Получение биологически активных продуктов белковой природы при комплексной переработке молочной сыворотки

Рытченкова, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение биологически активных продуктов белковой природы при комплексной переработке молочной сыворотки
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение биологически активных продуктов белковой природы при комплексной переработке молочной сыворотки"

На правах рукописи

005007953

Рытченкова Ольга Владимировна

Получение биологически активных продуктов белковой природы при комплексной переработке молочной сыворотки

Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

1 9 ЯНВ 2012

Москва - 2012

005007953

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева

Научный руководитель:

Доктор химических наук, доцент Красноштанова Алла Альбертовна

Официальные оппоненты:

Доктор технических наук, профессор Семеннхнна Вера Фнлатовна

Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности

Кандидат технических наук, доцент Гучок Жанна Леонидовна Московский государственный университет пищевых производств

Ведущая организация:

Северо-Кавказский государственный технический университет

Защита состоится «14» февраля 2012 г. в 12 ч. 30 мин, на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д. И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9, в аудитории 433 (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан « января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ^^

ДМ 212.204.13 / ШакирИ.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В современных экономических условиях возрастает роль технологий, ориентированных на использование или переработку вторичного сырья различного происхождения. Такой подход обусловлен необходимостью решения экологических проблем и повышения экономических показателей основного производства за счет утилизации отходов и получения дополнительной конкурентоспособной продукции.

Одним из крупнотоннажных отходов пищевых производств является молочная сыворотка, образующаяся при переработке молока в белково-жировые продукты (сыр, творог, казеин). Ежегодно в мире образуется более 130 млн тонн молочной сыворотки, из них около 2 млн тонн приходится на долю России. Эколого-экономические расчеты показывают, что 1 тонна молочной сыворотки может нанести такой же экологический ущерб, как 100 м3 хозяйственно-бытовых стоков при совокупных затратах на ее переработку 0,5-1,2 млн рублей [Зобкова З.С., 2007].

В России перерабатывается менее 50 % молочной сыворотки, поэтому проблема ее рационального использования стоит особо остро. Использование нативной молочной сыворотки в натуральном виде ограничено сроками ее хранения. Наиболее простой способ переработки молочной сыворотки - сушка - приводит к образованию продукта, не сбалансированного по основным питательным веществам, обладающего низкими органолептичсскими показателями. Более перспективным подходом является фракционирование молочной сыворотки с получением подсырных сливок, концентратов сывороточных белков, молочного сахара. Однако такие технологии, как правило, направлены на частичную переработку вторичного молочного сырья. В последние годы наибольший интерес вызывает глубокая переработка молочной сыворотки, предусматривающая извлечение из нее индивидуальных компонентов и получение их производных. Такие продукты могут найти более широкое применение в пищевой, медицинской и фармацевтической промышленности [Храмцов А.Г., 2003].

Наиболее ценными компонентами молочной сыворотки являются иммуноглобулины, лактоферрин и лактопероксидаза, хотя и присутствующие в небольших количествах, но обладающие защитной, антимикробной, антиоксидантной, иммуномо-дуляторной и регуляторной функциями. Данные соединения могут быть использованы в качестве основы для получения лечебно-профилактических продуктов [Ильина A.M., 2009]. В наибольшем количестве в молочной сыворотке содержатся (?-лактоглобулин и а-лактоальбумин, содержащие оптимально сбалансированный набор аминокислот. Благодаря высокой биологической ценности данные белки могут быть использованы д.чя производства продуктов детского и диетического питания [Токаев Э.С., 2007].

Таким образом, целесообразной является разработка технологии комплексной переработки молочной сыворотки, направленная на выделение высокоценных белковых компонентов и получение сопутствующих продуктов, обладающих важными биологическими функциями.

Цель н задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологии получения биологически активных продуктов белковой природы (лакто-пероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов, белкового гидролизата, р-галактозидазы) при комплексной переработке молочной сыворотки.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- определить основные физико-химические характеристики образцов молочной сыворотки, полученные при использовании различных технологий переработки молока;

- выбрать оптимальную схему фракционирования молочной сыворотки, позволяющую получить отдельные белковые фракции;

- подобрать оптимальные условия выделения лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулинов из фракций, обогащенных вышеперечисленными белковыми компонентами;

- подобрать оптимальные условия получения белкового гидролизата из фракции, обогащенной главными сывороточными белками ф-лактоглобулином и а-лактоальбумином);

- исследовать ростовые характеристики дрожжей рода КШууеготусея -продуцентов Р-галактозидазы при культивировании на питательных средах, содержащих депротеинизированную молочную сыворотку;

- разработать режимы получения ферментного препарата р-галактозидазы из на-тивной биомассы дрожжей Klu.yverom.yces тапиапиз\

- провести технико-экономические и эколого-экономические расчеты эффективности разработанной технологии.

Научная новизна.

Показано, что в рамках одной технологической схемы комплексной переработки молочной сыворотки возможно получение биологически активных продуктов белковой природы: лактоферрина, лактопероксидазы, иммуноглобулинов, белкового гидролизата, Р-галактозидазы.

Подтверждена возможность использования карбоксиметилцеллюлозы в качестве сорбента для выделения лактоферрина и лактопероксидазы из молочной сыворотки.

Экспериментально подобраны и научно обоснованы оптимальные условия ферментативного гидролиза фракции, обогащенной главными сывороточными белками (р-лакгоглобулииом и а-лактоальбумином), обеспечивающие степень гидролиза не менее 98 %.

Подтверждена возможность использования депротеинизированной молочной сыворотки и образующихся в предлагаемой технологии солевых стоков в качестве основы для приготовления питательной среды для культивирования дрожжей рода К1иу\'еготусе.ч - продуцентов Р-галактозидазы. Практическая значимость.

Разработана комплексная малоотходная технология переработки молочной сыворотки с получением биологически активных продуктов белковой природы (лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов, белкового щцролизата, Р-галактозидазы). Предлагаемая технология включает стадии ультраконцентрирования с использованием полупроницаемых мембран, ионообменную хроматографию на сорбенте карбоксиме-тилцеллюлозе, высаливание сульфатом аммония, ферментативный гидролиз, культивирование, дезинтеграцию клеток дрожжевой биомассы, осаждение в изоэлектрической точке. Разработаны способы очистки полученных белковых продуктов.

На основании полученных экспериментальных данных разработан лабораторный регламент и основные исходные данные для проектирования опытной установки комплексной переработки молочной сыворотки при расчетной мощности производства 30 ООО тонн/год по перерабатываемому сырью. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка эффективности реализации предлагаемой технологии.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на международной научно-практической конференции в рамках повышения квалификации «Технология молочных и молокосодержащих продуктов» (Ставрополь, 2008); Международных конференциях молодых ученых «Успехи в химии и химической технологии» (Москва, 2008, 2009, 2011); 6-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, 2009); V и VI Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011); 3-ей конференции молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях (Москва, 2009); Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичников с кие чтения» (Казань, 2009); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов» (Москва, 2011); Научно-практическом семинаре «Феномен молочной сыворотки: синтез науки, теории и практики» в рамках международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 12 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 209 наименований, в том числе 149 иностранных авторов, 4 приложения. Основной текст работы изложен на 140 страницах машинописного текста, включает 28 таблиц, 46 рисунков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы описаны основные технологии переработки молока; приведены общая характеристика и химический состав молочной сыворотки, а также рассмотрены существующие технологии ее переработки. Описаны свойства биологически активных сывороточных белков, рассмотрены современные способы их выделения из молочного сырья и области последующего применения. На основе проведенного анализа научно-технической и патентной литературы сделан вывод о целесообразности использования молочной сыворотки для совместного получения биологически активных продуктов белковой природы: лактоферрина, лактопероксидазы, иммуноглобулинов, белкового гидролизата и Р-галактозидазы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основным объектом исследования являлись образцы молочной сыворотки (подсырной, творожной, казеиновой), предоставленные молокоперерабатывающими предприятиями г. Москвы и Московской области.

В качестве микробных объектов использовали дрожжи КЫууеготусех ¡аейя штамм У-3268 и КШууеготусея ташами штамм ¥-3240 из коллекции ФГУП ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Содержание белковых веществ определяли методом Лоури, общее содержание углеводов - методом Дюбуа, содержание липидов - методом Сокслета [Шакир И.В. и др., 2008]. Общее содержание иммуноглобулинов оценивали по концентрации имму-

ноглобулина IgG методом радиальной иммунодиффузии [Фримель, 1979]. Содержание лактоферрина определяли методом иммуноферментного анализа с использованием набора «Вектор-Бест», активность лактопероксидазы - методом Бояркина с использованием бензидина в качестве субстрата [Лапина, 2003], активность р-галактозидазы - с использованием о-нитрофенил-р-О-галактопиранозида в качестве субстрата [Inchaurrondo, 1994]. Активность протеолитических ферментов определяли модифицированным методом Ансона при использовании в качестве субстрата казеи-ната натрия [Полыгалина, 2003].

Молекулярпо-массовое распределение белковых веществ определяли методом гель-хроматографии с использованием колонки диаметром 1 см и высотой 20 см, заполненной полимерным гелем марок Молселект и Сефадекс.

Фракционирование молочной сыворотки проводили с использованием лабораторной ячейки с рабочим давлением 0,2 МПа и плоскими мембранными фильтрами производства «Владипор» (Россия).

Ионообменную хроматографию проводили в статических и динамических условиях, в качестве элюента использовали растворы хлорида натрия различной концентрации. Содержание белковых веществ в элюате оценивали спектрофотометриче-ски при длине волны 280 нм.

Ферментативный гидролиз сывороточных белков осуществляли в аппарате с мешалкой и рубашкой при рН 7,5-8,0 и температуре 45-50 °С. Эффективность гидролиза оценивали по увеличению содержания низкомолекулярной пептидной фракции (молекулярная масса <2 кДа), неосаждаемой 50 %-ной трихлоруксусной кислотой. Степень гидролиза рассчитывали как отношение концентрации образующихся низкомолекулярных пептидов к исходной концентрации белка в растворе.

Культивирование дрожжей проводили в глубинных условиях в колбах Эрлен-мейера объемом 250 мл (объем питательной среды 100 мл) при инкубировании на качалках (150 об/мин) при температуре 28-30 °С, а также в лабораторном ферментере Фермус-3 объемом 5 л с заполнением питательной средой на 70% и постоянном перемешивании с интенсивностью 250 об/мин. Накопление микробной биомассы определяли прямым подсчетом клеток в камере Горяева и гравиметрическим методом.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов математической статистики, включенных в пакет программ «Ехе1» и «Statistica 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование физико-химических характеристик образцов молочной сыворотки

Состав молочной сыворотки может существенно варьироваться в зависимости от исходного качества молока и технологических режимов производства целевых продуктов (творога, сыра и казеина). Поэтому в работе была исследована серия образцов молочной сыворотки и определены их основные физико-химические характеристики (табл. 1).

В результате проведенных исследований установлено, что основное влияние на состав молочной сыворотки оказывает качество исходного молока. В молочной сыворотке, полученной из восстановленного молока, практически отсутствуют минорные белки лактопероксидаза, лактоферрин и иммуноглобулины, в то время как молочная сыворотка, образующаяся при переработке цельного молока, обогащена этими ценными компонентами. Таким образом, молочная сыворотка из цельного молока может

быть использована не только для получения белкового гидролизата, но и лактоперок-сидазы, лактоферрина и иммуноглобулинов.

Таблица]

Физико-химические характеристики образцов молочной сыворотки_

Показатель Вид молочной сыворотки

Творожная Подсырная Казеиновая

Цельное Восста- Цельное Восста- Цельное Восста-

Исходное сырье молоко новленное молоко новленное молоко новленное

молоко молоко молоко

Сухие вещества, % 5,7-6,7 5,5-6,5 6,5-7,2 6,2-7,0 5,5-6,5 5,5-6,4

Белки, г/л, в том числе: 7,8-9.6 6,5-9,0 7,8-8,9 6,2-7,5 7,1-10,4 6,0-9,5

Лактопероксидаза, ед/л 90-192 - 120-252 - 132-187

Лактоферрин, мг/л 10-45 - 15-50 - 15-25 -

Иммуноглобулин С, г/л 0,3-0.8 0-0,1 0,4-0,9 0-0,1 0,3-0,8 0-0,1

Углеводы, г/л 35,0-39,5 35,0-38.5 39,7-46,1 39,5-45,5 38,6-45,5 37,0 -47,0

Лишды, г/л 0,01-0,4 0,01-0,2 0,2-0,5 0,1-0,3 0,05-0,3 0,05-0,5

Плотность, кг/дм3 1,01-1,02 1,01-1,02 1.01-1,03 1,01-1,03 1,01-1,02 1,01-1,02

рН 5,0-6,0 5,0-6,0 5,5-6,5 5,5-6,5 4,2-4,8 4,2-4,8

В дальнейшей работе была использована подсырная сыворотка, полученная при переработке цельного молока, так как она характеризуется максимальным содержанием наиболее ценных компонентов белковой природы.

Выбор схемы фракционного разделения молочной сыворотки Молочная сыворотка - это комплексное вторичное сырье, содержащее белковые вещества с различными молекулярными массами. Анализ молекулярно-массового состава показал, что в ней содержится 19+1,5 % белков с молекулярными массами >65 кДа (иммуноглобулины, лактоферрин, лактопероксидаза, бычий сывороточный альбумин), 58+1,5 % с молекулярными массами 30-40 кДа (димер р-лактоглобулина) и 23+1,5 % с молекулярными массами 10-15 кДа (рис. 1). Следует отметить, что аналогичное молекулярно-массовое распределение белковых веществ характерно не только для подсырной, но и для творожной и казеиновой сыворотки.

Для получения отдельных белковых фракций на основе различия в молекулярных массах сывороточных белков был исследован процесс фракционирования молочной сыворотки на полупроницаемых мембранах с различной селективностью. В ходе эксперимента было установлено, что наиболее целесообразным является проведение двух последовательных стадий ультраконцентрирования по схеме, представленной на рис. 1.

Рис. 1. Схема фракционирования молочной сыворотки

При подборе режимов проведения стадии «ультраконцентрирование (I)» были использованы мембраны УАМ-500, УАМ-100, УПМ-100 и УПМ-50. Установлено, что обладающая максимальной производительностью мембрана УАМ-500 задерживает иммуноглобулины, лактопероксидазу и лактоферрин и максимально пропускает остальные сывороточные белки при степени концентрирования, равной 10 (табл. 2).

Таблица 2

Основные характеристики мембран на стадии «ультраконцентрирование (I)»_

Степень концентрирования Удельная производительность мембраны, л/м2*ч Интегральная селективность мембраны по белкам, %

УАМ-500 УАМ-100 УПМ-100 УПМ-50 УАМ-500 УАМ-100 УПМ-100 УПМ-50

2 13,5 ±0,75 9,6±0,30 6,1 ±0,24 5,1+0,48 46,9+0,12 57,2+0,71 54,6+0,43 74,1 ±0,26

4 12,1±0,81 8.9±0,61 5,9+0.49 5,0+0,39 40,4±0,46J 53,8±0,62 49,7±0,56 74,0±0,29

6 10,5 ±0,64 8.4±0,29 4,8±0,58 4,6+0,62 30,0±0,34 49,0±0,61 42,8+0,42 68.4±0,51

8 10,0±Я,59 7,5+0,78 4,2+0,62 4,4+0,71 22.4+0,28 46,9±0,34 31,9+0,28 62,8±0,42

10 9,5±0,38 7.1+0,41 | 3,9+0.47 4,0±0,32 17,6±0,31 38,0+0,36 28,0±0,59 58,0+0,38

При подборе режимов проведения стадии «ультраконцешрирование (П)» были использованы мембраны УПМ-50, УПМ-20 и УПМ-10. Установлено, что мембрана УПМ-20 обеспечива-

ет максимальную селективность по белкам при степени концешрирования, равной 5 (табл. 3).

Таблица 3

_ Основные характеристики мембран на стадии «ультраконцентрирование (II)»_

Степень концентрирования Удельная п; мемб юизводительность заны, л/м2*ч Интегральная селективность мембраны по белкам, %

УПМ-50 УПМ-20 УПМ-10 УПМ-50 УПМ-20 УПМ-10

2 5,0±0,33 6,4+0,39 2,6±0,05 91,0±0,65 93,7±0,39 92,0±0,43

3 4,9+0,21 5,8±0,25 2,4+0,17 90,6+0,54 94,6±0,47 91,5±0,65

4 4,6±0,19 5,6±0,14 2,3+0,11 90,2+0,28 94,0±0,62 91,5±0,38

5 4,4±0,11 5,5±0,17 2,2+0,09 89,9+0,62 93,1±0,31 90,5±0,63

Получаемые в ходе ультрафильтрации обогащенные фракции содержат примеси низкомолекулярных компонентов, поэтому для их очистки была использована 3-х кратная диафильтрация. При этом эксперименты показали, что диафильтрат, полученный на стадии «ультраконцентрирование (I)», следует объединять с пермеатом и направлять на стадию «ультраконцентрирование (П)».

Таблица 4

Основные характеристики фракций полученных при разделении молочной сыворотки

Фракция Сухие вещества, % Липиды, г/л Углеводы, г/л Белки, г/л

Фракция, обогащенная лактопероксидазой, лактоферрином, иммуноглобулинами 2,0±0,09 5,0+0,19 5,0+0,23 5,6±0,15

Фракция, обогащенная а-лакго-альбумином, Р-лактоглобулином, сывороточным альбумином крови 4,2±0,15 - 3,8±0,11 30,2±0,23

Депротеинизированная молочная сыворотка 4,4+0,12 - 38,0+0,45 0,57+0,05

Таким образом, показано, что последовательное ультрафильтрационное разделение молочной сыворотки на мембранах УАМ-500 и УПМ-20 позволяет получить три фракции: 1) фракцию, обогащенную лакгоперокевдазой, лактоферрином и иммуноглобулинами; 2) фракцию, обогащенную а-лактоальбумином, р-лактоглобулином и сывороточным альбумином крови; 3) депротеинизированную молочную сыворотку (табл. 4).

Подбор оптимальных условий выделения лактоперокендазы, лактоферрпна н иммуноглобулинов

Выделение лактопероксидазы и пактоферрина

Использование ультрафильтрации позволило получить фракцию, обогащенную лактопероксидазой, лактоферрином и иммуноглобулинами. Известно, что лактофер-рин и лактоперокевдаза, в отличие от иммуноглобулинов, являются катионными белками, поэтому для их выделения чаще всего применяют ионный обмен с использованием сорбентов на основе целлюлозы, декстранов и агароз с различными функциональными группами [Сова, 2006]. В настоящей работе для сорбции лактоперокендазы и лактоферрина была использована карбоксиметилцеллюлоза, причем несорбирован-ная фракция содержала иммуноглобулины.

Таблица 5

Подбор условий сорбции лактоперокендазы и лактоферрина в динамических условиях

Степень разбавления концентрата Исходное содержание Условия сорбции Степень сорбции, %

Лактоперокендазы, ед/л Лактоферрина, г/л Лактоперокендазы Лактоферрина

Без разбавления 1880±32,4 0,20+0,005 VpaciBopu— 43 40

2 940±24,8 0,10+0,003 SV v колонии 61 63

4 470±24,1 0,05+0,001 79 70

6 313±18,0 0,03+0,001 Скорость 87 79

8 235+12,5 0,03+0,001 протекания 88 90

10 188±5,7 0,02+0,001 10 мл/мин 91 93

При выборе оптимальных условий сорбции лактоферрина и лактоперокендазы подбирали следующие параметры: режим (статический, динамический), содержание сорбента, исходную концентрацию сорбируемых компонентов. Предварительные исследования показали, что в статических условиях при содержании ионообменника 5-40 % по объему степень сорбции лактоферрина и лактоперокендазы из раствора не превышала 35 % и 40 %, соответственно. Для увеличения степени сорбции процесс осуществляли в динамических условиях при уменьшении исходного содержания лактоферрина и лактоперокендазы разбавлением исходного раствора фосфатным буфером в 2-10 раз (табл. 5).

Анализ результатов (табл. 5) показал, что оптимальными условиями сорбции лактоферрина и лактоперокендазы являются следующие: проведение процесса в динамических условиях, разбавление фракции, обогащенной лактопероксидазой, лактоферрином и иммуноглобулинами, фосфатным буфером в 10 раз до содержания лактоферрина 0,02 г/л и

лактоперокендазы - 188 ед/л, что

_ _ _ хлорида натрия

позволило добиться сорбции белков более чем на 90 %.

Из литературных данных известно, что для десорбции катионных белков чаще всего используется градиент концентрации хлорида натрия [Овчинникова О.В., 2008]. Повышение ионной силы элюента вызывает ослабление электростати-

I 2 V

— Иммуноглобулины J1 актопер оксидаза

^Лактоферрин

« -

s s i

ж.

О 30 60 90 120 150 ISO 210 240 270 Объем элюата, мл Рис. 2. Профиль элюции градиентом концентрации

ческого взаимодействия между белком и катеонитом, что приводит к вымыванию белка в элюат.

В результате проведенных исследований было установлено, что элюцию следует проводить следующим образом: фосфатным буфером для удаления иммуноглобулинов, задержавшихся в свободной объеме колонки; 0,2 М раствором хлорида натрия для десорбции лактопероксидазы, 0,5 М раствором хлорида натрия для десорбции лактоферрина (рис. 2). Наличие белков с молекулярными массами, соответствующими лактопероксццазе и лактофер-рину, в полученных фракциях было подтверждено гель-хроматографией.

Таблица 6

Основные характеристики полупродуктов, полученных при сорбции лактоферрина и лактопероксидазы

Фракция Показатели

« в 1«£ О н ц 3 1.5 с с 2 ч: о 4 4» ^ я" £ -5 5 и Иммуноглобулин 0 Лакто-персксидаза Лакто-феррин

т/л г/л г/л V

Исходный раствор 1,0± 0,02 0,50+ 0,02 0,5+ 0,03 0,65+ 0,03 0,5+ 0,04 100 188± 5,7 100 0,02± 0,001 100

Ионообменное разделение на карбоксиметилцеллюлозе

Несорбированная фракция 1,0+ 0,02 0,45+ 0,02 0,5± 0,03 0,49+ 0,03 0,4+ 0,03 80 18+ 0,3 9,6 следы 7,4

Промывная вода 1,3± 0,05 1,00+ 0,05 - 2,44+ 0,14 2,0+ 0,12 20 - - - -

Фракция лактопероксидазы 2,1± 0,07 - - 0,36± 0,02 - - 3400+ 52,5 91,0 - -

Фракция лактоферрина 3,8± 0,07 - - 0,44+ 0,02 - - - - 0,37+ 0,011 93,0

Ультракоицеятрирование фракций лактопероксидазы и лактоферрина (мембрана УПМ-50)

Концентрат лактопероксидазы 2,3± 0,07 - - 3,04± 0,14 - - 34000± 530,0 90,5 - -

Концентрат лактоферрина 4,1± | 0,09 1 - 3,93+ 0,15 - - - - 3,7± 0,10 92,5

Очистка концентратов лактопероксидазы и лактоферрина диафильтрацией (мембрана УПМ-50)

Очищенный концентрат лактопероксидазы 1,2+ 0,05 3,04+ 0,14 34000± 530,0 90,5 -

Очищенный концентрат лактоферрина М± 0,05 - - 3,93+ 0,15 - - 3,7± 0,10 92,5

*- содержание от исходного количества в молочной сыворотке, %

Фракции лактопероксидазы и лактоферрина были сконцентрированы на мембране с отсекаемой молекулярной массой 50 кДа (УПМ-50) и очищены от избыточного количества хлорида натрия диафильтрацией. Выход лактоферрина и лактопероксидазы от исходного содержания в молочной сыворотке составил 92,5 % и 90,5 % соответственно. Основные характеристики полупродуктов, полученных в процессе сорбции и десорбции, а также стадии их дальнейшей переработки представлены в табл. б. Полученные очищенные концентраты лактоферрина (3,7 г/л) и лактопероксидазы (34000 ед/л) могут быть направлены на сушку без дополнительной обработки.

Выделение иммуноглобулинов

Как было указано выше, иммуноглобулины содержатся в несорбированных фракциях, полученных после сорбции лактоферрина и лактопероксидазы и промывки сорбента фосфатным буфером, поэтому целесообразным является их объединение.

Поскольку в полученной объединенной фракции содержание белков невысоко (0,58 г/л), раствор был сконцентрирован на мембране УАМ-500, в результате чего удалось получить концентрат иммуноглобулинов следующего состава: содержание белков - 12,2 г/л (из них 1дС) 10,0 г/л), углеводов - 0,4 г/л, липидов - 10,0 г/л.

Концентрат иммуноглобулинов содержит значительные количества липидов (около 50% по сухому веществу), присутствие которых снижает качество конечного продукта Проведенные исследования показали, что наиболее подходящим способом очистки иммуноглобулинов от липидов является высаливание. При исследовании зависимости степени осаждения иммуноглобулинов от концентрации сульфата аммония, вносимого в интервале 10-50 % от насыщения, было установлено, что при 40 %-ном насыщении раствора сульфатом аммония выпадает в осадок более 97 % иммуноглобулинов (рис. 3).

Получешшй после растворения осадка раствор иммуноглобулинов был очищен последовательными стадиями ультрафильтрации на мембране с отсекаемой молекулярной массой 100 кДа (УПМ-100) и диафильтрацией. При этом выход иммуноглобулинов составил 95 % от исходного количества в молочной сыворотке. Основные характеристики полупродуктов, получаемых в ходе очистки иммуноглобулинов, представлены в табл. 7.

Таблица 7

Основные характеристики полупродуктов, полученных на стадии выделения иммуноглобулинов

Фракция Показатели

Сухие вещества, % Липиды, г/л Углеводы, г/л Белки, г/л Иммуноглобулин в

г/л % *

Объединенная фракция иммуноглобулинов 1,0±0,02 0,48±0,02 0,48+0,03 0,58+0,05 0,5+0,04 100

Ультраконцентрирование объединенной фракции иммуноглобулинов (мембрана УАМ-500)

Концентрат иммуноглобулинов 3,0+0,09 10+0,4 0,4+0,02 12,2+0,41 | 10,0+0,41 99.5

Высаливание иммуноглобулинов сульфатом аммония

Осадок иммуноглобулинов 67.8+3,35 - - 17,4±0,51 % от сух. в-в 14,210,28 % от сух. в-в 96

Растворение осадка иммуноглобулинов после высаливания

Раствор иммуноглобулинов 2,6+0,08 - - 2,95+0,13 2,4+0,13 96

Ультраконцентрирование раствора иммуноглобулинов (мембрана УПМ-100)

Концентрат иммуноглобулинов 3,4±0,09 - - 11,8+0,37 9,6+0,48 95,2

Диафильтрация концентрата иммуноглобулинов (мембрана УПМ-100)

Очищенный концентрат иммуноглобулинов 2,1+0,08 - - 11,8±0,37 9,6±0,48 95,0

*- содержание от исходного количества в молочной сыворотке, %

Полученный очищенный раствор иммуноглобулинов с содержанием ^О 9,8 г/л может быть направлен на сушку без дополнительной очистки.

60* 40 20 ■ 0

£1

Степень насыщения раствора сульфата аммония. %

Рис. 3. Зависимость степени осаждения иммуноглобулина в от насыщения раствора сульфата аммония

Ферментативный гидролиз фракции, обогащенной главными сывороточными белками

При ультрафильтрационном разделении молочной сыворотки одной из полученных белковых фракций является фракция, обогащенная а-лактоальбумином, р-лакгоглобулином и сывороточным альбумином крови. Из литературных данных известно, что Р-лактоглобулин является сильным аллергеном и чаще всего используется в виде гидролиза-тов, поэтому для повышения биологической ценности была проведена ферментативная обработка белков, содержащихся в данной фракции, с получением белковых гидролизатов.

Таблица 8 Для проведения фер-

ментативного гидролиза были использованы отобранные в соответствии с литературными данными ферментные препараты: трипсин (4040+120 ед/г), химотрипсин (4960±150 ед/г), химопсин (5250+160 ед/г) и панкреатин (5310±160 ед/г) [Телишевская Л.Я., 2000].

При выборе оптимальных условий ферментативного гидролиза подбирали количество вносимого фермента (0,5-3,0 % от массы субстрата) и начальную концентрацию субстрата (15-30 г/л), которую устанавливали путем разбавления фракции, обогащенной главными сывороточными белками, дистиллированной водой. Продолжительность гидролиза была подобрана в ходе предварительных экспериментов и составила 3 ч. Основные результаты исследований приведены в табл. 8.

Анализ полученных данных показал, что гидролиз необходимо проводить при начальной концентрации белка не более 20 г/л. Это может быть связано с реологическими характеристиками системы: при высокой концентрации белка повышается вязкость, в результате чего возникают затруднения при контакте фермента с субстратом.

Таким образом, показано, что оптимальными условиями получения белкового гидролизата на основе фракции, обогащенной главными сывороточными белками, являются: начальная концентрация белка 20,0 г/л, расход химопсина 3 % от массы субстрата, продолжительность - 3 ч. В результате данного процесса удается достичь степени гидролиза 98 % при содержании аминного азота в белковом гид-ролизате 21,8 %.

Подбор оптимальных условий ферментативного гидролиза

Фермент- Условия гидролиза Характеристика

ный гидролизата

препарат Начальная Расход Степень Содержание

концентрация фермента, гидролиза, аминного

белка, г/л % % азота, %

Трипсин 15 3 35,5+0,80 11,0+0.45

20 3 35,1±0,71 9,5+0,41

20 0,5 22,8±0,67 9,1+0,42

20 1,0 29,1+0,46 10,2±0,47

20 2,0 32,5+0,80 9,9+0.39

25 3 32,3±0,85 12,3+0,49

30 3 26,5 ±0,72 14,1+0.56

Химо- 15 3 38,9±1,25 14,3+0.52

трипсин 20 3 39,9±1,24 11,0+0,40

20 0,5 25,5 ±0,51 8,8±0,32

20 1,0 31,9±1,36 9,1+0,35

20 2,0 35,8+1,55 11,0+0,37

25 3 36,4+1,28 12,9±0,48

30 3 27,5±0,76 12,5±0.46

Химоп- 15 3 98,0±1,55 22,6*0,91

син 20 3 98,0±1,55 21,8±0,80

20 0,5 77,9+1.23 16.5+0,62

20 1,0 89,1+1,43 17,9+0,71

20 2,0 98,0±1,50 17,5 ±0,75

25 3 75,7±1,05 17,4+0.70

30 3 61,2±1,14 17,3±0,68

15 3 б7,б±1,12 35,7±1,Э5

Панкреа- 20 0,5 39,7±1,10 15,9±0,59

тин 20 1.0 51,2+1,23 20,5+0.95

20 2,0 66,2+1,32 24,7±0,87

20 3 69,4+1,45 27,4+0,79

25 3 50,6+1,50 20,9±0,84

30 3 38,4+1,03 17,7+0,63

Использование депротешпннроваииой молочной сыворотки для получения ß-галактозидазы

Молочная сыворотка помимо белковых компонентов содержит значительные количества лактозы и минеральных компонентов, которые в рамках данной технологии образуются из исходного сырья на начальных стадиях переработки в виде депро-теинизированной молочной сыворотки. Высокое содержание лактозы, являющейся индуктором синтеза ß-галактозидазы, позволяет рассматривать данную фракцию в качестве основы питательной среды для культивирования продуцентов ß-галактозидазы. Анализ литературных данных показал, что эффективными продуцентами данного фермента являются дрожжевые культуры Kluyveromyces lactis и Kluy-veromyces marxianus, способные расти на различных лактозосодержащих средах и накапливать большие количества ß-галактозидазы.

Культивирование дрожнеейрода Kluyveromyces на питательных средах, содержащих депротеинизироеанную молочную сыворотку

Предварительные исследования по культивированию дрожжей Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus показали, что данные микроорганизмы способны активно расти на синтетических лактозосодер-жащей среде (контроль) и накапливать наибольшее количество ß-галактозидазы в конце логарифмической фазы роста (рис. 4).

В ходе экспериментов была подобрана питательная среда на основе депротеинизи-рованной МОЛОЧНОЙ сыворотки (табл. 9), при биомассе дрожжей в зависимости от продолжи-культивировании на которой дрожжей Kluy- «льноста культивирования veromyces marxianus удалось получить биомассу с максимальной активностью по ß-галактозидазе, равной 463 ед/г.

Таблица 9

Состав питательных сред, использованных для культивирования дрожжей Kluyveromyces marxianus

Контроль Питательная среда на основе депротеинизированной молочной сыворотки

Подобранная Комбинированная

Лактоза - 50 г/л, (NH&SO« -2 г/л, КН2Р04-5Г/Л, MgS04- 0,34 г/л, Дрожжевой экстракт - 2 г/л, pH 5,5. Белки - 0,57 г/л, Углеводы - 38,0 г/л, NH4H2PO1 - 4 г/л, M11SÖ4- 0,16 г/л, Дрожжевой экстракт - 1 г/л, pH 5,5. Белки-0,41 г/л, Углеводы - 25,8 г/л, Липиды - 0,29 г/л, (Ж,)2504 - 4,5 г/л, Мп304-0,16г/л, Дрожжевой экстракт -1 г/л, рН 5,5

В предложенной схеме комплексной переработки молочной сыворотки образуются стоки, содержащие лактозу и минеральные вещества. Для уменьшения нагрузки на очистные сооружения является целесообразным использование наиболее концентрированных стоков в качестве минеральной основы питательных сред. Поэтому была исследована возможность культивирования дрожжей КЬ^еготусм тагх1апш на комбинированной среде, содержащей депротеинизированную молочную сыворотку, диафильтрат, полученный на стадии «ультраконцентрирование (П)», и надосадоч-иую жидкость, полученную на стадии высаливания иммуноглобулинов и содержащую значительное количество сульфата аммония (табл. 9).

600

500

■я

400

Р зоо

S 200

< 100

□ К.lactis С K.nmrxitvius

Продолжительность, ч Рис. 4. Активность ß-галактозидазы

Основные ростовые характеристики при культивировании дрожжей Юиу^его-тусе5 татати на питательных средах, содержащих депротеинизированную молочную сыворотку, представлены в табл. 10.

Таблица 10

Ростовые характеристики К. тагштш при культивировании на питательных средах, _ содержащих депротеинизированную молочную сыворотку_

Питательная среда И. ч"1 Биомасса, г/л Степень усвоения углеводов, % У (по общим углеводам) Активность р-галактозидазы

Удельная, ед/г Общая, ед/л

Контроль 0,25 11,2+0,88 96,0 0,23 478±28.2 5357±212,0

Подобранная 0,3 13,1+0,95 97,0 0,36 463+19,5 6065+235,6

Комбинированная 0,3 12,8±0,73 96,5 0,51 486+28,7 6221+248,8

Анализ полученных данных показал, что при культивировании на комбинированной питательной среде дрожжи КЫууеготусея тагхйншй накапливают р-галактозидазу с наибольшей удельной активностью равной 486 ед/г.

Подбор оптимальных условий выделения Р-галактозидазы из биомассы Шиууеготусез тагхгапих

Из литературных данных известно, что дрожжевая р-галактозидаза является внутриклеточным ферментом с молекулярной массой более 200 кДа [Гореликова Г.А., 2004], поэтому его выделение может быть осуществлено по следующей схеме: дезинтеграция клеток дрожжей, концентрирование и очистка фермента.

Для дезинтеграции клеток нативной биомассы были использованы физические (перетирание со стеклом, ультразвуковая обработка) и химические (органические растворители, детергенты) методы воздействия. Наилучшие результаты были достигнуты при воздействии толуолом в количестве 2 % от объема суспензии биомассы в течение 2 ч, причем выход фермента составил 88 % от его содержания в биомассе.

Раствор, содержащий Р-галактозидазу, был сконцентрирован методом ультрафильтрации, очищен от внутриклеточных компонентов и низкомолекулярных примесей методами диафильтрации и осаждения в изоэлектрической точке (табл. 11).

Таблица 11

Основные характеристики полупродуктов, содержащих Р-галактозидазу_

Фракция Показатели фракции

Сухие вещества, % Белки, г/л Активность Р-галактозидазы % выхода

Натавная биомасса 40,0±0,80 - 486+29 ед/г АС Б 100

Дезинтеграция клеток толуолом

Экстракт Р-галактозидазы 6,5+0,19 4,5±0,16 21530±520 ед/л 88,6

Ультраконцентрирование экстракта Р-галактозидазы (мембрана УПМ-100)

Концентрат Р-галактозвдазы 3,2±0,10 14,1 ±0,42 320760±4551 ед/л 88,0

Диафипьтрация концентрата Р-талактозидазы (мембрана УПМ-100)

Очищенный концентрат Р-галактозидазы 2,9+0,08 13,0+0,46 317115+3870ед/л 87,0

Осаждение Р-галактозидазы в изоэлектрической точке (р! 5,0)

Осадок Р-галастозмдазы 95,0±2,85 1 80'Ш'45% I сухому веществу 24400+455 ед/г 69,6

Полученный осадок р-галактозидазы с удельной активностью 24400 ед/г белка может быть далее направлен на стадию сушки без дополнительной обработки.

Тсхнико-экономичсская оценка разработанной технологии переработки молочной сыворотки

Па основании проведенных исследований разработана принципиальная блок-схема комплексной переработки молочной сыворотки, включающая следующие стадии: •последовательное разделение молочной сыворотки методом ультрафильтрации;

• выделение лактопероксидазы и лактоферрина сорбцией на карбоксиметилцеллюлозе с последующей десорбцией растворами хлорида натрия;

•выделение иммуноглобулинов высаливанием сульфатом аммония;

• получение очищенных концентратов лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулинов ультрафильтрацией и диафильтрацией;

• ферментативный гидролиз фракции, обогащенной а-лактоапьбумином, Р-лактоглобулином и сывороточным альбумином крови, фермешпым препаратом химопсином;

• культивирование дрожжей Шщчеютуса пшшапш - продуцентов Р-галактозидазы на питательной среде, содержащей депротеинизированную молочную сыворотку и солевые стоки; •выделение Р-галактозидазы из нативной биомассы дезинтеграцией толуолом, ультраконцентрированием, диафильтрацией, осаждением в изоэлектрической точке (рис. 5).

Рис. 5. Принципиальная блок-схема переработки молочной сыворотки с получением биологически активных продуктов белковой природы

На основе проведенных исследований рассчитаны технико-экономические показатели трех вариантов технологических схем комплексной переработки молочной сыворотки мощностью 30 ООО тонн/год, отличающиеся характеристиками исходного сырья и предусматривающие получение:

1 - лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов, белкового гидролиза-та и р-галактозидазы;

2 - иммуноглобулинов, белкового гидролизата и Р-галактозидазы;

3 - белкового гидролизата и р-галактозидазы (табл. 11).

Таблица 11

Технико-экономические показатели комплексной технологии переработки молочной сыворотки

с получением биологически активных продуктов белковой природы

№ п/п Наименование показателя Единица измерения Значение показателей

1 2 3

1 Капитальные затраты тыс руб 107 730 107 190 104 640

2 Полная себестоимость годового выпуска тыс руб 422 670 286 880 141 310

3 Себестоимость единицы продукции - лактопероксидаза - лактоферрин - иммуноглобулины - белковый гидролизах гидролизат - 0-галактозидзза тыс. руб/т тыс. руб/т тыс. руб/т тыс. руб/т тыс. руб/т 174,14 101,65 10,75 0,42 4,58 15,83 0,61 6,75 1,25 13,71

4 Стоимость годового выпуска продукции тыс. руб/т 507 280 344420 169 570

5 Прибыль годовая тыс руб 84 610 57 540 28 260

6 Рентабельность а) производственных фондов б) продукции % % 72 20 49 20 25 20

7 Срок окупаемости капитальных вложений год 1,3 1,9 3,7

Из представленных данных следует, что разработанная технология рентабельна при переработке молочной сыворотки, получетой как из цельного, так и восстановленного молока.

Предварительный расчет эколого-экономического эффекта от внедрения разработанной технологии с выбранной мощностью показал, что экономия средств за счет снижения расходов на переработку отходов превысит 3,6 млн руб/год, кроме того, переработка молочной сыворотки в конкурентоспособную продукцию позволит получить до 84,6 млн руб/год дополнительной прибыли.

ВЫВОДЫ

1. Разработана принципиальная схема комплексной переработки молочной сыворотки, позволяющая получить биологически активные продукты белковой природы: лактопероксидазу, лактоферрин, иммуноглобулины, белковый гидролизат и Р-гапактозидазу.

2. Обоснован выбор схемы фракционирования молочной сыворотки, основанной на мембранном разделении и позволяющей получить следующие фракции: 1) фракцию, обогащенную лактопероксидазой, лактоферрином, и иммуноглобулинами; 2) фракцию, обогащенную р-лактоглобулином, а-лактоальбумином и сывороточным альбумином крови; 3) депротеинизированную молочную сыворотку.

3. Подобраны условия выделения лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулинов, включающие стадии ионного обмена, высаливания, ультрафильтрации и диафильтрации, позволяющие достичь выхода вышеперечисленных белков не ме-

нее 90 % от их исходного содержания в молочной сыворотке.

4. Подобраны условия получения белкового гидролизата со степенью гидролиза не менее 98 % и содержанием амшшого азота 21,8 %, предполагающие обработку фракции, обогащенной ß-лактоглобулином, а-лактоальбумином и сывороточным альбумином крови, с начальной концентрацией белка 20 г/л ферментным препаратом химопсином в количестве 3 % от массы субстрата.

5. Показана возможность использования депротеинизированной молочной сыворотки и минеральных стоков в качестве основы питательной среды для культивирования дрожжей Kluyveromyces marxianus, что позволяет получить биомассу с активностью по ß-галактозидазе 486 ед/г.

6. Подобраны условия выделения ß-галактозидазы из нативной биомассы дрожжей Kluyveromyces marxianus, включающие стадии дезинтеграции клеток, концентрирования и осаждения в изоэлектрической точке и позволяющие получить ферментный препарат с активностью 24400 ед/г, что сопоставимо с активностью известных коммерческих препаратов.

7. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка реализации разработа-ной технологии переработки молочной сыворотки при расчетной мощности производства 30 ООО тонн/год по перерабатываемому сырыо. Предварительный расчет эколого-экономического эффекта от внедрения разработанной технологии с выбранной мощностью показал, что экономия средств за счет снижения расходов на переработку отходов превысит 3,6 млн руб/год.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Рытченкова, О.В. Исследование молекулярного распределения белков при ультраконцентрировании молочной сыворотки на мембранах / A.A. Красноштанова, В.Г. Попов, О.В. Рытченкова//Молочная промышленность. 2010 №7. С. 60-61.

2. Рытченкова, О.В. Оптимизация процесса получения ферментативных гидролизатов белков молочной сыворотки с применением протеолитических ферментов / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова // Фундаментальные исследования. 2011. №8 (часть 3). С. 663-666.

3. Рытченкова, О.В. Выделение лактоферрина и лактопероксидазы из молочной сыворотки / A.A. Красноштанова, О.В. Рытченкова // Экология и промышленность России. 2011. МП. С. 48-51.

4. Рытченкова, О.В. Выделение белковых изолятов из концентрата молочной сыворотки / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова // Международная научно-практическая конференция «Технология молочных и молокосодержащих продуктов». Ставрополь. 2008. С. 152-154.

5. Рытченкова, О.В. Исследование процесса выделения белков из концентрата молочной сыворотки / О.В. Рытченкова // IV Международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии. Москва. 2008. Том XXII, №13. С. 79-82.

6. Рытченкова, О.В. Разработка приемов выделения белков из молочной сыворотки / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова // 6-я Международная конференция «Сотрудничество для решения проблемы отходов». Харьков. 2009. С. 154-156.

7. Рытченкова, О.В. Разработка основ технологии выделения белковых фракций из концентрата молочной сыворотки / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова // V Московский Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы раз-

вития». 2009 г. 4.1. С. 432 - 433.

8. Рытченкова, О.В. Состав молочной сыворотки и ее переработка мембранными методами / О.В. Рытченкова, Л.А. Красноштанова // 3-я Конференция молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях». Москва. 2009 г. С.204-207.

9. Рытченкова, О.В. Получение а-лактоальбумина и ß-лактоальбумина из молочной сыворотки / О.В. Рытченкова // V Международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии. Москва. 2009. Том XXIII, №10. С. 96-99.

10. Рытченкова, О.В. Исследование процесса выделения высокомолекулярных белков из молочной сыворотки / О.В. Рытченкова // XIII Международная конференция молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения». Казань. 2009. С. 288.

11. Рытченкова, О.В. Комплексная переработка молочной сыворотки с целью получения биологически активных веществ пищевого и медицинского назначения / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова // Московская Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов». Москва. 2010. С. 251-252.

12. Рытченкова, О.В. Культивирование дрожжевых культур-продуцентов фермента ß-галактозидазы на пермеате молочной сыворотки / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова // Всероссийский симпозиум с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов». Москва. 2011. С. 99.

13. Рытченкова, О.В. Исследование ферментативного гидролиза белков молочной сыворотки / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова // VI Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2011. ч.1. С. 369-370.

14. Рытченкова, О.В. Получение иммуноглобулинов, лактоферрина и лактоперокси-дазы из концентрата молочной сыворотки / О.В. Рытченкова, A.A. Красноштанова И Научно-практический семинар «Феномен молочной сыворотки: синтез науки и практики» в рамках Международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии». Ставрополь. 2011. С. 68-69.

15. Рытченкова, О.В. Культивирование продуцентов ß-галактозидазы на депротеини-зированной молочной сыворотке / И.Р. Яхин, О.В. Рытченкова // VII Международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии. Москва. 2011. Том XXV. №10. С. 33-36.

Подписано в печать:

11.01.2012

Заказ № 6485 Тираж - 110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Рытченкова, Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1.Общая характеристика молочной сыворотки, современное состояние и перспективы ее переработки.

1.2. Белковый состав молочной сыворотки.

1.3. Способы выделения сывороточных белков из молочного сырья.

1.4. Получение ферментативных гидролизатов сывороточных белков.

1.5. Получение микробной (3-галактозидазы.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Реагенты.

2.3. Методы анализа.

2.3.1. Определение сухих веществ в образцах.

2.3.2. Количественное определение белков в растворах.

2.3.3. Количественное определение углеводов в растворах.

2.3.4. Количественное определение липидов.

2.3.5. Количественное определение лактоферрина методом иммуноферментного анализа.

2.3.6. Определение активности лактопероксидазы.

2.3.7. Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии.

2.3.8. Определение протеолитической активности модифицированным методом Ансона.

2.3.9. Определение активности (3-галактозидазы.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Методика проведения ультраконцентрирования.

2.4.2. Методика проведения гель-хроматографии.

2.4.3. Методика проведения ионного обмена.

2.4.4. Методика выделения белков высаливанием.

2.4.5. Методика проведения ферментативного гидролиза.

2.4.6. Методика культивирования микроорганизмов.

2.4.7. Методика проведения дезинтеграции дрожжевой биомассы.

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Исследование физико-химических характеристик молочной сыворотки.

3.2. Исследование способов предварительного концентрирования молочной сыворотки.

3.3. Выбор схемы ультрафильтрационного разделения молочной сыворотки с получением белковых фракций.

3.4. Подбор оптимальных условий выделения лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов.

3.5. Исследование способов переработки фракции, обогащенной

-лактоглобулином, а-лактоальбумином, сывороточным альбумином крови.

3.6. Подбор оптимальных условий получения белковых гидролизатов на основе фракции главных сывороточных белков.

3.7. Использование депротеинизированной молочной сыворотки для культивирования микроорганизмов - продуцентов ß-галактозидазы.

3.8. Подбор оптимальных условий выделения ß-галактозидазы.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение биологически активных продуктов белковой природы при комплексной переработке молочной сыворотки"

Одним из крупнотоннажных отходов пищевых производств является молочная сыворотка, образующаяся при переработке молока в белково-жировые продукты (сыр, творог, казеин). Ежегодно в мире образуется более 130 млн тонн молочной сыворотки, из них около 2 млн тонн приходится на долю России. Эколого-экономические расчеты показывают, что 1 тонна молочной сыворотки может нанести такой же экологический ущерб, как 100 м хозяйственно-бытовых стоков при совокупных затратах на ее переработку 0,51,2 млн рублей.

В России перерабатывается менее 50 % молочной сыворотки, поэтому проблема ее рационального использования стоит особо остро. Использование нативной молочной сыворотки в натуральном виде ограничено сроками ее хранения. Наиболее простой способ переработки молочной сыворотки - сушка - приводит к образованию продукта, не сбалансированного по основным питательным веществам, обладающего низкими органолептическими показателями. Более перспективным подходом является фракционирование молочной сыворотки с получением подсырных сливок, концентратов сывороточных белков, молочного сахара. Однако такие технологии, как правило, направлены на частичную переработку вторичного молочного сырья. В последние годы наибольший интерес вызывает глубокая переработка молочной сыворотки, предусматривающая извлечение из нее индивидуальных компонентов и получение их производных. Такие продукты могут найти более широкое применение в пищевой, медицинской и фармацевтической промышленности.

Наиболее ценными компонентами молочной сыворотки являются иммуноглобулины, лактоферрин и лактопероксидаза, хотя и присутствующие в небольших количествах, но обладающие защитной, антимикробной, антиоксидантной, иммуномодуляторной и регуляторной функциями. Данные соединения могут быть использованы в качестве основы для получения лечебно-профилактических продуктов. В наибольшем количестве в молочной сыворотке содержатся (3-лактоглобулин и а-лактоальбумин, содержащие оптимально сбалансированный набор аминокислот. Благодаря высокой биологической ценности данные белки могут быть использованы для производства продуктов детского и диетического питания.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологии получения биологически активных продуктов белковой природы (лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов, белкового гидролизата, (3-галактозидазы) при комплексной переработке молочной сыворотки.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- подобрать оптимальные условия получения белкового гидролизата из фракции, обогащенной главными сывороточными белками ((3-лактоглобулином и а-лактоальбумином);

- исследовать ростовые характеристики дрожжей рода К1иууеютусе5 -продуцентов (З-галактозидазы при культивировании на питательных средах, содержащих депротеинизированную молочную сыворотку;

- разработать режимы получения ферментного препарата (З-галактозидазы из нативной биомассы дрожжей Кіиууеготусея тагхіапт;

- провести технико-экономические и эколого-экономические расчеты эффективности разработанной технологии.

Научная новизна.

Экспериментально подобраны и научно обоснованы оптимальные условия ферментативного гидролиза фракции, обогащенной главными сывороточными белками ((3-лактоглобулином и а-лактоальбумином), обеспечивающие степень гидролиза не менее 98 %.

Подтверждена возможность использования депротеинизированной молочной сыворотки и образующихся в предлагаемой технологии солевых стоков в качестве основы для приготовления питательной среды для культивирования дрожжей рода КІиууеготусеБ - продуцентов (З-галактозидазы.

Практическая значимость.

Разработана комплексная малоотходная технология переработки молочной сыворотки с получением биологически активных продуктов белковой природы (лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов, белкового гидролизата, (3-галактозидазы). Предлагаемая технология включает стадии ультраконцентрирования с использованием полупроницаемых мембран, ионообменную хроматографию на сорбенте карбоксиметилцеллюлозе, высаливание сульфатом аммония, ферментативный гидролиз, культивирование, дезинтеграцию клеток дрожжевой биомассы, осаждение в изоэлектрической точке. Разработаны способы очистки полученных белковых продуктов.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на международной научно-практической конференции в рамках повышения квалификации «Технология молочных и молокосодержащих продуктов» (Ставрополь, 2008); Международных конференциях молодых ученых «Успехи в химии и химической технологии» (Москва, 2008, 2009, 2011); 6-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, 2009); V и VI Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011); 3-ей конференции молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях (Москва, 2009); Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов» (Москва, 2011); Научно-практическом семинаре «Феномен молочной сыворотки: синтез науки, теории и практики» в рамках международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2011).

ГЛАВА І. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Рытченкова, Ольга Владимировна

выводы

1. Разработана принципиальная схема комплексной переработки молочной сыворотки, позволяющая получить биологически активные продукты белковой природы: лактоферрин, лактопероксидазу, иммуноглобулины, белковый гидролизат и (3-галактозидазу.

2. Обоснован выбор схемы фракционирования молочной сыворотки, основанной на ультрафильтрационном разделении и позволяющей получить следующие фракции: 1) фракцию, обогащенную лактоферрином, лактопероксидазой и иммуноглобулинами; 2) фракцию, обогащенную сывороточным альбумином крови, (3-лактоглобулином и а-лактоальбумином; 3) депротеинизированную молочную сыворотку.

3. Подобраны условия выделения лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулинов, включающие стадии ионного обмена, высаливания, ультрафильтрации и диафильтрации, позволившие достичь выхода вышеперечисленных белков не менее 90% от их исходного содержания в молочной сыворотке.

4. Подобраны условия получения белкового гидролизата со степенью гидролиза белка не. менее 98% и содержанием аминного азота 21,8%, предполагающие обработку фракции главных сывороточных белков с начальной концентрацией белка 20 г/л ферментным препаратом химопсином в количестве 3% от массы субстрата.

5. Показана возможность использования депротеинизированной молочной сыворотки и минеральных стоков в качестве основы питательной среды для культивирования дрожжей К1иууеготусез татапт, что позволяет получить биомассу с активностью по (3-галактозидазе 486 ед/г.

6. Подобраны условия выделения р-галактозидазы из нативной биомассы дрожжей КI иу V е го ту с е 5 таг .истин, включающие стадии дезинтеграции клеток, концентрирования и осаждения в изоэлектрической точке и позволяющие получить ферментный препарат с активностью 24400 ед/г, что сопоставимо с активностью известных коммерческих препаратов.

7. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка реализации разработаной технологии переработки молочной сыворотки при расчетной мощности производства 30 ООО тонн/год по перерабатываемому сырью. Предварительный расчет эколого-экономического эффекта от внедрения разработанной технологии с выбранной мощностью показал, что экономия средств за счет снижения расходов на переработку отходов превысит 3,6 млн руб/год.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Рытченкова, Ольга Владимировна, Москва

1. Кравченко Э.Ф. Использование молочной сыворотки в России и зарубежом / Э.Ф. Кравченко, Т.А. Волкова // Молочная промышленность. 2005. №4. С. 5658.

2. Храмцов А.Г. Технология продуктов из вторичного молочного сырья: Учебное пособие / А.Г. Храмцов, C.B. Василисин, С.А. Рябцова, Т.С. Воротникова. СПб.: ГИОРД, 2009. - 424 с.

3. Храмцов А.Г. Молочная сыворотка / А.Г. Храмцов. М.: Агропромиздат, 1990 г.-240 с.

4. Храмцов А.Г. Технология продуктов из молочной сыворотки / А.Г. Храмцов, П.Г. Нестеренко. М.: Дели принт, 2004 г. - 587 с.

5. Остроумов J1.A. Удаление минеральных элементов из концентратов сывороточных белков / J1.A. Остроумов, Г.Б. Гаврилов // Молочная промышленность. 2006. №2. С. 82.

6. Зобкова З.С. Использование функциональных пищевых ингредиентов творожной сыворотки / З.С. Зобкова, С.А. Щербакова // Молочная промышленность. 2007. №3. С. 44-46.

7. Евдокимов И.А. Современное состояние и перспективы переработки молочной сыворотки / И.А. Евдокимов // Молочная промышленность. 2006. №2. С. 18-21.

8. Гапонова JI.B. Переработка и применение молочной сыворотки / Л.В. Гапонова, Т.А. Полежаева, Н.В. Волотовская // Молочная промышленность. 2004. №7. С. 52-53.

9. Еникеев А.Ф. Пути совершенствования переработки молочной сыворотки / А.Ф. Еникеев, А.К. Какимов, Ж.Х. Какимова, A.C. Темиргалиева // Молочная промышленность. 2006. №2. С. 41-42.

10. Гаврилов Г.Б. Реологические свойства сывороточных белковых концентратов / Г.Б. Гаврилов// Молочная промышленность. 2006. №4. С. 82.

11. Евдокимов И.А. Осветление творожной сыворотки природным полимером хитозаном / И.А. Евдокимов, С.В. Василисин, М.С. Золотарева, Е.В. Воробьев // Молочная промышленность. 2005. №10. С. 61-63.

12. Козлов С.Г. Свойства макроколлоидов пектина в присутствии творожной сыворотки / С.Г. Козлов, А.Ю. Просеков, Н.В. Кааль // Молочная промышленность. 2005. №11. С. 45.

13. Рябцева С.А. Технология лактулозы: Учебное пособие / С.А. Рябцева. М.: ДеЛи принт, 2003. - 232 с.

14. Severin S. Milk biologically active components as nutraceuticals: review / S. Severin, X. Wenshui // Critical Reviews in Food Sciense and Nutrition. 2005. 45(7-8). P. 645-656.

15. Sawyer L. The core liposalin, bovine ß-lactoglobulin / L. Sawyer, G. Kontopidis // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. 1482. P. 136-148.

16. Kontopidis G. Invited Review: ß-lactoglobulin: Binding Properties, Structure and Function / G. Kontopidis, C. Holt, L. Sawyer // Journal Dairy Science. 2004. 87. P. 785-796.

17. Adams J.J. Structure of bovine ß-lactoglobulin (variant A) at very low ionic strength / J.J. Adams, B.F. Anderson, G.E. Norris, L.K. Creamer, G.B. Jameson // Journal of Structural Biology. 2006. V. 154 (3). P. 246-254.

18. Liu H. Antioxidant Nature of Bovine Milk ß-Lactoglobulin / H. C. Liu, W. L. Chen, S. J. T. Mao // Dairy Science. 2007. 90. P. 547-555.

19. Fogolari F. Monomeric bovine ß-lactoglobulin adopts a ß-barrel fold at pH 2 / F. Fogolari, L. Ragona, L. Zetta, S. Romagnoli, K.G. De Kruif, H. Molinaria // FEBS Letters. 1998. 436. P. 149-154.

20. Богатова O.B. Химия и физика молока: Учебное пособие / О.В. Богатова, Н.Г. Догарева. Оренбург: ГОУ ОГУ, 2004. - 137 с.

21. Havea P. The roles of disulphide and non-covalent bonding in the functional properties of heat-induced whey protein gels / P. Havea, A.J. Carr, L. K. Creamer // Journal of Dairy Research. 2004. 71. P. 330-339.

22. Башаева Д.В. Изменение белков молока при тепловой обработке / Д.В. Башаева, P.P. Хаертдинов // Молочная промышленность. 2008. №7. С. 74-75.

23. Ikeda S. Raman spectroscopy of heatinduced fine-stranded and particulate beta-lactoglobulin gels / S. Ikeda, E. C. Y. Li-Chan // Food Hydrocolloids. 2004. V. 18. P. 489-498.

24. Krebs M.R. Amyloid Fibril-Like Structure Underlies the Aggregate Structure across the pH Range for b-Lactoglobulin / M.R. Krebs, G.L. Devlin, A.M. Donald // Biophysical Journal. 2009. V.96. P. 5013-5019.

25. Kim J.I. Separation of Whey Proteins by Anion-Exchange Membranes / J.I. Kim, D.Y. Choi, K.H. Row // Korean J. Chem. Eng. 2003. 20(3). P. 538-541.

26. Токаев Э.С. Сывороточные белки для функциональных напитков / Э.С. Токаев, Е.Н. Баженова, Р.Ю. Мироедов // Молочная промышленность. 2007. №10. С. 55-56.

27. Euston S.R. Denaturation and aggregation of b-lactoglobulin a preliminary molecular dynamics study / S.R. Euston, S. Ur-Rehman, G. Costello // Food Hydrocolloids. 2007. 21. P. 1081-1091.

28. Фелик С.В. Белковые компоненты продуктов для детей дошкольного и школьного возраста / С.В. Фелик, А.Ю. Золотин, Т.А. Антипова // Молочная промышленность. 2010. №5. С. 28-30.

29. Ногаллер А. М. Пищевая аллергия / A.M. Ногаллер. М.: Медицина, 1983. -192 с.

30. Shen X. Q. Effect of enzymic hydrolysis on the antigenicity of whey proteins / X. Q. Shen, H. Zheng, Y. K. Luo // Chin Dairy Industry. 2006. 34 (6). P. 12-15.

31. Vandenplas Y. The use of hydrolisates in allergy prevention programmes / Y. Vandenplas // Eur. J. Clin. Nutr. 1995. 49(1). P. 84- 86.

32. Permyakov E.A. Minireview a-Lactalbumin: structure and function / E.A. Permyakov, L.J. Berliner// FEBS Letters. 2000. 473. P. 269-274.

33. Vanhooren A. Structural Basis for Difference in Heat Capacity Increments for Ca-Binding to Two a-Lactalbumins / A. Vanhooren, K. Vanhee, K. Noyelle, Z. Z. Majer, M. Joniau, I. Hanssens // Biophysical Journal. 2002. V.82. P. 407-417.

34. Rosner H.I. The Human a-Lactalbumin Molten Globule: Comparison of Structural Preferences at pH 2 and pH 7 / H.I. Rosner, C. Redfield // J. Mol. Biol. 2009. 394. P. 351-362.

35. Chowdhury F.A. A comparative study of the a-subdomains of bovine and human a-lactalbumin reveals key differences that correlate with molten globule stability / F.A. Chowdhury, D.P. Raleigh // Biochemistry. 2004. V.43. 31.

36. Ashton L. pH-Induced conformational transitions in a-lactalbumin investigated with two-dimensional Raman correlation variance plots and moving windows / L. Ashton, E.W. Blanch // Journal of Molecular Structure. 2010. 974. P. 132-138.

37. Do S.I. Novel induction of a-lactalbumin-mediated lacdiNAc-R expression in vivo / S.I. Do, K.Y. Lee, H.N. Kim // Biochemistry. 2000. 348. P. 229-234.

38. Sluyser M. Application of Apoptosis to Cancer Treatment / M. Sluyser // Publisher: Springer. 2005. P. 370.

39. Yang J.F. Structural changes of a-lactalbumin induced by low pH and oleic acid / J.F. Yang, M. Zhang, J. Chen, Y. Liang // Biochimica et Biophysica Acta. 2006. 1764. P. 1389-1396.

40. Патент IL 162244 B. Infant formula compositions comprising increased amounts of alpha-lactalbumin / R. Hachayal. US 60/343253; filed 21.12.2001; pub. date 17.02.2010.-30 p.

41. Патент US 2004/0077539 Al, Int. CI. A61K 47/00, A61K 38/38. Alpha-lactalbumin as prebiotic agent / K. Maase. № 012003653; filed 01.02.2001 (EP); pub. date 22.04.2004. - 11 p.

42. Патент EP 2002/001241. Int.CI. A23C 19/09, A23C 9/13, A23J 1/20. Alpha-lactalbumin as prebiotic agent / K. Maase, J. Steijns. № 012003653; filed 01.02.2001; pub. date 01.02.2002. - 5 p.

43. Патент US 2006/0229436 Al, Int. CI. C07K 14/76. Lactalbumin production process/ C. Svanborg, P.A. Hakansson, M.W. Svensson. № 9724725.8; filed 21.11.1997 (GB); pub. date 12.10.2006. - 23 p.

44. Патент US 2008/0167233 Al, Int. CI. A61K 38/38, A61P 31/12. Active complex of alpha-lactalbumin (HAMLET) and cofactor / C. Svanborg. № 0210464.4; filed 08.05.2002 (GB); pub. date 10.07.2008. - 9 p.

45. Патент US 2009/0325872 Al, Int. CI. A61K 38/38, C07K 14/76, A61P 3/00. Use of alpha-lactalbumin for regulations of glycemia / D. Tome, J.F. Huneau, T. Mikogami, B. Laplaize. № 0603810; filed 27.04.2006 (FR); pub. date 31.12.2009. -12 p.

46. Ройт А. Основы иммунологии / А. Ройт. M.: Мир, 1991. - 327 с.

47. Butler J.E. Bovine immunoglobulins: Review / J.E. Butler // J. Dairy Sci. 1969. V.52. №12. P. 1895-1909.

48. Патент CA 2171607 Al, Int. CI. C07K 16/04, A61K 39/395. Method of obtaining Immunoglobulins from Colostrum and Their Use in Pharmaceutical Composition / C.J. Graham. № 1314-; filed 20.09.1993; pub. date 30.03.1995,- 25 c.

49. Chan L.E. Thermal stability of bovine milk immunoglobulin G and the effect of added thermal protectants on the stability / L.E. Chan, A. Kummer, J.N. Losso, D.D. Kitts, S. Nakai // Food Res Int J. 1995. 28. P. 9.

50. Mehra R. Milk immunoglobulins for helth promotion / R. Mehra, P. Marnila, H. Korhonen // International Dairy Journal. 2006. 16. P. 1262-1271.

51. Пол. У. Иммунология. Пер. с англ./ У. Пол. М.: Мир, 1987. - 204 с.

52. Ильина A.M. Технология получения биологически активного комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» из вторичного молочного сырья. Дис. канд. техн. наук: 05.18.07 / A.M. Ильина. Москва, 2009. - 193 с.

53. Perre P.V. Protection of newborns through Maternal Immunization. Transfer of antibody via mother's milk / P.V. Perre // Vaccine. 2003. V.21. P. 3374-3376.

54. Патент РФ 2277421 CI, МПК A61K 35/12, A61K 35/20. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива рогатого скота/ Ю. Н. Федоров, И.Ю. Ездакова, Т.А. Чеботарева. № 2005109539/15; заявл. 05.04.2005; опубл. 10.06.2006. Бюл. №16.-6 с.

55. Тюриков Ю.М. Разработка препарата иммуноглобулина для внутривенного введения и использование его для терапии иммунодицитных состояний. Автореф. дис. . канд. медиц. наук: 14.00.36 / Ю.М. Тюриков. Москва, 2008. -28 с.

56. Abdallah F.B. Transferrins: iron release from lactoferrin / F.B. Abdallah, J.M. El, H. Chahine // Journal of Molecular Biology. 2000. V.30. Issue 2. P. 255-266.

57. Gonzalez-Chavez S.A. Lactoferrin: structure, function and applications / S.A. Gonzalez-Chavez, S. Arevalo-Gallegos, Q. Rascon-Cmz // International Journal of Antimicrobial Agents. 2009. 33. P. 301.el-301.e8.

58. Abe H. Heat Stability of Bovine Lactoferrin at Acidic pH / H. Abe, H. S ai to, H. Miyakawa, Y. Tamura, S. Shimamura, E. Nagao, M. Tomita // Journal of Dairy Science. 1991. V. 74. Issue 1. P. 65-71.

59. Патент WO 2009/154447 Al, Int. Cl. A61K 38/40, A61K 47/26 Heat-stable,aqueous lactoferrin composition and its preparation and use / C. Linqiu, H. Maas. № 08158354.4; filed 16.06.2008 (EP); pub. date 23.12.2009. - 24 p.

60. Persson B.A. Molecular evidence of stereo-specific lactoferrin dimers in solution / B.A. Persson, M. Lund, J. Forsman, D.E.W. Chatterton, T. Akesson // Biophysical Chemistry. 2010. 151. P. 187-189.

61. Indyk H.E. Determination of lactoferrin in bovine milk, colostrum and infant formulas by optical biosensor analysis / H.E. Indyk, E.L. Filonzi // International Dairy Journal. 2005. Y.15. Issue 5. P. 429-438.

62. Ильина A.M. Повышение биологической ценности творога / A.M. Ильина, Г.С. Комолова, JI.B. Голубева, А.Н. Пономарев, А.А. Мерзликина // Молочная промышленность. 2011. №4. С. 74-75.

63. Патент US 2005/220953 Al, Int. Cl. A23C 1/00. Process of isolation lactoferrin / А.О.F. Lihme. № PA 200200348; filed 07.03.2002; pub. date 06.10.2005. - 17 p.

64. Соколов A.B. Структурно-функциональные характеристики взаимодействия церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой. Дисс. . канд. биол. наук: 03.00.04 / А.В. Соколов. Москва, 2007. - 148 с.

65. Baker E. N. Molecular structure, binding properties and dynamics of lactoferrin / E. N. Baker, H. M. Baker // Cell. Mol. Life Sci. 2005. 62. P. 2531 2539.

66. Бабина C.E. Лактоферрин как полифункциональная гидролаза молока человека. Дисс. . канд. хим. наук: 03.00.04 / С.Е. Бабина. Новосибирск, 2006. - 140 с.

67. Farnaud S. Lactoferrin -a multifunctional protein with antimicrobial properties / S. Farnaud, R.W. Evans // Mol. Immunol. 2003. 40(7) P. 395-405.

68. Патент US 2009/270309 Al, Int. CI. A61K 38/16, A61K 38/10, A61K 38/08. Use for lactoferrin fragments and hydrolysates / J. Cornich, I.R. Reid, K.P. Palmano. № 543031; filed 14.10.2005; pub. date 29.10.2009. - 50 p.

69. Arnold D. Antiadenovirus activity of milk proteins: lactoferrin prevents viral infection / D. Arnold, A.M. Di Biase, M. Marchetti, A. Pietrantoni, P. Valenti, L. Seganti, F. Superti // Antiviral Res. 2002. 53(2). P.153-158.

70. Van der Strate B.W. Antiviral activities of lactoferrin / B.W. Van der Strate, L. Beljaars, G. Molema, M.C. Harmsen, D.K. Meijer // Antiviral. Res. 2001. 52(3). P. 225-239.

71. Абатуров А.Е. Значение металлосвязывающих белков в неспецифической защите респираторного тракта. 1. Лактоферрин / А.Е. Абатуров // Здоровье ребенка. 2009. 4(19). С. 5-8.

72. Патент AU 2009225309 Al, Int. CI. А61К 38/40, A61L 15/32, С07К 14/79. Lactoferrin compositions and methods of wound treatment / E. Jose, V. Atul. pub. date 05.11.2009.-58 p.

73. Патент AU 2010200210 Al., Int. CI. A61K 38/40, C07K 14/00. Oral lactoferrin in the treatment of sepsis / K. Petrak, A. Varadhachary. pub. date 11.02.2010.- 46 p.

74. Патент US 2007/0259007 Al, Int. CI. A61K 45/00, A61P 43/00. Lactoferrin: an adjuvant for vaccines / M.L. Krizel, J.K. Actor. № 60/635414; filed 10.12.2004; pub. date 08.11.2007,- 19 p.

75. Патент WO 2009/009065 Al, Int. CI. A61K 38/16. Biofilm prevention using lactoferrin/ N. Cohen, B.J. O'Malley, A.G. Chiu, J.N. Palmer, J.D. Steiger. -60/929674; filed 09.07.2007; pub. date 15.01.2009. 34 p.

76. Tsuda H. Cancer prevention by bovine lactoferrin and underlying mechanisms-a review of experimental and clinical studies / H. Tsuda, K. Sekine, K. Fujita, M. Ligo // Biochem Cell Biol. 2002. 80(1). P.131-136.

77. Патент WO 2009/118771 А2, Int. CI. F23D 14/82. Use of lactoferrin for prevention of neonatal sepses in premature newborns / P. Manzoni, M. Acri. № RM 2008000163; filed 26.03.2008; pub. date 01.10.2009. - 27 p.

78. Wang Y.Z. Effect of dietary bovine lactoferrin on performance and antioxidant status of piglets / Y.Z. Wang, C.L. Xu, Z.H. An, J.X. Liu, J. Feng // Animal Feed Science and Technology. 2008. V.140. Issues 3-4. P. 326-336.

79. Патент ЕР 2196211 Al, Int. CI. А61К 38/21, А61К 38/40, А61Р 31/12. Apolactoferrin compositions and methods of the use thereof for treating viral hepatitis С / N.E. Shatunovsku. № 970159 P; filed 05.09.2007; pub. date 16.06.2010,- 18 p.

80. Ortiz de Montellano P.R. Peroxidases / P.R. Ortiz de Montellano // Comprehensive Toxicology. 2010. Chapter 4.09. P. 169-184.

81. Shin K. Identification of lactoperoxidase in mature human milk / K. Shin, M. Tomita, B. Lonnerdal // The Journal of Nutritional Biochemistry. 2000. V.ll. Issue 2. P. 94-102.

82. Haberska К. Activity of lactoperoxidase when adsorbed on protein layers / K. Haberska, O. Svensson, S. SShleev, L. Lindh, T. Arnebrant, T. Ruzgas // Talanta. 2008. 76. P.1159-1164.

83. Kussendrager K.D. Lactoperoxidase: physico-chemical properties, occurrence, mechanism of action and applications / K.D. Kussendrager, A.C. Hooijdonk // British Journal of Nutrition. 2000. 84 (1). P. 19-25.

84. Huang L. Heme-protein covalent bonds in peroxidases and resistance to heme modification during halide oxidation / L. Huang, R. Paul, O. de Montellano // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2006. V.446. Issue 1. P. 77-83.о

85. Singh A.K. Crystal Structure of Lactoperoxidase at 2.4 A Resolution / A.K. Singh, S. Sharma, S.B. Singh, P. Kaur, A. Bhushan, A. Srinivasan, P. Tej // Journal of Molecular Biology. 2008. V.376. Issue 4. P. 1060-1075.

86. Патент US 5164312, Int. CI. C12N 9/96, C12N 9/08. Method for stabilizing the enzyme lactoperoxidase in products / K.E.L. Bjorck. № 86029048; filed 30.06.1986 (SE); pub. date 17.11.1992. - 3 p.

87. Langbakk B. Demonstration and partial purification of lactoperoxidase from human colostrum / B. Langbakk, T. Flatmark // FEBS 1753. 1984. V. 174. № 2. P. 300-303.

88. Shin K. Identification of lactoperoxidase in mature human milk / K. Shin, M. Tomita, B. Lonnerdal // The Journal of Nutritional Biochemistry. 2000. V.l 1. Issue 2. P. 94-102.

89. Boots J.W. Lactoperoxidase: From catalytic mechanism to practical applications / J.W. Boots, R. Floris // International Dairy Journal. 2006. V.16. Issue 11. P. 12721276.

90. Althaus R.L. Analysis Time and Lactation Stage Influence on Lactoperoxidase System Components in Dairy Ewe Milk / R.L. Althaus, M.P. Molina, M. Rodriguez, N. Fernandez // Journal of Dairy Science. 2001. V.84. Issue 8. P. 1829-1835.

91. Haddadin M. S. Preservation of raw milk by activation of the natural lactoperoxidase systems / M.S. Haddadin, S.A. Ibrahim, R.K. Robinson // Food Control. 1996. V. 7. Issue 3. P. 149-152.

92. Шидровская В.П. Ферменты сырого молока и их роль в оценке его качества / В.П. Шидловская // Молочная промышленность. 2009. №1. С. 10-12.

93. Cankaya М. Effects of bovine milk lactoperoxidase system on some bacteria / M. Cankaya, M. Sisecioglu, O. Baris, M. Gulluce, H. Ozdemir // Prikl Biokhim Mikrobiol. 2010. 46(1). P. 64-68.

94. Ozer B.H. Natural antimicrobial systems. Lactoperoxidase and Lactoferrin / B.H. Ozer//Encyclopedia of Food Microbiology. 2004. P. 1587-1591.

95. Seifu E. Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: a review / E. Seifu, E.M. Buys, E.F. Donkin // Trends in Food Science & Technology. 2005. V.16. Issue 4. P. 137-154.

96. Овчинникова O.E. Лактопероксидазная система консервирования сырого молока / O.E. Овчинникова, Г.С. Комолова // Молочная промышленность. 2008. №9. С. 69-70.

97. Патент US 6312687 Bl, Int. CI. А61К 38/54, А61К 38/43. Stabilized lactoperoxidase and glucose oxidase concentrate / W.G. Guthrte, D.V. Roper. № 9708641; filed 29.04.1997 (GB); pub. date 06.11.2001. - 7 p.

98. Патент JP 1230600 Al. Isolation of an immunoglobulin rich fraction from whey. pub. date 14.09.1989.

99. Metsamuuronen S. Enrichment of a-lactalbumin from diluted whey with polymeric ultrafiltration membranes / S. Metsamuuronen, M. Nystrom // Journal of Membrane Science. 2009. 337. P. 248-256.

100. Portugal C.A.M. Effect of physicochemical conditions on the ultrafiltration of P-lactoglobulin: Fluorescence probing of induced structural change / C.A.M. Portugal, J.C. Lima, J.G. Crespo // Journal of Membrane Science. 2008. 321. P. 69-80.

101. Практикум по биохимии: учебное пособие / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 195 с.

102. Сова В.В. Выделение и очистка белков. Методическое пособие по курсу «Химия и биохимия белков и ферментов» / В.В. Сова, М.И. Кусайкин. -Владивосток: Изд. Дальневост. Ун-та, 2006. 42 с.

103. Патент ЕР 1234507 Al, Int. CI. A23J 1/20, А23С 9/146. Process for isolating beta-lactoglobulin from milk or milk fractions / H.H.J. De Jongh № 01200710.0; filed 26.02.2001; pub. date 28.08.2002. - 13 p.

104. Овчинникова O.E. Разработка технологии биологически активного препарата на основе защитного комплекса молока и куриного лизоцима. Дис. . канд. техн. наук: 05.18.04 / О.Е. Овчинникова. Москва, 2008. - 193 с.

105. Патент РФ 2390253 С1, МПК A23J 2/20, F23J 3/08. Способ получения лактоферрина из молочного сырья / З.С. Зобкова, А.В. Мишина, Г.В. Шехватова, В.В. Смолянинов. № 2008151488/13; заявл. 25.12.2008; опубл. 27.05.2010. Бюл. №15.-5 с.

106. Патент AU 613688, Int. CI. A23J 001/20, С07К 003/28. Process for extracting pure fractions of lactoperoxidase and lactoferrin from milk serum / H. Burling. № 8704719; filed 27.11.1987; pub. date 14.06.1989. - 18 p.

107. Патент US 5149647, Int. CI. C12N 9/08, C07K 3/22. Process for extracting pure fractions of lactoperoxidase and lactoferrin from milk serum / H. Burling. № 88/00643; filed 25.11.1988; pub. date 22.09.1992. - 7 p.

108. Патент ЕР 1466923 Al, Int. CI. C07K 14/79, A23C 9/146. Method for producing lactoferrin / S. Akinori, К Saitama. № 2003098597; filed 01.04.2003; pub. date 13.10.2004,- 10 p.

109. Патент ЕР 1234507 Al, Int. CI. A23J 1/20, A23C 9/146. Process for isolating beta-lactoglobulin from milk or milk fractions / H.J. De Jongh. № 01200710; filed 26.02.2001; pub. date 28.08.2002. - 13 p.

110. Патент WO 97/27757, Int. CI. A23C 9/146, 21/00, 21/06, A23J 1/20, 3/08. Production of an immunoglobulin enriched fraction from whey protein solutions / J.S. Ayers, M. Pritchard. № 280916; filed 31.01.1996; pub. date 07.08.1997. 27 p.

111. Патент CA 1196310 Al, Int. CI. C25B 7/00. A process for the separation of immunoglobulins from colostrum / R. Goudal, P. Huart, V. Sanches, J. Mahenc. № 8201230; filed 27.01.1982; pub. date 05.11.1985. - 16 p.

112. Wu M.B.M. Isolation and Purification of Lactoferrin and Immunoglobulin G from Bovine Colostrum with Serial Cation-Anion Exchange Chromatography / M.B.M. Wu, Y.J Xu // Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2009. 14. P. 155160.

113. Патент US 005986063 A, Int. CI. C07K 1/18, C07K 14/435, A23J 1/20. Isolating (3-lactoglobulin and a-lactalbumin by eluting from a cation exchanger without sodium chloride / M.R. Etzel. pub. date 16.11.1999. - 16 p.

114. Pedersen L. Whey Proteins as a model system for chromatographic separation of proteins / L. Pedersen, J. Mollerup, E. Hansen, A. Jungbauer // Journal Chromatography B. 2003. 790. P. 161-173.

115. Goodall S. Selective Separation of the Major Whey Proteins Using Ion Exchange Membranes / S. Goodall, A.S. Grandison, P.J. Jauregi, J. Pricetv // Dairy Sci. 2008. 91. P. 1-10.

116. Bhattacharjee S. Studies on the fractionation of (3-lactoglobulin from casein whey using ultrafiltration and ion exchange membrane chromatography / S. Bhattacharjee, C. Bhattacharjee, S. Datta // Journal of Membrane Science. 2006. 275. P. 141-150.

117. Патент US 4782138, Int. CI. A23J 1/20. Process for selectively separating the alpha-lactalbumin from the proteins of whey / J. Rialland, J. Barbier. № 8509153; filed 17.06. 1985; pub. date 01.11.1988. - 5 p.

118. Патент WO 92/03468, Int. CI. C07K 3/00, 3/24, C07K 3/28, 13/00, 15/06. Method for isolating alpha-lactalbumin from whey / W.E. Heine, P.D. KlEin, C. Miyashita. № 91/060447; filed 23.08.1991; pub. date 05.03.1992. - 25 p.

119. Lucena M.E. Lactalbumin precipitation from commercial whey protein concentrates / M.E. Lucena, S. Alvarez, C. Menendez, F.A. Riera, R. Alvarez // Separation and Purification Technology. 2007. 52. P. 446-453.

120. Патент РФ №1709606, МПК A61K 35/20. Способ получения лактоферрина / Р.И. Якубовская, Е.Р. Немцова, Н.И. Казачкина, В.И. Борисов, В.И. Чиссов. -№ 4808706/14; заявл. 01.03.1990; опубл. 27.01.2000. Бюл. №4.

121. Rodrigues L.R. Partitioning and separation of a-lactalbumin and (3-lactoglobulin in polyethylene glycol/ammonium sulphate aqueous two-phase systems / L.R. Rodrigues, A. Venancio, J.A. Teixeira // Biotechnology Letters. 2001. 23. P.1893-1897.

122. Monteiroa P.S. Partition of a-lactoalbumin and (3-lactoglobulin by cloud point extraction / P.S. Monteiroa, J.S. dos Reis Coimbra, L.A. Minima, J.A. de Oliveira, L.H. Mendes da Silva// Journal of Chromatography В 2008. 867. P. 189-193.

123. Liu L.J. Analysis molecular weight distribution on whey protein hydrolysates / L.J. Liu, C.H. Zhu, Z. Zhao // Food and boiproducts processing. 2008. 86. P. 1-6.

124. Донской H.C. Методы гидролиза белков молока / Н.С. Донской, А.Д. Лодыгин, А.Г. Храмцов // Сборник научных трудов СевКавГТУ. Серия «Продовольствие». 2010. №6. С. 19-21.

125. Кравченко Э.Ф. Состав и некоторые функциональные свойства белков молока / Э.Ф. Кравченко, Ю.Я. Свириденко, Н.В. Плисов // Молочная промышленность. 2005. №11. С. 42-45.

126. Лодыгин А. Д. Изучение кинетики ферментативного гидролиза сывороточных белков с использованием электроактивированных растворов / А.Д. Лодыгин, Л.А. Борисенко, А.В. Адоньев, Е.И. Ломидзе // Вестник СевКавГТУ. Серия «Продовольствие». 2004. №1 (7).

127. Максимюк Н.Н. О преимуществах ферментативного способа получения белковых гидролизатов / Н.Н. Максимюк, Ю.В. Марьяновская // Фундаментальные исследования. 2009. №1. С. 34-35.

128. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты: Получение, состав, применение Л.Я. Телишевская. М.: Аграрная наука, 2000. - 295 с.

129. Mota М. V. Enzymatic hydrolysis of whey protein concentrates: peptide HPLC profiles / M.V. Mota, M.B.P. Toliveira, C. Rocha // Liquid Chromatogr. Relat. Technol. 2004. 27 (16). P. 2625-2639.

130. Sinha R. Whey protein hydrolysate: Functional properties, nutritional quality and utilization in beverage formulation / R. Sinha, C. Radha, J. Prakash, P. Kaul // Food Chemistry. 2007. 101. P. 1484-1491.

131. Guadix A. Production of whey protein hydrolysates with reduced allergenicity in a stable membrane reactor / A. Guadix, F. Camacho, E.M. Guadix // Journal of Food Engineering. 2006. 72. P. 398-405.

132. Prieto С.A. A cyclic batch membrane reactor for the hydrolysis of whey protein / C.A. Prieto, A. Guadix, P. Gonzarlez-Tello, E.M. Guadix // Journal of Food Engineering. 2007. 78. P. 257-265.

133. Prieto C.A. Optimal operation of a protein hydrolysis reactor with enzyme recycle / C.A. Prieto, E.M. Guadix, A. Guadix // Journal of Food Engineering. 2010. 97. P. 24-30.

134. Bayram T. Antioxidant activity of whey protein fractions isolated by gel exclusion chromatography and protease treatment / T. Bayram, M. Pekmez, N. Arda, A.S. Yalcm // Talanta. 2008. 75. P. 705-709.

135. Nik A.M. Surface adsorption alters the susceptibility of whey proteins to pepsindigestion / A.M. Nik, A.J. Wright, M. Corredig // Journal of Colloid and Interface Science. 2010. 344. P. 372-381.

136. Galvao C.M.A. Producing a phenylalanine-free pool of peptides after tailored enzymatic hydrolyses of cheese whey / C.M.A. Galvao, G.A. Pinto, C.D.F. Jesus, R.C. Giordano, R.L.C. Giordano // Journal of Food Engineering. 2009. 91. P. 109117.

137. Донской Н.С. Способы выделения белка из молочной сыворотки / Н.С. Донской // Материалы XIII научно-технической конференции «Вузовская наука Северо-Кавказскому региону». Ставрополь, 2009. Т.1. - 217 с.

138. Lucena M. Beta-lactoglobulin removal from whey protein concentrates. Production of milk derivatives as a base for infant formulas / M. Lucena, E. Alvarez, C.S. Menendez // Sep. Purif. Technol. 2006. 52. P. 310-316.

139. Kleinman R. E. Use of infant formulas in infants with cow milk allergy a review and recommendation / R. E. Kleinman, S. Bahna // Pediatr. Allergy. Immunol. 1991. V.4.P. 146-155.

140. Sorva R. (3-Lactoglobulin secretion in human milk varies widely after cow's milk ingestion in mothers of infants with cow's milk allergy / R. Sorva, S. Makinen-Kiljunen, K. Juntunen-Backman // Allergy and Clinical Immunology. 1994. 93. P. 787-792.

141. Makinen-Kiljunen S. Bovine (3-lactoglobulin levels in hydrolised protein formulas for infant feeding / S. Makinen-Kiljunen, R. Sorva // Clin. Exp. Allergy. 1993. V.23. P. 287-291.

142. Залашко M.B. Биотехнология переработки молочной сыворотки /М.В. Залашко. М.: Агропромиздат, 1990. - 192 с.

143. Kaur G. Hydrolysis of whey lactose using CTAB-permeabilized yeast cells / G. Kaur, P.S. Panesar , M.B. Bera, H. Kumar // Bioprocess Biosyst Eng. 2009. 32. P. 63-67.

144. Aktas N. Optimization of lactose utilization in deproteinated whey by Kluyveromyces marxianus using response surface methodology (RSM) / N. Aktas, H. Boyaci, M. Mutlu, A. Tanyolac // Bioresource Technology. 2006. 97. P. 2252-2259.

145. Rollini M. Influence of substrate on (3-galactosidase production by Kluyveromyces strains / M. Rollini, V. Trinetta, A. Musatti, M. Manzoni // Annals of Microbiology. 2008. 58 (4). P. 705-710.

146. Rech R. Simplified feeding strategies for fed-batch cultivation of Kluyveromyces marxianus in cheese whey / R. Rech, M. Z. Ayub // Process Biochemistry. 2007. 42. P. 873-877.

147. Goncalves J.A. Partial Purification and Characterization of p-D-Galactosidase from Kluyveromyces marxianus / J.A. Goncalves, F.J. Castillo // Journal of Dairy Science. 1982. 1982. V. 65. Issure 11. P. 2088-2094.

148. Champluvier B. Preparation and properties of (3-galactosidase confined in cells of Kluyveromyces sp. / B. Champluvier, B. Kamp, P.G. Rouxhet // Enzyme and Microbial Technology. 1988. V.10. Issure 10. P. 611-617.

149. Fujimura Y. Purification and molecular characterization of p-galactosidase from yeast Kluyveromyces lactis / Y. Fujimura, S. Rokushika, M. Ohnishi // J. Biol. Macromol. 2003. 3(3). P. 97-103.

150. Сухих О.А. Получение препарата грибной (3-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности. Дис. . канд. техн. наук: 03.00.23 / О.А. Сухих. -Москва, 2007. 177 с.

151. Пилипенко О.С. Активность и стабильность (3-галактозидаз. Дис. . канд. хим. наук: 02.00.15 / О.С. Пилипенко. Москва, 2006. - 170 с.

152. Патент US 005514560 A, Int. CI. C12Q 1/54, G01N 33/573. Substrates for р-galactosidase / W.B. Manning, P. Khanna, G. Choate. pub. date 07.05.1996. - 6 p.

153. Гореликова Г.А. Основы современной пищевой биотехнологии: Учебное пособие / Г.А. Гореликова. Кемерово, 2004. - 100 с.

154. Gosling A. Recent advances refining galactooligosaccharide production from lactose / A. Gosling, G.W. Stevens, A.R. Barber, S. E. Kentish, S.L. Gras // Food Chemistry. 2010. 121 . P. 307-318.

155. Flores M.V. Permeabilization of yeast cells {Kluyveromyces lactis) with organic solvents / M.V. Flores, C.E. Voget, R.J.J. Ertola // Enzyme and Microbial Technology. 1994. V.16. Issure4. P. 340-346.

156. Stredansky M. Optimization of P-galactosidase extraction from Kluyveromyces marxianus / M. Stredansky, M. Tomaska, E. Sturdik, L. Kremnicky // Enzyme and Microbial Technology. 1993. V.15. Ussure 12. P. 1063-1065.

157. Joshi M.S. Permeabilization of yeast cells (Kluyveromyces fragilis) to lactose by digitonin / M.S. Joshi, L.R. Gowda, L.C. Katwa, S.G. Bhat // Enzyme and Microbial Technology. 1989. V.ll. Issure 7. P. 439-443.

158. Kippert F. A rapid permeabilization procedure for accurate quantitative determination of P-galactosidase activity in yeast cells / F. Kippert // FEMS Microbiology Letters. 1995. V. 128. Issure 2. P. 201-206.

159. Becerra M. Extraction of Intracellular Proteins from Kluyveromyces lactis / M. Becerra, E. Rodríguez-Belmonte, E. Cerdán, I. González Siso // Food technol. biotechnol. 2001. 39 (2). P. 135-139.

160. Silva M.E. Purification of microbial (3-galactosidase from Kluyveromyces fragilis by bioaffinity partitioning / M.E. Silva, T.T. Franco // Revista de Microbiologia. 1999. 30. P. 324-331.

161. Патент РФ 2249971 C2, МПК A23C21/00, A23C21/02, A23C21/10. Способ производства безлактозного продукта из молочной сыворотки / Е.Г. Нечаев, А.Р. Панченко, М.С. Тюльпанов. №2002134314/13; заявл. 19.12.2002; опубл. 20.04.2005.

162. Лодыгин А.Д. Теоретические предпосылки и технология получения производных лактозы галактоолигосахаридов / А.Д. Лодыгин, А.В. Серов, А.Б. Рябцева // Вестник СевКавГТУ. 2006. № 3 (7). ISBN 5-9296-0310-3

163. Ovsejevi К. Development of a continuous solid phase process for reduction and thiol-dependent immobilization of yeast (3-galactosidase / K. Ovsejevi, K. Cuadra, F. Batista-Viera // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009. 57. P. 188-193.

164. Numanoglu Y. (3-Galactosidase from Kluyveromyces lactis cell disruption and enzyme immobilization using a cellulose-gelatin carrier system / Y. Numanoglu, S. Sungur // Process Biochemistry. 2004. 39. P. 703-709.

165. Inchaurrondo V.A. Yeast Growth and (3-galactosidase production during aerobic bath cultures in lactose-limited synthetic medium / V.A. Inchaurrondo, O.M. Yantomo, C.E. Voget// Process Biochemistry. 1994. V.29 (1). P. 47-54.

166. Domingues L. Aspergillus niger ß-galactosidase production by yeast in a continuous high cell density reactor / L. Domingues, N. Lima, J.A. Teixeira // Process Biochemistry. 2005. №40. P. 1151-1154.

167. Общая биотехнология. Лабораторный практикум: учебное пособие / И.В. Шакир, A.A. Красноштанова, Е.В. Парфенова, H.A. Суясов, Е.С. Бабусенко, В.Д. Смирнова. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2008. - 120 с.

168. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. МУК 4.2.2316-08.

169. Чешкова A.B. Ферменты и технологии для текстиля, моющих средств, кожи, меха: Учебное пособие для ВУЗов / A.B. Чешкова. И.: ГОУВПО ИГХТУ, 2007.-282 с.

170. Фримель Г. Иммунологические методы / Г. Фримель. Изд.: Медицина, 1987.-476 с.

171. Полыгалина Г.В. Определение активности ферментов. Справочник / Г.В. Полыгалина, B.C. Чередниченко. М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 с.

172. Гаврилов Г.Б. Современные аспекты переработки молочной сыворотки мембранными методами /Г.Б. Гаврилов. Кемерово: Кузбассвузиздат, 2004. 160 с.

173. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот/ Л.А. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.

174. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н.Б. Градова, Е.С. Бабусенко, И.Б. Горнова, H.A. Гусарова. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 1999. - 130 с.

Информация о работе

Рытченкова, Ольга Владимировна
кандидата технических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Получение биологически активных продуктов белковой природы при комплексной переработке молочной сыворотки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы