Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лизоформы холиновых фосфолипидов грудного молока и их значение в формировании микробиоценоза кишечника недоношенных новорожденных детей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Лизоформы холиновых фосфолипидов грудного молока и их значение в формировании микробиоценоза кишечника недоношенных новорожденных детей"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛВДОВАШЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ШКР0БШ01Ш им. Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

КУШАРЕВА Мария Васильевна

ЛИЗОФОРШ ХОЛШОВЫХ ФОСФОЛИПВДОВ ГРУДНОГО МОЛОКА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ФОРМИРОВАНИИ ШКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ.

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения РСФСР

Научные руководители - доктор биологических наук,

профессор Э.Г.Щербакова; доктор медицинских наук Р.М.Харькова

Официальные оппоненты- доктор биологических наук,

профессор И.Б.Кунаева; доктор медицинских наук, профессор Г.А.Яровая

Ведущее учреждение - ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт педиатрии АМН СССР. ( Ц

Защита диссертации состоится 199>1г.

в *£л^-часов на заседании специализированного совета К 084.18.01 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиология им. Г.Н.Габричевского Ш РСФСР по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Москс ского научно-иооледовательского института эпидемиологш и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РСФСР.

Автореферат разослан Щ-Шп 1990 г.

Ученый секретарь специализированного оовета

доктор медицинских наук Л.П.Семенова

ОБЩАЯ ХАРКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопросы формированвя микробиоцаноза кишечника у новорожденных недоношенных детей я значимость рационального питания в этом процессе относятся к числу актуальных проблем педиатрии и привлекают пристальное внимание клиницистов, микробиологов, биохимиков ( Г.И.Гончарова, 1986; А.З.Смо-лянская, 1987; В.%undef.uht tiaSL 1985;//. y.cdic$cL et <x2,} 1983 ).

Сохранение естественного вскармливания как самого физиологичного и оптимального для детей первого года жизни остается наиболее существенным фактором, гарантирующим нормальное развитие и здоровье ребенка.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в исследовании химического состава и биологических свойств грудного молока. Наличие в нем комплекса биологически активных соединений и иммуиокомпвтентных клеток обеспечивает специфическую и неспецйфичоскую противоинфекционную резистентность, способствует элиминации из желудочно-кишечного'тракта патогенной и условно патогенной микрофлоры и стимулирует рост индигешшх микроорганизмов - бифидобактерий, лактобактерий, эубактерий и т.д., что приводит к формированию нормобиоценоза кишечника.

Однако, в настоящее время появляются данные о снижении защитных свойств грудного молока и появлении в нем ряда поврэзда-юнгих факторов ( пищевые аллергены, медиаторы воспаления и др> ) , что сопровождается значительным возрастанием периода становления биоценоза кишечника и нередко - развитием энгерального синдрома у новорожденных ( И.Б.Куваева, 1986; Е.М.Фатеева о соавт., 1986, 1989; Г.И.Гончарова с.соавт., 1S87, ISQQi H&witt éteU.) 1976; Cf. ficLlioêssûneteihWb и др.) .

Поэтому предметом специальных исследований явилось изучение роли мэмбранных биологически активных фосфолипидов и их метаболитов, -участвующих в воспалительном процессе. Среди них наибольшего внимания заслуживают производные фосфатидилхолина -лизофосфатвдилхолин( ЯФХ ), фактор активации тромбоцитов (ФАТ) и его аналог лизо-ФАТ. Обладал чрезвычайно высокой биологической активностью, а в определенных концентрациях и токсическими свойствами, эти соединения могут вызывать повреждение и нарушение функции биологических мембран и принимать участие в патогенезе

различны!, в ром числе яелудочно-кшпечных заболеваний < В.О.Поздняков о соавт., ХШ'Ж^ие^ £./«^¿.1386; Мс Кеап ^.1985).

Наличие в грудном ыолоке лимфоцитов, макрофагов, а также нейтрофилов, способных активно синтезировать ФАТ и лизофосфа-тида, свидетельствует о возможности появления этих соединений в грудном молоке. Обладая выраженной мемЗранотропной активностью, данные фосфолшшда могут привести к изменениям адгезивностн микробных клеток - одного из важнейших слагаемых механизма шшробт ной колонизации кишечника представителями нормальной микрофлоры.

Изложенные соображения могут служить обоснованием актуальности выявления взаимосвязи между особенностями фосфолипидного состава грудного молока и развитием дагабиоценоза кишечника у новорожденных и детей первого года жизни, находящихся на естественном вскармливании, для разработки методов повышения эффективности лечения этого контингента детей.

Целью работы явилось установление роли лизоформ холиновых фосфолипвдов в формировании биоценоза кишечника у новорожденных недоношенных детей и обоснование целесообразности фармакологической коррекции фосфолшадного состава грудного молока.

Задачи исследованияД.Установить наличие лизоформ холиновых , фосфолипидов в грудном молоке у преждевременно родивших женщин в течение первого месяца лактации в зависимости от состояния жх здоровья, определить активность фосфолипазы А в грудном молоке.

2. Изучить в модельных исследованиях на эритроцитах человека влияние грудного молока с различным фосфолипвдным ооставом, экстрактов фосфолипидов молока, стандартных препаратов ФАТ, лизо-ФАТ, фосфатидалхошт, лизофосфатдцилхолана и лизоцима на адгезию штаммов бифидобактерий В. Ы^скигть 1,

Ш-42 и В.Ьп0и.пиЪ 379М.

3. Определить фагоцитарную активность макрофагов и общую антибактериальную активность грудного молока с различным содержанием лизо-ФАТ и лизофосфатвдилхолина.

4. Исследовать состояние биоценоза кишечника у новорожден-дах недоношенных детей в зависимости от их гестационного возрас та и фосфолшщцного состава грудного молока.

5. Изучить влияние кверцетина при его назначении кормящим

матерям на фосфолипидннй состав грудного молока, показатели фагоцитоза, общую антибактериальную активность молока, а также на адгезивные свойства бифидобактерий под действием молока в опытах ¿п тгЖго. Оценить эффективность применения кверцетина у кормящих матерей одновременно с назначением бифидумбактерипа их детям на микрофлору кишечника я клиническое состояние новорожденных.

6. Исследовать эффективность применения комплексной биологически активной добавки БАЛ-2, содержащей ллзоцшл и бифидобак-терии, у недоношенных новорозданных детей, получавши донорское грудное молоко с измененным фосфолштдным составом.

Натчнвя новизна. Впервые показано, что у женщин с хроническими соматическими и инфекционно-Воспалительными заболеваниями, обострявшимися со время: беременности а после родов, а также перенесших токсикозы беременных, в грудном молоке обнаружены фактор активации тромбоцитов и лизо-ФАТ. У этих матерей в грудном молоке также наблюдалось увеличение содержания лизо-фосфатидилхолина и его появление в сыворотке молока. 7 здоровых кормящих матерей но выявлены ФАТ и лизо-ФАТ в цельно« грудном • молоке, а ЛФХ - в сыворотке молока.

Получены новые данные о ром лизофосфатидов - лизо-ФАТ и ЛФХ женского молока в формировании биоценоза кшачника новорожденных недоношенных детей. Показано изменение спектра фосфоли- .' двдов копрофлльтратов при дисбактериозэ кишечника у новорожденных недоношенных детей.'

Установлено шгкбирувдее действие лизоформ холкнсодержа-тих фосфолгашдов ( лизо-ФАТ и ЛФХ ) на адгезивные свойства би-фидобактерий - ъЛф(1ат.1, В.а</с&<е<?»г&5: МС-42, Ъ.^оя^и/тг Е 379М.

Показано, что витаминный препарат "Квзрцетин" подавляет активность фосфолипазн А грудного молока, нормализует его фос-фолипидный^состав и защитные свойства. Одновременное назначение кверцетина кормящим матерям и бифидумтерапии их детям способствует коррекции биоценоза кишечника и улучшает клиническое состояние новорожденных с килечным синдромом и локальными шфек-ционно-воспалительными заболеваниями.

Впервые выявлено стимулирующее влияние лизрцима на адгезивные свойства некоторых штаммов бифидобактерий - ъЛ$<1а В.а¿о '1те.иЬ'ч МС-42, ъЛзп^аог В 379М, входящих в состав

бифидумбактерина, бифилина и биологически активных добавок ЕАД-1Б и БАД-2.

Получены ноше данные об эффективности применения комплексной биологически активной добавки БАД-2, содержащей лизоцим и живые бифидобактерии, для лечения кишечного синдрома у новорожденных недоношенных детей, получающих донорское молоко с измененным фосфолшвдныи составом.

Практическая ценность. Определение фосфолипидного состава • грудного молока, особенно выявление в нем ФАТ, лизо-ФАТ и ДФХ, может быть использовано как дополнительный критерий в оценке наличия у кормящих матерей воспалительного процесса. Новорожденные дети этих матерей должны быть выделены л группы риска по возможности развития у них диобакториоза кишечника и инфек-ционно-воспалителышх заболеваний.

Предложен комплекс методов оценки защитных свойств грудного молока, который включает определение его фосфолипидного состава, фагоцитоза макрофагов, общей антибактериальной активности, а также влияние молока на адгезию бкфидобактерий.

Выявлена целесообразность определения спектра, фосфолипи-дов в копрофильтратах для экспресс-диагностики дисбактериоза кншечника и возможности наблюдения за состоянием биоценоза новорожденных недоношенных детей в процессе лечения.

Разработан патогенетически обоснованный метод коррекции защитных свойств кенского молока и биоценоза кишечника новорожденных недоношенных детей с применением кверцетина у кормящих матерей и бифидумбактерина у их новорожденных детей.

Предложена схема обогащения стерильного донорского молока с измененным фосфолипидшш составом биологически активной до- ■ бавкой БАД-2, что позволяет повысить эффективность лечения новорожденных детей с кишечным синдромом и инфекционно-воспали-тельными заболеваниями, нормализовать состав кишечной микрофлоры.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и.обсуждены: на секции неонатологов общества детских врачей, г. Москва, 1989 г.; на совместной научно-практической конференции отделения физиологии и патологии новорожденных детей, клинико-диагностического отделения и лаборатории патологии обмена веществ МНИИП и ДХ МЗ РСФСР, проблемной лаборатории мадкшдаокой

цитологии ЦОЛИУВ МЗ СССР и коллектива врачей детских отделений городской клинической больницы МЗ г.Москвы, 5 апреля 1990 г.; на научной конференции Института питания АМН СССР "Питание: здоровье и болезнь", ноябрь 1990г.

Реализация работы. Результаты исследования и практические рекомендации внедрены в работу детских отделений городской клинической больницы №13 г. Москвы, родильного дома №27 г.Москвы.

Публикации. По теш диссертации опубликовано 5 научных работ. ,

Объем и структура диссертации, Работа изложена на 242 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель включает 148 источников отечественной и 165 зарубежной литературы.

Работа иллюстрирована 38 таблицами и 13 рисунками.

Диссертация выполнена в отделении детского питания (рук. - д.м.н. Харькова P.M. ), отделении физиологии и патологии новорожденных детей (рук. - д.м.н. Дементьева Г.М. ) ШИИПиДХ МЗ РСФСР и в проблемной научно-исследовательской лаборатории медицинской цитологии ЦОЛИУВ МЗ СССР (зав. - д.б.я., профессор Щербакова Э.Г. ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объем клинического материала и методы исследования.

Наш было обследовано 136 новороэдзняых детей и 134 их кормящие матери. Обследованные женщины и дети были разделены на 4 основные группы-с учетом состояния их здоровья и характера вскармливания новорожденных. В 1-ю группу вошли 16 здоровых матерей и их 16 новорожденных здоровых доношенных детей. Во 2-ю группу ^ошш 15 кормящих матерей и 15 условно здоровых недоношенных детей. 3-ю группу составили 45 ггатерей и их 45 недоношенных новорожденных детей с кишечным синдромом и локальными инфокционно-воспалительными заболеваниями. В 4-ю группу вопли 58 преждевременно родивших легации и их 60 новорожденных недоношенных детей (2 двойни ^с кишечным синдромом и локальными инфек-цпонно-воспалительныш заболеваниями. Дети 1-й, 2-й и 3-й групп

находились на грудном вскармливании, дети 4-й группы вскаршш-вались стерильным донорским молоком. Инфекционно-воспалитальные заболевания у недоношенных новорожденных детей в 3-й и 4-й группах были представлены ом^шштом, конъюнктивитом, бактериальным ринитом, отитом, трахеитом, инфекцией мочевыводящих путей и т.д., которые развивались в сочетании с кишечным синдромом.

Комплексное клиническое обслэдовшше детей включало обычные метода сбора анамнеза, объективного обследования, лабораторной п инструментальной диагностики. Клиническое обследование матерей проводилось в родильном доме и при их поступлении в стационар 2-го этапа шхаживаввя и осуществлялось с учетом параклинических методов (общий клинический и биохимический анализ крови и мочи, микробиологическое исследование ),

Комплексное лечение больных детей в клинике включало соблюдение соответствующего возрасту режима, питания, патогенетическую направленность мероприятий (гормональное, антибактери- ■ алыюе, инфузнонное, шлмуностиьулирующее и симптоматическое лечение ). Кроме того, детям 3-й и 4-й групп проводили бифидум-терашш препаратами бнфидукбактерин и БАД-2. У 30 матерей 3-й группы для коррекции фосфолипвдного состава грудного молока и повышения его защитных свойств применяли внутрь блокатор кальциевых каналов препарат "Кверцегин".

■ Специальные биохимические и микробиологические исследования проводились по следующим методикам:

Липидный состав плазмы крови и эритроцитов определяли методом одномерной тонкослойной хроматографии, изложенным в руководстве Ю.Е.Вельтищева и Н.С.Кисляк (1979 ). Спектр фосфолипи-дов копрофильтратов, цельного грудного молока, его сыворотки и лейкоцитов, а также плазмы и эритроцитов крови исследовали методом двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках "Си-луфол" с последующей деноитометрической обработкой, как изложено в справочнике М.Кейтс (1975 ). Количество ЛФХ определяли по липидному фосфору методом В.Е.Баськовского (1972 ). Определение ФАТ и лизо-ФАТ осуществляли методом биологического тестирования по агрегации тромбоцитов кроликов, предложенного М.В'Л-Ы 1983 ).

Об активности фосфолипазы А грудного молока судили по степени просветления желточной эмульсии после гидролиза лецитина ( по Е.Хабзрману в модификации Э.А.Юрьевой, 1983) i

Общая антибактериальная активность молока оценивалась по его способности ингибировать рост тест-штамма золотистого стафилококка в соответствие с рекомендациями К.Н.Прозоровской о соавт. ( 1981) . Фагоцитарная активность макрофагов грудного молока определялась методом У,Ра.хаоп dal,( 1979- ) в нашей модификации, которая предполагает проведение реакции фагоцитоза в обезжиренном молоке ( рац. предложение £67? от 17.12.88) « Определение влияния стандартных препаратов фосфолипидов и лизоцима на адгезию бкфидобактерий проводили на эритроцитах человека методом В.И.Брилис с соавтС 1986) . Исследование адгезивных свойств бифидобактерий в присутствии грудного молока и его фос-фолшшдных экстрактов осуществляли тем же методом после предварительной очистки молока от триглицеридов ( рац. предложение ^6э4 от 24.03.88J . Экстракты фосфолипидов дополнительно очищали методом одномерной тонкослойной хроматографии { Ю.й.Вель-тищев, Н.С.Кисляк, 1979 ).

,. Изучение микробиоценоза кишечника новорожденных детей проводили путем микробиологического посева фекалий в соответствие с рекомендациями Р.В.Эпытейн-Литвак, Ф.Л.Вилыианской ( 1977 ) н. А.З.Сшлянской, 0.П.Марко ( 1983 ) . Содержание анаэробных неспо-рообразующих микроорганизмов определяли методом А.К.Балтрашэ-вич и Т.П.КомаровскойС1978, 1984 ) . Лактобактерии выделяли на плотной модифицированной среде Рогозы (рац. предложение $722 от 26.09.88 ).

Достоверность различий между показателями в сравниваемых группах'устанавливали на основе критериев Стыодента ш Пирсона. Зависимость между показателями изучалась с помощью корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный клиншсо-анамнестический анализ выявил рад неблагоприятных факторов риска у матерей по развитию локальных инфекционно-воспалительных заболеваний у их новорожденных недоношенных детей. Установлено, что у женщин 3-й и 4-й групп достоверно чаще, чем у матерей 2-й группы, встречались хронические

гнойно-воспалительные заболевания. Большое значение имели также особенности отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза: привычное невынашивание, обострение в период беременности и родов хронических соматических и воспалительных заболеваний. Чаще отмечалась патология беременных в виде угрозы прерывания и токсикозов различной степени выраженности.

Анализ полученных результатов позволил установить наличие особенностей метаболизма липидов у женщин в исследуемых груп-. пах. Так, у здоровых матерей 1-й группы, родивших здоровых доношенных детей, и у женщин 2-й группы, имевших условно здоровы: недоношенных детей, спектры общих липидов плазмы крови и эритроцитов не отличались. Во 2-й группе выявлено перераспределен© фракций фосфолипидов (ФЛ ) плазмы крови, которое характеризовалось достоверным возрастанием содержания сфингомиелина С СМ и снижением уровня фосфатидилэтаноламина (ФЭА ), что, по мнению ряда авторов, может характеризовать латентное хроническое воспаление при отсутствии клинических симптомов. Выявленные нами изменения в спектре ФЛ плазмы могут свидетельствовать о наличии скрытых воспалительных процессов у преждевременно родивших женщин, имевших в анамнезе хронические инфекционно-воспалитель-ные заболевания. Наиболее информативным считается снижение уро: ня ФЭА в плазме, появление биологически активных метаболитов ФХ (ФАТ, лизофосфатиды, лейкотриены ), выявление которых позволяет предопределить характер течения воспалительного процесса ( А.А.Ананенко, с срав., 1989; А.Т.Хусейнов, 1989; М.В.Дудки-на, 1987 ) .

Значительные нарушения в содержании липидов плазмы крови и эритроцитов отмечались у женщин 3-й группы по сравнению с показателями в 1-й группе. К выявленным особенностям липидо-граммы плазмы крови относятся возрастание содержания ФЛ с 28,8; до 33,6$ и снижение содержания триглицеридов (ТГ) с 13,1 до 4,7$. Эти изменения свидетельствуют об активации мембраноде-структивных процессов, происходящих в тканях при воспалении. Дри этом высокое содержание ФЛ может быть связано как с деградацией мембранных структур.клеток, так и с нарушением биосинте за этого класса соединений. Дефицит ТГ в плазма характеризует активность биохимических процессов, сопровождающих воспаление и требующих больших затрат энергии (А.Н.Дунаевы, 1984; Л.ВДра нова о соавт., 1984 и др ). Изменение липидного обмена у женщи

3-й группы прослеживалось при анализе содержания лшшдных фракций общих липидов в эритроцитах, где, напротив, отмечалось значительное уменьшение количества ФЛ и появление неэстерифициро-ванных жирных кислот (НЭЖ ), количество которых колебалось от 3 до 13,5$. Указанные изменения также характеризуют наличие воспаления и могут быть следствием как угнетения синтеза сложных молекул липидов, так и повышенной активности фосфолипаз, приводящих к расщеплению фосфолипвдов. У большинства женщин 3-й группы - 75/з, отмечалось остров воспаление в момент обследования, а у остальных имело место обострение хронических инфек-ционно-воспадительных заболеваний во второй половине беременности, то есть дислипидемия у этих матерей сочеталась о клинически выраженным воспалением, что согласуется с данными литературы С И.И.Рюмина, 1985; М.В.Дудкша, 1987 ). Нарушение лилейного обмена у женщин 3-й группы также выявлялось при исследовании ФЛ плазмы крови и эритроцитов. Перераспределение ФЛ в плазме было связано с возрастанием в 1,8 раза количества Ш1 и в 1,4 раза СМ при одновременном снижении уровня фосфатидил-инозитола (ФИ) в 3,5 раза и ФЭА в 1,6 раза по сравнению с таги же показателями 1-й группы (р<0,05 ).

Изучение фосфолипидного состава молока во всех группах матерей, показало различный характер перераспределения фракций ФЛ. Так, у матерей 2-й группы отмечалось снижение количества ФЭА и и фосфатидилсерина (ФС) в сыворотке молока, что, возможно, следует объяснить некоторой активацией при вялотекущей, инфекции' перекисного окисления-липидов, включающей в этот процесс в первую очередь легкоокисляеше фракции.

Иная направленность в изменении состава фосфолштадных компонентов молока отмечалась в группе женщин, имеющих больных детей ( 3-я группа) , где выявлено увеличение содержания ЛФХ в цельном молоке до 12*1,18$ ( норма - 3,5*0,94$, р < 0,001) и в лейкоцитах молока до 9,7+0,99$((норма - 5,0+0,83$, р<0,05) .

Изучение фосфолипидного состава сыворотки молока у здоровых .'женщин, родивших здоровых доношенных детей, показало отсутствие в нем фракции ЛФХ. У матерей, родивших условно здоровых недоношенных детей, ЛФХ также не выявлялся в сыворотке молока иди обнаруживался непродолжительное время в единичных случаях в следовых количествах. Установлено наличие ЛФХ в сыво-рот.чз молока у большинства женщин 3-й группы, доля которого в

- 10 -

спектре ФЛ состовляла от 4 до 2Ъ%. Появление ЛФХ в сыворотке молока и его повышенное содержание в лейкоцитах молока свидетельствует о разрушении клеточных структур вследствие гидролиза ФХ - основного компонента биологических мембран, что нередко наблюдается при воспалении (К).Е.Вельтищев с соавт., 168?; Безрукова Г.А. с соавт., 1989; Э.А.Юрьева, 1979). Концентрация ЛФХ в сыворотке молока женщин 3-й группы колебалась в пре- • делах от 0,6 до 5,0 мг$, и при кормлении детей молоком о содержанием ЛФХ более 1 мг$ сопровождалось развитием тяжелых и средненяжелых форм инфекционно-воспалителыюго процесса у новорожденных недоношенных детей.

Фоофолшвдный состав стерильного донорского молока приближался к таковому у женщин 3-й группы. Содержание ЛФХ в нем в 3,4 раза превышало.соответствующий показатель в 1-й и 2-й группах и составило в среднем 10,2+1,83^. Абсолютное содержание ЛФХ в отдельных образцах донорского молока колебалось в широких пределах от 0,03 до 6,0 и только в половине из них концентрация фосфолшида значительно превышало показатель нормы, т.е. 2,1+0,55 щ>. В 5 из 20 образцов ЛФХ отсутствовал.

Фосфолипидный состав грудного молока преждевременно родивших женщин не зависит 'от срока гестации.

Проведенные наш исследования, свидетельствуют об отсутствии ФАТ и лизо-ФАТ в грудном молоке здоровых женщин, родивших в срок и имеющих здоровых детей. Во 2-й группе ФАТ не определялся, г», только у 2 женщин лизо-ФАТ выявлялся в следовых количествах (ОДнг/мл ) . При повторном исследовании через 5 -6 дней ФАТ и лизо-ФАТ нэ обнаруживались в этой группе.

В 3-й группе только у 3 матерей в грудном молоке определяли ФАТ в количестве 0,2-0,3 нг/мл. Однако у 85$ женщин этой группы в молоке обнаружен лизо-ФАТ в концентрации от 0,1 до 0,6 нг/ш. В стерильном донорском молоке ФАТ обнаружен не был, а! лизо-ФАТ определялся только в 30$ образцов молока в количестве 0 ¡,2 нг/ш. У детей, вскармливаемых грудным молоком, с наличием в нем лизо-ФАТ в концентрации 0,2 нг/ш и выше, отмечалось тяжелое течение диспепсии и локальной, инфекции.

Появление или повышенное содержание лизофосфатидов в грудном молоке и его'компонентах связано с активацией фосфолшазы А молока, гидролизующей фосфолшида с отщеплением от молекул

последних остаток жирной кислоты. Активность фосфолипазы А в молоке женщин 3-й группы выявлена в 73$ случаев и составила в среднем 2,21+0,17 условных единиц. Б то же время активность фермента отсутствовала, в 81/5 женщин 1-й группы и лишь у 19$ обнаружена в следовых количествах. Аналоги'- ае данные получены во 2-й группе. В стерильном донорском молоке активность фосфолипазы А не выявлена, что связано с инактивацией фермента в процессе термической обработки молока.

Таким образом, нарушение лшидного состава грудного молока, а именно появление в нем ФАТ, лизо-ФАТ, повышенное содержание ЛФХ в молоке и наличие этого метаболита в сыворотке молока с . одновременным, как правило, увеличением активности фосфолипазы А, наблюдалось у матерей с инаекционно-воспалительныш и аутоиммунными заболеваниями. Дислипвдемия у женщин сопровождалась развитием кшзтаого синдрома у новорожденных недоношенных детей. Расстройства со стороны желудочно-кизечного тракта у новорожденных, находившихся на грудном вккаршиваяии, явилось следствием появления в молоке липидных метаболитов, участвующих в повреждении кишечника и развитии воспаления. Отрицательней эффект ФАТ на организм ребенка (развитие диареи ), вероятно,, южно также объяснить активирующим действием этого соединения на фосфолипазу А с последующим'высвобождением арахидоновой кислоты, которая метаболизируется с образованием лейкотриенов (У£ ЙШ^^сЬ,985 ).

Несколько иная закономерность наблюдалась при вскармливании новорожденных стерильным донорским молоком, фосфолипидный состав которого довольно вариабельный. игсутствие лизофосфата-дов в донорском молоке или их низкое содержание не вызывало развития кишечного синдрома у грудных детей. В случае появления в донорском молоке лизо-ФАТ, а также при повышенном содержании ЛФХ у детей наблюдалась диспепсия (4-я,группа ).

Исследование защитных свойств грудного молока с различным фосфолипидным составом позволило раскрыть некоторые механизш влияния лизофосфатидов на колонизацию кишечника-у новорожденных недоношенных детей.

В модельных исследованиях на эритроцитах человека показано, что лизо-ФАТ и ЛФХ подавляли адгезию всех изучаемых штаммов бифидобактерий, но степень подавления адгезии зависела от вида штамма и концентрации лизофосфатида. Снижение адгезивное-

ти по двум показателям "СПА* я "К" отмечалось в пределах концентраций ЛФХ от 10~7до 10~3М. В большей степени ингибируюцее действие ЯФХ выявлено б отношении штамма ъХцшит 1. Лизо-^АТ подавлял адгезию бифвдобактерий ъХ'^тиХ и В»аЫмсгнНз щ~4< по двум показателям в пределах концентраций от 10~^до 1СГ^М, а В.&м^л* в 37ЭМ - от 10~®до 10"%. Таким образом, в отношении последнего штамма отмечается наименьший ингибирующий эффект. ФАТ в концентрациях и ФХ в концентрациях нё влияли на адгезивность бифидобактерий.

Изучение воздействия грудного молока на адгезию бифидо-флоры позволило установить, что адгезивность штамма ъЛоп^шп В 379 М не нанялась в 1-й и 2-й группах, но она снижалась в 2 раза в 3-й относительно этих групп. Адгезия В,В!р'с1ипи 1 и В. а-Л

42 по одному показателю во 2-й группе была несколько ниже, чем в 1-й. Под влиянием грудного молока женщин 3-й группы наблюдалось подавление адгезии этих штаммов бнфа-добактерлй одновременно по двум показателям в 1,5 - 2,4 раза по сравнению с 1-й и 2-й группами. Установлена тесная прямая корреляционная взаимосвязь мевду содержанием лизофосфагидов в нативном грудном молоке и его кнгабирующим действием на адгезию бифвдобактерий.

Снижение адгезивности изучаемых штаммов бифидобактерий в 1,5 - 2,0 раза отмечалось в присутствии всех образцов .стерильного донорского молока. Однако в большей степени оно имело место при появлении лизо-ФАТ и повышенном содержании ЛФХ.

Показано, что при нормальном спектре фосфолипвдных экстрах тов молока в 1-й и 2-й группах женщин показатели адгезии исследуемых штамдав бифидобактерий не менялись. Напротив, значительное ингибирование адгезивности этих штаммов отмечалось при действии фосфолшщцных экстрактов донорского молока и в 3-й группе. При атом наблюдалось снижение величин "СПА." и "К" в 1,6 -7,¿'раза по сравнению с соответствующими показателями 1-й и 2-Й групп.

Защитные свойства грудного молока в значительной степени определяются фагоцитарной активностью макрофагов. Наш выявлено взаимосвязь между фагоцитозом макрофагов, общей антибактериальной активностью молока и развитием кишечного синдрома у

аоворожденных детей. При высокой фагоцитарной способности макрофагов и общей антибактериальной активности молока, как это имело место у женщин 1-й и 2-й групп, наблюдали благополучное течение периода новороаденности у детей. У матерей 3-й группы, дети которых страдали кишечными дисфункциями, показатели фагоцитоза были в 1,3-1,8 раза ниже, чем в 1-й г 2-й группах, общий антибактериальный эффект также был значительно подавлен.Антибактериальная активность пастеризованного донорского молока была ниже, чем нативного грудного во всех 3-х группах, что связано с инактивацией защитных компонентов при стерилизации.

Протективныэ свойства грудного молока не зависели от сроков родоразрешения, но находились в тесной взаимосвязи с состоянием здоровья матери и в значительной степени оказывали влияние на формирование биоценоза кишечника у новорожденных детей.

У 11 из 16 детей 1-й группы на 5-6 сутки жизни был отмечен нормобиоценоз. У остальных детей выявлены изменения в составе аэробной флоры или сочэтанныэ нарушения аэробногг и анаэробного компонентов.

К концу 1-й недели жизни во 2-й группе у всех условно здоровых недоношенных детей выявлена субклиническая форма дисбак-териоза; у 11 из 15 отмечались незначительные нарушения аэробного компонента, у другой части детей установлены более глубокие изменения биоценоза, характеризующиеся дефицитом бифидобак-терий и высоким содержанием факультативной микрофлоры. Нормализация микробиоценоза кишечника у недоношенных условно здоровых детей наблюдалась только к концу 1го месяца жизни.

• В 3-й группе новорожденных у большинства из них (у 36 из 45 ) имели место сочетанию нарушения в составе аэробной и анаэробной микрофлоры, которые сопровождались отсутствием или дефицитом бифидобактерий. У остальных детей, составивших незначительную часть группы, нарушения в кишечном биоценозе затронули только аэробную микрофлору. Развитие тяжелых и среднвтя-жвлых форм дисбактвриоза было связано с возрастанием содержания ЛФХ в молоке. Тан, 3-я степень дасбиоэа у 20 детей сочеталась с увеличением в 2 раза содержания ЛФХ в молоке и в 3,5 раза - в сыворотке молока по сравнению с теми же показателями пря 1-й степени дисбактериоза.

С увеличением содержания лизо-ФАТ в молоке нарастали

нарушения в составе биоценоза кишечника: для 1-й степени дио-биоза количество лизо-ФАТ в молоке составило 0,10±0,04 нг/мл, 2-й - 0„23*0,02 и 3-й - 0,34+0,04 нг/мл. Становление нормальной микрофлоры кишечника в 3-й группе, как правило, продолжалось в течение 1-2 месяцев.

У всех обследованных новорожденных детей, получавших стерильное донорское молоко( 4-я группа ), были выявлены нарушения в микробиоценозе кишечника различной степени выраженности. У большинства детей установлены сочеганные изменения аэробного ж анаэробного компонентов,, характерные для 2-й и ^-й степени дисбиоза» Формирование нормобиоценоза у детей.4-й. группы обычно' заканчивалось к концу 2-го месяца жизни, а в отдельных случаях - 3-го месяца жизни.

Исследование спектра Ф1 копрофильтратов также подтверждает роль биологически активных липидов в формировании биоценоза кишечника у новорожденных. При нормобиоценозе кишечника в ко- . профнльтратах отсутствовал ЛФХ, а при различных стадиях дис-бактариоза его количество находилось в пределах от 2 до 43$. По мере увеличения концентрации ЛФХ в копрофшхьтратах отмечалось развитие более глубоких изменений в биоценозе кишечника. Исследование спектра ФЛ копрофильтратов может быть использовано для экспресс-диагностика дасбактериоза кишечника с последующим, по необходимости, проведением посева ( рац. предложение №807 от 16.11.89) о

Таким образом, ФАТ и лизофосфатнда грудного молока могут участвовать в развитии диарея у новорожденных детей через механизм мембранодвстабилизируадего действия указанных ФЛ на клетки слизистой кишечника, а также в результате снижения защитных свойств грудного молока, что способствует развитию дис-бактериоза, возникновению и поддержанию инфекционно-воспали-тельного процесса в кишечнике у ребенка.

с Результаты настоящей работы позволили определить и обосновать методы коррекции дисбактериоза кишечника у новорожденных недоношенных детей. Принципиальная особенность выбранных нами препаратов заключалась в целесообразности восстановления фос-фрлишедного состава и защитных свойств грудного молока. Для нормализации спектра ФЛ нативного грудного молока и его защитных свойств кормящим матерям назначали мембраностабилизирувдий

[репарат кверцетин (рац. предложение $720 от 05.03.88 ). Прэ-[арат применяли внутрь по 0,02 г два раза в день в течение 2-6 юдель. Эффективность применения кверцетина характеризовалась ¡нижением к 14 - 18 дню лечения в 4,8 раза содержания Ш1 в 'рудном молоке, в 3,3 раза в лейкоцитах ¡.толока, а в сыворотке долоко. к этому периоду обследования ЛФХ не ^наруживался ни в >дном случае. На 14-18 день лечения кверцетином в 5 раз по срав-генгаз о исходным уровнем снизилось содержание в грудном молоке тизо-ФАТ, а к 21-30 дню лечения это соединение не обнаруживаюсь в молоке ни у одной женщины. При назначения препарата отмечалось ингибирование активности фосфолипазы А. Нормализация ¡зосфолипидного состава грудного молока сопровождалась восстановлением его защитных свойств. Значительно возрастали фагоцитарная активность макрофагов, общий антибактериальный эффект срудного молока, адгезря бкфидобактерий в присутствии молока з его фосфолипидннх экстрактов. К концу лечения у 85$ женщин, эти показатели достигали нормы.

Коррекция состава и защитных свойств грудного молока кверцетином сочеталась с применением бифидумбактерина у новорожденных недоношенных детей. Возрастание уровня бифидобактернй в фекалиях и стойкий нормобиоценоз кишечника у этих детей достигались на 2-4 недели раньше, чем у их сверстников, получавших бифидумбактерин и материнское молоко без коррекции его состава и защитных свойств кверцетином.

Для нормализации микробиоценоза кишечника новорожденных недоношенных детей 4-й группы, получавших стерильное донорское молоко, были использованы препараты, содержащие бифидобак-терии - бифидумбактерин и БАД-2. Лечебный эффект комплексной биологически активной добавки ЕАД-2 обусловлен действием как бифидобактерпй, так и'лизоцнма, оказывающим бифидогенаый, им-муномодулирующий, антибактериальный, противовоспалительный и мембраностабштзируюпшй эффект (О.В.Бухарин, 1974; А.М.Большакова с соавт., 1984 и др. ). Модельное исследование, проведенное наш на эритроцитах человека, показало, что лизоцим также способен стимулировать адгезивные свойства бифидобактернй, что, вероятно, следует объяснить его мембранотропным действием. Увеличение показателей "К" и "СПА" изучаемых штаммов бифидобактерпй имело место в широких пределах концентраций лизоцима - от 50 до 1600 мкг/мя.

Таким образом, внесение лизоцима в составе БАД-2 в донорское грудное молоко позволяет не только повысить антибактериальные, противовоспалительные и бифидогенные свойства молока, но и усилить адгезию бифидобактерий. БАД-2 назначали новорожденным недоношенным детям в количестве 6-8 г в сутки в течение 2-3 недель. К концу курса лечения был достигнут высокий клинический и микробиологический эффект. У этих детей нормализация стула наступала в 2,5 раза быстрее, чему их сверстников, получавших бифидумбактерин. В результате применения БАД-2 в течение 2-3 недель был достигнут стойкий нормобиоценоз у 75$ детей, а у остальных отмечались незначительные изменения в составе аэробов. Мезду тем, у новорожденных, леченных бифидумбактер* ном в течение 3 недель, нормализация микрофлоры кишечника отмечалась только в 29$ случаев. Применение БАД-2 позволило достигну! _ наступления быстрой положительной клинической динамики: улучшение общего состояния, исчезновения воспалительных очагов, значительной прибавки массы тела, сроднесуточная величина которой.была в 2 раза выше, чем у детей, леченных бифидум-бактерином.

Таким образом, в настоящем исследовании была установлена роль лизоформ холиновых фосфолипидов грудного молока в становлении микробиоценоза кишечника недоношенных новорожденных детей. Негативное влияние лизо?-ФАТ и ЛФХ связано с действием этих соединений на механизм защитных свойств грудного молока и с угнетением адгезивной способности бифидобактерий.

Разработанные методы повышения защитных свойств грудного молока и коррекции микрофлоры кишечника с применением кверце-ткна, бифидумбактерина и БАД-2 могут быть рекомендованы при выхаживании и лечении новорожденных с кишечным синдромом и локальной инфекцией.

вывода

о

1. В грудном молоке преждевременно родивших женщин, страдающих хроническими шфекцйонно-воспалительннш или аутоиммунными заболеваниями, а также в стерилизованном женском молоке обнаружены биологически'активные метаболиты фосфолипидов - фак-Ар активации тромбоцитов (ФАТ) , лизо-ФАТ и в сыворотке молока - лизофосфатидилхолин (1ФХ ), содержание которых не зависит от сроков гестации. В натиныоы грудном молоке больных

«енщин выявлена активность фосфолипазы А, которая коррелировала с содержанием ЛФХ и лизо-ФАТ молока. Б грудном молоке здоровых женщин, родивших доношенных или недоношенных детей, фактор активации тромбоцитов, лизо-ФАТ и ЛФХ в сыворотке молока не определялись, а активность фосфолипазы А практически не реги-зтрировалась.

2. Выявлено ингибирующее действие лизоформ холинсодержа-цих фосфолипидов - лизо-ФАТ и ЛФХ'и стимулирующее влияние ли-зоцима на адгезивные свойства бифидобактерий ВЛфЛит.!, Ъ.ас1о-

МЗ-42/В^опцит в 379?Л в' мод лышх исследованиях на эритроцитах человека. Установлена прямая корреляционная связь .гажду содержанием лизофосфатидов в грудном молоке ж его инги-5ирующим действием на адгезию бифидобактерий.

3. Наличие лизоформ фосфолипидов в грудном молоке и его шворотке, как правило, сочетается со значительным снижением защитных свойств молока - угнетением фагоцитарной активности аакрофагов, антибактериальной активности молоками ингибицией «гезии бифидобактерий. .

4. Показано, что вскармливание грудным молоком со снижен-[ыми защитными свойствами и наличием в нем ФАТ, лизо-ФАТ, а в ¡ыворотке молока ЛФХ сопровождается развитием дисбактэриоза галечника различной степени выраженности, диспепсией и локаль-мми инфекционно-воспалительными заболеваниями у новорожденное недоношенных детей. Изменения микробиоценоза кишечника :арактеризуются отсутствием или дефицитом бифидо- и лактобак-'ерий и доминирующим ростом лактозоотрицательных энтеробакте-1ИЙ и гемолитических форм микроорганизмов. Выявлено изменение пектра фосфолипидов копрофильтратов при дисбактериозе кишеч-ика у новорожденных детей. Наличие ЛФХ в копрофильтратах яв-яется наиболее.информативным показателям нарушения микроэко-огии кишечника.

5. Назначение флаваноида кверцетина кормящим матерям, стра-ающим инфекционно-воспалительными или аутоиммунными заболева-иями, приводит к нормализации защитных свойств грудного моло-а: подавлению активности фосфолипазы А и снижению концентра-ии лизофосфолипидов, восстановлению антибактериальной актив-ости грудного молока, фагоцитарной активности макрофагов мо-ока, стимуляции адгезии бифидобактерий.

6. Разработана оптимальная схема нормализации микробио-

ценоза кишечника у новорожденных недоношенных детей, находящихся на грудном вскармливании, предусматривающая лечение их • бифидумсодержащими препаратами на фоня коррекции фосфолипид-ного состава грудного молока кверцетином у матерей.

7. Обогащение донорского молока с измененным фосфолипид-ным составом биологически активной добавкой БАД-2, содержащей лизоцим и бифидобактерии, способствует быстрой нормализации биоценоза кишечника у новорожденных недоношенных детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение содержания ФАТ, лизо-ФАТ, а тазде уровня ЛФХ в грудном молоке, исследование защитных свойств молока могут служить дополнительной объективной характеристикой наличия инфекционно-воспалительного процесса у кормящих матерей и испо.. зоваться как критерий качества грудного молока. Исследование биохимических и иммунологических свойств грудного молока рекомендуется проводить женщинам, страдающим хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями, которые обострялись в период беременности и родов, а также перенесших токсикозы беременных различной степени выраженности; матерям, у детей которых развился кишечный синдром; женщинам, донорам грудного молока.

2. Для коррекции защитных свойств и липидного состава женского молока и дисбактериоза кишечника у недоношенных новорожденных детей рекомендуется сочетанное применение кверцетина внутрь у кормящих матерей по 0,02 г два раза в день в течение 2-6 недель ж бифидумгерапш у их детей.

. 3. БАД-2 рекомендуется назначать недоношенным новорожденным детям с кишечным синдромом и локальными инфекционно-воспалительными заболеваниями при вскармливании этих детей стерильным донорским молоком. БАД-2 назначается из расчета 6-8 г в сутки в 3-5 кормлений с донорским молоком. Курс лечения -2-3 Недели.

4. Определение спектра фосфолипидов в копрофильтратах у новорожденных недоношенных детей предлагается как метод экспресс диагностики дисбактериоза кишечника к может использоваться для динамического наблюдения в процессе лечения дисбиоза.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Состояние перекисного окислокия липвдов и лзгаидного состава плазмы у новорожденных, перенесших острую ж хроническую гипоксию / М.Ф.Дещокина, Г.В.Тананова, В.Ф.Демин, М.В.Дудкина, Л. й. йльашсо, М.В.Кушарева, С.И.Сватлов // Педиатрия. - 1988. Й2. С.22-26.

2. Оптимизация стнроэкологии кшочш ла нэдоношешшх новорожденных дотай кисломолочной скзсью "Бифзлин" / Н.А.Абросимова, Р.М.Харькова, М.В.Кушнарава, А.В.КозлоЕа // Педиатрия. - 1989. -Ä3. - С.30-33.

3. Кушарева М.В., Харькова Р М., Абросимова H.A. Метод определения влияния грудного молока на адгезивные свойства т-кроорганизмов // Лабораторное дело. - 1990. - A3. - С.69-71.

4. Защатныэ факторы грудного молока у преждевременно родивших женщин я ах влияние на состояние биоценоза кишечника у новорожденных детей/ Р.М.Харькова, С.Н.Зацепина, М.В.Кушнарава, А.Е.Козлова, М.И.Фролова, О.Н.Белова// Актуальные вопросы ин-фекционно-воспалитэльннх заболеваний у новорожденных детей: Сб. тр. ШИШиДХ МЗ РСФСР. - Москва, 1990. - С.32-38.

5. Применение биологически активной добавки БАД-2 для улучшения защитных свойств донорского молока и коррекции микрофлоры кишечника у недоношенных детей / М.В.Кушнарава, Е.С.Кепш-шян, Р.М.Харькова, М.И.Фролова, 0.И.Дедушкина, Э.Г.Щербакова// Актуальные вопросы инфекционно-воопалитэльных заболеваний у новорожденных детей: Сб. тр. ШИШиДХ МЗ РСФСР. - Москва, 1990. -С.104-110.

участок множительной техники вонц амн cc

ТИРАЖ

— 3 а к.' q>b

ПОДП. К ПЕМ АТи( Ц.90 П -