Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование полиморфизма ферментных и других белков женского молока в связи с репродуктивной функцией женщин и соматотипом новорожденных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование полиморфизма ферментных и других белков женского молока в связи с репродуктивной функцией женщин и соматотипом новорожденных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАМН

<"- • <"■'.: на правах рукописи

УДК 575.599.9

БЫЧКОВСКАЯ Любовь Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ФЕРМЕНТНЫХ И ДРУГИХ БЕЛКОВ ЖЕНСКОГО МОЛОКА В СВЯЗИ С РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИЕЙ ЖЕНЩИН И СОМАТОТИПОМ НОВОРОЖДЕННЫХ

(03.00.15. - ГЕНЕТИКА)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

^ч»

Работа выполнена в лаборатории экологической генетики Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор В.А. Слицын

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, С.С. Шишкин кандидат медицинских наук, доцент А.Н. Прытков

Ведущее научное учреждение: Институт общей генетики РАН им. Н.И. Вавилова

Защита диссертации состоится " / * СС*ОК<Х 1998 г. в час, на заседании Диссертационного совета Д.001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН (МГНЦ РАМН) (115478, Москва, Москворечье, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН

Автореферат разослан •У 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Развитие современной теоретической и практической медицины характеризуется неуклонно возрастающим использованием генетичеких методов. Поскольку с генетической точки зрения организм любого человека имеет неповторимые характеристики, то результат взаимодействия любого организма с различными влияющими на него факторами среды будет строго индивидуальным.

Научная медицина всегда стремилась не только к познанию механизмов общих реакций организма, но и их специфических проявлений у конкретного индивида. По мере накопления знаний о закономерностях индивидуального развития организма человека становится все более ясным, что процессы роста и развития, включая постнатальный период, представляют собой реализацию в определенных условиях среды генетической программы, унаследованной индивидом от своих родителей.

Одной из актуальных и малоизученных проблем медицинской генетики является проблема влияния генетически обусловленных признаков материнского организма на развитие плода и последующее постнатальное развитие новорожденного.

Проблема здоровья новорожденных всегда была в центре внимания в педиатрической практике. Активный рост и развитие ребенка сопровождаются большими затратами энергии, обусловливающими необходимость поступления в организм достаточного количества строго сбалансированных и легко усвояемых пищевых компонентов. Детальное изучение основных компонентов женского молока показало высокую усвояемость и соответствие их структуры возможностям желудочно-кишечного тракта ребенка. Таким образом, исследования состава и свойств грудного молока, проведенные в последние годы, позволяют по-новому подойти к организации медицинской помощи беременной женщине и служат основанием для разработки новых методов профилактики всевозможных клинических нарушений. Чрезвычайно важны данные, полученные при изучении содержания в грудном молоке некоторых из основных

ингредиентов белкового состава, оценка корреляционных взаимоотношений этих данных с показателями физического развития новорожденных и репродуктивной функцией женщин, поскольку даже в случаях неблагоприятного влияния на плод в организме беременной женщины происходит компенсаторная оптимизация состава грудного молока и качественного его соответствия потребностям организма ребенка.

Многие метаболиты и питательные вещества проникают в молоко непосредственно из материнской крови, тогда как другие являются строго тканеспецифичными, т.е. экспрессируются только в молочной железе в период лактации, например, фосфоглюкомутаза четвертого локуса. Состав грудного молока может сильно варьировать в зависимости от разных причин, в том числе и генетических.

Основная информация о наследственном полиморфизме у человека ранее была получена преимущественно при исследовании генетических систем крови. Существующая до настоящего времени информация о генетической гетерогенности ферментных и других белков женского молока остается крайне фрагментарной. Существованйе тканевой специфичности в проявлении дискретной генетической изменчивости позволяет получить новые данные о структурной гетерогенности ферментных и других белков, проявляющихся в женском молоке в связи с перспективой познания их специфической функциональной нагрузки.

Изменчивость разных признаков оценивается по морфологическому, клиническому, биохимическому, иммунологическому или физиологическому фенотипу. К настоящему времени известны крайне фрагментарные данные о дискретной электрофоретической изменчивости белков, экскретируемых клетками молочной железы и поступающих к ребенку через молоко матери. Существуют немногочисленные сведения об электрофоретической гетерогенности казеиновых белков и специфического четвертого локуса фосфоглюкомутазы (РОМ4), изоферменты которого проявляются исключительно в женском молоке. Одновременно значительно возросло число работ о наличии сопряженности генетического полиморфизма в целом, с одной стороны, и морфо-физиологическими признаками и репродуктивными характеристиками - с другой.

Все вышеизложенное определило актуальность данною исследования, результаты которого смогут внести вклад в изучение организмов матери и ребенка как системы.

Цель работы.

Основной целью работы явилось углубленное продолжение изучения уже известных и установление новых структурных полиморфизмов ферментных и других белков женского молока в выборке женщин, преимущественно русской национальности, проживающих в Москве, установление связи этих полиморфизмов с морфофункциональными особенностями новорожденных и некоторыми физиологическими характеристиками рожениц.

Задачи исследования:

1) с помощью современных методов генетико-биохимического анализа выявить фенотипическое разнообразие ферментных и других белков женского молока в репрезентативной выборке женщин, преимущественно русской национальности, проживающих в Москве;

2) по полученным экспериментальным данным о дискретной изменчивости ферментных и других белков женского молока провести оценки частот фенотипов и генов, охарактеризовать соответствие наблюдаемых распределений фенотипов теоретически ожидаемым, определить величины гетерозиготности;

3) на основании имеющейся информации об антропометрических признаках новорожденных определить связь между полиморфными факторами изученных систем и особенностями соматотипа детей;

4) изучить возможную связь между некоторыми физиологическими признаками женщин (начало тепагсИе, наличие выкидышей, уровень лактации) с дискретными маркерными полиморфизмами, идентифицируемыми в женском мол оке.

Научная новизна.

Разработаны методы анализа, позволяющие установить дискретные полиморфные системы некоторых ферментных и других белков женского молока. В образцах молока идентифицированы различные варианты некоторых функционально различных белковых систем. Впервые обнаружены новые полиморфные маркеры: амилаза, лакгоэстераза и

лактоферрин женского молока. Впервые в представленной выборке женщин определены частоты аллелей локусов лактоэстеразы (ЕЗ), лактоферрина (1.Р) и амилазы (АМУ1). Принадлежность женщины к тому или иному типу фосфоглкжомутазы-4 и лактоферрина может быть связана с некоторыми антропометрическими признаками новорожденных. Показана зависимость между полиморфизмом фосфоглюкомутазыЧ < и такой репродуктивной характеристикой, как наличие/отсутствие выкидышей. Уровень лактации матерей оказался сопряженным с полиморфизмом амилазы-1 женского молока.

Практическая значимость работы.

Развитие современной теоретической и практической медицины характеризуется неуклонно возрастающим использованием генетических маркеров для исследования изменчивости в норме и при патологии. Результаты проведенных исследований могут представлять интерес для таких дисциплин, как биология в целом, генетика, педиатрия; иметь прикладное значение для разработки принципов оптимального питания новорожденных, прогнозирования их физического развития при учете генетических особенностей материнского организма. Данные могут быть полезны в клинической практике для анализа аномальных форм макросомии и микросомии у новорожденных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны методы анализа, позволяющие установить дискретные полиморфные системы некоторых ферментных и других белков женского молока - лактоэстеразы (ЕЗ), лактоферрина (1-Р) и амилазы (АМУ1).

2. Обнаружены новые полиморфные маркеры: амилаза, лактоэстераза и лактоферрин женского молока.

3. Установлены частоты аллелей локусов соответстующих маркеров, экспрессирующихся в женском молоке.

4. Принадлежность женщины к тому или иному типу фосфоглюкомугаэы-4 й лактоферрина может быть связана с некоторыми антропометрическими признаками новорожденных.

5. Показана зависимость между полиморфизмом фосфоглюкомутазы-4 и такой репродуктивной характеристикой, как наличие/отсутствие

выкидышей. Уровень лактации матерей сопряжен с дискретной генетической изменчивостью амилазы-1 женского молока.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на первом (третьем) Российском съезде медицинских генетиков (1994) и межлабораторном семинаре Института клинической генетики МГНЦ РАМН (1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объем работы. Работа изложена на 124 листах машинописного текста; состоит из "Введения", разделов "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение"Выводы" и списка цитированной литературы (17 отечественных и 134 зарубежных работ). В тексте диссертации представлены 14 рисунков и 14 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материал для исследования. В качестве источника биологического материала использовались образцы молока, собранные от 180 женщин, преимущественно русской национальности, в период лактации в первые пять суток после рождения ребенка в нескольких родильных домах Москвы. Одновременно проводился опрос рожениц согласно составленной нами карте:

1. Фамилия, имя, отчество роженицы:

2. Год рождения:

3. Место рождения:

4. Национальность:

5. Профессия:

6. Место рождения и национальность родителей роженицы:

Новорожденный ребенок:

7. Пол -; рост •; вас -; окружность головы-; грудной клетки -

8. Состояние здоровья новорожденного:

Характеристики роженицы:

9. Возраст начала тепагсИе:

10. Всего беременностей: а)эакончились родами; б)выкидышами; в) мед.обортами; г) мертпорождениями (причина смерти);

11. Уровень лактации:

12 Фамилия, имя, отчество отца:

13. Место рождения и национальность отца:

14. Место рождения и национальность родителей отца:

15. Наличие родственных связей матери и отца новорожденного:

Полученные образцы молока немедленно замораживались и в дальнейшем сохранялись в температурном режиме -7СРС до момента исследования без консерванта.

Для анализа использовалось обезжиренное молоко, обработанное четыреххлористым углеродом. Для этого образцы молока интенсивно встряхивались с четыреххлористым углеродом в соотношении 1/1 и центрифугировались при 10 ООО об/мин 30 мин при температуре 4°С. Исследованию подвергался отобранный супернатант, сохранявшийся в дальнейшем в рефрижираторе при температуре -20°С.

Методы исследования генетических маркеров. Поскольку методов исследования основной массы белков такого биологического материала как женское молоко практически не существует, мы разработали, опробовали и предложили новые модификации ранее применявшихся методов работы с такими источниками биологического материала, как кровь и слюна.

Изоферментный спектр фосфоглюкомутазы женского молока впервые исследовался методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в полиакриламидном геле. Для разделения изоферментов PGM* нами был применен метод (Kamboh M.J., Kirk R.L. 1984), ранее использовавшийся для идентификации эритроцитарных изоферментов PGM. Фенотипы фосфоглкжомутазы-4 определялись в 0,5 мм полиакриламидном геле методом изоэлектрофокусирования с использованием амфолинов фирмы LKB pH 5-7. Католитом и анолитом служили 1% растворы амфолинов фирмы LKB, характеризующиеся рН6-8 и рН4-6 соответственно. Режим изоэлектрофокусирования задавался параметрами, не превышающими следующие значения: для тока -15 тА, напряжения - 2000 V, мощности -18 W. Изоэлектрофокусирование проводилось в течение 2,5 часов при температуре 4°С. Идентификация изоферментных зон фосфоглюкомутазы достигалась путем применения субстрат-окрашивающей смеси по методу (Прокоп О., Гелер В. 1991).

Для определения полиморфизма изоферментов лактоэстеразы женского молока впервые был использован электрофоретический метод, применяемый для определения широкого спектра сывороточных белков (Altland К., Hackler R., Knoche W. 1980) в предложенной нами модификации

(Спицын В.А., Бычковская Л.С. 1994), заключающейся в изменении параметров режима злетрофореза для получения более четкой картины изоферментных зон данного маркера. Электрофоретический анализ осуществлялся в полиакриламидном геле в камерах вертикальной конструкции, которая позволяла одновременно проводить анализ 54 проб биологического материала. Режим электрофореза задавался параметрами, не превышающими следующие значения: для напряжения - 400 V, тока - 10 гпА, мощности - 85 W. Электрофорез проводился в таком режиме в течение 30 мин, затем порог стабилизации тока' поднимался до 30 тА и поддерживался до окончания электрофореза. В качестве стандарта для определения лактоэстеразы использовалась сывороточная холинэстераза. Идентификация изоферментов лактоэстеразы женского молока осуществлялась согласно общепринятой методике (Robson Е., Harris Н. 1966) с применением в качестве субстрата а-нафтилацетата, а в качестве красящего агента - Прочной красной TR-соли.

Для анализа полиморфизма а-амилазы женского молока был применен метод ИЭФ в полиакриламидном геле, предложенный в работе (Eskersall P.D., Beeley J.A. 1981) и используемый обычно для определения разновидностей амилазы слюны. ИЭФ проводилось в 1мм полиакриламидном геле с градиентом рН4-8 с применением амфолинов фирмы "Serva". Для полимеризации геля, в отличие от способа, предложенного в методике, мы использовали TEMED фирмы "Pharmacia" и персульфат аммония фирмы "Serva". ИЭФ проводилось при напряжении 1200V, мощности - 10W. После 30-минутного предизоэлектрофокусирования образцы женского молока наносились на гель в количестве 5 мкл на фрагментах из фильтровальной бумаги шведского производства Munkteil 1F. Одновременно с исследованием образцов молока в качестве контроля наносились образцы слюны, полученные вместе с молоком от одного и того же донора. После 30-минутного ИЭФ бумажные носители удалялись и дальнейшее фокусирование продолжалось еще 2 часа. Для идентификации одних и тех же изоферментов а-амилазы женского молока использовались два метода: 1) после ИЭФ гель погружался в боратный буфер, pH 8.3 (1,24г Н3ВО4+ 0,01 М NaOH с доведением общего объема дистиллированной водой до 1 л), содержащий 1% гидролизованного крахмала фирмы "Serva", где

выдерживался 30 минут при комнатной температуре (Eskersall P.D.. Beeley J.A. 1981); 2) в 100 мл дистиллированной воды растворяли: 0.5 г гидролиэованного крахмала, 0.02 г хлорида натрия и 1г агара фирмы "Difco". После предварительного кипячения и охлаждения инкубационной смеси до 37°С полученным раствором покрывали гель и выдерживали при комнатной температуре 30 минут. По истечении времени инкубации, агаровое покрытие удалялось, а гель подвергался дальнейшей обработке. Гели, инкубируемые первым и вторым способами, подвергались окрашиванию йодным раствором, содержащим в определенном соотношении KJ и J2 (2г KJ растворяли в Змл дистиллированной воды добавляли 1г J2 и общий объем раствора доводили до 100мл дистиллированной водой) в течение 1 - 2 мин. Отмывание гелей осуществлялось в дистиллированной воде до проявления прозрачных зон фермента на голубом фоне.

Для определения полиморфизма лактоферрина, белка женского молока, впервые был применен электрофоретический анализ в полиакриламидном геле по методу Altland (Altland К., Hackler R„ Knoche W. 1980) в предложенной нами модификации. Для получения более четких зон лактоферрина мы снизили pH анодного буфера с 8,1 до 7,7; также были введены изменения в режим электрофореза. Первоначальный электрофорез осуществлялся при ограничении параметров тока до 130 тА, напряжения -400 V, мощности - 85 W и прерывался после прохождения бромфеноловой линией 2/3 длины блока для внесения образцов. Предварительно подготовленные образцы в количестве 10 мкл вносились в гель. В пробы молока в соотношении 1/1 добавлялся 40% раствор сахарозы. В качестве белковых стандартов использовался набор для электрофореза с молекулярными весами от 14000 до 92000 фирмы "Pharmacia". Дополнительным стандартом служил трансферрин сыворотки крови. Электрофорез происходил при параметрах, не превышающих заданные ограничения: для тока - 51 тА, напряжения - 400 V и мощности - 85 W, до миграции альбумина сыворотки крови, окрашенного бромфенолом, до нижнего анодного края пластины геля. Идентификация зон лактоферрина осуществлялась после окрашивания гелей методом, предложенным в работе Altland (Altland К., Hackler R., Knoche W. 1980) с использованием кумасси R-250, сульфосалициловой кислоты, метанола и дистиллированной воды в

соотношении 0,1 г/3 г/30 мл/60 мл соответственно с последующим отмыванием гелей от красителя в 7% растворе уксусной кислоты.

Статистическая обработка данных. Расчеты фенотипических и генных частот, уровня наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностей осуществлялись стандартными методами, принятыми в популяционной генетике. Проводилась проверка соотношения наблюдаемого распределения фенотипов изученных систем теоретически ожидаемым в соответствии с законом Харди-Вайнберга. При оценивании доверительного интервала частот аллелей использована Бутстрепп - техника. Для определения величины связанности вариации показателей амилазы, лактоэстераэы, фосфоглюкомутазы-4 и лактоферрина с другими признаками использовался стандартный пакет программ Systat. Достоверность различий оценивалась с помощью множественного теста (поправки Бонферони).*

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Оценка фенотипических и генных частот систем: фосфоглюкомутазы (PGM 4), лактоэстераэы (Е 3), амилазы (Amy 1) и лактоферрина (LF) женского молока.

Оценка особенностей генетической структуры ферментных и других белковых систем, экспрессирующихся в женском молоке, безусловно, осложняется невозможностью проведения посемейного анализа, установления распределения генотипов у потомков на генетико-биохимическом уровне анализа этого материала.

Тем не менее косвенные подходы могут служить аргументами в пользу генетической обусловленности выявленных фенотипов и дать возможность определить характер наследования дискретного структурного полиморфизма:

* Автор приносит благодарность за консультативную помощь при статистической обработке данных ведущему научному сотруднику Института антропологии МГУ Дерябину В.Е.

1) наличие симметрии альтернативных форм конкретного электрофоретически проявляющегося белка; визуализация гибридных фракций или их удвоенного числа у гетерозиготных носителей, располагающихся на уровне обеих гомозигот при отсутствии гибридных зон;

2) проявление постоянства электрофоретической картины при последующих многократных исследованиях того же материала и наличие строго ограниченного числа фенотипов, легко классифицируемых на гомо- и гетерозиготные состояния;

3) установление соответствия наблюдаемого соотношения фенотипов теоретически ожидаемому согласно закону Харди-Вайнберга при проверке соответствующей генетической гипотезы.

Все эти условия были соблюдены при анализе фенотипического распределения изучаемых нами систем.

Фосфоглюкомутаза (PGM 4)

Впервые с помощью метода изоэлекгрофокусирования (ИЭФ) в полиакриламидном геле (ПААГ) исследовался изоферментный спектр фосфоглкжомутаэы женского молока. На рисунке № 1а и № 16 представлены фенотипы и изоформы PGM 4 образцов молока, полученные в исследуемой выборке с помощью метода ИЭФ.

а.

старт* 1-1 i-z 1-3 Z-2 Z-3 21

""" _ _ ея

Рис. № 1а. Схематическое изображение дискретных вариантов PGM 4 а. - фенотипы PGM 4.

craprf 2 1

Рис. № 16. Схематическое изображение дискретных вариантов PGM 4 б. - изоформы PGM 4 В результате исследований было выявлено 6. дискретных эпектрофоретических форм PGM 4, контролируемых 4 аллелями: PGM 4*1, PGM 4*2, PGM 4*3 и PGM 4*4. В таблице № 1 представлено распределение частот наблюдаемых фенотипов, в таблице № 2 представлены данные распределения генных частот системы PGM 4 в изученной нами выборхе женщин.

Таблица № 1

Распределение частот наблюдаемых фенотипов PGM 4 женского молока.

N наблюдаемые частоты фенотипов

1-1 1-2 1-3 2-2 2-3 2-4

180 11 70 2 72 15 10

Таблица № 2

аптШ PGM 4*1 . ' , PGM 4*3 % Г ; PGM 4*4 ,

частоты генов 0.260 0.662 0.053 0.025

доверительный интервал 0.217+0.297 0.608+0.714 0.036+0.072 0.011+0.039

х'ш 11.78 d.f.= 6 р > 0,05

Наблюдаемая гвтсрозиготность - 0,539 ± 0.037

Ожидаемая еетерозиаотность - 0.488 ± 0.023

%гт • точный критерий Фишера.

Градиент изменчивости генных частот исследуемой выборки в ряду их уменьшения располагается в следующем порядке: PGM4*2 > PGM4*1 > PGM4*3 > PGM4*4. С наибольшей частотой встречаются аллели PGM4*2 и PGM 4*1, тогда как два остальных аллеля отмечены значительно реже. Параметры наблюдаемой гвтерозиготности составили от 0.502 до 0.576, а ожидаемой гетерозиготности - от 0.465 до 0.511

Лактоэстораза (Е 3) Впервые в полиакриламидном геле методом электрофореза ло методу (Altfand К., Hackler R., Knoche W. 1980) был получен спектр изоформ фермента хоЛинэстеразы женского молока, получившего наименование лаетоэстераза третьего локуса (Е 3). На рисунке № 2 приводятся результаты электрофорвтического разделения лактоэстеразы. В качестве стандарта для сравнительного анализа использовалась сыворотка человека, в которой идентифицируются варианты псевдохолинэстеразы. Представляется очевидным, что изоферменты лактоэстеразы обнаруживают более высокую мобильность при электрофорезе по сравнению с соответствующими изоферментами сыворотки крови, определяемыми локусом Е2. В отличие от четырех или пяти элекгрофоретических фракций, иллюстрирующих холинэстеразную активность в образцах сыворотки крови, в образцах женского молока идентифицируются от одной до двух фракций, отличающихся по элекгрофоретической подвижности.

старт

фенотипа 1-1 1-2 1-3 2-2 2-3 Рис. № 2. Схематическое изображение дискретных вариантов Е3

При суммарном исследовании 180 образцов женского молока нам удалось выявить пять фенотипов Е3, обозначенных нами, как 1-1, 1-2,1-3, 22 и 2-3. В таблице Na 3 показано распределение частот фенотипов и аллелей исследуемого маркера.

Таблица № 3

Распределение частот фенотипов и аллелей лактоэстеразы покуса Еэ, экспрессирующегося в женском молоке.

Численность 1-1 1-2 1-3 2-2 2-3

наблюдаемая 116 46 9 7 2

ожидаемая 114,4 49,4 8,8 5,4 1,9

частоты фенотипов

частоты аллелей

аллоли

Е 3*1

Е 3*2

Е 3*3

частоты генов

0,797 ±0,021

0,172 ±0,020

0,031 ± 0.009

"0,05» р * 0,05

Наблюдаема я гетерозиготность = 0,317 ± 0.035

Ожидаемая гетврозиготность = 0,334 ± 0,027

Х,т - оценка соответствия равновесию Харди-Взйнберга

Из представленной табл. №3 видно, что наиболее вероятным представляется предположение, согласно которому установленные варианты Е5 контролируются тремя аллелями единого аутосомного кодоминантного локуса с соответствующими частотами Е3*1 =0.797, Е3*2=0.172 и Е3*3=0.031. Наблюдаемое распределение фенотипов лактоэстеразы удовлетворительно согласуется с теоретически ожидаемым в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга (хг=0.9569 при <±Г.=3, Р>0.05). Параметры наблюдаемой гетерозиготности составили от 0.282 до 0.352, ожидаемой гетерозиготности - от 0.307 до 0.361.

Амилаза (К.Ф. 3.2.1.1 ) Впервые методом изоэлектрофокусирования был идентифицирован изоферментный спектр а-амилазы женского молока. На рисунках N2 3 и 4 представлены результаты, полученные при исследовании изоферментного спектра а-амилазы, женского молока и цельной слюны, используемой в качестве контроля изоферментного спектра а-амилазы. При сравнительном анализе с помощью метода ИЭФ образцов а-амилазы молока и

используемой в качестве контроля а-амилазы слюны мы наблюдали идентичность расположения зон изоферментов. Пределы градиента рН электрофоретических вариантов по изоэлектрическим точкам для а-амилазы слюны хорошо известны (Eskersall P.D., Beeley J.A. 1981). Поскольку варианты амилазы женского молока совпадают с соответствующими вариантами амилазы слюны, мы сочли возможным характеризовать выявленные нами фенотипы по тем же изоэлектрическим точкам. При суммарном исследовании 180 образцов женского молока нам удалось выявить три фенотипа амилазы Amy 1*1-1, Amy 1*1-2, Amy 1 * 2-2.

Треки: 1, 2, 3 - образцы женского молока; трек: 4 - образец слюны

р|| старг*

е,5 ыств ££ ,ЕИЯ!И

7,0

треки 12 3 4

фенотипы 1-1 1-2 2-2 1-1

рис. № 3. Схематическое изображение дискретных вариантов амилазы (АМУ1) женского молока (метод идентификации № 1).

старт ■» рц

6.5 "®И" Еш " "

7,0

треки 12 3 4

фенотипы 1-1 1-2 2-2 1-1

рис. N0 4. Схематическое изображение дискретных вариантов амилазы (АМУ1) женского молока (метод идентификации № 2).

На представленных рисунках № 3 и №4 видно, что в области рН от 6,5 до 7,0 картина изоферментного спектра а-амилазы женского молока и цельной слюны, определяемые методом изоэлектрофокусирования, по

своей подвижности и расположению зон ферментной активности совпадают, тогда как в области рН от 7,3 до 7,5 второй метод идентификации позволил обнаружить на тех же гелях специфическую зону активности AMY, характерную только для женского молока. Это дает нам основание предположить, что в женском молоке, по-видимому, дополнительно существует особая тканеспецифическая амилаза, продуцируемая молочной железой и контролируемая, в отличие от общей амилазы слюны и молока, еще одним дополнительным локусом.

В таблице № 4 представлено распределение фенотипических и аллельных частот а-амилазы женского молока.

Таблица № 4

Распределение фенотипических и аллольных частот а-амилазы женского молока.

частоты t JOHOTVriOB

численность 1-1 1-2 2-2

наблюдаемая 153 24 3

ожидаемая 151,25 27,5 1,25

частоты аллолой

аллели Ату 1*1 Ату 1*2

частоты генов 0,917 ±0,015 0,083 + 0,015

.".'•> .df.kl" Р>0,05........

Наблюдаемая гетерозиготность ~ 0,133 ± 0,025

Ожидаемая гетерозиготность - 0.153 ± 0,024

X*hw - оценка соответствия равновесию Харди-Вайнберга.

Оценка соответствия эмпирического распределения фенотипов Amy 1 теоретически ожидаемому удовлетворительно согласуется с равновесием Харди - Вайнберга ( х2ии =2,916 при d.f.=1, Р >0,05). Из таблицы № 4 видно, что с наибольшей частотой в нашем материале представлен гомозиготный фенотип 1-1, с наименьшей - 2-2, с промежуточной частотой встречаемости выявлен гетерозиготный вариант 2-1. Сходство распределения фенотипических и генных частот а-амилазы женского молока московской выборки с аналогичным распределением (NN-325, NW-22, WW-5)

генетических разновидностей слюнной амилазы в европейских популяциях также косвенно свидетельствует о гомологии этих систем. Параметры наблюдаемой гетерозиготности составили от 0.108 до 0.158, ожидаемой - от 0.129 до 0.177.

Лактоферрин (LF)

На рисунке № 5 показаны идентифицируемые методом электрофореза варианты лактоферрина женского молока. При суммарном исследовании 180 образцов женского молока нам удалось выявить три фенотипа LF: LF1-1 , LF1-2 и LF 2-2.

фенотипы 1-1 2-2 1-2 рис.№ 5. Схематическое изображение вариантов лактоферрина (ЬЯ) женского молока.

В таблице № 5 представлены результаты исследования полиморфизма женского молока.

Таблица № 6

Распределение фенотипичоских и генных частот белка лактоферрина женского молока.

частоты с 39ИОТИПО0

численность 1-1 1-2 2-2

наблюдаемая 89 80 11

ожидаемая 92.45 73.10 14.45

частоты аллелей

аллели LF 1*1 LF 1*2

частоты генов 0.717 ±0.024 0.283 ± 0.024

XSHW

Наблюдаемая гетерозиготность = 0.444 ± 0.037

Ожидаема я гетерозиготность = 0.406 ± 0,021

X2hw - оценка соответствия равновесию Харди-Вайнберга.

Из табл. №5 видно, что с наибольшей частотой представлен гомозиготный фенотип 1-1, с наименьшей - 2-2, с промежуточной частотой встречаемости выявлен гетерозиготный фенотип 2-1. Оценка соответствия эмпирического распределения фенотипов LF теоретически ожидаемому удовлетворительно согласуется с равновесием Харди-Вайнберга (xJmv=1,604 при d.f.=1, Р >0,05). Параметры наблюдаемой гетерозиготности составили от 0.407 до 0.481, ожидаемой - от 0.385 до 0.427.

Соотношение дискретного генетического полиморфизма систем лактоэстеразы (Е 3), фосфоглкжомутазы (PGM 4), лактофоррина (LF) и амилазы (AMY1) женского молока с соматотипом новорожденных.

Основными показателями физического развития детей первого года жизни являются характеристики веса и длины тела. Средний вес доношенного новорожденного составляет 3,4-3,5 кг для мальчиков и 3,2-3,4 кг для девочек. Длина тела здорового доношенного ребенка при рождении колеблется в пределах 48-52 см, в отдельных случаях может достигать 55-57 см. Существуют также и другие антропометрические признаки, определяющие его физическое развитие, в частности, это - обхваты головы и фуди новорожденного и т. д. В нашей работе для характеристики соматического развития новорожденного мы использовали весь этот комплекс признаков.

В таблице №6 показаны корреляционные отношения факторов изучаемых полиморфных систем AMY 1, Е 3, PGM 4 и LF с каждым из антропометрических параметров новорожденного при вероятности ошибки, составляющей 0,1 % (***), 1 % (**) и 5 % (*). Из табл. Na 6 видно, что для женщин, родивших девочек, обнаружена достоверная положительная корреляционная связь со всеми антропометрическими параметрами новорожденного, но только для фенотипа PGM4 2-2. Для женщин, родивших мальчиков, существует неслучайная корреляционная связь длины тела новорожденного со следующими генетическими полиморфными факторами с PGM4 1-2, PGM4 2-2, LF1-1 и LF 1-2. Причем фенотипы PGM4 1-2 и LF 1-1 с длиной тела новорожденного коррелируют отрицательно, а фенотипы

PGM4 2-2 и LF 1-2 - положительно. Эти же системы PGM4 1-2, PGM4 2-2, LF 1-1 и LF 1-2 обнаруживают достоверную ассоциацию с весом новорожденного, причем связь эта, кроме LF 1-2, отрицательна. Достоверная корреляционная связь фенотипов PGM4 2-2 и LF 1-1 проявляется и с такими показателями, как обхваты головы и груди. Причем для фенотипа PGM4 2-2 эта связь положительная, а для LF 1-2 она отрицательна.

Таблица № 6

Корреляция факторов изученных полиморфизмов с антропометрическими характеристиками новорожденных.

фенотипы снгроеюибтрическиэ ларактзриегкки новорожденного' ■ V

женщин n длина тела вес обхват I обхват

головы груди

ныо девочки

AMY 1-1 64 + 0.025 + 0.052 - 0.041 - 0.035

AMY 1-2 16 - 0.018 - 0.035 + 0.029 - 0.035

ЕЗ 1-1 70 + 0.102 - 0.130 - 0.124 - 0.108

PGM 1-2 38 - 0.173 - 0.179 - 0.160 - 0.081

PGM 2-2 - 23 + 0.30S«" + 0.445"* + 0.422"* + 0.369*"

LF 1-1 47 - 0.062 + 0.092 + 0.000 + 0.012

LF 1-2 32 + 0.147 + 0.035 + 0.098 + 0.083

новорожденные мальчика

AMY 1-1 88 + 0.150 + 0.105 + 0.080 + 0.076

ЕЗ 1-1 47 - 0.021 + 0.012 -0.021 -0.026

ЕЗ 1-2 43 + 0.017 - 0.033 -0.019 + 0.025

PCM 1-2 31 - 0,402*" -0.145 -0.123

PGM 2-2 , ' 50 + 0.359"' ~ 0.525»«* + 0.24S" i 0.255"

LF 1-1 42 - 0.208' - 0.247" - 0.206* -0.233"

LF 1-2 48 4 0.246" + 0.251«» + 0.116 + 0.156

Вероятность ошибки составляет 0,1% ("*), 1 % (**), 5% (*)

В пользу справедливости установленных зависимостей между тем или иным соматотипом новорожденного и генетическими разновидностями PGM4 и LF может свидетельствовать согласованность выявленных связей, т.е. при положительной корреляции антропометрических характеристик с одним фенотипом систем LF и PGM закономерно наблюдается противоположная -отрицательная - зависимость между этими же признаками и другим соответствующим фенотипом каждой из этих же дискретных систем.

В данном контексте заслуживают внимания наблюдения о взаимосвязи полиморфизма локуса 1 системы фосфоглюкомутазы у матерей, больных диабетом, с осложнениями при беременности, сопровождающимися избыточной массой ребенка при рождении (Bottini Е., Gerlini G., Fallucca F. 1985).

Рост и развитие организма в период раннего онтогенеза зависят от многих экзогенных и эндогенных причин. Среди последних роль генетических факторов остается малоизученной. Так, аллель PGM1 эритроцитарного фермента фосфоглюкомутазы ассоциируется с максимальной скоростью увеличения размеров тела в период внутриутробного развития плода. Наличие этого аллеля также сопровождается весьма существенной дисперсией массы тела плода (Bottini Е., Lucarini N., Gerlini G., 1990). Относительно недавно было установлено (Kelso A.J., Siffert Т., Maggi W. 1992), что у матерей с группой крови А(И) масса тела новорожденных девочек выше, чем у рожениц с группой крови В(Ш). В работе (Lonnerdal В., Iyer S. 1995) также отмечено, что железо-связывающий белок лакгоферрин может проявлять функции неспецифического ростового фактора. В нашем случае мы можем только констатировать зависимость между фенотипами PGM 4 и LF матери с соматотипом новорожденных, не рассматривая причин такой связи.

Соотношение дискретного генетического полиморфизма AMY 1, ЕЗ, PGNI4 и LF с репродуктивной функцией женщин и уровнем лактации.

Результаты исследования соотношения дискретного генетического полиморфизма систем AMY 1, Е 3, PGM 4 и LF с репродуктивной функцией женщин и уровнем лактации представлены в таблицах №7 и №8.

Исследуемые показатели репродуктивной функции женщин, такие, как возраст menarche и количество беременностей (включая все роды и аборты), наличие/отсутствие выкидышей характеризуются дискретным типом изменчивости (т.е. с малым числом вариантов), поэтому для каждого из них была проведена следующая группировка данных: а) возраст начала menarche. Наиболее объективный из показателей полового созревания у женщин - возраст начала menarche. Возраст, когда этот признак появляется у 50% детей, по данным Соловьевой B.C. (Соловьева B.C. 1973) для девочек равен 13 лет 3 мес. Половое созревание у девочек в возрасте от 8 до 11 лет считается крайними вариантами нормы, а поздним - 15 лет 6 мес. (Властовский В.Г. 1976). Средний возраст menarche а московской выборке по полученным нами данным равняется 13,5 лет и не выходит за рамки средних общепринятых показателей; б) общее число беременностей; о) наличие/отсутствие выкидышей в репродуктивном периоде женщины.

Для определения связей (таблица №7) с такими признаками, как наличие выкидышей, возраст menarche, общее число беременностей (включая роды и аборты), т.е. характеристиками дискретного типа изменчивости, с малым числом вариантов использовался анализ таблиц сопряженности с вычислением критерия описывающего достоверность связи, коэффициента <р, отражающего величину этой связи и показателя (prob), описывающего величину ошибки. Связь оказывалась достоверной, если величина ошибки (prob) не превышала значения равного, 0,05.

Из табл. №7 видно, что только фенотипы одной системы PGM 4 1-2 и PGM 4 2-2 обнаруживают достоверную корреляционную связь с наличием выкидышей в репродуктивном периоде женщин, родивших мальчиков, при величине ошибки, составляющей 5% ('). Для этих показателей был посчитан коэффициент ф, отражающий величину и направление этой связи. Для женщин, родивших мальчиков, с фенотипом PGM 4 1-2 величина этой связи оказалась положительной и равной +0.227, а с фенотипом PGM 4 2-2 величина этой связи является отрицательной и равна -0.225. Иными словами, женщины с гетерозиготным фенотипом PGM 4 1-2 статистически значимо чаще могут иметь выкидыши и, напротив, женщины, родившие мальчиков с фенотипом PGM 4 2-2 оказываются в более благоприятном

положении, у которых число выкидышей оказывается статистически меньшим. В данном контексте заслуживает внимания параллелизм повышения частоты генетически обусловленного варианта PGM 1-1 локуса 1 фосфоглюкомутазы у женщин с привычным невынашиванием беременности (Boltini Е., Coromaldi L„ Carapella Е„ 1983).

Таблица № 7

Сопряженность дискретного генетического полиморфизма систем AMY 1, PGM

4 и LF с некоторыми показателями репродуктивной функции женщин.

показатели репродуктивной функции женщин

изученные возраст начала общее число наличие выкидышей

полиморфны«! menarche беременностей (роды+аборты) в анамнезе женщины

системы 2 х2 г prob

для женщин, родивших мальчиков

PGM 1-2 1.552 0.460 0.002 0.967 5.038* 0.025

PGM 2-2 2.880 0.237 0.004 0.952 4.941* 0.026

LF 1-1 0.587 0.746 0.101 0.751 2.395 0.122

LF 1-2 1.145 0.564 1.359 0.244 0.048 0.827

d.f. = 2 d.f. = 1 d.f. = 1

для женщин, р обивших девочек

AMY 1-1 1.285 0.526 1.195 0.274 2.465 0.116

AMY 1-2 0.919 0.632 2.051 0.152 1.871 0.171

PGM 1-2 1.786 0.409 0.050 0.823 0.083 0.773

PGM 2-2 1.933 0.380 0.061 0.805 2.545 0.111

LF 1-1 0.948 0.622 1.036 0.309 0.278 0.598

LF 1-2 2.389 0.303 1.333 0.248 1.537 0.215

d.f. = 2 d.f. = 1 d.f. = 1

Примечание к таблице №7: х' - показатель описывающий достоверность связи;

d.f. - число степеней свободы;

prob < 0,05 - связь считается достоверной;

(*) - вероятность ошибки составляет 5 %.

В таблице №8 показано соотношение дискретного генетического полиморфизма исследуемых систем с уровнем лактации. В данном контексте также следует обратить внимание на ранее выявленную связь на физиологическом уровне между активностью амилазы и продолжительностью лактации (Dewit О., 1990). В нашем случае установлена связь генетически обусловленного полиморфизма AMY 1 с уровнем лактации.

Таблица № 8

Соотношения дискретного генетического полиморфизма систем AMY 1, Е 3, PGM 4 и LF с уроанем лактации.

полиморфные системы AMY 1-1 уровень лактации

женщины, родившие мальчиков женщины, родившие девочек

хг i Ф

0.036 0.019 8.103" -0.312

AMY 1-2 - - 3.615 0.209

ЕЗ 1-1 0.270 -0.053 2.554 -0.175

ЕЗ 1-2 0.327 -0.058 - -

PGM 1-2 1.309 0.116 3.573 0.207

PGM 2-2 0.204 -0.046 3.162 -0.195

LF 1-1 0.015 0.013 0.943 0.107

LF1-2 0.084 -0.029 1.127 ,_ -0.117

где х1 - величина, описывающая достоверность связи;

<Р - коэффициент, отражающий характер и направление этой связи.

Для определения связей признаков исследуемых генетических полиморфных систем AMY 1, Е 3, PGM 4 и LF с таким качественным признаком, как уровень лактации, применялось стандартное вычисление по четырехпольной таблице сопряженности с определением критерия х*. описывающего достоверность связи и коэффициента q>, отражающего величину и направление этой связи (таблица №8). Из таблицы №8 видно, что достоверная зависимость при вероятности ошибки, равной 1% (**), с уровнем лактации для женщин, родивших девочек, обнаруживается только с фенотипом AMY1 1-1, причем показатель этой связи имеет отрицательный характер.

До настоящего времени почти ничего не было известно о полиморфизме ферментных и других белков женского молока. В представляемой работе фактические данные могут отражать характер генетико-биохимической изменчивости, наблюдаемой в таком биологическом материале, как женское молоко, для одной из изученных групп, преимущественно русской национальности. При электрофоратическом исследовании четырех полиморфных систем три были идентифицированы впервые. Анализ продемонстрировал, что наблюдаемая среднелокусная гетерозиготность по четырем изученным маркерам составила 0.356, а, соответственно, ожидаемая среднелокусная гетерозиготность оказалась

сходной - 0.345. Мы имели возможность сопоставить данные о генетическом полиморфизме 4 систем женского молока с четырьмя антропометрическими показателями новорожденных и физиологическими характеристиками женщин. Были установлены достоверные связи между непрерывно варьирующими антропометрическими признаками новорожденных и полиморфизмом по системам PGM4 и LF. Макросомия или микросомия асоциируется с определенными фенотипами этих систем. При этом противоположно направленные морфотипы оказались связанными с разными фенотипами этих систем, что подтверждает реальность полученных корреляций. К сожалению, к настоящему времени мы не имеем возможности объяснить установленные связи. Возможно, что гены PGM 4 и LF имеют сцепление с локусами, отвечающими за клеточную пролиферацию и ростовые процессы. Можно также предполагать, что такой эффект будет наблюдаться вследствие межлокусного взаимодействия двух или более несцепленных генов. Только дальнейшие специальные исследования позволят идентифицировать причины установленных связей. При этом представляется целесообразным в этом же направлении провести сравнительное изучение тех же полиморфизмов в связи с антропометрическими данными для других популяций некоторых этнических групп. Обширная литературная информация свидетельствует о существоваонии ряда полифункциональных белков, одна из функций которых определяется как неспецифический фактор роста и клеточной пролиферации. К таким полиморфным системам можно, в частности, отнести трансферрин, лактоферрин, сывороточную холинэсгеразу и др. Множество полиморфных систем крови и других тканей {например, плаценты) оказались связанными с особенностями репродуктивной функции (трансферрин, щелочная плацентарная фосфатаза и др.). Частоты выкидышей, спонтанных абортов, мертворождений во многом оказались сопряженными с наличием того Или иного генотипа матери по этим системам. Поэтому мы не исключаем, что ряд факторов системы PGM4 также ассоциируется с репродуктивными характеристиками, как это демонстрируется в представленной работе. Об этом также свидетельствуют ранее полученные данные о наличии связи между полиморфизмом другого локуса - Р{ЗМ1 - с такими репродуктивными аномалиями, как наличие выкидышей, спонтанных

абортов, мертворождений. Нами впервые было показано, что генетический полиморфизм амилазы женского молока статистически значимо связан с уровнем лактации рожениц. Подтверждением о возможности связи этих двух независимых показателей служит предшествующее наблюдение о физиологической ассоциации активности амилазы молока с продолжительностью лактации женщин (Dewit О., 1990).

Таким образом, рамки нашего исследования были ограничены поиском новых генетически полиморфных систем, идентифицируемых в женском молоке, установлением частоты распределения фенотипов и аллелей изученных систем, а также установлением возможных связей между такого рода полиморфизмами и рядом морфофункциональных и физиологических признаков. Представляется важным в дальнейшем получить сравнительные данные по этим же системам для других этнотерриториальных групп в норме и в случае различных патологических состояний.

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны методы анализа, позволяющие установить дискретные полиморфные системы ряда ферментных и других белков в женском молоке.

2. Идентифицированы различные варианты некоторых независимых белковых систем в образцах молока от 130 женщин Москвы преимущественно русской национальности.

3. Впервые были обнаружены новые полиморфные маркеры: лактоэстераза, лактоферрин и амилаза женского молока.

4. Установлены частоты фенотипов и соответствующих аллелей четырех исследуемых маркеров: фосфоглюкомутазы-4, лактоферрина, лактоэстеразы и амилазы-1.

5. Принадлежность к тому или иному типу фосфоглюкомутазы-4 и лактоферрина может быть связана с некоторыми антропометрическими признаками новорожденных.

6. Показана зависимость между полиморфизмом фосфоглюкомутазы-4 и такой репродуктивной характеристикой, как наличие/отсутствие выкидышей.

7. Характер лактации иследуемых женщин сопряжен с полиморфизмом амилазы-1 женского молока.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Спицын В.А., Бычковская Л.С. Новый локус холинэстеразы (Ез), экспрессирующийся в женском молоке. Генетика, 1994, т.ЗО, № 2, с. 172-175.

2. Спицын В.А., Бычковская Л.С., Дерябин В.Е. Влияние генетического полиморфизма фосфоглкжомутазы, идентифицируемой в женском молоке (локус РСМ4), на соматотип новорожденных и репродуктивную функцию женщин. Вестник Российской Академии медицинских наук, 1997, № 2, с. 3134.

3. Бычковская Л.С. Экспрессия нового локуса холинэстеразы в женском молоке. Тезисы докладов первого (третьего) Российского съезда медицинских генетиков. 1994, с. 13.