum and tumor tissues in dogs with hepatocellular carcinoma. // J .Vet. Diagn. Invest.-2006.-v.18.- p. 291 -295.

182. Knobler H., Benderly M., Boyko V. et al. Adiponectin and the development of diabetes in patients with coronary artery disease and impaired fasting glucose // Eur J. Endocr.- 2006.- Vol. 154.- P. 87-92.

183. Kovacs P., Geyer M., Berndt J., Klöting N., Graham T., Böttcher Y.,

184. Enigk B., Tönjes A., Schleinitz D., Schön M., Kahn B., Blüher M., Stumvoll111

185. M. Effects of genetic variation in the human retinol binding protein-4 gene (RBP4) on insulin resistance and fat depot-specific mRNA expression. // Diabetes.- 2007,-v. 56.-N 12.-p.3095-3100.

186. Kroes R., Williams G., Weisburger J. Early Appearance of Serum a-Fetoprotein during Hepatocarcinogenesis as a Function of Age of Rats and Extent of Treatment with 3f-MethyI-4-dimethylaminoazobenzene. II Cancer Res.-1972.-v. 32.- p. 1526 1532.

187. Krumlauf R., Hammer R., Tilghman S., Brinster R. Developmental regulation of alpha-fetoprotein genes in transgenic mice. // Mol. Cell. Biol.-1985.-v. 5.-p. 1639- 1648.

188. Krusius T., Ruoslahti E. Carbohydrate structure of the concanavalin A molecular variants of alpha-fetoprotein. // J. Biol. Chem.-1982.-v. 257.-p. 3453 3457.

189. Kim K, Han J., Kim H., Lee M. Expression, purification and characterization of TAT-high mobility group box-lA peptide as a carrier of nucleic acids. // Biotechnol Lett. 2008 .- N 3.- p. 18-23.

190. Kogo H., Yoshie M., Kutsuke M., Tamura K. Roles of Implantation-related Factors, Stathmin and Insuline-like Growth Factor-binding Protein 7 in Reproductive Endocrinology. // Yakugaku Zasshi. 2008.- v. 128.- N 4.-p. 565-574.

191. Kreutz M., Fritsche J., Andreesen R., Krause S. Regulation of cellular retinoic acid binding protein (CRABP II) during human monocyte differentiation in vitro. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998 v. 248.-N3.- p-. 830-834.

192. Lee J., Im J., Lee H., Shim J., Youn B., Lee D. Visceral adiposity is associated with serum retinol binding protein-4 levels in healthy women. // Obesity (Silver Spring).-2007.-v.l5.- N 9,- p. 225-232.

193. Lee S., Lee J., Kim S., Park J., Lee W., Mori K., Kim S., Kim L, Suk K. Adual role of lipocalin 2 in the apoptosis and deramification of activated microglia. J. Immunol.-2007,-v. 179.-N 5.-p.3231-3241.

194. Lee J., Bruley D., Kang K. Manipulation of the affinity between protein and metal ions by imidazole and pH for metal affinity purification of protein C from Cohn fraction IV-1. // Adv. Exp. Med. Biol.- 2008,-v. 614.-p. 93-100.

195. Lei G., Liu L. Xiong X. Wei Y. Zheng X. New alpha-amino phenylalanine tetrazole ligand for immobilized metal affinity chromatography of proteins. // J.Sep. Sci.-2008 . V.12.-N 3. p. 112-117.

196. Lester E., Miller J., Yachnin S. Human Alpha-Fetoprotein as a Modulator of Human Lymphocyte Transformation: Correlation of Biological Potency with Electrophoretic Variants. //PNAS.-1976.-v.73.-p. 4645 4648.

197. Lin Y., Jin D., Vacher J., Feuerman M. Sequence requirements for alpha-fetoprotein gene expression during liver regeneration. // Cell Growth Differ.-1995.-V. 6.-p. 1549-1552.

198. Liu C., Chen J., Kuei C., Sutton S., Bonaventure P., Lovenberg T. Relaxin-3/Insulin-like Peptide 5 Chimeric Peptide, a selective ligand for G-protein -Coupled Receptor. // Molecular Pharmacology .- 2005.- V.67.-N l.-p. 231-240.

199. Little R., England J., Wiedmeyer H., Goldstein D. Glycosylated hemoglobin measured by affinity chromatography: Micro-sample collection and room temperature storage. // Clin.Chem. -1983.- v.29.-p. 1113-1115.

200. Logdberg L.^ Wester L. Lipocalins // Biochim.biophys.acta. 2000 -V.1482. - P:284-297.

201. Lu N., Changelian P., Unanue E. Alpha-fetoprotein inhibits macrophage expression of la antigens. // J. Immunol. 1984.- v. 132.- p. 1722 - 1727.

202. Mackiewicz A., Mackiewicz K. Alpha 1 acid glycoprotein. // Glycoconjugate J. 1995.- V.12-P.241-247.

203. Maiolini R., Perrua B., Masseyeff R. Enzymoimmunoassay ofhuman alpha-foetoprotoln. J. Immunol. Meht, 1975, v.6, p.355-362.

204. Mallia A., Hermanson G., Krohn R., Fujimoto E., Smith P. Preparation and use of boronic acid affinity support for separation and quantitation of glycosylated hemoglobins. Anal. Letters.-1981.-v. 14.-p.649-661.

205. Matsumoto I., Ito I., Seno N. Affinity adsorbents on TSK-gel base.// J. Chromatogr.-1982.-V.239.- P.- 747-754.

206. Melbye M., Wohlfahrt J., Lei U., N0rgaard- Pedersen B., Mouridsen H., Lambe H., Michels K. Fetoprotein-a Levels in Maternal Serum During Pregnancy and Maternal Breast Cancer Incidence. // J. Natl. Cancer Inst.-2000.-v. 92.-p.1001 1005.

207. Middle F., Bannister A., Bellingham A., Dean P. Separation1 of glycosylated haemoglobins using immobilized phenilboronic acid. // Biochem .J.-1983 .-v.209.-p.771 -779.

208. Mikaelyan M., Poghosyan G., Gasparyan V. Rapidpurification of annexin V from human placenta by affinity chromatography. // Prep. Biochem. Biotechnol.-2008.-v.38.-N 2.- p. 152-157.

209. Mizejewski G., Pass K. Fetoprotein-a and Hypothyroidism in Infants. // Pediatrics.- 1992,-v. 90.- p. 1008 1009.

210. Mizejewski G., Keenan R., Setty R. Separation of the estrogen-activated growth-regulatory forms of alpha- fetoprotein in mouse amniotic fluid. // Biol. Reprod.-1990.-v. 42.-p. 887 898.

211. Mizejewski G. Physiology of Alpha-Fetoprotein as a Biomarker for Perinatal Distress: Relevance to Adverse Pregnancy Outcome. // Experimental Biology and Medicine.-2007.-v. 232,- p. 993 1004.

212. Morii M., Travis J. The reactive site of human inter-alpha-trypsin inhibitor is in the amino-terminal half of the protein. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler.- 1985.-v. 366.-N 1.-p. 19-21.

213. Morris M., Grandis., Litton J. The correlations of glycosylated serum protein and glycosylated hemoglobin concentrations with blood glucose in diabetic pregnancy. // Am. J. Obset Gynecol.-1985.-V. 153.-p. 257-260.

214. Morel L., Depeiges A„ Dufaure J. LESP, an androgen-regulated lizard epididymal secretory protein family identified as a new member of the lipocalin superfamily. // J. Biol. Chem.- 1993.- v. 268.- N 14.- p. 1027410281.

215. Mukaida N., Kasahara T., Ko Y., Kawai T. Establishment of a highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for interleukin- la emploing a fluorogenic substrate.//J. Immunol. Methods.- 1988.-v.l07.-p.41-46.

216. Musa K. Caglar J., Bakkeren A., Geven W. Fetoprotein-a Normal Values. // Pediatrics.- 1989.- v. 83.- p. 640-643

217. Nakabayashi H., Taketa K., Yamane T., Oda M., Sato J. Hormonal Control of a-Fetoprotein Secretion in Human Hepatoma Cell Lines Proliferating in Chemically Defined Medium. // Cancer Res.-1985.- v. 45.-p. 6379-6383.

218. Nagata A., Igarashi M., Toh H., Urade Y., Hayaishi O. Structural organization of the gene for prostaglandin D synthase in the rat brain. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1992,-v. 89.- N 12.- p. 5376-5380.

219. Nalwar D., Barr B., Kesson C., Robb D. Determination of adult and fetal hemoglobins by affinity chromatography. // Clin. Chim. Acta.-1983.-v.128.-p. 61-67.

220. Nielsen S., Spener F. Fatty acid-binding protein from rat heart is phosphoiylated on Tyrl9 in response to insulin stimulation. // J. Lipid Res. -1993,-v. 34.- N 8.- p. 1355-1366.

221. Ng W., Ng F. Elevated serum alpha-fetoprotein in a patient with undifferentiated carcinoma of the gall bladder. // J. Clin. Pathol.-1995.- v. 48.-p. 1061 1063.

222. Pathange L., Bevan D., Zhang C. Quantifying protein microstructure and; electrostatic effects on the change in gibbs free energy of binding in immobilized metal affinity chromatography. // Anal. Chem.- 2008.-V. 80.-N 5.-p.1628-1640.

223. Pervaiz, S. and Brew, K. Homology and structure-function correlations between al-acid glycoprotein and; serum retinol-binding protein' and; its relatives.//FASEB J.-1985.-v.l.-p. 209-214.

224. Pepper D. Some alternative coupling chemistries for affinity-chromatography. // Mol. Biotechnol. 1994. - v. 2.- N 2. - p. 157-178.

225. Petty K. Metal-chelate affinity chromatography. // Curr. Protoc. Mol. Biol:- 2001.-Chapter 10.'- Unit 10.1 IB.

226. Phillips K.,, Scurry J., Toner G. Alpha-fetoprotein production by a malignant mixed mullerian tumour of the uterus. // J. Clin. Pathol.-1996.- v. 49.-p. 349-351.

227. Platis D., Labrou N. Affinity chromatography for, the purification of therapeutic proteins from transgenic maize using immobilized histamine. // J. Sep. Sci.- 2008 .-N 4 .- p. 636-645.

228. Pope R., Apps J., Page M., Allen K., Bodansky H. A novel device fort he rapid in-clinic measurement of haemoglobin Ale. // Diaet. Med.-1993.- v.10.-N3.- p.260-263.

229. Radanyi C., Mercier-Bodard C., Secco-Millet C., Baulieu E.,Richard-Foy H. Alpha-fetoprotein is not a Component of the Estradiol Receptor of the Rat Uterus. // PNAS.-1977.-v. 74.-p. 2269 2272.

230. Rajala M.W., Obici S., Schherer P.E. et al. Adipose-derived resistin andgut-derived resistin-like molecule-b selectively impair insulin action on glucose production // J. Clin. Invest.- 2003.- Vol. 111.- P. 225-230.

231. Rassart E. Apolipoprotein D // Biochim. Biophys. Acta.-2000-v. 1482.-p. 185-198.

232. Randle P., Taylor K. Insulin, in protein fractions of serum from healthy people and from insulin-treated diabetics.// Lancet 1958,-v. 2,- N7054.-p. 996-997.

233. Reed P., Bhathnagar D., Dhar H., Winocour P. Precise measurent of glycated« serums albumin by column affinity chromatography and immunoturbidimetry. // Clin. Ghim. Acta:-1986:- v. 161.- p. 191-199.

234. Rendell M., Rasbold K., Neirenberg J., Hermanson G., Klenk D., Smith P. // Clin. Biochem.- 1986.- v. 19.- N 4.- p. 216-220.

235. Richardson B., Hulka S., Peck J., Hughes C., Berg B., Christianson R., Calvin J. Levels of Maternal Serum Alpha-fetoprotein (AFP) in Pregnant Women and Subsequent Breast Cancer Risk.// Am. J. Epidemiol.-1998.- v. 48.-p. 719 727.

236. Roy R., Kundu S. Silicagel affinity adsorbents // Anal. Biochem. -1979:-v.98.-p. 338-341.

237. Sakai M., Morinaga T., Urano Y., Watanabe K., Wegmann T., Tamaoki

238. T. The human alpha-fetoprotein gene. Sequence organization and the 5'flanking region. // J. Biol. Chem.-1985.-v. 260.- p. 5055 5060.

239. Savu L., Benassayag C., Vallette G., Christeff N., Nunez E. Mouse alpha1.fetoprotein and albumin. A comparison of their binding properties withestrogen and fatty acid ligands. // J. Biol. Chem.-1981.- v. 256.-p. 9414-941.

240. Sasaki R., Nishimura N., Hoshino H., Isa Y., Kadowaki M., Ichi T.,

241. Scharpe S., Eid M., Cooreman W., Lauwers A. Alpha-1-Anti-trypsin, aninhibitor of renin. Biochem. J. -1976.-V. 153 — p.505-507.

242. Schroeder F., Atshaves B., Starodub O. Expression of liver fatty acidbinding protein alters growth and differentiation of embryonic stem cells. //

243. Mol. Cell. Biochem. -2001.- v. 219.- N 1-2.- p. 127-138.

244. Scoazec J, Moreau A., Feldmann G., Bernuau D. Cellular Expression ofa-Fetoprotein Gene and Its Relation to Albumin Gene Expression during Rat

245. Azo-Dye Hepatocarcinogenesis. // Cancer. Res.-1989.- v. 49.- p.1790 1796.

246. Sell S., Sheppard H, Poler M. Effects of -Fetoprotein on Murine Immune

247. Responses: II. Studies on Rats. //J. Immunol.-1977.- v.ll9.-p. 98 103.

248. Sipe J., de Mayer-Guignard J., Fauconner B. Purification of mouse cellinterferon by affinity chromatography on a solid-phase immunoadsorbent. //

249. Proc. Nat. Acad. Sci.USA.- 1973 .-v. 70.- p. 1037-1040.

250. Schaffler A., Muller-Ladner U., Scholmerich J., Buchler C. Role ofadipose tissue as an inflammatory organ in human diseases // Endocr. Rev. 2006. -Vol. 27.- P. 449—467.

251. Shea J., Randell E., Vasdev S., Wang P., Roebothan B., Sun G. Serum retinol-binding protein 4 concentrations in response to short-term overfeeding in normal-weight, overweight, and obese men. // Am. J. Clin. Nutr. -2007.-V.86-N 5.-p.1310-1315.

252. Sheppard H., Sell J., Trefts P., Bahu R. Effects of -Fetoprotein on Murine Immune Responses: I. Studies on Mice. // J. Immunol. -1977.- v.119.- p. 91 -97.

253. Shima K., Ito N., Hirota M., Yono M., Yamamoto Y., Uchida T. Highperformance liquid chromatographic assay of serum glycated albumin. // Diabetologia.- 1988.-v. 31.- 627-631.

254. Schwartz N., Michaelson J., Putterman C. Lipocalin-2, TWEAK, and other cytokines as urinary biomarkers for lupus nephritis. // Ann. N. Y. Acad. Sci.-2007,-v.l 109.-p.265-274.

255. Speziale P., Visai L., Rindi S., Di Poto A. Purification of human plasma fibronectin using immobilized gelatin and Arg affinity chromatography. // Nat Protoc.-2008.-v. 3.-N 3.- p. 525-533.

256. Spear B., Tilghman S. Role of alpha-fetoprotein regulatory elements in transcriptional activation in transient heterokaryons. // Mol. Cell. Biol.-1990.-v. 10.- p. 5047 5054.

257. Steppan C.M., Bailey S.T., Bhat S. et al. The hormone resistin links obesity to diabetes //Nature. -2001. -Vol. 409. -p. 307-312.

258. Sun X., Ge R., Chiu J., Sun H., He Q. Identification of Proteins Related to Nickel Homeostasis in Helicobater pylori by Immobilized Metal Affinity Chromatography and Two-Dimensional Gel Electrophoresis. // Met. Based Drugs.-2008.-v.289.-490-497.

259. Sviridov D., Meilinger B., Drake S., Hoehn G., Hortin G. Coelution of Other Proteins with Albumin during Size-Exclusion HPLC: Implications for Analysis of Urinary Albumin. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol.- 2007,-v. 292.-p.430 439.

260. Tager H.S. Adnormal products of the human insulin gene // Diabetes.-1984.-33.-p.693-697.

261. Talwar G.P., Moudgil K.D., Gupta S.K., Srivastava L.M., Mishra R. Evaluation of an enzyme immunoassay based'on sonicate supernatant antigens. Indian J. Lepr. 1988. V.60. -p.159.

262. Tan Y., Barakat E., Berthold W. The isolation and amino acid/sugar composition of human fibroblastoid interferon/ // J. Biol. Chem,-1979.- v. 254.-p.8067-8072.

263. Tanaka K., Imoto I., Inoue J. Frequent methylation-associated silencing of a candidate tumor-suppressor, CRABP1, in esophageal squamous-cell carcinoma. // Oncogene.- 2007.- v. 26.- N 44.- p. 6456-6468.

264. Toftager-Larsen К., Kjaersgaard E.,Jacobsen J., Norgaard-Pedersen B. Reactivity of amniotic fluid' alpha-fetoprotein with concanavalin A in relation to gestational age: clinical implications. // Clin. Chem.-1980.-v. 26 p. 1656 -1659.

265. Turkova J.//Biochim. et biophys.acta. -1977. -Voh257. p.257-263.

266. Tyner A., Godbout R., Compton R., Tilghman S. The ontogeny of alpha-fetoprotein gene expression in the mouse gastrointestinal tract: // J. Cell Biol.-1990.-v. llO.-p. 915-918.

267. Urbach A., Zitelli В., Blatt J., Gartner J., Malatack J. Elevated a-Fetoprotein in a Neonate With a Benign Hemangioendothelioma of the Liver. // Pediatrics.-1987.-v.80.- p. 596-597.

268. Wang L., Yan H. NMR study suggests a major role for Arg III in maintaining the structure and dynamical- properties of type IP human cellular retinoic acid binding protein. //Biochemistry .-1998.-v. 37.- N 37.- p. 1302113032;

269. Weith: H., Wiebers J., Gilham P. Synthesis of cellulose; derivatives containing the dihydroxyboryl group ¡and study of their capacity to form: specific complexes with sugars and<nucleic acidi components. // Biochemistry.-1970.-N9.-p. 4396-44401.

270. Waller D., Lustig L., Cunningham C. Second-trimester maternal serum alpha-fetoprotein levels and the risk of subsequent fetal death. // N. Engl. J: Med.-1991-v. 325.-p. 6 10;

271. Ward V. IC., Hammock B.D., Choudary P.V. A microplate assay for the determination of protein deglycosylation // BioTechniques. -1994. v.16.- N 6; - p.1036-1038.

272. Weinbach R. Microbiolbgia. Parazitoll si Epidemiol. 1958. v.3. - 213 p.

273. West I., Goldring O. Lectin, affinity chromatography // Mol. Bioteclinol.- 1994. 2, N 2. - C. 147-155.

274. Wichterle O., Lim D. Hydrophilic gels for biological use // Nature.-1960.-V.185.-P.117-118.

275. WestermarkP., Wernstedt. C., Wilcnder E., Sletten K. A novel peptide in the caloitonm gene related peptide family as an amyloid fibril protein the endocrine pancreas. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986 .-v. 140.-p.827-831.

276. White C., Akbari A., Doucette S:, Fergusson D., Hussain N., Dinh L, Filler G., Lepage N., Knoll G. A novel equation to estimate glomerular filtration rate using beta-trace protein. // Clin. Chem.- 2007.-v.53.-N 11.r p. 1965-1968.

277. Wolfrum C., Borchers T., Sacchettini J., Spener F. Binding of fatty acids and peroxisome proliferators to orthologous fatty acid binding proteins fromhuman, murine, and bovine liver. // Biochemistry .- 2000.- v. 39.- N6.- p. 1469-1474.

278. Wells G., Nosworty M., Hamilton J., Tarnopolski M., Tein I. Skeletal muscle metabolic dysfunction in obesity and metabolic syndrome. // Can. J. Neurol. Sci.- 2008.- v. 35,- N 1.- p. 31-40.

279. Wide L., Porath J. Solid-phase radioimmunoessay // Biochim. Biophys. Acta.-1966.-v.130.-p.257-260.

280. Wilting J., Kremer J., Janssen L. Drug binding to human alpha-1-acid glycoprotein in health and disease. // Pharmacol. Rev. — 1988.-v.40 .- NT.- p. 1-47.

281. Wu H., Jia W., Bao Y., Lu J., Zhu J., Wang R., Chen Y., Xiang K. Serum retinol binding protein 4 and nonalcoholic fatty liver disease in patients with type 2 diabetes mellitus. // Diabetes Res. Clin. Pract.-2008.-v.79.- N 2.-p. -185-190.

282. Xu Y., Halsall B., Heineman W. Heterogeneous enzyme immunoassay of alpha-fetoprotein in maternal serum by flow-injection amperometric detection of4-aminophenol. //Clin. Chem.-1990.-v. 36.-p. 1941 1944.

283. Yan Q. Yang Q.,Mody N.,Graham T., Hsu C., Xu Z.,Houstis N., Kahn B., Rosen E. The adipokine lipocalin 2 is regulated by obesity and promotes insulin resistance. //Diabetes.-2007.-v.56.- N lO.-p. 533-540.

284. Young A., Scapin G., Kromminga A. Structural studies on human muscle fatty acid binding protein at 1.4 A resolution: binding interactions with three C18 fatty acids. // Structure.-1994.- v. 2.- N6.-p. 523-534.

285. Yamamoto R., Azuma M., Hoshi N., Kishida T., Satomura S., Fujimoto S. Lens culinaris agglutinin-reactive a-fetoprotein, an alternative variant to a-fetoprotein in prenatal screening for Down's syndrome. // Hum: Reprod.-2001 .v. 16.-p. 2438 2444.

286. Yang Y., Spitzer E., Kenney N. Members of the fatty acid binding protein family are differentiation factors for the mammary gland. // J. Cell Biol. -1994.-v. 127.-N4.-p. 1097-1109.

287. Yasukawa K. High-performance affinity chromatography system for rapid, efficient assay of glycated albumin. // J. Chromatogr. 1992.-v.597.-p.271-275.

288. Yasukawa Z., Sato S., Sano R., Ogawa Y., Kitajima K. Identification of disialic acid-containing glycoproteins in mouse serum: a novel modification of immunoglobulin light chains, vitronectin, and plasminogen. // Glycobiology.-2006,-v. 16.-p. 651 -665.

289. Yu Z., Ye X., Zhao F., Huang P., Hu F., Franco O., Wang J., Li H., Liu Y., Lin X. Elevated retinol-binding protein 4 levels are associated with metabolic syndrome in Chinese people. // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 2007,-v. 92.-N 12.-p. 4827-4834.

290. Young P., Tilghman S. Induction of alpha-fetoprotein synthesis in differentiating F9 teratocarcinoma cells is accompanied by a genome-wide loss of DNA methylation. // Mol. Cell. Biol.-1984.-v. 4.- p. 898 907.

291. Zanotti G., Scapin G., Spadon P. Three-dimensional structure of recombinant human muscle fatty acid-binding protein. // J. Biol. Chem.-1992.- v. 267.- N 26.- p. 18541-18550.

292. Zanotti G., Scapin G., Spadon P. Three-dimensional structure of recombinant human muscle fatty acid-binding protein. // J. Biol. Chem.- 1992.-v. 267.-N 26.-p. 18541-18550.

293. Zasshi Y. Roles of Implantation-related Factors, Stathmin and Insuline-like Growth Factor-binding Protein 7 in Reproductive // Endocrinology — 2008.-v. 128.-N 4.-p. :565-574.

294. Информация для участникагцель процедуры

295. Условия работы с коллекцией образцов крови.

296. Кровь и другой клеточный материал будут поступать и храниться в течение 8 и более лет.

297. Все образцы крови будут помечены числовым кодом без обозначений фамилий пациентов.

298. Материалом являются приготовленные биологические образцы и их производные, включающие кровь, клетки, ДНК, РНК и т.д.

299. В случае необходимости взятия дополнительных образцов участники или их семьи будут заблаговременно оповещены об этом.

300. Участники будут информированы, что взятие образцов крови может причинить минимальный дискомфорт.

301. Индивидуальная информация проведенных анализов (количество инсулин-связыващих белков и уровень распределения инсулина в крови в соответствии к определенной фамилии) будут храниться строго конфиденциально.1. Согласие Участника1. Участие.

302. Добровольность участия в исследованиях.

303. Участник предоставляет образцы и право их использовать добровольно. Он может отказаться от участия в сдаче образцов и исследовании, что не повлияет на медицинское обслуживание его самого и членов его семьи.1. Риск и помощь.

304. Участник понимает, что он может испытывать определенный дискомфорт при стандартной сдаче образцов, крови или медицинском опросе. Опытный медицинский персонал обеспечит все необходимое для того, чтобы свести данный риск к минимуму.

305. Участник ознакомлен с написанным выше и согласен принять участие. Участник (Ф.И.О., подпись)

306. Подпись лица, свидетельствующего о добровольном участии (Ф.И.О., подпись)

307. Результаты испытаний диагностического набора для определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека на основе мета-аминофенилбороноывой кислоты, имобилизованной насиликагеле

308. Определение процента гликогемоглобина в капиллярной крови пациентов, не страдающих сахарным диабетом.

309. А) Практически здоровые доноры.

310. Б) Пациенты, не страдающие сахарным диабетом, находившиеся на стационарном лечении с другими диагнозами.

311. Ф.И.О. % гликозилированного гемоглобина * Уровень гликемии в мМоль/л ** Иа базе какой клинико-диагностической лаборатории проводилось определение. Диагноз.

312. Т.О.Х. 6,4 5,2 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Синдром Иценко-Кушинга.

313. С.О.П. 7,6 5,4 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Тиреотоксикоз.

314. П.В.И. 7,6 5,2 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Аутоиммунный тиреоидит

315. П.В.М. 8,7 4,2 Эндокринологическое отделение ГКБ №21. Гипотиреоз

316. С.В.Х. 6,3 4,7 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Болезнь Эдисона

317. Д.А.А. 6,9 5,2 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21.

318. Х.А.В. 5,4 5Д Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Тиреотоксикоз

319. С.П.Р. 7,8 5,5 Эндокринологическое отделение ГКБ №21. Гипотиреоз

320. Н.М.В. 8,0 4,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Диффузный токсический зоб

321. Н.Р.Л. 8,0 5,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Тиреотоксикоз

322. Г.М.И. 8,5 6,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Тиреоидит

323. Б.А.Ш. 10,0 5,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Ожирение

324. Х.Г.Г. 6Д 4,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21. Гипертиреоз

325. С.Ф.Ф. 7,6 5,6 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова. Гипертиреоз

326. Е.З.Т. 5,6 6,5 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова. Сахарный диабет не подтвержден

327. А.Х.М. 6Д 5,4 Эндокринологическое отделение РКБ им.1. Куватова1. Обследование6,0 4,5 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова1. З.А.М. Гипертиреоз4,1 3,5 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова

328. Х.Р.А. Послеоперационный гипотиреоз

329. С.М.А. 4,7 4,5 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова Гипотиреоз4,5 3,8 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова1. Г.В.Т, Гипотиреоз4,2 4,7 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова1. Б.М.П. Гипертиреоз

330. Ф.З.А. 5,2 5,0 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова гипертония7,3 4,0 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова1. Б.А.Н. Гипотиреоз

331. М.Л.И. 4,0 5,4 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова Гипертиреоз

332. Я.М.Р. 4,8 4,5 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова Гипертиреоз

333. Среднее значение % Ггб в гемолизатах пациентов этой группы составило 6,6±0,54%, значения колебались в пределах 4,0 — 10,0%.

334. Определение % Ггб в капиллярной крови пациентов, страдающих сахарным диабетом, с удовлетворительной компенсацией нарушений углеводного обмена (значения гликемии не превышают 8,0 ммоль/л)

335. Ф.И.О. % гликозилированного гемоглобина * Уровень гликемии в мМоль/л ** На базе какой клинико-диагностической лаборатории проводилось определение. Диагноз.

336. Г.М.И. 8,9 6,8 Поликлиника № 13

337. Г.Р.Р. 8,3 6,6 Поликлиника № 13с.в.ч. 6,2 6,6 Поликлиника № 13г.т.с. 8,9 7,6 Поликлиника № 13

338. Г.Р.Т. 6,6 7,6 Поликлиника № 13

339. М.П.С. 7,7 4,4 Поликлиника № 8

340. А.В.М. 8Д 6,2 Поликлиника № 8

341. Ш.Р.А. 10,9 7,6 Поликлиника № 8

342. В.А.П. 9,5 7,5 Поликлиника № 8

343. В.А.А. 8,9 6,3 Поликлиника № 8

344. Е.А.П. 10,2 6,2 Поликлиника № 8

345. К.А.Р. 4,0 4,8 РКБ, кабинет №12

346. Б.М.П. 11,0 3,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

347. Н.Л.Ю. 14,0 7,2 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

348. Д.А.М. 8,0 8,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

349. Ш.П.А. 8,8 7,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

350. К.Р.Л. 9,7 7,8 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

351. П.В.Д. 10,7 7,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21г.т.г. 8,8 7,2 Эндокринологическое отделение ГКБ № 211. Эндокринологическое

352. И.Л.А. 8,4 7,8 отделение ГКБ № 21

353. П.А.Е. 8,3 8.0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21и.л.м. 7,9 4,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21с.в.м. 5,0 4,2 Хирургическое отделение РКБ им. Куватодая.с.ю. 9,6 6,9 Эндокринологическое отделение РКБ

354. К.А.И. 8,6 7,7 Эндокринологическое отделение РКБ

355. С.Т.И. 6,7 3,0 Хирургическое отделение РКБ им. Куватода

356. Ю.С.А. 4,0 3,6 Хирургическое отделение РКБ им. Куватода

357. И.М.В. 7,3 6,3 Хирургическое отделение РКБ им. Куватода

358. О.Д.М. 7Д 6,3 Хирургическое отделение РКБ им. Куватода

359. Я.Р.П. 6,3 6,0 Эндокринологическое отделение РКБл.л.и. 9,4 7,5 Эндокринологическое отделение РКБ1. Эндокринологическое33

360. Ч.И.Т. 8,9 7,9 отделение РКБ

361. А.К.И. 8,0 5,4 Эндокринологическое отделение РКБ

362. К.Т.А. 7,8 8,4 Эндокринологическое отделение РКБ

363. Б.И.А. 9,1 7,6 Эндокринологическое отделение РКБ

364. М.А.Н. 8,7 5Д Эндокринологическое отделение РКБ

365. Е.З.Т. 8,7 5,1 Эндокринологическое отделение РКБ

366. М.Т.А. 5,6 6,5 Эндокринологическое отделение РКБ

367. С.М.Х. 4,0 5,8 Эндокринологическое отделение РКБ

368. К.Х.А. 8,0 7,4 Эндокринологическое отделение РКБ

369. Я.М.Я. 5,0 5,9 Эндокринологическое отделение РКБ

370. Среднее значение % Ггб составило для этой группы больных 8,1 ±0,26%.

371. Определение % Ггб в капиллярной крови пациентов, страдающих сахарным диабетом в стадии декомпенсации углеводного обмена (значениягликемии превышают 8 мМоль/л)

372. Н.Е.А. 11,0 10,0 Поликлиника № 13

373. К.П.Д. 9,2 11,9 Поликлиника № 8

374. Л.Р.А. 13,6 11,4 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

375. А.З.Т. 11,7 11,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

376. З.В.А. 14,0 9,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

377. К.В.Н. 13,4 9,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

378. З.Р.А. 13,0 8,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

379. Н.Л.Ю. 14,3 9,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

380. А.М.Т. 16,2 10,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

381. К.С.Т. 11,8 9,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

382. К.Е.Р. 12,3 13,6 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

383. Г.Р.Ш. 12,2 16,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

384. П.Л.Е. 13,0 9,3 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

385. Л.С.Т. 11,8 8,9 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21г.л.м. 13,3 9,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

386. Т.Ф.Д. 9,9 8,7 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21к.л.ю. 17,0 10,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

387. Х.А.А. 10,8 9,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21ш.г.л. 12,8 9,8 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21г.н.и, 13,6 12,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

388. Л.П.А. 9,4 8,5 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

389. П.А.М, 11,8 9,7 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

390. Х.Р.И. 15,2 10,2 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

391. М.А.Р. 11,4 4,1 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

392. Н.А.К. 12,0 9,8 Эндокринологическое отделение ГКБ № 211. Эндокринологическое

393. Н.И.К. 9,8 8,6 отделение ГКБ № 21

394. А.Х.Х. 18,4 12,7 Эндокринологическое отделение РКБ им. Куватова

395. М.Н.П. 14,2 8,9 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21г.и.м. 10,3 9,8 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

396. М.А.Н. 8,2 8,0 Эндокринологическое отделение ГКБ № 21

397. М.У.Л. 7,5 11,2 Хирургическое отделение РКБ им. Куватова

398. Т.О.Л. 7,2 9,8 Хирургическое отделение РКБ им. Куватова

399. С.У.Р. 11,5 14,2 Хирургическое отделение РКБ им. Куватова