Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лактоферрин как полифункциональная гидролаза молока человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Бабина, Светлана Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение и физико-химические свойства лактоферрина.

1.1.1. Строение молекулы лактоферрина.

1.1.2. Связывание ионов железа.

1.1.3. Полимерные формы лактоферрина.

1.1.4. Деление на изоформы.

1.2. Метаболизм лактоферрина.

1.3. Биологические функции лактоферрина.

1.3.1. Транспорт ионов железа.

1.3.2. Антимикробные свойства лактоферрина.

1.3.2.1. Антибактериальная активность.

1.3.2.2. Антивирусная активность.

1.3.2.3. Антигрибковая активность.

1.3.2.4. Антипаразитарная активность.

1.3.3. Регуляция процессов воспаления.

1.3.4. Участие ЛФ в процессах пролиферации и дифференцировки клеток.

1.3.5. Иммуномодулирующие свойства лактоферрина.

1.3.6. Взаимодействие лактоферрина с различными клетками организма.

1.3.7. Связывание лактоферрина раковыми клетками. Противораковое действие.

1.3.8. Взаимодействие лактоферрина с полианионами.

1.3.8.1. Связывание гепарина.

1.3.8.2. Взаимодействие с нуклеиновыми кислотами.

1.3.9. Природа клеточных рецепторов к лактоферрину.

1.3.10. Ферментативные активности лактоферрина.

1.3.10.1. РНК-гидролизующая активность лактоферрина.

1.3.10.2. Предполагаемый механизм гидролиза нуклеиновых кислот.

1.3.10.3. Протеазная активность лактоферрина.

1.3.11. Лактоферрин как ингибитор протеаз.

1.3.12. Лактоферрин как фактор транскрипции.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Получение сорбента анти-ЛФ-сефарозы.

2.2.2. Выделение ЛФ из молока.

2.2.3. Определение концентрации ЛФ.

2.2.4. Получение железонасыщенного лактоферрина.

2.2.5. Электрофоретический анализ белка.

2.2.6. "Кислотный шок" препаратов ЛФ.

2.2.7. Аиализ олигомеризации ЛФ с помощью электрофореза.

2.2.8. Протеолитическое расщепление ЛФ трипсином.

2.2.9. Получение и очистка 5 -[32Р]-меченых олигопуклеотидов.

2.2.10. Очистка пуклеотидов. р 2.2.11. Определение активности ЛФ в реакции гидролиза олигопуклеотидов.

2.2.12. Определение активности ЛФ в реакции гидролиза ДНК фага X и ДНК плазмиды pBR-322.

2.2.13. Определение пуклеотидфосфатазной активности ЛФ.

2.2.14. Определение амилолитической активности ЛФ.

2.2.15. Определение каталитических активностей ЛФ in situ.

2.2.16. Определение кинетических параметров реакции гидролиза.

2.2.17. Измерение спектров кругового дихроизма (КД).

2.2.18. Измерение спектров малоуглового рентгеновского рассеяния.

2.2.19. Измерение светорассеяния.

2.2.20. Спектрофлуориметрическое определение констант диссоциации комплексов ЛФ с нуклеотидами.

2.2.21. Влияние нуклеотидов на связывание и гидролиз ON лактоферрином.

2.2.22. Определение цитотоксичности ЛФ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение изоформ лактоферрина.

3.2. Анализ каталитических активностей ЛФ и его изоформ.

3.2.1. Доказательства принадлежности каталитической активности изоформам ЛФ.

3.2.2. Тестирование активностей ЛФ in situ.

3.2.3. Субстратная специфичность ЛФ.

3.2.3.1. Нуклеазная и ДНК-фосфатазная активности изоформ ЛФ.

3.2.3.2. Нуклеотидфосфатазная активность изоформ ЛФ.

3.2.3.3. Амилолитическая активность изоформ ЛФ.

If 3.2.4. ЛФ - как основная ДНКаза, РНКаза и АТРаза молока человека.

3.2.5. Апоптоз клеток под действием ЛФ.

3.3. Взаимодействие лактоферрина с АТР и другими нуклеотидами.

3.3.1. Изучение взаимодействия ЛФ с нуклеотидами методом флуоресцентного титрования и кругового дихроизма.

3.3.2. Взаимодействие ЛФ с различными нуклеотидами.

3.3.3. Влияние нуклеотидов на комплексообразование ЛФ с ДНК и его ДНК-гидролизующую активность.

3.3.4. Анализ возможной природы нуклеотид-связывающих центров ЛФ.

3.4. Изучение влияния субстратов ЛФ на его олигомерное состояние.

3.4.1. Олигомерные формы ЛФ в растворе.

3.4.2. Изучение олигомерного состояния ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния и светорассеяния.

3.4.3. Изучение олигомерных форм растворов лиофилизованного ЛФ.

3.4.4. Влияние нуклеотидов на олигомеризацию ЛФ.

3.4.5. Определение констант диссоциации комплексов олигомерных форм ЛФ с нуклеотидами методами СР и флуоресцентного титрования.

3.4.6. Влияние олигонуклеотида и олигосахарида на олигомеризацию ЛФ.

3.5. Природа полифункциональности ЛФ.

4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лактоферрин как полифункциональная гидролаза молока человека"

Хорошо известно, что материнское молоко для новорожденного - это не только идеально сбалансированная пища, но и комплексная защита организма, направленная, в первую очередь, на восполнение недостаточности собственного иммунитета ребенка. Наряду с moho-, олиго- и полисахаридами, витаминами и витамино-подобными соединениями, минеральными солями и микроэлементами, молоко содержит различные ферменты, нуклеиновые кислоты и пуклеотиды, гормоны и гормоно-подобные соединения, факторы роста и дифференцировки клеток и, наконец, комплекс так называемых защитных факторов и большое количество жизнеспособных клеток [1—3].

Роль Сахаров, витаминов, гормонов, микроэлементов, минеральных солей, содержащихся в грудном молоке, достаточно очевидна. Казеин, а-лактальбумин, а также moho-, олиго- и полисахариды ответственны за питательную функцию: их расщепление приводит к образованию аминокислот и олигосахаридов, которые, в основном, используются для синтеза новых биополимеров, необходимых растущему организму ребенка [4].

Целый комплекс различных факторов ответственен за защитную роль молока. Однако основу защитной функции составляют белковые компоненты молока. Это белки специфической защиты организма: иммуноглобулины, интерфероны, система комплемента, бифидогенный фактор, ускоряющий рост бифидобактерий и ингибирующий колонизацию кишечника кишечной палочкой [3, 5] и широкий спектр белков, обеспечивающих неспецифическую защиту. Среди них лактоферрин, лизоцим, а-лактальбумин, к-казеин, лактопероксидаза [6-8]. Эти белки обеспечивают бактерицидное, бактериостатическое и антивирусное действие. Показано, что белки как специфической, так и песпецифической защиты обладают устойчивостью к протеазам желудочно-кишечного тракта и могут выполнять защитные функции в нативном и частично разрушенном состоянии.

Ряд ферментов, представленных в молоке, также обладает защитными свойствами. Липазы и пероксидазы проявляют бактерицидное и антивоспалительное действие, ингибиторы протеаз отвечают за целостность белков молока [4, 9]. Кроме того, липазы и амилазы принимают участие в расщеплении жиров и полисахаридов, тем самым способствуя образованию питательных компонентов материнского молока [10]. Последние исследования показали, что иммуноглобулины помимо названных свойств обладают способностью катализировать гидролиз нуклеиновых кислот, нуклеотидов и казеина, а также фосфорилирование белков, полисахаридов и липидов молока [11-16].

Большой вклад в комплекс защитных факторов молока вносит лактоферрин -фактор неспецифической защиты ребенка от вирусов и бактерий. Этот гликопротеид с молекулярной массой около 80 кДа помимо молока широко представлен в различных секреторных жидкостях организма, таких как слюна, слеза, секреты носовых желез. Кроме того, ЛФ обнаружен в плазме крови, однако в значительно меньшей концентрации.

Лактоферрин является едва ли не единственным примером белка с уникальным набором биологических свойств различного характера. Будучи трансферриновым белком, оп не только регулирует концентрацию ионов железа в крови и секретах, но и обладает ярко выраженным антимикробным и антивирусным действием. Лактоферрин считается одним из важнейших иммунных факторов молока. Он участвует в защитных реакциях организма и регулирует функции иммунокомпетентных клеток. Одно из наиболее интересных свойств лактоферрина — это взаимодействие с полианионами: гепарином, ДНК и РНК. Кроме того, лактоферрин проникает в ядра клеток, связывается со специфическими последовательностями ДНК и активирует процессы транскрипции. Строгая видовая и, в то же время, широкая межорганная специфичность лактоферрина говорят о неоднозначности биологической роли белка.

В последние годы показано, что белок гидролизует РНК, у ЛФ обнаружены структурные мотивы, подобные активному центру РНКазы А. Для установления причин исключительной полифункциональности ЛФ, обуславливающих его биологическую роль в организме, необходимо детальное изучение процессов взаимодействия ЛФ с такими жизненно важными молекулами, как ДНК, РНК, нуклеотиды, полисахариды.

Цель данной работы заключалась в анализе связывающих и гидролизующих активностей различных форм лактоферрина, а также в изучении олигомерного состояния белка и его изменения под действием специфических лигандов.

В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи.

• Выделить, исследовать и сравнить различные изоформы ЛФ с индивидуальным набором ферментативных активностей, доказать принадлежность каталитической активности изоформам белка.

• Изучить цитотоксическое действие изоформ ЛФ на иммортализованные эукариотические клетки.

• Исследовать специфичность взаимодействия белка с различными дезокси- и рибонуклеотидами и проанализировать их влияние на функции ЛФ.

• Изучить олигомерное состояние ЛФ и действие специфических лигандов на процессы олигомеризации белковых молекул.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бабина, Светлана Евгеньевна

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что лактоферрин молока человека (ЛФ) обладает амилолитической и неспецифической нуклеотидфосфатазной активностями. Впервые проведено сравнение пяти каталитически активных изоформ электрофоретически гомогенных препаратов ЛФ. Показано, что каждая изоформа ЛФ обладает своим набором ферментативных активностей: ДНКазной, РНКазной, ДНК-, нуклеотидфосфатазной и амилолитической. Доказано, что данные активности являются собственным свойством изоформ ЛФ.

2. Установлено, что изоформы ЛФ различным образом влияют на рост и пролиферацию иммортализованпых клеток мыши и человека. Изоформа ЛФ, проявляющая максимальную ДНК- и РНК-гидролизующие активности, стимулирует апоптоз клеток и обладает наибольшим цитотоксическим эффектом.

3. Показано, что ЛФ взаимодействует с различными рибо- и дезоксирибонуклеозид-5'-моно- ди- и трифосфатами. Белок имеет три центра связывания с различным сродством к нуклеотидам. Связывание нуклеотидов с высоко аффинным центром стимулирует олигомеризацию белка. Взаимодействие со средне аффинным участком, обладающим нуклеотидфосфатазной активностью, активирует связывание ЛФ с ДНК и ее гидролиз. Низко аффинный нуклеотид-связывающий центр является центром узнавания ДНК лактоферрином, который при высоких концентрациях связывает мононуклеотиды.

4. Впервые показано, что ЛФ в растворе образует олигомерные формы, которые могут содержать как минимум несколько десятков мономерных молекул белка. Степень олигомеризации возрастает при увеличении концентрации ЛФ. Показано, что АТР, AMP, d(pT)io и мальтогептоза увеличивают степень олигомеризации ЛФ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Бабина, Светлана Евгеньевна, Новосибирск

1. Mestecky, J., Russell, M.W. Passive and active protection against disorders of the gut (1998) Vet. Quarterly, 20(3), S83-S87.

2. Hanson, L.A. Breastfeeding provides passive and likely long-lasting active immunity (1998) Annal Allerg. Asth. Immunol., 81(6), 523-533.

3. Xanthou, M. Immune protection of human milk( 1998) Biol. Neonate, 74(2), 121-133.

4. Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins (2003) Am. J. Clin. Nutr., 77(6), 1537-1543.

5. Hakansson, A., Zhivotovsky, В., Orrenius, S., Sabharwal, Н., Svanborg, С. Apoptosis induced by a human milk protein (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(17), 8064-8068.

6. Грачев, И.И., Попов, C.M., Скопичев, В.Г. Цитофизиология секреции молока (1976) Ленинград, Наука, 87-199.

7. Aumaitre, A., Seve, В. Nutritional importance of colostrum in the piglet (1978) Ann. Rech. Vet., 9(2), 181-192.

8. Hamosh, M. Protective function of proteins and lipids in human milk (1998) Biol. Neonate, 74(2), 163-176.

9. Hamosh, M. Bioactive factors in human milk (2001) Pediatr. Clin. North. Am., 48(1), 69-86.

10. Канышкова, Т.Г. Нуклеазные активности антител и лактоферрина молока человека (1999) Диссертация на соискание уч. ст. канд. хим. наук, Новосибирск.

11. Семенов, Д.В. Нуклеотид-гидролизующие антитела и лактоферрин молока человека (1998) Диссертация на соискание уч. ст. канд. хим. наук, Новосибирск.

12. Odintsova, E.S., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Casein-hydrolyzing activity of slgA antibodies from human milk. (2005) J. Mol. Recognit., 18(5), 413-21.

13. Kit, Y.Ya., Semenov, D.V., Nevinsky, G.A. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A. (1996) Biochem. Mol. Biol. Int., 39(3), 521527.

14. Karataeva, N.A., Gorbunov, D., Prokudin, I.V., Buneva, V.N., Kulminskaya, A.A., Neustroev, K.N., Nevinsky, G.A. Human milk antibodies with polysaccharide kinase activity. (2006) Immunol. Lett., 103(1), 58-67.

15. Gorbunov, D.V., Karataeva, N.A., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Lipid kinase activity of antibodies from milk of clinically healthy human mothers. (2005) Biochim Biophys Acta, 1735(3), 153-166.

16. Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia. (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331.

17. Levay, P.F., Viljoen, M. Lactoferrin: a general review. (1995) Haematologica., 80(3), 252267.

18. Metz-Boutigue, M.H., Jolles, J., Mazurier, J., Schoentgen, F, Legrand, D., Spik, G., Montreuil, J., and Jolles, P. Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. (1984) Eur. J. Biochem., 145(3), 659-676.

19. Weinberg, E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential. (2001) J. Pharm. Pharmacol. 53(10), 1303-10.

20. Legrand, D., Salmon, V., Coddeville, B., Benaissa, M., Plancke, Y., Spik, G. Structural determination of two N-linked glycans isolated from recombinant human lactoferrin expressed in BHKcells. (1995) FEBS Lett., 365(1), 57-60.

21. Van Berkel, P.H., van Veen, H.A., Geerts, M.E., de Boer, H.A., Nuijens, J.H. Heterogeneity in utilization of N-glycosylation sites Asn624 and Asnl38 in human lactoferrin: a study with glycosylation-site mutants. (1996) Biochem. J., 319(1), 117-122.

22. Moguilevsky, N., Retequi, L., Masson, P. Comprasion on human lactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes. Relative molecular mass, isoelectric point, iron-binding properties and uptake by the liver. (1985) Biochem. J., 229(2), 353-359.

23. Shongwe, M.S., Smith, C.A., Ainscough, E.C., Baker, H.A., Brodie, A.M., Baker, E.N. Anion binding by human lactoferrin: results from crystallographic and physicochemical studies. (1992) Biochem. J., 31(18), 4451-4458.

24. Davidson, L. A., and Lonnerdal, B. Fe-saturation and proteolysis of human lactoferrin: effect on brush-border receptor-mediated uptake of Fe andMn. (1989) 257(6 Pt 1), 930-944.

25. Mazurier J., SpikG. Comparative study of the iron-binding properties of human transferring. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. (1980) Biochim. Biophys. Acta, 629(2), 399-408.

26. Sousa, M., Brock, J.H., Iron in immunity. Cancer and Inflammation. (1989) John Wiley & Sons.

27. Bennett, R.M., Bagby, G.C., Davis, J. Calcium-dependent polymerization of lactoferrin. (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun., 101(1), 88-95.

28. Bagby, G.C.Jr., Bennett, R.M. Feedback regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production. (1982) Blood, 60(1), 108-112.

29. Mantel, C., Miyazawa, K., Broxmeyer, H.E. Physical characteristics and polymerization during iron saturation of lactoferrin, a myelopoietic regulatory molecule with suppressor activity. (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 121-132.

30. Rosenmund, A., Kuyas, C., Haeberli, A. Oxidative radioiodination damage to human lactoferrin. (1986) Biochem. J., 240(1), 239-245.

31. Semenov, D.V., Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds ATP and dissociates into monomers. (1999) Biochem. Mol. Biol. Int., 47(2), 177-84.

32. Furmanski, P., Li, Z.P. Multiple forms of lactoferrin in normal and leukemic human granulocytes. (1990) Exp. Hematol. 18(8), 932-935.

33. Rado, T.A., Bollekens, J., Laurent, G., Parker, L., Benz, E.J. Lactoferrin biosinthesis during granulocytopoiesis. (1984) Blood, 64(5), 1103-1109.

34. Maneva, A.I., Sirakov, L.M., Manev, V.V. Lactoferrin binding to neutrophilic polymorphonuclear leucocytes. (1983) Int. J. Biochem., 15(7), 981-984.

35. Kijlstra, A., Jeurissen, S.H., Koning, K.M. Lactoferrin levels in normal human tears. (1983) Br. J. Ophthalmol. 67(3), 199-202.

36. Rey, M.W., Woloshuk, S.L., deBoer, H.A., Pieper, F.R. Complete nucleotide sequence of human mammary gland lactoferrin. (1990) Nucleic Acids Res. 18(17), 5288.

37. Saito, K., Nakanuma, Y. Lactoferrin and lysozyme in the intrahepatic bile duct of normal livers and hepatolihiasis. An immunnohistochemical study. (1992) J. Hepathol. 15(1-2), 147-53.

38. Brock, J.H. The physiology of lactoferrin. (2002) Biochem. Cell. Biol., 80(1), 1-6.

39. Derisbourg, P., Wieruszeski, J.M., Montereuil., Spik. G. Primary structure of glycans isolated from human leucocyte lactotransferrin. Absence of fucose residues questions the proposed mechanism ofhyposideraemia. (1990) Biochem. J., 269(3), 821-825.

40. McAbee, D.D. Isolated rat hepatocytes acquire iron from lactoferrin by endocytosis. (1995) Biochem. J., 311(2), 603-609.

41. Cox, T., Mazurier, J., Spic, J. Montreuil J, Peters TJ. Iron binding proteins and in/lux of iron across the duodenal brush border. Evidence for specific lactotransferrin receptors in the human intestine. (1979) Biochim. Biophys. Acta, 588(1), 120-128.

42. Farnaud, S., Evans, R.W. Lactoferrin—a multifunctional protein with antimicrobial properties. (2003) Mol. Immunol. 40(7), 395-405.

43. Arnold, R.R., Brewer, M., and Gauthier, J.J. Bactericidal activity of human lactoferrin: sensitivity of a variety of microorganisms. (1980) Infec. Immun., 28(3), 893-898.

44. Ellison, R. T., Giehl, T.J.and Laforce, F M. Damage of the outer membrane of enteric gramnegative bacteria by lactoferrin and transferrin (1988) Infect. Immun., 56(11), 2774-2781.

45. Arnold, R.R., Russell, J.E„ Champion, W.J., Brewer, M., Gauthier, J.J. Bactericidal activity of human lactoferrin: differentiation from the stasis of iron deprivation. (1982) Infect. Immun. 35(3), 792-799.

46. Yu, R.H., Schryvers, A.B. Bacterial lactoferrin receptors: insights from characterizing the Moraxella bovis receptors. (2002) Biochem. Cell Biol., 80(1), 81-90.

47. Ward, P.P., Uribe-Luna, S., Conneely, O.M. Lactoferrin and host defense. (2002) Biochem. Cell Biol., 80(1), 95-102.

48. Gutteridge, J.M., Paterson, S.K., Segal, A.W., Halliwell, B. Inhibition of lipid peroxidation by the iron-binding protein lactoferrin. (1981) Biochem. J., 199(1), 259-261.

49. Winterbourn, C.C. Lactoferrin-catalysed hydroxyl radical production. Additional requirement for a chelating agent. (1983) Biochem. J., 210(1), 15-19.

50. Baldwin, D.A., Jenny, E.R., Aisen, P. The effect of human serum transferrin and milk lactoferrin on hydroxyl radical formation from superoxide and hydrogen peroxide. (1984) J. Biol. Chem., 259(21), 13391-13394.

51. Valenti, P., Greco, R., Pitari, G., Rossi, P., Ajello, M., Melino, G., Antonini, G. Apoptosis of Caco-2 intestinal cells invaded by Listeria monocytogenes: protective effect of lactoferrin. (1999) Exp. Cell. Res., 250(1), 197-202.

52. Arnold, R.R., Cole, M.F., McGhee, J.R. A bactericidal effect for human lactoferrin. (1977) Science, 197(4300), 263-265.

53. Tomita, M., Takase, M., Wakabayashi, H., Bellamy, W. Antimicrobial peptides oflactoferrin. (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 209-218.

54. Odell, E.W., Sarra, R., Foxworthy, M., Chappie, D.S., Evans, R.W. Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human lactoferrin. (1996) FEBS Lett., 382(1-2), 175178.

55. Sojar, H.T., Hamada, N., Genco, R.J. Structures involved in the interaction of Porphyromonas gingivalis fimbriae and human lactoferrin. (1998) FEBS Lett., 422(2), 205-208.

56. Baveye, S., Elass, E., Mazurier, J., Spik, G. and Legrand, D. Lactoferrin: a multifunctional glicoprotein involved in the modulation of the inflammatory process. (1999) Clin. Chem. Lab. Med., 37(3), 281-286.

57. Fujihara, T., Hayashi, K. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type-1 (HSV-1) infection to mouse cornea. (1995) Arch.Virol., 140(8), 1469-1472.

58. Giansanti, F., Rossi, P., Massucci, M.T., Botti, D., Antonini, G., Valenti, P., Seganti, L. Antiviral activity of ovotransferrin discloses an evolutionary strategy for the defensive activities oflactoferrin. (2002) Biochem. Cell Biol., 80(1), 125-130.

59. Yi, M., Kaneko, S., Yu, D.Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin (1997) J. Virol., 71(8), 5997-6002.

60. Nozaki, A., Ikeda, M., Naganuma, A., Nakamura, T., Inudoh, M., Tanaka, K., Kato, N. Identification of a lactoferrin-derived peptide possessing binding activity to hepatitis C virus E2 envelope protein. (2003) J. Biol. Chem., 278(12), 10162-10173.

61. Arnold, D., Di Biase, A.M., Marchetti, M., Pietrantoni, A., Valenti, P., Seganti, L., Superti, F. Antiadenovirus activity of milk proteins: lactoferrin prevents viral infection. (2002) Antiviral Res., 53(2), 153-158.

62. Mann, D.M., Romm, E., Migliorini, M. Deleniation of the glycosaminoglican-binding site in the human inflamatory response protein lactoferrin (1994) J. Biol. Chem., 269(38), 2366123667.

63. Lin, T.Y., Chu, C., Chiu, C.H. Lactoferrin inhibits enterovirus 71 infection of human embryonal rhabdomyosarcoma cells in vitro. (2002) J. Infect. Dis. 186(8), 1161-1164.

64. Wakabayashi, H., Uchida, K., Yamauchi, K., Teraguchi, S., Hayasawa, H., Yamaguchi, H. Lactoferrin given in food facilitates dermatophytosis cure in guinea pig models. (2000) J. Antimicrob. Chemother., 46(4), 595-602.

65. Okamoto, T., Tanida, T., Wei, B., Ueta, E., Yamamoto, T., Osaki, T. Regulation of fungal infection by a combination of amphotericin B and peptide 2, a lactoferrin peptide that activates neutrophils. (2004) Clin. Diagn. Lab. Immunol., 11(6), 1111-1119.

66. Takakura, N., Wakabayashi, H., Ishibashi, H., Teraguchi, S., Tamura, Y., Yamaguchi, H., Abe, S. Oral lactoferrin treatment of experimental oral candidiasis in mice. (2003) Antimicrob. Agents Chemother., 47(8), 2619-2623.

67. Masci, J.R. Complete response of severe, refractory oral candidiasis to mouthwash containing lactoferrin and lysozyme. (2000) AIDS, 14(15), 2403-2404.

68. Kuipers, M.E., de Vries, H.G., Eikelboom, M.C., Meijer, D.K., Swart, P.J. Synergistic fungistatic effects of lactoferrin in combination with antifungal drugs against clinical Candida isolates. (1999) Antimicrob. Agents Chemother., 43(11), 2635-2641.

69. Cirioni, O., Giacometti, A., Barchiesi, F., Scalise, G. Inhibition of growth of Pneumocystis carinii by lactoferrins alone and in combination with pyrimethamine, clarithromycin and minocycline. (2000) J. Antimicrob. Chemother., 46(4), 577-582.

70. Turchany, J.M., Aley, S.B., Gillin, F.D. Giardicidal activity of lactoferrin and N-terminal peptides. (1995) Infect. Immun., 63(11), 4550-4552.

71. Machnicki, M., Zimecki, M., Zagulski, T. Lactoferrin regulates the release of tumour necrosis factor alpha and interleukin 6 in vivo. (1993) Int. J. Exp. Pathol., 74(5), 433-439.

72. Zagulski, T., Lipinski, P., Zagulska, A., Jarzabek, Z. Antibacterial system generated by lactoferrin in mice in vivo is primarily a killing system. (1998) Int. J. Exp. Pathol., 79(2), 117123.

73. Baveye, S., Elass, E., Mazurier, J., Legrand, D. Lactoferrin inhibits the binding of lipopolysaccharides to L-selectin and subsequent production of reactive oxygen species by neutrophils. (2000) FEBS Lett., 469(1), 5-8.

74. Britigan, B.E., Serody, J.S., Cohen, M.S. The role of lactoferrin as an anti-inflammatory molecule. (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 143-156.

75. Boxer, L.A., Haak, R.A., Yang, H.H., Wolach, J.B., Whitcomb, J.A., Butterick, C.J., et al. Membrane-bound lactoferrin alters the surface properties of polimorfnonuclear leukocytes. (1982) J. Clin. Invest., 70(5), 1049-1057.

76. Kurose, I., Yamada, T., Wolf, R., Granger, D.N. P-selectin-dependet leukocyte recruitment and intestinal mucosal injury induced by lactoferrin. (1994) J. Leukoc. Biol., 55(6), 771-717.

77. Bagby, G.C.Jr. Regulation of granulopoiesis: the lactoferrin controversy. (1989) Blood Cells, 15(2), 386-399.

78. Galbraith, P.R. Effects of lactoferrin on human granulopoiesis in vitro. (1986) Clin. Invest. Med., 9(1), 1-5. ■

79. Conneely, O.M.J. Antiinflammatory activities of lactoferrin. (2001) Am. Coll. Nutr., 20(5), 389-395.

80. Damiens, E., Mazurier, J., el Yazidi, I., Masson, M., Duthille, I., Spik, G., Boilly-Marer, Y. Effects of human lactoferrin on NK cell cytotoxicity against haematopoietic and epithelial tumour cells. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1402(3), 277-287.

81. Kijlstra, A. The role of lactoferrin in the nonspecific immune response on the ocular surface. (1990) Reg. Immunol., 3(4), 193-197.

82. Garre, C., Bianchi-Scarra, G., Sirito, M., Musso, M., Ravazzolo, R. Lactoferrin binding sites and nuclear localization in K562(S) cells. (1992) J. Cell. Physiol., 153(3), 477-482.

83. Adamik, B., Zimecki, M., Wlaszczyk, A., Berezowicz, P., Kubler, A. Lactoferrin effects on the in Vitro immune response in critically ill patients. (1998) Arch. Immunol. Ther. Exp., 46(3), 169-176.

84. Zhang, W., Lachmann, P.J. Neutrophil lactoferrin release induced by IgA immune complexes can be mediated either by Fc alpha receptors or by complement receptors through different pathways. (1996) J. Immunol., 156(7), 2599-2606.

85. Kievits, F., Kijlstra, A. Inhibition of C3 deposition on solid-phase bound immune complexes by lactoferrin. (1985) Immunology. 54(3), 449-459.

86. Nishiya, K., Horwitz, D.A. Contrasting effects of lactoferrin on human lymphocyte and monocyte natural killer activity and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. (1982) J. Immunol., 129(6), 2519-2523.

87. Audrain, M.A., Gourbil, A., Muller, J.Y., Esnault, L.M. Anti-lactoferrin autoantibodies: relation between epitopes and iron-binding domain. (1996) J. Autoimmun., 9(4), 569-574.

88. McAbee, D.D., Esbensen, K. Binding and endocytosis of apo- and holo-lactoj'errin by isolated rat hepatocytes. (1991) J. Biol. Chem., 266(35), 23624-23631.

89. Rejman, J. J., Turner, J.D., Oliver, S.P. Characterization of lactoferrin binding to the MAC-T bovine mammary epithelial cell line using a biotin-avidin technique. (1994) Int. J. Biochem., 26(2), 201-206.

90. Bennett, R.M., Davis, J. Lactoferrin binding to human peripheral blood cells: an interaction with a B-enriched population of lymphocytes and a subpopulation of adherent mononuclear cells. (1981) J. Immunol., 127(3), 1211-1216.

91. Kawasaki, Y., Sato, K., Dosako, S. Role of basic residues of human lactoferrin in the interaction with D lymphocytes. (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(2), 314-318.

92. Rochard, E., Legrand, D., Mazurier, J., Montreuil, J., Spik, G. The N-terminal domain I of human lactotransferrin binds specifically to phytohemagglutinin-stimulated peripheral blood human lymphocyte receptors. (1989) FEBS Lett., 255(1), 201-204.

93. Yamada, B.Y., Amagasaki, T., Jaeobsen, D.W., Green, R. Lactoferrin binding by leukemia cell lines. (1987) Blood, 70(1), 264-270.

94. Tsuda, H., Sekine, K., Fujita, K., Ligo, M. Cancer prevention by bovine lactoferrin and underlying mechanisms—a review of experimental and clinical studies. (2002) Biochem. Cell Biol., 80(1), 131-136.

95. Sakai, T., Banno, Y., Kato, Y., Nozawa, Y., Kawaguchi, M. Pepsin-digested bovine lactoferrin induces apoptotic cell death with JNK/SAPK activation in oral cancer cells. (2005) J. Pharmacol. Sci., 98(1), 41-48.

96. Yang, N., Stensen, W., Svendsen, J.S., Rekdal, O. Enhanced antitumor activity and selectivity of lactoferrin-derivedpeptides. (2002) J. Pept. Res., 60(4), 187-197.

97. Bi, B.Y., Liu, J.L., Legrand, D., Roche, A.C., Capron, M., Spik, G., Mazurier, J. Internalization of human lactoferrin by the Jurkat human lymphoblastic T-cell line. (1996) Eur. J. Cell. Biol., 69(3), 288-296.

98. Kuwata, H., Yip, T.T., Yamauchi, K., Teraguchi, S., Hayasawa, H., Tomita, M., Hutchens, T.W. The survival of ingested lactoferrin in the gastrointestinal tract of adult mice. (1998) Biochem. J., 334(2), 321-323.

99. Bennett, R.M., Davis, J. Lactoferrin interacts with deoxyribonucleic acid: a preferential reactivity with double-stranded DNA and dissociation of DNA-anti-DNA complexes. (1982) J.Lab. Clin. Med., 99(1), 127-138.

100. He, J., Furmanski, P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. (1995) Nature, 373(6516), 721-724.

101. Kanyshkova, T.G., Semenov, D.V., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. (1999) FEBS Lett., 451(3), 235-237.

102. Bennett, R.M., Davis, J., Campbell, S., Portnoff, S. Lactoferrin binds to cell membrane DNA. Association of surface DNA with an enriched population of B cells and monocytes. (1983) J.Clin. Invest., 71(1), 611-618.

103. Hekman, A. Association of lactoferrin with other proteins, as demonstrated by changes in electrophoretic mobility. (1971) Biochim. Biophys. Acta, 251(3), 380-387.

104. Malmquist, J., Johansson, B.G. Interaction of lactoferrin with agar gels and with Trypan Blue. (1971) Biochim. Biophys. Acta, 236(1), 38-44.

105. Devi, A.S., Das, M.R., Pandit, M.W. Lactoferrin contains structural motifs of ribonuclease. (1994) Biochim. Biophys. Acta, 1205(2), 275-281.

106. Ramaswamy, H., Swamy, C.V., Das, M.R. Purification and characterization of a high molecular weight ribonuclease from human milk. (1993) J. Biol. Chem., 268(6), 4181-4187.

107. McCormick, J. J., Larson, L.J., Rich, M.A. RNase inhibition of reverse transcriptase activity in human milk. (1974) Nature, 251(5577), 737-740.

108. Das, M.R., Padhy, L.C., Koshy, R., Sirsat, S.M., Rich, M.A. Human milk samples from different ethnic groups contain RNase that inhibits, and plasma membrane that stimulates, reverse transcription. (1976) Nature, 262(5571), 802-805.

109. Zhao, X.Y., Hutchens, T.W. Proposed mechanisms for the involvement of lactoferrin in the hydrolysis of nucleic acids. (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 271-278.

110. Plaut, G., Qiu, J., St Geme, J.W.3rd. Human lactoferrin proteolytic activity: analysis of the cleaved region in the IgA protease of Haemophilus influenzae. (2000) Vaccine, 19(1), 148-152.

111. Paetzel, M., Strynadka, N.C. Common protein architecture and binding sites in proteases utilizing a Ser/Lys dyad mechanism. (1999) Protein Sci., 8(11), 2533-2536.

112. Qiu, J., Hendrixson, D.R., Baker, E.N., Murphy, T.F., St Geme, J.W.3rd., Plaut, A.G. Human milk lactoferrin inactivates two putative colonization factors expressed by Haemophilus influenzae. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(21), 12641-12646.

113. Ohashi, A., Murata, E., Yamamoto, K., Majima, E., Sano, E„ Le, Q.T., Katunuma, N. New functions of lactoferrin and beta-casein in mammalian milk as cysteine protease inhibitors. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun., 306(1), 98-103.

114. Grzonka, Z., Jankowska, E., Kasprzykowski, F., Kasprzykowska, R., Lankiewicz, L., Wiczk, W., Wieczerzak, E., Ciarkowski, J., Drabik, P., Janowski, R., Kozak, M., Jaskolski, M.,

115. Fleet, J.C. A new role for lactoferrin: DNA binding and transcription activation (1995) Nutr. Rev., 53(8), 226-227.

116. Baeuerle, P.A. Transcriptional activators. Enter a polypeptide messenger (1995) Nature, 373(6516), 661-662.

117. Sudar, F., Csaba, G., Robenek, H. Studies on internalization and intracellular localization of membrane DNA in mouse peritoneal macrophages, by means oflactoferrin-gold complex. (1986) Acta Histochem., 80(1), 13-18.

118. Son, K.N., Park, J., Chung, C.K., Chung, D.K„ Yu, D.Y., Lee, K.K., Kim, J. Human lactoferrin activates transcription of IL-lbeta gene in mammalian cells. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun., 290(1), 236-241.

119. Зарытова В. Ф., Иванова Е. М., Романенко В. П. Синтез олигонуклеотидов в хлороформе триэфирным методом. (1985) Биоорг. химия, 11(6), 815-820.

120. Мудраковская А. В., Ямковой В. И. Препаративное получение гомоолигорибонуклеотидов, терминированных 5 '-фосфатом (1990) Ферменты микроорганизмов и деградация биополимеров, Москва, ВНИИСЭТИ, 199-206.

121. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Nucleic Acides (1975) v. 1, New York, CRC Press, 589.

122. Layne, E. Spectrophotometric and turbodimetric methods for measuring proteins. (1957) Methods Enzymol., 3,447-454.

123. Mazurier, J., Spik, G. Comparative study of the iron-binding properties of human transferrins. I. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. (1980) Biochim. Biophys. Acta, 629(2), 399-408.

124. Laemmli, U.K Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. (1970) Nature, 227(5259), 680-685.

125. Merril, C.R., Goldman, D., van Keuren, M.L. Gel protein stains: silver stain. (1984) Methods Enzymol., 104, 441-447.

126. Suelter, C.H. A particial guide to enzymology (1985) Biochemistry: A series of monographs, 164-166.

127. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование (1984) Москва, Мир, 132.

128. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джойс К., Справочник биохимика. (1991) Москва, Мир.

129. Savel'ev, A.N., Kanyshkova, T.G., Kulminskaya, A.A., Buneva, V.N., Eneyskaya, E.V., Filatov, M.V., Nevinsky, G.A., Neustroev, K.N. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk. (2001) Clin. Chim. Acta, 314(1-2), 141-152.

130. Rosenthal, A.L., Lacks, S.A. Nuclease detection in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. (1977) Anal. Biochem., 80(1), 76-90.

131. Келети Т. Основы ферментативной кинетики (1990) Москва, Мир, 131-135.

132. Свергуп Д.И., Фейгин J1.A. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. (1986) Москва, Наука, 50-279.

133. Гилл Ф., Мюррей У., Райт М. Практическая оптимизация. (1985) Москва, Мир, 509.

134. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов (1980) Москва, Мир, 191-210.

135. Буравлев В. М., Вепринцев Б. Н. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы, техника, проблемы. (1976) Москва, Мир, 352.

136. Watanabe, Т., Nagura, Н., Watanabe, К., Brown, W.R. The binding of human milk lactoferrin to immunoglobulin A. (1984) FEBS Lett., 168(2), 203-207.

137. Buneva, V.N., Kanyshkova, T.G., Vlassov, A.V., Semenov, D.V., Khlimankov, D.Yu., Breusova, L.R., Nevinsky, G.A. Catalytic DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers. (1998) Appl. Biochem. Biotechnol., 75(1), 63-76.

138. Kanyshkova, T.G., Semenov, D.V., Khlimankov, D.Yu., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers. (1997) FEBS Lett., 416(1), 23-26.

139. Невинский, Г.А., Канышкова, Т.Г., Бунева, B.H. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии (обзор). (2000) Биохимия, 65(11), 1473-1487.

140. Невинский, Г.А., Семенов, Д.В., Бунева, В.Н. Каталитически активные антитела (абзимы), индуцированные химически стабильными аналогами переходных состояний (обзор). (2000) Биохимия, 65(11), 1459-1472.

141. Bernardi, G. Spleen acid deoxyribonuclease. (1971) The Enzymes (Ed. Boyer, P.D.), New York, Academic Press, 271-287.

142. Zhang, Z.Y. Mechanistic studies on protein tyrosine phosphatases. (2003) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 73, 171-220

143. Ramponi, G., Stefani, M. Structure and function of the low Mr phosphotyrosine protein phosphatases. (1997) Biochim. Biophys. Acta, 1341(2), 137-156.

144. Hunsucker, S.A., Spychala, J., Mitchell, B.S Human cytosolic 5'-nucleotidase I: characterization and role in nucleoside analog resistance. (2001) J. Biol. Chem., 276(13), 1049810504.

145. Hoglund, L., Reichard, P.J. Cytoplasmic 5'(3')-nucleotidase from human placenta. (1990) Biol. Chem., 265(12), 6589-6595.

146. Hayman, A.R., Warburton, M.J., Pringle, J.A., Coles, В., Chambers, T.J. Purification and characterization of a tartrate-resistant acid phosphatase from human osteoclastomas. (1989) Biochem. J., 261(2), 601-609.

147. Lohman, T.M. Kinetics of protein-nucleic acid interactions: use of salt effects to probe mechanisms of interaction. (1986) CRC Crit. Rev. Biochem., 19(3), 191-245.

148. Yuan, R. Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases. (1981) Annu. Rev. Biochem., 50,285-319.

149. Svensson, B. Protein engineering in the alpha-amylase family: catalytic mechanism, substrate specificity and stability. (1994) Plant. Mol. Biol., 25(2), 141-157

150. Savel'ev, A.N., Kanyshkova, T.G., Kulminskaya, A.A., Buneva, V.N., Eneyskaya, E.V., Filatov, M.V., Nevinsky, G.A., Neustroev, K.N. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk. (2001) Clin. Chim. Acta., 314(1-2), 141-152.

151. Marshall, J.J., Miwa, I. Kinetic difference between hydrolyses of gamma-cyclodextrin by human salivary and pancreatic alpha-amylases. (1981) Biochim. Biophys. Acta., 661(1), 142147.

152. Nevinsky, G.A., Kanyshkova, T.G., Semenov, D.V., Vlassov, A.V., Gal'vita, A.V., Buneva, V.N. Secretory immunoglobulin A from healthy human mothers' milk catalyzes nucleic acid hydrolysis. (2000) Appl. Biochem. Biotechnol., 83(1-3), 115-129.

153. Glukhov, B.N., Jerusalimsky, A.P., Canter, V.M., Salganik, R.I. Ribonuclease treatment of tick-borne encephalitis. (1976) Arch. Neurol., 33(9), 598-603.

154. Gudding, R. DNases in milk and blood sera from different species. (1979) Acta. Vet. Scand., 20(3), 404-416.

155. Dalaly, В. K., Eitenmiller, R. R., Friend, B. A. and Shahani, К. M. Human milk ribonuclease (1980) Biochim. Biophys. Acta., 615(2), 381-391.

156. Vlassov, A, Florentz, C, Helm, M, Naumov, V, Buneva, V, Nevinsky, G, Giege, R., Characterization and selectivity of catalytic antibodies from human serum with RNase activity (1998) Nucleic Acids Res., 26(23), 5243-5250.

157. Семенов Д.В., Канышкова Т.Г., Кит Ю.А., Хлиманков Д.Ю., Акимжанов A.M., Горбунов Д.А., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса G человека гидролизуют пуклеотиды (1998) Биохимия, 63(8), 1097-1106.

158. Hakansson, A., Zhivotovsky, В., Orrenius, S., Sabharwal, Н., Svanborg, С. Apoptosis induced by a human milk protein. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92(17), 8064-8068.

159. Schwartz, L.M., & Osborne, B.A. Programmed cell death, apoptosis and killer genes. (1993) Immunol. Today, 14(12), 582-590.

160. Wyllie, A.H. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. (1980) Nature, 284(5756), 555-556.

161. Hardonk, M.J., Koudstaal, J. Enzyme histochemistry as a link between biochemistry and morphology. (1976) Prog. Histochem. Cytochem. 8(2), 1-68.

162. Невинский, Г.А. Роль слабых специфических и неспецифических взаимодействий в узнавании и превращении ферментами протяженных ДНК. (2004) Молекулярн. биология, 38(5), 756-785.

163. Tuzikov, F.V., Zinoviev, V.V., Vavilin, V.I., Malygin, E.G. Small-angle X-ray scattering study of enzyme-substrate interaction in solution. (1988) Studia Biophisica, 125, 169-172.

164. Tuzikov, F.V., Zinoviev, V.V., Vavilin, V.I., Malygin, E.G. Application of the Small-Angle X-ray Scattering technique for the study of two-step equilibrium enzyme-substrate interactions. (1996) Biopolymers, 38(2), 131-139.

165. Anderson, B.F., Baker, H.M., Norris, G.E., Rice, D.W., Baker, E.N. Structure of human lactoferrin: crystallographic structure analysis and refinement at 2.8 A resolution. (1989) J. Mol. Biol., 209(4), 711-734.