Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-генетическое исследование больных сахарным диабетом 2 типа

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клинико-генетическое исследование больных сахарным диабетом 2 типа"

На правах рукописи

005051204

БЕЛОУСОВА Оксана Николаевна

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4 АПР 2013

Белгород - 2013

005051204

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель:

Чурносов Михаил Иванович, доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

Иванов Владимир Петрович, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой биологии, медицинской генетики и экологии

Щипков Валерий Петрович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации, и.о. заведующего кафедрой биологии и общей генетики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

ОС

Защита диссертации состоится « ссб » сМ^И/и/З 2013 года в « /с? » часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автореферат разослан ■> 13 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 доктор биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Сахарный диабет 2 типа (СД2) - самое распространенное эндокринное заболевание, которое представляет собой одну из острейших медико-социальных проблем, так как ведет к ранней инвалидизации и повышению смертности среди населения вследствии развития различных осложнений (Yamauchi T. et al., 2003; Alssema M. et al., 2007; Colagiuri S. et al., 2009; Hemmingsen B. et al., 2011; Шестакова M.B. и др., 2001; Якунина Н.Ю. и др., 2007; Дедов И.И. и др., 2011). В настоящее время более 285 млн человек в мире страдают сахарным диабетом, в 90% случаев это сахарный диабет 2-го типа. В России более 3 млн человек больны сахарным диабетом, из них 2,8 млн - сахарным диабетом 2-го типа. Согласно прогнозам ВОЗ к 2025 году количество больных диабетом в мире вырастет до 435 млн человек (Dinarello С.А. et al., 2010; Майоров А.Ю. и др., 2008; Дедов И.И. и др., 2010; Vistisen D. et al., 2011). По частоте инвалидизации и смертности сахарный диабет стоит на 3 месте после сердечно-сосудистых заболеваний и онкопатологии. В Российской Федерации данное заболевание включено в Федеральную целевую программу «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (20072011 гг.)» (Постановление Правительства РФ от 10.05.07 № 280). Сахарный диабет 2-го типа считают «неинфекционной эпидемией» (Дедов М.В., 2011).

СД2 относят к мультифакториальным заболеваниям (Чистяков Д.А. и др., 2010; Burgdorf K.S. et al., 2011; Ellervik С. et al., 2011). Согласно литературным данным роль генетических факторов в развитии СД 2 составляет 60-80% (Симбирцев А.С. и др., 2005; Носиков В.В. и др., 2008). Научные исследования последних лет показали, что важное значение в развитии СД2 играют цитокины (Wisse В.Е. et al., 2004; Verstrepen L. et al., 2008; Bradley J.R. et al., 2008), которые способствуют развитию инсулинорезистентности, причем одними из ключевых медиаторов ее развития являются факторы некроза опухоли (Densem С. G. et al., 2002; Liu D.M. et al., 2004; Trujillo M.E. et al., 2005; Wang M. et al., 2010 ). Обладая множеством медико-биологических эффектов (оказывают

иммуномодулирующее, цитотоксическое и провоспалительное действие, стимулируют липолиз, активируют систему гемостаза, индуцируют апоптоз и др.) факторы некроза опухоли могут влиять на развитие и прогрессирование сахарного диабета 2 типа (Parvin H. et al., 2001; Rosen E.D. et al., 2002; Vincent A.M. et al., 2002; Chen G. Et al., 2002; Joseph N.A. et al., 2004; Goldstein B.J. et al., 2005; Argoff C.E. et al., 2006; Benedicte F.B. et al., 2007).

С молекулярно-генетических позиций сахарный диабет 2-го типа изучен недостаточно. Подавляющее число работ по исследованию роли различных генов-кандидатов в формировании СД2 и его осложнений проведено за рубежом (Chen G. et al., 2002; Wisse В.Е. et al., 2004; Verstrepen L. et al., 2008; Bradley J.R., 2008; Rung J. et al., 2009; Boraska et al., 2010). В Российской Федерации лишь несколько работ посвящено молекулярно-генетическим аспектам сахарного диабета 2-го типа (Ященко И.А., 2004;

Кондратова Н.В. 2005; Хабарова О.Ю. и др., 2007; Майоров А.Ю., 2009; Потапов В .А. и др., 2010; Никитин А.Г., 2010; Коненков В.И. и др., 2012;). Роль полиморфных маркеров генов факторов некроза опухоли и их рецепторов в отношении сахарного диабета 2-го типа в нашей стране мало изучена, что диктует необходимость проведения данных исследований в Российской Федерации.

Цель: Изучить вовлеченность генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли и их рецепторов в формирование и клиническое течение сахарного диабета 2-го типа.

Задачи:

1) Изучить распространенность полиморфных вариантов генов фактора некроза опухоли а (-308G/A TNFa), лимфотоксина a (+250A/G Ltd), рецепторов фактора некроза опухоли 1-го (+36A/G TNFR1) и 2-го (+1663A/G TNFR2) типов у больных сахарным диабетом 2-го типа и в популяционной выборке.

2) Рассмотреть роль молекулярно-генетических маркеров и их комбинаций в формировании СД2.

3) Проанализировать ассоциации генов-кандидатов с клиническими особенностями СД2.

4) Исследовать влияние генетических полиморфизмов на развитие осложнений сахарного диабета 2-го типа.

5) Оценить связи генетических вариантов факторов некроза опухоли и их рецепторов с клинико-лабораторным статусом больных сахарным диабетом 2-го типа.

Научная новизна. Впервые выявлено важное клиническое значение полиморфных локусов факторов некроза опухоли (-308G/A TNFa, +250A/G Ltd) и их рецепторов (+36A/G TNFR1, +1663A/G TNFR2) при сахарном диабете 2-го типа среди русского населения Центрального Черноземья России. Установлены генетические факторы подверженности к сахарному диабету 2-го типа, определены межгенные сочетания, ассоциированные с формированием СД2. Выявлены молекулярно-генетические маркеры неблагоприятного клинического течения заболевания и развития его осложнений.

Научно-практическое значение. Результаты проведенного исследования расширяют представления о молекулярно-генетических детерминантах сахарного диабета 2-го типа. Установленные в исследовании генетические варианты цитокинов, ассоциированные с повышенным уровнем гликированного гемоглобина, глюкозурией, развитием ангиопатии нижних конечностей у больных СД2 могут быть использованы в работе эндокринологических стационаров для выявления среди больных группы риска неблагоприятного клинического течения заболевания, развития осложнений. Результаты работы используются в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» и в практической деятельности Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: Третьей международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения-2010» (Белгород, 2010), 5 Всероссийском диабетологическом конгрессе (Москва, 2010), Международной научно-практической конференции «Современный взгляд на болезни внутренних органов и полиморбидность» (Белгород, 2011), XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина-человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2011), VI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011), Итоговой научной конференции сотрудников Курского государственного медицинского университета, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск,

2011), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Алмазовские чтения 2011» (Санкт-Петербург, 2011), 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием: «Молодежная наука и современность» (Курск, 2011), VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва,

2012), V Юбилейной международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения-2012» (Белгород, 2012), 66-й Итоговой научной конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2012).

Личный вклад автора. Автором лично определены цели и задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения, проведено клиническое- обследование всех больных сахарным диабетом 2-го типа. Автор лично принимал участие в выполнении молекулярно-генетических исследований, проводил обработку, анализ и обобщение полученных результатов, апробацию результатов исследования, подготовку основных публикаций по выполненной работе, написание и оформление рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Генетические полиморфизмы +250A/G Lía, -308G/A TNFa, +36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2 определяют риск формирования сахарного диабета 2 типа.

2. Молекулярно-генетические маркеры ассоциированы с клиническими особенностями сахарного диабета 2-го типа и развитием его осложнений.

3. Клинико-лабораторный статус больных СД2 связан с генетическими вариантами факторов некроза опухолей и их рецепторов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов

и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения.

Материалы диссертации изложены на 141 странице машинописного текста и содержат 22 таблицы и 37 рисунков. Библиографический указатель содержит 235 наименований, из которых 148 иностранных.

Материалы и методы исследования Клиническая характеристика исследованных больных

Группу исследования составили 544 человека: 236 больных сахарным диабетом 2 типа и 308 человек популяционного контроля. В нее включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой. Среди 236 больных сахарным диабетом 2 типа мужчин было 64 человека (27,12%), женщин- 172 (72,88%). В популяционной выборке (п=308) распределение по полу было аналогичным: мужчины - 82 человека (26,62%), женщины -226 (73,38%) (р>0,05). Средний возраст больных составил 57,85±6,11 лет (варьировал от 37 до 76 лет), популяционной выборки - 60,20±6,28 лет (варьировал от 31 до 79 лет) (р>0,05).

. Клинико-лабораторное обследование пациентов проводилось на базе эндокринологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Среди клинических признаков СД2 изучены: возраст манифестации заболевания, степень тяжести и характер компенсации сахарного диабета 2-го типа, наличие инсулинопотребности и эффективность терапии, развитие осложнений. Нами были рассмотрены клинико-лабораторные показатели, патогенетически значимые для СД2.

Всем больным СД2 и индивидуумам популяционного контроля проводилось типирование четырех молекулярно-генетических маркеров: диаллельные локусы генов факторов некроза опухоли а (-308С/А ТЫ Ра), лимфотоксина а (+250А/С Ыа), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36А/С ТЫРШ), рецептора фактора некроза опухоли второго типа (+1663А/С ТЫР 112). Генотипирование осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Молекулярно-генетические методы

Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4-5 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции (МаЛечу, 1985) . Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторе с флюоресцентной

детекцией IQ5 (Bio-Rad) с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М», олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол».

Генотипирование ДНК-маркеров осуществлялось методом дискриминации аллелей с использованием Tag Man зондов и программного обеспечения - Standart Edition Version 2,0 (Bio-Rad).

Статистические методы

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами (Животовский JI. А., 1983). Для оценки соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использовали критерийл/2 (Вейр Б., 1995).

Ассоциации молекулярно-генетических маркеров с

предрасположенностью к сахарному диабету 2 типа, а также с клиническими особенностями течения заболевания, развитием осложнений оценивали с помощью таблиц сопряженности 2x2 с расчетом критерия %2 с поправкой Йетса на непрерывность' и отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI) (Schlesselman J., 1982). Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с СД2 проведен с помощью программного обеспечения APSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику (Favorov А. V., et al., 2005). Оценку уровня статистической значимости полученных результатов проводили с использованием поправки Бонферрони (Реброва О. Ю., 2006).

При изучении связей генетических полиморфизмов с патогенетически значимыми количественными признаками СД2 в начале оценивали характер распределения исследуемых признаков с использованием критерия Шапиро-Уилка (Реброва О. Ю., 2006). Получено, что распределение всех исследуемых количественных признаков (клинико-лабораторные и др. показатели) не соответствовало закону нормального распределения и поэтому для их описания применяли медиану (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а для сравнительного анализа - критерий Манна-Уитни (Реброва О. Ю„ 2006).

Результаты исследования и их обсуждение

1. Исследование роли генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формировании сахарного диабета 2 типа

Изучение частот генотипов изучаемых генетических маркеров (табл. 1) показало, что для всех рассмотренных локусов в популяционной выборке и в группе больных СД2 эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (р>0,05).

Таблица 1

Распределение полиморфных маркеров генов факторов некроза опухоли и их рецепторов у больных СД2 и в контрольной группе

2 и я о ч Аллели, генотипы, генетическое разнообразие Больные СД 2 (п=236) Контрольная группа (п=308) СЖ (95% С1) х2;р

п % п %

ч 1 "1 ¥ +250 А 341 12,25 473 77,04 0,77 (0,58-1,03) /2=3,01; р=0,08

+250 в 131 27,75 141 22,96 1,29 (0,97-1,74) Х2=3,01; р=0,08

+250 АА 129 54,66 180 58,63 0,85 (0,59-1,81) Х2=0,70; р=0,40

+250 А в 83 35,16 113 36,80 0,93 (0,64-1,34) 7^=0,09; р=0,76

+250 со 24 10,18 14 4,57 2,36 (1,14-4,95) )Г!=5,61; р=0,01

н„(не) 0,35 (0,40) 0,36 (0,35)

-30НС/Л Т!\Та -308 с 405 85,8! 539 88,94 0,75 (0,91-1,94) ■¿=2,12; р=0,14

-308 А 67 14,19 67 11,06 1,33 (0,51-1,09)

-308 <7£7 176 74,57 242 79,87 0,73 (0,48-1,13) Х2=1,84;р=0,17

-308 Ав 53 22,45 55 18,15 1,30(0,83-2,05) Х2=1,27; р=0,25

-308 АА 7 2,98 6 1,98 1,51 (0,45-5,15) Х2=0,20; р=0,64

н„(не) 0,22 (0,24) 0,18(0,19)

+36А/в ГДТ«/ +36 с 237 50,42 318 51,62 0,94(0,73-1,21) Х2=0,16; р=0,68

+36 А 235 49,58 298 48,38 1,05 (0,82-1,35) Х2=0,16;р=0,68

+36 Св 66 27,96 76 24,68 1,18(0,79-1,77) Х2=0,58; р=0,44

+36 АС 106 44,91 166 53,89 0,69 (0,48-0,99) Х2=3,95; р=0,04

+36 АА 64 27,13 66 21,43 1,36(0,90-2,06) Х2=2,07; р=0,15

н„(не) 0,44 (0,50) 0,53 (0,49)

+1663А/С, ТЛ М2 +1663 с 272 57,63 341 55,74 1,07 (0,83-1,37) /=0,25; р=0,61

+1663 А 200 42,37 269 44,26 0,93 (0,72-1,19) Х2=0,25; р=0,61

+1663 вв 81 34,32 101 33,12 1,05 (0,72-1,53) Х2=0,04; р=0,83

+1663 Ав 110 46,61 138 45,24 1,05 (0,74-1,50) Х2=0,05; р=0,81

+1663 А А 45 19,07 66 21,64 0,85 (0,54-1,33) Х2=0,39; р-0,53

н„(не) 0,46 (0,48) 0,43 (0,49)

* Примечание: Но и Не - наблюдаемая и ожидаемая гетерозигогность

Уровень аллельного разнообразия по рассматриваемым локусам варьировал от Н0=0,18 (для локуса -308С/А ТШа) до Н0=0,53 (для локуса +36Л/С

TNFR1) в популяционной выборке и от Н0=0,22 (-308G/A TNFa) до Н0=0,46 (+1663A/G TNFR2) среди больных СД2.

Установлена более высокая частота генетического варианта +250GG лимфотоксина а среди больных СД2 (10,18%) по сравнению с контрольной группой, где анализируемый показатель составил 4,57% (%2=5,61, р=0,01, с учётом поправки Бонферрони рсог=0,03). По другим исследуемым генетическим полиморфизмам достоверных различий в концентрациях алалелей и генотипов не обнаружено (р>0,05).

При изучении связи молекулярно-генетических маркеров факторов некроза опухолей и их рецепторов с формированием СД2 у больных сахарным диабетом 2 типа в зависимости от наследственной отягощенности по СД2 выявлены значимые различия в концентрациях генетических вариантов по локусу +250A/G Lta (рис.1): у больных СД2 без наследственной отягощенности по СД2 концентрация генотипа +250GG лимфотоксина а составляет 14,39% и в 3,5 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%,х2=17,76, р=0,01, pCOr=0,03, OR=3,52, 95% CI 1,63-7,63) так и пациентов с наследственной отягощенностью по СД2 (4,26%, х2=5,18, р=0,02, рсог=0,06). Также больные СД2 без наследственной отягощенности отличаются более высокой концентрацией генетического варианта +250G лимфотоксина а (32,37%) в сравнении с контрольной группой (22,96%, х2=8,34, р=0,004, OR=l,61, 95% CI 1,16-2,23) и пациентами с наследственной отягощенностью по СД2 (21,81%, х2=6,68, р=0,01).

S?

я с S н о Е 4* U Я

н о н

я 3"

Контрольная Больные без Больные с группа наследственной наследственной

отягощенности отягощенностью

по СД2 ПО СД2

Рис. 1. Частота генотипа +250GG Lta среди больных СД2 в зависимости от наследственной отягощенности по СД2 и в контрольной группе

С помощью биоинформатических подходов нами выявлены достоверные различия в концентрациях сочетаний аллеля +250А Lta с аллелем +36G TNFR1 и аллелем +1663А TNFR2 между больными сахарным

диабетом 2-го типа без наследственной отягощенности по СД2 (33,81%) и контролем (45,45%). Данное сочетание является протективным фактором формирования сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов без отягощенного семейного анамнеза по СД2 (р=0,0004, рсог=0,03, (Ж=0,47, 95% CI 0,31-0,73). Также, зарегистрированы различия в распространенности сочетаний двух генетических маркеров +250А Lta и -308G TNFa между больными сахарным диабетом 2-го типа без наследственной отягощенности по СД2 (82,73%) и популяционным контролем (91,55%). Эта комбинация полиморфных вариантов генов факторов некроза опухоли также является протективной для формирования сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов без наследственной отягощенности по СД2 (р=0,0004, Рсог=0,04, OR=0,32, 95% CI 0,17-0,61).

Полученные данные свидетельствуют о значимом вкладе комбинаций полиморфных вариантов генов факторов некроза опухоли (-308G/A TNFa, +250A/G Lta, +36A/G TNFR1, +1663A/G TNFR2) в формирование сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов без отягощенного семейного анамнеза по СД2. Согласно литературным данным (Eissner G. et al. 2004; Sasaki M. et al., 2005; Okuse K. et al., 2007; Brian E. C., 2009) факторы некроза опухолей (фактор некроза опухоли а, лимфотоксин а) через свои рецепторы (рецепторы фактора некроза опухоли 1-го и 2-го типов) участвуют в реализации широкого спектра медико-биологических процессов в организме (митогенные факторы в апоптозе адипоцитов, стимуляция секреции лептина и регуляция функции митохондрий, участие в регуляции обмена углеводов и жиров, индукция инсулинорезистентности в жировой ткани и мышцах, подавление секреции инсулина b-клетками островков поджелудочной железы), имеющих важное значение в этиопатогенезе сахарного диабета 2-го типа (Anderson Р.J. et al., 2001; Boden G. et al., 2002; Joseph N.A.et al., 2004; Кондратова H.B. и др., 2005; Галстян Г.Р. и др., 2008; Гумилевский Б. Ю. и др., 2010).

2. Молекулярно-генетические маркеры и клинико-лабораторный статус больных сахарным диабетом 2 типа.

Важными маркерами неблагоприятного течения СД2 являются повышенный уровень гликемии и гликированного гемоглобина, которые служат показателями степени компенсации сахарного диабета и эффективности проводимой терапии (Дедов И.И, и др., 2011).

При изучении ассоциаций генетических полиморфизмов с клинико-лабораторным статусом больных сахарным диабетом 2 типа установлено, что молекулярно-генетический маркер +36A/G TNFR1 ассоциирован с уровнем гликированного гемоглобина у больных СД2. Индивидуумы с генотипом +36АА TNFR1 отличаются повышенным уровнем гликированного гемоглобина (медиана - 8,95%, нижний квартиль - 7,80%, верхний квартиль -10,60 %) по сравнению с больными, имеющими генетические варианты +36AG и +36GG TNFR1 (медиана - 8,50%, интерквартильный размах 7,10-9,6%,р=0,03).

Ассоциации с клинико-лабораторными показателями больных СД2 (уровень гликемии и гликированного гемоглобина) обнаруживает и генетический маркер +250А/С Ыа: пациенты с генетическими вариантами +2 5 ОАО и +250АА и а имеют более высокий уровень гликемии (медиана - 10,50 ммоль/л, нижний квартиль - 8,20 ммоль/л, верхний квартиль - 12,60 ммоль/л) и гликированного гемоглобина (медиана — 8,80%, нижний квартиль - 7,40%, верхний квартиль - 10,30%) по сравнению с пациентами с генотипом +250СС Ыа (медиана - 8,50 ммоль/л, интерквартильный размах - 6,05-11,25 ммоль/л, р=0,01 и медиана - 6,91% , интерквартильный размах - 6,16-8,70%, р=0,001, соответственно)(рис.2).

-250А011 +250АА

-25000

□ М«з'|эп

□ 25%-7ЕЖ М|п-Мах

Рис. 2. Уровень гликемии у больных СД2 в зависимости от генотипов локуса +250А/С Ь1а

Наряду с этим выявлены ассоциации генетических вариантов локуса -308С/А фактора некроза опухоли а с уровнем гликированного гемоглобина, СОЭ, сахара в моче и показателем канальцевой реарбсобции у больных СД2. Так, индивидуумы с генотипами -308СА и -308АА ТЫРа имеют повышенный уровень гликированного гемоглобина (медиана - 8,97%, нижний квартиль - 7,69%, верхний квартиль - 10,90%) и сниженную канальцевую реабсорбцию (медиана - 99,00 мкмоль/л, интерквартильный размах - 98,00-99,00 мкмоль/л) по сравнению с пациентами с генотипом -308СС ТЫРа (медиана -8,50%, интерквартильный размах - 7,10-9,76%, р=0,03, и медиана - 99,00 мкмоль/л, интерквартильный размах -98,80-99,ООмкмоль/л, р=0,02, соответственно) (рис. 3). Также у больных СД2 с генотипами -308СА и -308АА ТЫРа уровень сахара в моче (медиана -1,00 %, нижний квартиль - 0,02 %, верхний квартиль - 2,25%) и уровень СОЭ (медиана - 16,00 мм/час, нижний квартиль - 9,00 мм/час, верхний квартиль -24,00 мм/час) статистически достоверно превышают аналогичные показатели индивидуумов с генотипом -308СС ТИРа (медиана - 1,00 %, интерквартильный размах - 0,00-2,00 %, р=0,03 и медиана - 14,00 мм/час,

интерквартильный размах - 8,00-23,00 мм/час, р=0,006, соответственно). Таким образом, маркерами неблагоприятного клинико-лабораторного статуса больных СД2 являются -308АА и -308GA TNFa. Согласно литературным данным (Dalziel et al., 2002; Fernandez et al., 2003; Pogoda Т. V. et al., 2007; Namkung J. H. et al., 2007; Kirwan et al., 2009; Кондратова Н.П. и др., 2005) генетический вариант -308А TNFa связан с повышенным уровнем продукции фактора некроза опухоли а, который обладает выраженным иммуномодулирующим, цитотоксическим, провоспалительным действием, стимулирует липолиз, индуцирует инсулинорезистентность и апоптоз.

г!

i '8

fe 16 §

2 14 8

1 12 а

g ю

Щ

-30sga и -308аа

-308GG

□ Median

□ 25%-7S% Mirv-Max

Рис. 3. Ассоциации генетических вариантов локуса -308С/А ТНРа с уровнем гликированного гемоглобина у больных СД2

3. Изучение влияния генетических факторов на клинические особенности сахарного диабета 2 типа.

Проведено исследование ассоциации генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов (+250А/0 иа, -308С/А ТЫРа, +36АЮ ТШШ и +1663АЮ ТЫРЯ!) с клиническими характеристиками сахарного диабета 2-го типа. Среди клинических признаков СД2 детально анализировались различные осложнения заболевания (диабетическая ангиопатия нижних конечностей, нефропатия, ретинопатия, синдром диабетической стопы). Развитие и прогрессирование данных осложнений ведет к ранней инвалидизации и гибели пациентов (УатаисЫ Т. е1 а!., 2003; А^Бета М. е1 а1., 2007; Со^шп Б. ^ а1., 2009; Нетт^еп В. е1 а1., 2011; Шестакова М.В. и др., 2001; Якунина Н.Ю. и др., 2007; Дедов И.И. и др., 2011). В исследуемой группе больных СД2 (п=236) у 130 больных (55,08%) отмечалось наличие ангиопатии нижних конечностей, у 49 индивидуумов (20,76%) наблюдался синдром диабетической стопы, диабетическая нефропатия была зарегистрирована у 144 человек (61,01%), ретинопатия - у 171 больных (72,45%) исследуемой группы.

Установлены генетические факторы риска развития ангиопатии нижних конечностей: пациенты СД2 с ангиопатией нижних конечностей имеют наибольшую частоту аллеля -308А Т№а (17,31%) (рис.4) в сравнении с контрольной группой (11,06%, х2=5,77, р=0,02, (Ж=1,68, 95% СІ 1,09-2,59 и пациентами без ангиопатии нижних конечностей (10,38%, р=0,02).

Контрольная группа Больные СД2 с Больные СД2 без

ангнопатией нижних ангиопатии нижних конечностей конечностей

Рис. 4. Ассоциации генетического варианта -308А TNFa с развитием ангиопатии нижних конечностей у больных СД2

Наши результаты соответствуют литературным данным (Dalziel В. et al„ 2002; Namkung J. H. et al., 2007; Kirwan et al., 2009; Кондратова H. В. И др., 2009), свидетельствующим о том, что аллель -308А TNFa является прогностически неблагоприятным фактором течения сахарного диабета 2 типа и развития его осложнений.

Выявлены молекулярно-генетические маркеры, ассоциированные с более благоприятным клиническим течением СД2 (без осложнений). Генетический вариант +250G Lta связан с течением СД2 без нефропатии (OR=l,58, р=0,02) и ангиопатии нижних конечностей (OR=l,58, р=0,01), а генотип +250GG Lta маркирует течение СД2 без ретинопатии (OR=3,80, р=0,01, рсог=0,03), синдрома диабетической стопы (C)R=3,10, р=0,01, Рсог=0,03), ангиопатии нижних конечностей (OR=3,99, р=0,0009, рсог=0,0027) и нефропатии (OR=4,41, р=0,0007, рсог=0,0021).

Важное значение при определении индивидуальной тактики ведения больных СД2, профилактики развития и прогрессирования осложнений имеет своевременное диагносцирование инсулинопотребности и назначение в соответствии с этим эффективного лечения (Pittas A. G. et al., 2004; Wisse В. Е. et al., 2004; Аметов А. С. и др., 2007; Майоров А. Ю. 2009; Дедов И. И. и др., 2011; Hemmingsen В. et al., 2012). В исследуемой группе (п=236) инсулинопотребность наблюдалась у 169 человек (71,61%). На

таблетированной терапии находились 72 человека (30,50%), 64 пациента получали (27,11%) инсулинотерапию, 100 больных были на комбинированной терапии (42,39%). На момент исследования положительный эффект от проводимой терапии имели 71 пациент (30,08%). Выявлено, что у больных СД2 без инсулинопотребности концентрация генотипа +250GG лимфотоксина а составляет 16,42% и в 2-4 раза превышает аналогичные показатели как контрольной группы (4,57%, %2 =10,56, р=0,01, pcor=0,03, OR=4,ll, 95% CI 1,64-10,24) так и пациентов с инсулинопотребностью (7,69%, х2=3,10, р=0,07). Установлено, что у больных СД2 с положительным эффектом от проводимой терапии распространенность генотипа +250GG лимфотоксина а составляет 18,31% и в 3-4 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%, х2=И,42, р=0,0008, pcor=0,0024, OR=4,69, 95% CI 1,95-11,26), так и пациентов без эффекта от терапии (6,67%, ,15, р=0,01, рсог=0,03). В группе пациентов с положительным эффектом от терапии пероральными сахароснижающими препаратами (п=48) (рис.5) частота генотипа +250GG Lía составила 20,84%, тогда как среди больных с отрицательным эффектом от этой терапии (п=24) данный показатель равнялся - 0,00% (/2=4,20, р=0,04), а в контрольной группе он был равен 4,57% (х2=14,95, р=0,0007, рсог=0,0021, OR=5,51, 95% CI 2,10-14,37).

Контрольная группа Больные СД2 с Больные СД2 с

отрицательным положительным

эффектом от терапии эффектом от терапии

Рис. 5. Частота генотипа +250GG Lía среди больных СД2, получавших пероральные сахароснижающие препараты, в зависимости от эффективности лечения

Выводы

1. Генетические полиморфизмы лимфотоксина а (+250А/С Ца), фактора некроза опухоли а (-308С/А ТШа), рецепторов факторов некроза опухоли 1-го ([+36А/С ГАУШ) и 2-го (+1663А/С ТЫРЯ2) типов ассоциированы с

формированием сахарного диабета 2-го типа и его осложнений, клиническими особенностями заболевания, клинико-лабораторным статусом больных.

2. Частота генетического варианта +250GG лимфотоксина а среди больных сахарным диабетом 2-го типа (10,18%) в 2,2 раза выше по сравнению с популяционным контролем (4,57%). У пациентов без наследственной отягощенности концентрации генотипа +250GG Lía (14,39%) и аллеля +250G Lta (32,37%) наибольшие.

3. Сочетание аллелей +250А Lta, +36G TNFR1, +1663А TNFR2 и комбинация генетического варианта +250А Lía совместно с -308G TNFa являются протективными факторами развития сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов без отягощенного семейного анамнеза (OR=0,47 и OR=0,32, соответственно).

4. Развитие ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа ассоциировано с аллелем -308А TNFa (OR=l,68). Течение заболевания с низким уровнем гликемии и гликированного гемоглобина, без инсулинопотребности и осложнений, с положительным эффектом от проводимой терапии маркируется полиморфными вариантами +250GG Lta и +250G Lta.

5. Генетические варианты -308АА и -308GA TNFa ассоциированы с повышенным уровнем сахара в моче, сниженной канальцевой реабсорбцией, высокой скоростью оседания эритроцитов, а генотипы +36АА TNFR1 и -308АА, -308GA TNFa маркируют повышенный уровень гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа.

Практические рекомендации

1. При медико-генетическом консультировании для оценки риска развития сахарного диабета 2 типа следует проводить молекулярно-генетическое тестирование генов факторов некроза опухолей и их рецепторов (+250A/G Lta, -308G/A TNFa, +36A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2) с учетом наследственной отягощенности по СД2.

2. В эндокринологических стационарах при обследовании пациентов с сахарным диабетом 2 типа в качестве маркера повышенного риска развития ангиопатии нижних конечностей рекомендуется использовать генетический вариант -308А TNFa. У больных СД2 в качестве маркеров благоприятного течения заболевания (низкий уровень гликированного гемоглобина, без осложнений и инсулинопотребности) использовать полиморфные варианты +250G Lta и +250GG Lta.

3. При назначении лечения больным СД2 пероральными сахароснижающими препаратами следует учитывать результаты молекулярно-генетического типирования локуса +250A/G лимфотоксина а (генотип +250GG Lta ассоциирован с положительным эффектом от терапии).

Список сокращений

Lta — лимфотоксин a

TNFa — фактор некроза опухоли a

TNFR1 — рецептор фактора некроза опухоли первого типа TNFR2 — рецептор фактора некроза опухоли второго типа СД2 — сахарный диабет 2 типа СОЭ — скорость оседания эритроцитов

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Белоусова, О. Н. Изучение роли генетических факторов в возникновении осложнений сахарного диабета 2 типа / О. Н. Белоусова, М. И. Чурносов // Геронтологический журнал им. В. Ф. Купревича. - 2010. -№ 2. - С. 16-17. - (Геронтологические чтения-2010 : III междунар. науч.-практ. конф., Белгород, 11-12 нояб. 2010 г. / БелГУ).

2. Белоусова, О. Н. Клинико-генетическое исследование сахарного диабета 2 типа / О. Н. Белоусова, М. И. Чурносов // 5 Всероссийский диабетологический конгресс, Москва, 23-26 мая 2010 г. : тез. докл. / Эндокринол. науч. центр, Рос. ассоц. эндокринологов. - М., 2010 - С.68.

3. Белоусова, О. Н. Влияние молекулярно-генетического маркера +1663 A/G TNFR2 на возникновение диабетической полинейропатии при сахарном диабете 2 типа / О. Н. Белоусова, М. И. Чурносов // Современный взгляд на болезни внутренних органов и полиморбидность : материалы междунар. науч.-практ. конф., Белгород, 19-20 мая 2011 г. / НИУ БелГУ ; под ред. О. А. Ефремовой. - Белгород, 2011.-С. 16-17.

4. Белоусова, О. Н. Генетические полиморфизмы факторов некроза опухоли и его рецепторов при сахарном диабете 2 типа / О. Н. Белоусова // Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье : тез. XIV всерос. мед.-биол. конф. молодых исслед. с междунар. участием, Санкт-Петербург, 16 апр. 2011 г. / С.-Петерб. гос. ун-т, Рос. физиол. о-во им. И. П. Павлова [и др.]; гл. ред. П. К. Яблонский. - СПб., 2011. - С. 26.

5. Белоусова, О. Н. Оценка роли генетического полиморфизма -308 A/G TNFa в формировании сахарного диабета 2 типа / О. Н. Белоусова, Ю. Ю. Чурносова // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2011. -№ 1, спец. вып. - С. 85-86.

6. Чурносова, Ю. Ю. Анализ ассоциации сахарного диабета 2 типа с молекулярно-генетическим маркером +1663 A/G TNFR2 / Ю. Ю. Чурносова, О. Н. Белоусова // Вестник Российского государственного медицинского университета- 2011. — № 1, спец. вып. - С. 86-87.

7. Белоусова, О. Н. Распределение молекулярно-генетического маркера лимфотоксина-альфа среди населения Центрального Черноземья / О. Н. Белоусова, М. И. Чурносов // Университетская наука: взгляд в будущее : материалы итог. науч. конф. сотрудников КГМУ, Центр.-Чернозем, науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН, посвящ. 76-летию Курск, гос. мед. ун-та, Курск, 2-3 февр. 2011 г. : [в 3 т.] / Курск, гос. мед. ун-т,

Центр.-Чернозем, науч. центр РАМН, Рос. акад. естеств. наук ; [под ред. В. А. Лазаренко и др.]. - Курск, 2011. - Т. 1. - С. 227-229.

8. Белоусова, О. Н. Степень тяжести сахарного диабета 2 типа и генетический полиморфизм +1663А/в Т№112 / О. Н. Белоусова, М. И. Чурносов // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии : 2 всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 17-19 мая 2010 г. : сб. материалов / КГМУ, адм. Курск, обл., Рос. акад. естеств. наук [и др.] ; [отв. ред. В. П. Иванов]. - Курск, 2011. - С. 36.

9. Белоусова, О. Н. Частота развития диабетической ретинопатии и генетический полиморфизм +1663А/в ЮТ112 при сахарном диабете 2-го типа / О. Н. Белоусова, М. И. Чурносов // Алмазовские чтения 2011 : тез. всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 80-летию со дня рождения академика РАМН В. А. Алмазова, Санкт-Петербург, май 2011. -СПб., 2011.-С. 52.

10. Белоусова, О. Н. Оценка роли наследственных факторов в возникновении сахарного диабета 2 типа / О. Н. Белоусова, М. И. Чурносов // Молодежная наука и современность : материалы 76-й всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых, Курск, 19-20 апр. 2011 г. : в 3-х ч. / Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН ; Курск, гос. мед. ун-т [и др.] ; ред. кол.: В. А. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2011. - Ч. 1. - С. 59.

11. Белоусова, О. Н. Степень тяжести сахарного диабета 2 типа и генетические варианты локуса -308С/А ТЫ Ра / О. Н. Белоусова // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2012. -№ 1, спец. вып. - С. 101.

12. Белоусова, О. Н. Исследование влияния генетических полиморфизмов -308в/А Т№а и +36АЛЗ ТИРШ на развитие вторичной инсупинопотребности у больных сахарным диабетом 2 типа / О. Н. Белоусова // Геронтологический журнал им. В. Ф. Купревича. - 2012.-№1 - 2. - С. 3. -(Геронтологические чтения-2012 : 5 междунар. науч.-практ. конф., Белгород, 6-10 февр. 2012 г.).

13. Белоусова, О. Н. Исследование ассоциаций генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли и их рецепторов с формированием сахарного диабета 2 типа / О. Н. Белоусова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - Серия: Медицина, Фармация. - 2012. - №16 - С.79-85.

14. Белоусова, О. Н. Ассоциации генетических полиморфизмов -308С/А Т№а и +16630/А Т№112 на развитие диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом 2 типа / О. Н. Белоусова // 66-я Итоговая научная конференция молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета / Материалы конференции - Ростов-на-Дону.: ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России, 2012. - С. 198.

Подписано в печать 11.02.2013. Гарнитура Times New Roman Формат 60><84/16.Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 54. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, д.85