Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие генов, индуцируемых метанолом, в росте и устойчиовсти растений к стрессу

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Участие генов, индуцируемых метанолом, в росте и устойчиовсти растений к стрессу"

На правах рукописи

Поздышев Денис Валерьевич

УЧАСТИЕ ГЕНОВ, ИНДУЦИРУЕМЫХ МЕТАНОЛОМ, В РОСТЕ И УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К СТРЕССУ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

15 АПР 2015

005567436

МОСКВА 2015

005567436

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Дорохов Юрий Леонидович

Официальные оппоненты:

Эльдаров Михаил Анатольевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, руководитель группы генетической инженерии грибов, ведущий научный сотрудник

Голденкова-Павлова Ирина Васильевна, доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, руководитель группы функциональной геномики, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии имени академиков М.МШемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится У 2015 года в /2- "часов на заседании диссертационного совета Д

501.001.76 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.hio.trisu.ru

Автореферат разослан « / » а/ь/гЛлЯ 2015 года Ученый секретарь Л

диссертационного совета, кандидат биологических наук

ч \

И.А. Крашенинников

В руководстве диссертационной работой принимала участие доктор биологических наук Комарова Татьяна Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Растения, не имея возможности избежать стрессовых воздействий среды, выработали способность эффективно на них отвечать (Kissoudis et al., 2014). Растения способны синтезировать летучие органические соединения (ЛОС), которые играют роль химических сигналов, передающих информацию о стрессе на значительные расстояния. Такие сигналы могут быть приняты другими растительными организмами, повышая их шансы на эффективный ответ (Holopainen and Blande, 2012). В качестве примеров соединений с подобной функцией можно назвать ЛОС зеленых листьев, терпены, фитогормоны, такие как этилен и метилированные производные жасмоновой и салициловой кислот (Dorokhov et al., 2014).

Метанол, или древесный спирт, является ЛОС растений, функция которого неизвестна. До недавнего времени метанол рассматривался как побочный продукт роста клетки (von Dahl et al.,

2006). Источник метанола в растении - реакция деметилирования пектина с участием фермента пектинметилэстеразы (ПМЭ) в процессах роста и повреждения клеточной стенки (Pelloux et al.,

2007). ПМЭ отщепляет метальные группы от сложных эфиров галактуроновых кислот пектина с образованием метанола. Метанол не является ядом для растений, а его нанесение в концентрациях, существенно превышающих физиологические концентрации, непосредственно на листья Arabidopsis thaliana (Downie et al., 2004) меняет содержание мРНК ряда генов, среди которых наиболее представлены гены метаболизма и сигнальных путей клетки. Известно, что ПМЭ повышает устойчивость растений ко многим биотическим стрессам, а атака фитофага и механическое повреждение листа сопровождается резким выбросом в атмосферу газообразного метанола, который возможно влияет на активность генов соседнего растения.

Приведенные факты позволили нам выдвинуть гипотезу о том, что метанол принимает участие в регуляции иммунного ответа, а также росте и развитии растительной клетки.

Степень разработанности темы. Данная работа посвящена экспериментальному подтверждению гипотезы о физиологической и эпигенетической функции метанола. Был проведен сравнительный анализ транскриптомов клеток интактного листа и листа, обработанного газообразным метанолом в концентрациях, близких к физиологическим в условиях стресса. Анализ выполнен методом вычитающей подавляющей гибридизации. В результате получен список генов, индуцируемых метанолом (ГИМ). Среди них были обнаружены гены, участвующие в регуляции межклеточного транспорта. Поставлены эксперименты, позволяющие оценить влияние метанола, а также конкретных ГИМ на распространение вируса табачной мозаики (ВТМ). В связи с тем, что в процессе роста и развития растения содержание метаболического метанола в клетке меняется, нами был рассмотрен вопрос о влиянии уровня эндогенного, не связанного со стрессом, метанола на регуляцию ГИМ.

На основе полученных данных был предложен механизм взаиморегуляции метанола и ГИМ по типу обратной связи через воздействие на ПМЭ. Получены экспериментальные доказательства в пользу такого механизма.

Цель и задачи. Основной целью представленной диссертационной работы является изучение участия ГИМ в росте я стрессовых реакциях растений. Поставленная цель достигается решением четырех задач:

1. Выявить гены КЧсоПапа ЬетИагтапа, экспрессия которых повышается в ответ на газообразный метанол;

2. Исследовать участие ГИМ в регуляции плазмодесм и в межклеточном транспорте ВТМ;

3. Идентифицировать ГИМ среди генов, ответственных за рост и развитие листьев табака;

4. Получить экспериментальные доказательства в пользу предложенного нами мехашома регуляции ГИМ по типу обратной связи.

Научная новизна. В представленной диссертационной работе впервые были описаны изменения в экспрессии генома растительной клетки в ответ на повышенный уровень газообразного метанола в физиологических концентрациях. Были идентифицированы гены, чувствительные к метанолу, также был изолирован промотор, индуцируемый метанолом. ГИМ были найдены также среди генов, значимых для развили листа. Показано влияние ГИМ на регуляцию плазмодесмального транспорта, а также на чувствительность растения к вирусной инфекции, предложены механизмы такого влияния. Впервые была предложена схема регуляции гена, основавшая на принципе обратной связи с участием метанола.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе собраны доказательства в поддержку гипотезы о новой функциональной роли метанола как регулятора иммунных реакций и, вероятно, онтогенеза листа, описаны эффекты и предложены механизмы действия метанола. Предложена теоретическая схема обратной негативной регуляции ГИМ, универсальность которой может способствовать решению других задач в области биологии растений.

В практическом плане, обнаруженные закономерности активизации межклеточного транспорта могут бьггь использованы для усовершенствования систем продукции целевых белков в растении с помощью вирусных векторов на основе геномов вирусов растений. Найденные генетические маркеры растущих зон табака, а также изолированные последовательности промоторов растений, один из которых индуцируется метанолом, также могут быть использованы в биотехнологии.

Методология и методы исследования. Данная экспериментальная работа проводилась на хорошо изученных модельных растениях МсоНапа ЬемЪатгапа и ЬЧсоЧапа /аЬасит. Вычитающая подавляющая гибридизация была выполнена фирмой Евроген (Россия). Для создания генно-инженерных конструкций были использованы стандартные молекулярно-биологические методы; для трансформации растений был использован метод транзиентной трансформации с помощью клеток А^оЬасГегшт Ште/ас1еп5; ферме1ггативные тесты и работа с белками осуществлялась по описанным ранее в литературе методам.

Положения, выносимые на защиту:

1. В геноме растений рода ШсоНапа (М. Ьсыкатшпа и N. IаЬасит•) существует группа генов, индуцируемых газообразным метанолом (ГИМ);

2. Группа ГИМ включает гены, способные увеличивать плазмодесмальный транспорт, среди которых гены ЫСАРР, ¡3-1,3-глюканаза, 5ЕОР и МЮ-21;

3. Газообразный метанол способствует репродукции ВТМ в растении, что вызвано, в частности, индукцией генов ЫСАРР, ¡5-1,3-глюканаза, МЮ-21, а также, вероятно, взаимодействием белка ЫСАРР и транспортного белка ВТМ;

4. Гены группы ГИМ различаются по реакции на метанол, не связанный со стрессом. Среди ГИМ есть ген SEOP, экспрессия которого активируется в ответ на повышение эндогенного метанола, а также ген NCAPP, не реагирующий на изменения эндогенного метанола;

5. Регуляция гена NCAPP может осуществляться по механизму обратной связи в цикле «NCAPP-ПМЭ-Mctamn-NCAPP», где NCAPP, индуцированный метанолом, осуществляет подавление синтеза ПМЭ и, следовательно, снижает уровень синтеза метанола растением.

Степень достоверности и апробаиия результатов. Результаты работы были представлены на конференциях: «ЕМВО workshop: Intercellular communication in plant development and disease-2014», Бишофшем, Франция; Конференция «Ломоносов-2014», Москва, Россия; Конгресс «FEBS-2013», Санкт-Петербург, Россия; Конгресс «FEBS-2012», Севилья, Испания; Конгресс «FESPB-2010», Ваченсия, Испания, а также на семинаре отдела химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского (12 сентября 2014 года).

Публикаиии. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 6 материалов международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части (3 раздела), заключения и списка цитируемой литературы из 171 наименования. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста и включает 39 рисунков и 6 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез метанола увеличивается при механической травме растения

Большинство стрессовых воздействий на растение сопровождается механическим повреждением его тканей. Дня имитации этого процесса листья модельных растений N. bentliamiana и N. tabacum обрабатывали абразивным материалом целитом. Механическая травма приводит к накоплению мРНК ПМЭ (рисунок 1), увеличению ферментативной активности ПМЭ в клеточных стенках (рисунок 2), накоплению метанола в соке растения, а также повышенной эмиссии метанола поврежденным листом в среду (рисунок 3).

0 13 8 часы после травмы

контроль нанесения

Рисунок 1, Повреждение листа N. юЬасит целитом вызывает накопление мРНК ПМЭ. Данные нозерн-блот анализа с ДНК зондом, комплементарным кодирующей последовательности ПМЭ. Результаты получены совместно с Т.В. Комаровой

До травмы После травмы

Рисунок 2. Изменение ферментативной активности ПМЭ в клеточных стенках листьев N. ЮЬасит до травмы и через 3 часа после обработки абразивным материалом. Изменение статистически значимо (/К0.01).

фДВМЫ о

О

Время после травмы, часы Время после травмы, минуты

Рисунок 3. Слева - динамика изменения концентрации метанола в соке листьев N. шЬасит после повреждения абразивным материалом. Статистически значимая разница по сравнению с концентрацией до травмы достигается в точках 3, 16 и 24 часа после травмы (*, р< 0,01). Справа -динамика изменения эмиссии метанола листьями N. ЬеШИатшпа после повреждения абразивным материалом. Замеры газообразного метанола методом абсорбирующей капли. Разница в эмиссии между травмированным и интактным листом, в каждой временной точки, а также изменения эмиссии поврежденного листа через 1 и через 3 часа после травмы, статистически значимы (р<0,01).

2. Метанол приводит к изменениям в транскриптомс растительной клетки Для исследования роли метанола в реакции растения на стресс был проведен сравнительный анализ транскриптомов контрольного растения N. ЬепМктиапа и растения, обработанного газообразным метанолом в концентрациях, близких к физиологическим в условиях механической травмы. Анализ проводили с помощью метода вычитающей подавляющей гибридизации, этот метод позволяет сравнить два образца тотальной РНК.

Гены, активация которых в ответ на метанол наиболее значительна, можно условно разделить на группы в соответствии с их функциями, это гены, кодирующие белки ответа на стресс, гены, кодирующие белки клеточной энергетики (ферменты фотосинтеза и гликолиза), группа генов ионных транспортеров и группа генов анаболизма. При этом наиболее представлена группа генов ответа на стресс (таблица 1).

Функциональная аннотация ближайшего гомолога Номер фрагмента в базе

при поиске по базе CeneBank Genebank

ß-l,3-glucanase, basic PR-2 FN432035

ß-l,3-glucanase (vacuolar isoform) FN432037

Proteinase inhibitor II FN432036

Methanol-induced gene-21 (MIG-21) FN432041

PME inhibitor FN432040

Elicitor inducible protein FN432735

1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase FN432033

p-cyanoalanine synthase FN432034

NCAPP, non-cell autonomous pathway protein FN432039

Salicylic acid binding catalase FN432738

Heat shock protein 70 FN432734

Pathogen- and wound-inducible antifungal protein CBP20 FN432038

DnaJ protein FN5619U

Peroxidase FN432751

Таблица 1. Основные гены, ассоциированные со стрессом, содержание мРНК которых возрастает в листьях N. benthamiana после инкубации в среде с газообразным метанолом в концентрациях, близких к физиологическим в условиях механической травмы. По результатам вычитающей подавляющей гибридизации. Результаты получены совместно с Т.В. Комаровой.

В группе генов стрессовых белков можно отметить три белка PR группы (от англ. pathogenesis related, белки, ассоциированные с патогенезом): |3-1,3-глюканаза, ингибитор протеиназ II и пероксидаза, а также белки-регуляторы фитогормонов - это каталаза, связывающая салицилат (salicylic acid binding catalase, SABC) и оксидаза 1-амииоциклопропанкарбоновой кислоты (АКК-оксидаза).

Для верификации результатов были отобраны б генов (таблица 2), а в качестве отрицательного контроля был взят ген DCL1 (dicer like protein 1) - ген, участвующий в специфическом иммунном ответе (сайленсинге) и не обнаруженный по результатам данных вычитающей гибридизации. Гены, мРНК которых накапливается в ответ на метанол, были обозначены как гены, индуцируемые метанолом (ТИМ).

я , Относительное количество мРНК

г ья « с. Я Ч 5 й * о 2 ¡¡-1,3- АКК Ингибитор

•А - глюканаза ИСАРР МЮ-21 оксидаза оси протеина:; II

Метанол 17,5 118,7±4,01 9,89±2,67 3,60±0,80 3,40±0,67 2,34±0,73 1,32±0,42

70,0 398,53± 12,53 48,84*5,19 17,5!±2,60 7,67±1,05 2,71±0,67 7,11±0,68

Контроль и ±0,1 1,00±0,25 1,00±0,3 1,00=0,26 1,00±0,23 1,0040,39 1,00*0,33

Таблица 2. Верификация ГИМ методом количествений полимеразнй цепной реакции с обратной транскрипцией ^ЯТ-РСЛ). Растения N. ЬетИагпшпа инкубировали в закрытой емкости в течение 18 часов с метанолом или без. Метанол в контрольной емкости - это метанол, эмулируемый растением за время инкубации без добавления метанола извне. Уровень мРНК контрольного растения принят за единицу. Результаты получены совместно с Т В. Комаровой.

Если в качестве источника метанола было взято растение N. ЬепЛатшпа с листьями, поврежденными целитом, то в неповрежденном растении после инкубации с травмированным содержание мРНК найденных ГИМ повышалось (рисунок 4).

Для генов с наибольшей чувствительностью к метанолу, была определена динамика накопления мРНК в течение пяти суток после трехчасового воздействия газообразного метанола на растение (рисунок 5).

□ Инкубацияс интактньмрастение« Ш Инкубзциястравмированным растением

р-1,з-:.иок1ттн Ж:ЛРР МЮ-21 Ннтттор Нныбптор

Ш/Э нропч/шш II

Рисунок 4. qRT-PCR анализ накопления мРНК ГИМ при инкубации интаггного растения N. ЬепИшпиапа в общей атмосфере с растением, травмированным целитом, в течение 3 часов. За единицу принят уровень мРНК после инкубации с интактным растением. По оси ординат логарифмическая шкала.

100.0 -,

/1-1, S -глю канат NC'APP

□ мю-21

10.0.

1.0 4—É

0.1

0

-► 3

Инкубация с ыетаиолои

24

48 72 96 120

Время после инкубации, часы

120

Рисунок 5. qRT-PCR анализ динамики накопления мРНК ГИМ в растениях N. benlhamiana после трехчасовой инкубации в атмосфере с повышенным содержанием метанола. За единицу принят уровень мРНК в точке 0, то есть перед инкубацией. По оси ординат логарифмическая шкала. Результаты получены совместно с Т.В. Комаровой.

3. ГИМ активируют межклеточный транспорт

Для исследования межклеточного транспорта макромолекул нами выбран метод транзиентной агробактериальной трансформации одиночных растительных клеток бинарным вектором, содержащим двукратный GFP (2xGFP, green fluorescent protein) под контролем CaMV 358-промотора [промотор вируса мозаики цветной капусты (cauliflower mosaic virus, CaMV), широко применяемый в биотехнологии, далее обозначается 35S], Лгроинфильтрацию производили суспензией бактериальных клеток с низкой концентрацией, чтобы изначально получить одиночные трансформированные клетки. После проведения агроинфильтрации растения находились вне эксикатора 6 часов для того, чтобы прошла трансформация, после этого проводилась трехчасовая инкубация в атмосфере с метанолом, а через 21 час подсчитывали кластеры клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Кластер - это трансформированная клетка и соседние клетки, в которые 2xGFP смог перейти из первично трансформированной. Таким образом, чем больше процент одиночных кластеров, тем более «закрыты» плазмодесмы. В качестве контроля использовапи интактное растение. Результаты представлены на рисунке 6.

3 3(1

__I Од:1но'«1ые клетки -нет трэнсгортэ)

О клетки э кластер ■ Г~ з кпетН! в кластере Ш : л £слег ю'епжв кластер-:

Контроль После инкубации с метанолом

Рисунок 6. Сравнение активности межклеточного транспорта в растении, обработанном метанолом, и в контрольном растении. Разница статистически значима (р<0,01). Результаты получены совместно с Т.В. Комаровой.

Для изучения участия конкретных ГИМ в активации метанолом плазмодесмального транспорта макромолекул был проведен эксперимент, где вместо обработки метанолом проводилась совместная агротрансформация листьев 2хОИР и индивидуальными ГИМ, участие которых в регуляции межклеточного транспорта можно ожидать - это /}-1,3-глюканаза, .УСАРР и МЮ-21 (рисунок 7). В качестве контроля на метод агроинфилырации было взято растение, трансформированное вектором рВГЫ, не несущим трансгена.

Я Одиночные клетки ¡неттранспорта; Ш 2 клетки в кластере О 3 клеши в кластере 92 3 Я ч и более кпетоквкязстере

о 30

76.3 73,9 '7.5

йвв ■ • А. :

В

16,4 7.5 ¡5,7

3 2 о.З ¡¡В 5.5 ,,8 Я5,3 2'7 ЙИ 1.8

ЯП 1 - , г®

рш ХСЛРР Шв-21 Р-и-.-.иокянта

Рисунок 7. Участие ГИМ в межклеточном транспорте. Была проведена совместная агроинфильтрация растений одним из ГИМ (или контрольным вектором рВ1Ы, не несущим трансген) и 2хОРР. Результаты трансформаций статистически значимо отличаются от трансформации с рВВД (р<0,01). Результаты получены совместно с Т.В.Комаровой.

Из результатов, представленных на рисунках 6 и 7, видно, что после обработки растения метанолом, а также при совместней инфильтрации с индивидуальными РИМ количество одноклеточных кластеров уменьшается, появляется новая группа с числом клеток в кластере более трех. Это свидетельствует о том, что плазмодесмальный транспорт активируется. Таким образом, метанольный сигнал сам по себе, выделенный из контекста травмы, активирует межклеточный транспорт посредством повышения уровня накопления мРНК ¡1-1,3-глюканазы, ИСАРР и ШС-21.

4. Участие ГИМ в вирусной инфекции

При агроинфильтрации листьев N. ЬепГИат1апа вектором на основе генома тобамовируса крестоцветных (крВТМ), кодирующая последовательность транспортного белка в котором была заменена на репортерш,ш ген йРР — крВТМгвРР (МагШоппе! е! а! , 2005), можно оценивать активность межклеточного транспорта такого модельного вируса. Участок клеток с ОРР, представленный клетками эпидермиса и, в меньшей степени, мезофилла, называется фокусом инфекции. По преобладающему размеру этих фокусов можно судить об эффективности распространения вирусной РНК. Эксперименты показывают, что метанол способствует распространению вируса (рисунок 8).

□ контроль

с метанолом

0,2-0.3

0,3-0.4 0,4-0,5 0,5-0,6 Диаметр фокуса инфекции, мм

Рисунок 8. Оценка эффективности заражения вирусным вектором крВТМ.ОИР после инкубации растений N. Ьеп/Иатшпа с метанолом и без метанола (контроль). Указаны средние проценты фокусов разного диаметра от общего числа фокусов инфекции со стандартными ошибками. Изменение статистически значимо (р<0,01). Результаты получены совместно с Т.В.Комаровой.

Дня того, чтобы подтвердить обнаруженные эффекты в ситуации, приближенной к природной, был проведен эксперимент на растениях N. IаЬасит с использованием суспензии частиц ВТМ дикого типа. После заражения вирусом, растения инкубировали 18 часов с газообразным метанолом в концентрациях близких к конценграциям при травме, а через трое суток после этого брали высечки на qRT-PCR анализ для определения количества РНК ВТМ в листе (рисунок 9).

Процесс репродукции вируса складывается из процессов межклеточного транспорта вирусной РНК и биосинтеза вирусных макромолекул в клетке. Мы показали, что метанол приводит к повышенной репродукции РНК ВТМ, а также, что ГИМ увеличивают пропускную способность

плазмодесм. Эти два факта позволяют предполагать, что наблюдаемый нами эффект чувствительности табака, обработанного метанолом, к вирусу связан с активацией генов ¡1-1,3-глюканазы, КСАРР и МЮ-21

Контроль Инкубация с

метанолом

Рисунок 9. Газообразный метанол повышает эффективность репродукции ВТМ. Растения, инокулированные 8ТМ, инкубировали в течение 18 часов в среде с повышенным содержанием метанола. Представлены результаты анализа qRT-PCR, за единицу принято количество вирусной РНК после инокуляции. Разница между опытом и контролем статистически значима (р<0,01). Результаты получены совместно с Т.В.Комаровой.

Вирус попадает в клетку растения в момент травмы, а это значит, что ранние этапы заражения происходят в условиях повышенных концентраций метанола, когда начинают активно функционировать ГИМ. При этом р-1,3-глюканаза и NCAPP имеют плазмодесмальную локализацию (Lee, 2003, Zavaliev et al., 2011). Для транспортного белка ВТМ (ТБ) было показано, что он способен эксплуатировать растительные системы транспорта, связываясь с белками с периферийной локализацией для собственного внутриклеточного транспорта (например, Chen et а!., 2000). Вышесказанное позволило выдвинуть гипотезу о том что TF> ВТМ может связывать (Н.З-глюканазу и NCAPP, которые, вероятно, активны в момент вирусной инфекции.

Дтя проверки наличия взаимодействия ТБ ВТМ с NCAPP и р-1,3-глюканазой был использован метод связывания белков на мембране в ренатурирующих условиях в двух вариантах. В первом варианте белки, кодируемые указанными ГИМ, иммобилизировали на мембране, а затем мембрану инкубировали в ренатурирующем буфере с ТБ ВТМ. При наличии специфического взаимодействия, связанный на мембране из буфера ТБ детектируется специфическими антителами. Проведенные нами тесты показывают, что in vitro ТБ ВТМ взаимодействует с иммобилизованным NCAPP, но не взаимодействует с Р-1,3-глюканазой (рисунок 10, дорожки 1-6). Для подтверждения полученного результата опыт был повторен во втором вариаоте метода (реципрокный вариант), когда ТБ ВТМ был изначально иммобилизован на мембране, а рекомбинантный NCAPP подавали из раствора в ренатурирующих условиях (рисунок 10, дорожки 7-11). Связавшийся белок, детектировали антителами к NCAPP. Хотя сигнал был значительно слабее, чем в экспериментах по первой схеме, мы заключили, что NCAPP связывается с ТБ ВТМ.

шшзш

123456 789 10 11

Рисунок 10. Белок NCAPP взаимодействует с ТБ ВТМ in vitro. Проверка взаимодействия белков методом связывания на мембране. На пленке слева (дорожки 1-6) сигнал свидетельствует о наличии белка ТБ, связанного из буфера на мембрану с иммобилизованными на ней белками: 1) Р-1,3-глюканазой 1 мкг, 2) Р-1,3-глюканазой 0,33 мкг, 3) NCAPP 1,5 мкг, 4) NCAPP 0,5 мкг, 5) маркерами молекулярного веса, 6) ТБ ВТМ 0,6 мкг (положительный контроль). На пленке справа (дорожки 7-11) сигнал свидетельствует о наличии белка NCAPP, связанного из буфера на мембрану с иммобилизованными на ней белками: 7) р-1,3-ппоканазой 0,5 мкг, 8) маркерами молекулярного веса, 9) ТБ ВТМ 1 мкг, 10) ТБ ВТМ 0,5 мкг, 11) ТБ ВТМ 0,1 мкг.

5. Метанол влияет на регуляцию устьиц

В нормальных условиях эмиссия метанола может контролироваться устьицами (1\!етесек-МагеЬаП ет а!., 1995). Нами было показано, что повышенная концентрация газообразного метанола вызывает закрытие устьиц в интактном растении (рисунок 11). Во-первых, закрытие устьиц - это один из признаков неспецифического иммунного ответа (Ме1ойо й а!., 2006), во-вторых, закрытие устьиц может привести к еще большему увеличению метанола в соке интактного растения за счет собственного синтеза. Таким образом, этот факт говорит в пользу участия метанола в генерализованной реакции листа на стрессовое воздействие среды.

О с. ft В

1м

Рисунок 11. Влияние метанола на апертуру устьиц. Устьица были синхронизированы - 2 часа в темноте, затем 2 часа на свету, после этого листья помещены в герметичные емкости. В емкости «в» был метанол в количествах, близких к повышенным физиологическим. Емкость «а» помещена в темноту, а остальные две оставлены на свету. Через час проведены замеры просвета устьица. Видно, что а) в темноте устьица стали закрываться, б) на свету остались открыты, в) в присутствии метанола закрылись. Апертуры б) и а) статистически значимо отличаются (р<0,01).

6. Влияние метаболического метанола на регуляцию ГИМ

В процессе нормального развития листа есть состояния, при которых концентрация метанола в сокс значительно изменяется. Чтобы определить, чувствительны ли найденные ГИМ к таким, не

связанным со стрессом, изменениям метанола, а также чтобы понять принципиальную разницу в регуляции генов, чувствительных к метанолу, в нормальных условиях и в условиях механической травмы, была использована модель sink и source листьев.

Нормальный рост растительной клетки сопровождается растяжением и изменением физических свойств клеточной стенки, вызванными деметилированием пектина ПМЭ (Komarova et al., 2014). Помимо созревания клеточных стенок, процесс роста растения характеризуется, в первую очередь, изменением углеводного метаболизма, когда незрелые листья, потребляющие фотоассимиляты, превращаются в листья, их производящие. Незрелые листья, в этом контексте, называются sink листьями, а зрелые - source листьями, в соответствии с англоязычным статьями, где эти понятия были впервые введены (Ауге, 2011, Kühn и Grof, 2010).

Мы проанализировали содержание мРНК ПМЭ в sink и source листьях табака с помощью qRT-PCR и показали, что в sink листьях содержание мРНК ПМЭ более чем в два раза выше уровня её мРНК в source листьях (рисунок 12, слева). Результат по измерению мРНК ПМЭ соотносится с данными о концентрации метанола в соке sink листьев по сравнению с source листьями (рисунок 12, справа). Данный результат подтверждается сравнением эмиссии метанола в растущих и сформировавшихся тканях растений других видов (Hiive et al., 2007).

е 1.2

¡3=

ЭГ

<i 1.0

£ 0.8

Ф

|0.6 S

с 2E JS

5 0.2

1 О

щщ

I

м

jggii

ВИН

и *

с- ф

с а

а о

£ «

= х

11 Ii

« с О о

80

60

40

20

3 entsink)

13 см (source)

3 см (sink) 13 см (sources

Рисунок 12. Слева - относительное содержание мРНК ПМЭ в sink и source листьях N. labacum (указаны размеры листьев) по результатам qRT-PCR анализа. За единицу принят уровень мРНК в sink листе. Разница статистически значима (р<0,01). Справа - содержание метанола в соке sink и source листьях табака N. tabacum (указаны размеры листьев). Разница статистически значима (р<0,01). Результаты получены совместно с И В. Петруней.

Наличие на одном растении зон с разной концентрацией метанола в соке позволяет сравнить влияние эндогенного метанола на активность ГИМ, для которых показана регуляция метанолом из среды. Нами был проведен qRT-PCR анализ содержания мРНК ГИМ, а именно NC.APP, /3-1,3-глюканазы, MIG-21 и ингибитора протеиназ ¡1 в sink и source листьях табака. Оказалось, что уровень транскриггции гона NCAPP не меняется, а для трех других генов увеличивается в разы в source листьях (таблица 3).

Листья табака Относительное количество мРНК

В- 1,3 -рлюканаза NCAPP MIG-21 Ингибитор npoinciinal П

Sink (3 см) 0,83±0,08 0,80±0,10 0,98±0,03 1,01 ±0,02

Source (10-13 см) 41,29±1,61 1,14±0,14 21,85±3,30 3,87±0,28

Таблица 3. Содержание мРНК ГИМ в sink и source листьях табака по результатам qRT-PCR анализа. За единицу принят уровень мРНК в sink листе. Изменение значимо для всех генов (р<0,01), кроме NCAPP.

7. Новые ГИМ с дифференциальной экспрессией в sink н source зонах листа Нами были определены гены, уровень транскрипции которых наиболее значимо различается в sink и source зонах, а значит в условиях повышенного и пониженного фонового уровня эндогенного метанола, соответственно. Анализ проводился с помощью метода вычитающей подавляющей гибридизации - было проведено сравнение образцов тотальной РНК из sink и source листьев (таблица 4).

Ген Предполагаемая фупкция Номер в базе European Nucleotide Archive

Повышенная экспрессия в source листьях

*Svgar transporter (ST) Предполагаемый двунаправленный транспортер сахара, активность которого сопряжена с транспортом продуктов фотосинтеза и Б^ок-Боцгсс трансформацией листа HG4250S8

*A tain-repressed protein (ARP) Генная мишень воздействия ауксинов, регулирующих рост растения HG425066

*Elicitor responsible protein (ERP) Участие в транспорте продуктов фотосинтеза и вирусов по флоэме HG424989

Glucosyl transferase Участие в биосинтезе Сахаров HG425054

Glutathione transferase Участие в процессах детоксификации HG425060

*Salicylic acid binding catalase (SABCJ Участие в росте растения, является генной мишенью воздействия салициловой кислоты HG425067

Повышенная экспрессия в sink листьях

Chlorophyll a'b binding proteins (CABs) Участие в фотосинтезе HG424982

Chloroplasi genome encoded ribosomal proteins Участие в биосинтезе белка в хлоропластах HG424986

'Sieve element occlusion protein (SEOP) Участие в транспорте продуктов фотосинтеза, участие в репарации ситовидного элемента флоэмы при его повреждении HG425012

H2A and H3 histone proteins Гистоновые белки HG4249S3

Oxj'gen evolving complex 33 kDa photoSystem II protein Участие в фотосинтезе HG425001

CMoroplast plastocyanin precursor Участие в фотосинтезе HG425007

Таблица 4. Основные гены с дифференциальной экспрессией в sink и source листьях по результатам вычитающей подавляющей гибридизации. *, гены, отобранные для дальнейшего аиализа.

По результатам вычитающей гибридизации в sink зоне происходит активное накопление мРНК генов, кодирующих компоненты аппарата фотосинтеза, белки, участвующие в синтезе тРНК, белки клеточной стенки, белки-регуляторы морфогенеза. В то же время в source зоне наиболее представлены гены, кодирующие белки-транспортеры Сахаров, а также белки гормональной регуляции. В целом полученные результаты отражают и согласуются с теми свойствами, которыми характеризуются sink и source зоны.

qRT-PCR анализ содержания мРНК отобранных для верификации генов в листьях разных ярусов подтвердил изменение уровня их транскрипции в разы в sink и source зонах (рисунок 13).

Рисунок 13. Верификация генов, отобранных по результатам вычитающей подавляющей гибридизации, методом qRT-PCR. Оценка уровня накопления мРНК ST. SEOP, ART, ERP и SABC в листьях разных ярусов, по оси ординат логарифмическая шкала, за единицу принято содержание мРНК в sink листьях. Для каждого из указанных генов разница в уровне накопления мРНК в sink и source листьях статистически значима (р<0,01).

Далее для этих же генов была проведена проверка чувствительности к газообразному метанолу из среды (рисунок 14). Показано, что в ответ на метанол статистически значимые изменения наблюдаются только для генов SEOP, ARP и SABC. Уровень накоатения мРНК SEOP, как в случае с эндогенным метанолом в sink ткани, так и в случае с метанолом извне, возрастает. Это

позволяет предполагать, что в растении существуют механизмы, которые основаны на рецепции уровня метанола генами, подобными ЖОР.

■ контроль п с метанолом

1,03 —i—

3 45

i

Рисунок 14. qRT-PCR анализ накопления мРНК генов, отобранных по результатам вычитающей подавляющей гибридизации. Относительное количество мРНК ST, SEOP, ARP, ERP и SABC в листьях N. tabacum после воздействия газообразного метанола, но оси ординат логарифмическая шкала, за единицу принято содержание мРНК в контрольных листьях. Разница значений уровня мРНК между контрольными и обработанными метанолом растениями статистически значима (р<0,01) для генов SEOP, ARP и SABC.

8. Промотор гена NCAPP чувствителен к метанолу

Повышение накопления мРНК ГИМ, в частности NCAPP, в ответ на метанол уже было продемонстрировано (таблица 2). Для дальнейшего изучения этой системы был изолирован транскрипционный промотор гена NCAPP длиной 1500 пар нуклеотидов (последовательность в GenBank: HG937605.1). С помощью метода «прогулка по хромосоме» была получена последовательность, находящаяся перед кодирующей частью гена NCAPP в растении N. benthamiana. На основе этой последовательности были созданы три бинарных вектора с вариациями по длине промотора (500, 1000 и 1500 пар нуклеотидов) и репортерным геном GUS. Агротрансформация растений полученными векторами с последующим измерением активности фермента GUS, показала, что длины последовательности в 1000 пар нуклеотидов (далее будет обозначаться как прNCAPP) достаточно для того, чтобы стабильно детектировать сигнал (рисунок 15).

Рисунок 15. Выделение промотора гена NC.APP. Результаты измерения активности GUS после

агротрансформации растений N. benthamiana контрольной конструкцией 35S-GUS, эффективность которой принята за 1, и конструкциями под контролем фрагмента промотора NCAPP разной длины.

J5S 0,5 1.0 1.5

Длина промотора fJCAPP. тыс. п.н.

Стоит отметить, что агробактериапьную траизиентную систему экспрессии нельзя использовать в экспериментах по проверке чувствительности к метанолу, так как процедура инокуляции является значительным механическим стрессом для растительной ткани сама по себе. Поэтому для дальнейшей работы были получены растения N. benthamiana, стабильно экспрессирующие ген GUS под контролем промотора NCAPP дайной 1000 пар нуклеотидов (линии трансгенных растений 2А. 2F, 4, 10, 11, последовательность введенного трансгенав GenBank: HG974538.1}.

Инкубация трансгенных растений линии 2F в среде с повышенным содержанием метанола и последующий qRT-PCR анализ накопления мРНК гена GUS, показывают, что промотор гена NCAPP чувствителен к метанолу (рисунок 16).

3

О х г ф о.

X -

Л О

С ¡£

¥

S" V

г о и ? ® S

5 §

О а

контроль с нетанолон

Рисунок 16. Промотор гена NCAPP чувствителен к метанолу. Уровень накопления мРНК GUS в трансгенных растениях N. benlhamiana линии 2F (прNCAPP-GUS) через 24 часа после 6-ти часовой инкубации в среде с повышенной концентрацией метанола. Уровень мРНК до инкубации принят за единицу, в качестве контроля - инкубация растений той же линии при инкубации без добавления метанола. Изменение статистически значимо (р<0,01).

В полученных трансгенных растениях содержание мРНК ЫСАРР снижено в десятки раз по сравнению с N. ЬепИштшпа дикого типа. Нокдаун этого ГИМ наблюдается во всех полученных линиях (рисунок 17). Наиболее низкое содержание мРНК ЫСАРР отмечено в растениях линии 2Р.

1.2 .

с 1 . с

? 0.8 . с

£ о.б. «

0,4 .

О 3

Дикий г «л

2А 4 10 2F

Линии трансгенов np,N'C/lPP-Gi/S

Рисунок 17. Накопление мРНК NCAPP в растениях разных линий, несущих трансген GUS под контролем ripNCAPP Уровень мРНК в растении дикого типа был принят за единицу, изменение для всех линий трансгенов статистически значимо (р<0,01) по сравнению с диким типом.

Для линии 2Г также характерен повышенный уровень накопления мРНК гена ПМЭ в сравнении с растениями дикого типа. Как показывает цИТ-РСЯ анализ, для этих растений уровень мРНК ПМЭ выше, чем в растениях дикого типа, в 2-6 раз в зависимости от поколения линии 2Р (рисунок 18).

Нлш Пксдрр

i

шт$м

Днкштнп ГО Т1 Т2

Рисунок 18. Накопление мРНК ПМЭ и ЫСАРР линии трансгенных растений 2Р разных поколений по результатам чЯТ-РСИ анализа. Уровень транскрипции соответствующих генов в растениях дикого типа был принят за единицу. Изменение содержания мРНК указанных генов во всех поколениях трансгенов статистически значимо (р<0,01) по сравнению с диким типом.

9. Экспрессия гена ПМЭ зависит от А'С'АРР При агротрансформации N. ЬепЛагтапа бинарным вектором, кодирующим ЫСАРР белок под контролем 355 промотора, содержание мРНК эндогенной ПМЭ падает (рисунок 19).

шЫСАРР

100-1

•х

St

л

с; о р ю

Ё S

О

О Г Г S

¿ К

О О

10

0 1

24 48

Бремя после arpen нонупяци и _ часов Рисунок 19. qRT-PCR анализ накопления мРНК ПМЭ и NCAPP в листьях N. benthamiana, агротрансформированных вектором, несущим NCAPP под контролем 35S промотора. Транзиентная трансформация повышает содержание транскрипта NCAPP в десятки раз уже через сутки; одновременно наблюдается подавление накопления эндогенной мРНК ПМЭ. Уровни содержания мРНК генов до трансформации приняты за единицу. Все изменения статистически значимы (р<0,01). По оси ординат -логарифмическая шкала.

Для определения локализации белка NCAPP в нашей лаборатории был создан бинарный вектор, кодирующий NCAPP с 3xFLAG пептидом на С-конце. Эта метка широко применяется в молекулярной биологии растений (Ueda et al., 2011). Листовой материал растений N. benthamiana,

агротрансформированных этим вектором, был разделен на четыре фракции. Вестерн-блот анализ с помощью антител на пептид FLAG показал, что меченый NCAPP находится, главным образом, во фракции белков клеточной стенки (рисунок 20), что подтверждает его функциональную гомологию с ранее описанным белком NtNCAPPl (Lee, 2003).

А Б В Г

Рисунок 20. Вестерн-блот анализ растений, синтезирующих NCAPP с меткой 3xFLAG на С-конце. После агротрансформации растений конструкцией 35S-NCAPP-3xVLAG (схема в правой части рисунка), листовой материал был разделен на четыре фракции: А) фракция белков клеточной стенки, включающая в себя и белки аппарата гшазмодесмы; Б) фракция легких мембран, содержащая в основном белки ЭПР и хлоропластов; В) фракция тяжелых мембран, содержащая в основном ядерные белки; и Г) цитоплазматическая фракция. Эти фракции были проанализированы методом вестерн-блота с антителами против FLAG.

Присутствие NCAPP в ядерной фракции (рисунок 20, дорожка В), а также ядерная локализация гомологов NCAPP из N. tabacum (Lee, 2003, Heese-Peck и Raikhel, 1998) дали нам основание предположить, что NCAPP способен влиять на экспрессию гена ПМЭ по принципу транскрипционного фактора негативной регуляции

Для проверки этой гипотезы из генома N. benthamiana мы изолировали последовательность ДНК длиной 1750 пар нуклеотидов, располагающуюся перед стартовым кодоном гена ПМЭ (последовательность в GenBank: HG937606.1). Датее, мы создали бинарный вектор, содержащий репортерный ген GUS под контролем этой последовательности (прДМЭ). Агротрансформация листьев N. benthamiana конструкцией прПМЭ-GUS показала, что щПМЭ направляет экспрессию гена GUS, обеспечивая детектируемый сигнал (рисунок 21).

Рисунок 21. Результаты

ферментативного теста на активность GUS в листьях после агротрансформации растений N. benthamiana контрольной конструкцией 35S-GUS и конструкцией прПМЭ-GUS. Результат измерений активности GUS для 35S-GUS принят за единицу. Изменения статистически значимы (р<0,01).

mm

Í—у-——

прПМЭ-GUS

Далее мы оценивали эффективность работы npff.V/Э по количеству GUS в условиях сверхэкспрессии NC APP. При совместной агроинфильтрации вектора прПМЭ-GUS вместе с 35S-NCAPP повышенный уровень экспрессии NCAPP подавляет синтез GUS и на уровне транскрипции, и на уровне накопления белка, что выражается в понижении активности фермента GUS (рисунок 22).

о 1.2

прПМЭ-GUS прПМЭ-GUS +• + pßlN 35S-NC.APP

1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 О

"Т

f-

ш

прПМЭ-GUS + PBIN

прПМЭ-GUS + 35S-NCAPP

Рисунок 22. qRT-PCR анализ содержания мРНК GUS (слева), а также ферментативный тест на активность GUS (справа), для листьев, агроинфильгрированных конструкцией пр/7МЭ-GUS в сочетании либо с 35S-NCAPP, либо с «пустым» вектором pBIN. За единицу принято количество мРНК GUS или активность в листе, трансформированном прПМЭ-GUS совместно с pBIN. Изменения статистически значимы (р<0,01).

10. Уровень транскрипции гена ПМЭ влияет на уровень эмиссии метанола

Ранее уже были представлены факты, говорящие в пользу прямой корреляции между уровнем накопления мРНК ПМЭ и уровнем эмиссии метанола Так, в травмированной ткани повышенная транскрипция ПМЭ связана с повышенной активностью данного фермента клеточной стенки и с более активным выбросом метанола в воздушную среду (рисунки 1-3). Также нами показано, что в sink зонах листьев табака повышенный уровень мРНК ПМЭ вызывает рост концентрации метанола в соке (рисунок 12).

Полученные в нашей лаборатории линии трансгенных растений 2F и 11 с нокдауном гена NCAPP и, вероятно, вызванной этим повышенной транскрипционной активностью гена ПМЭ позволяют еще раз проверить наличие корреляции. Тест на ферментативную активность ПМЭ в таких растениях показал, что активность ПМЭ в них выше, чем в растениях N. benthamiana дикого типа, в 3-4 раза (рисунок 23, слева). При этом уровень эмиссии метанола трансгенмыми растениями выше в 2-2,5 раза (рисунок 23, справа).

Трлнсгеиные пинии

Трлисгенные линии

Рисунок 23. Активность ПМЭ (слева) и уровни эмитируемого метанола (справа) в двух линиях трансгенных растений с нокдауном ЫСАРР в сравнении с растениями дикого типа. Различия между растениями дикого типа и трансгенами статистически значимы (р<0,01).

Полученные результаты позволяют предложить модель регуляции экспрессии гена ЫСАРР по принципу обратной связи (рисунок 24). Были получены экспериментальные дказательства трех утверждений. Во-первых, промотор гена ЫСАРР чувствителен к метанолу, во-вторых, повышенное содержание мРНК ЫСАРР ведет к снижению уровня накопления мРНК ПМЭ, вероятно через его транскрипционный промотор, и, в-третьих, от уровня накопления мРНК ПМЭ зависит интенсивность эмиссии метанола.

Рисунок 24. Модель обратной регуляции экспрессии генов с участием \'САРР. Механическое повреждение клеточной стенки активирует ПМЭ (1). Синтез ПМЭ и её секреция в клеточную стенку (КС) (2) приводят к активному синтезу метанола (3), что, в частности, влечет за собой увеличение его концентрации в цитоплазме и активацию экспрессии гена М'АРР через промотор, индуцируемый метанолом (4). ЫСАРР подавляет транскрипционную активность промотора ПМЭ (5). Подавление экспрессии П\0 снижает уровень эмиссии метанола, останавливая, в конечном счете, транскрипцию ЫСАРР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспрессия гена ПМЭ в растении повышается в ответ на любой стресс, сопряженный с механическим воздействием на клеточную стенку. 13 данной работе показано, что от уровня накопления мРНК ПМЭ в клетке зависит ферментативная активность ПМЭ, а также уровень метанола, синтезируемого растением. Особенно ярко данная зависимость проявляется в модельной ситуации с механической травмой листа абразивным материалом, когда эмиссия метанола возрастает в десятки раз в сравнении с неповрежденным листом. Так как механический стресс является неизбежным спутником практически любого стрессового воздействия на растение, была выдвинута гипотеза о сигнальной функции метанола в иммунном ответе растения. Для проверки этого предположения был проведен сравнительный анаши транскригггомов неповрежденного листа N. benthamiana и листа, инкубированного в среде с повышенным содержанием метанола в концентрациях, близких к физиологическим. Оказалось, что в клетках листа, обработанного метанолом, наиболее значимо меняется содержание мРНК генов, кодирующих стрессовые белки. Среди них ß-J.S-глюканаза, ингибитор протгиназ //, пероксидаза и другие гены, ассоциированные с патогенезом. Также можно выделить гены, участвующие в метаболизме гормонов растений (этилена и салициловой кислоты). Все гены, уровень накопления мРНК которых увеличивается в ответ на метанол, были названы ГИМ - гены, индуцируемые метанолом. Можно рассматривать полученный список ГИМ как реакцию клетки на сигнал от соседней травмированной зоны листа, подготавливающий клетку к атаке патогена и активирующий её метаболизм.

В диссертации определена реакция растения на повышенную концентрацию экзогенного метанола на клеточном уровне. Во-первых, показана активация метанолом межклеточного транспорта. Вероятнее всего, данный эффект связан с повышением транскрипции генов ß-l,3-глюканазы. NCAPP и MIG-21, так как они находятся в числе генов, наиболее чувствительных к метанолу, а также потому, что экспрессия каждого из них по отдельности приводит к повышению пропускной способности плазмодесм.

Во-вторых, было показано, что повышенные концентрации метанола в среде приводят к закрытию устьиц. Учитывая, что ранее была показана ключевая роль устьиц в регуляции эмиссии метанола в нормальных условиях, можно предположить, что закрытие устьиц приводит к накоплению метанола в неповрежденной ткани, получившей метанолыплй сигнал от соседней поврежденной зоны. Таким образом, интактный лист потенциально имеет возможность усиливать принимаемый сигнал.

В диссертации также было показано, что воздействие газообразного метанола в концентрации, близкой к физиологической, приводит к повышенной репродукции ВТМ. Вероятнее всего, это связано с эффектом активации межклеточного транспорта Такое предположение подтверждается результатами экспериментов с модифицированной формой вируса, в которых продемонстрировано увеличение фокусов инфекции после обработки метанолом. Повышению чувствительности к ВТМ обработанных метанолом растений, вероятно, также способствует взаимодействие между ТБ ВТМ и белком NCAPP, показанное в данной работе.

Результаты экспериментов по исследованию чувствительности ГИМ к метанолу совпадают как в случае инкубации растения в атмосфере с метанолом, так и при выдерживании растения в общем пространстве с другими травмированными растениями, то есть когда метанол подается вместе с другими ДОС, Для исследования вопроса о том, как влияют на экспрессию ГИМ изменения концентрации метанола в соке за счет модификации собственной клеточной стенки, был проведен сравнительный анализ транскриптомов листьев разных ярусов одного растения. Было показано, что содержание метанола в листьях верхнего яруса примерно в два раза больше, чем в нижнем. Оказалось, что множество генов, содержание мРНК которых увеличено в листьях с повышенным содержанием эндогенного метанола, и множество генов, активирующихся в ответ на экзогенный метанол, имеют лишь единичные случаи пересечения.

Анализ генов, полученных при сравнении транскриптомов листьев с разным уровнем эндогенного метанола, позволил обнаружить две особенности регуляции ГИМ. Первая особенность связана с геном 5ЕОР. Уровень накопления его мРНК возрастает как в случае с эндогенным, так и в случае с экзогенным метанолом. Это означает, что 5ЕОР функционально является рецептором метанола. Потенциально, метанол может определять регуляцию генов в ходе развития листа, так как существует градиент концентрации метанола в растущей ткани листа. Вторая особенность связана с геном К'САРР, уровень мРНК которого зависит от экзогенного метанола, и не зависит от эндогенного.

Для изучения регуляции ЫСАРР был изолирована промоторная последовательность данного гена. Используя трансгенные растения, мы показали чувствительность прК'САРР к метанолу. Таким образом, экспрессия гена К'САРР регулируется на уровне транскрипции. Затем с помощью транзиентной экспрессии, а также трансгенных растений, было показано, что от уровня накопления мРНК К'САРР в клетке зависит уровень мРНК ПМЭ, причем это обратная зависимость. Чтобы прояснить природу такой регуляции, был изолирован промотор гена ПМЭ, и было показано, что сверхэкспрессия гена МСАРР подавляет транскрипцию репортерного гена под контролем прПМЭ. Учитывая, что уровень синтезируемого метанола коррелирует с количеством мРНК ПМЭ, можно постулировать наличие в растительной клетке механизма обратной связи «М?Л№-ЯЛ/Э-метанол-К'САРР» в качестве системы регуляции К'САРР, а возможно и других ГИМ.

ВЫВОДЫ

1. Метанол, эмитируемый травмированным растением, вызывает в соседнем растении (а) накопление мРНК генов, получивших название генов, индуцируемых метанолом (ГИМ), (б) активацию межклеточного транспорта, (в) закрытие устьиц листа.

2. Гены группы ГИМ, а именно, /1-1,3-глюканаза. К'САРР, БЕОР и ранее не описанный ген, МЮ-21, принимают участие в модификации межклеточного транспорта.

3. Группу ГИМ можно подразделить на три подгруппы, различающиеся между собой по реакции на метанол. Первая подгруппа включает ¡5-1,3-глюканазу, МЮ-21, ВАВС и игибитор протеиназ II. Их мРНК накапливается при повышении концентрации экзогенного и снижении

концентрации эндогенного метанола. Во вторую подгруппу входит ген ЯЕОР, мРНК которого накапливается при ответе как на экзогенный, так и на эндогенный метанол. Третья подгруппа представлена геном ЫСАРР, уровень накопления мРНК которого не зависит от эндогенного метанола, а регулируется экзогенным.

4. Устойчивость растения к стрессу включает в себя механизм обратной связи в цикле «метанол-ЫСАРР-ПМЭ-жтаноп», где КС.АРР, индуцированный метанолом, подавляет транскрипцшо ПМЭ и, следовательно, снижает уровень синтеза метанола растением.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ

1. Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Petrunia I. V.,FroIova I.V., Pozdvshev D.V.. Gleba Y.Y. Airborne signals from a wounded leaf facilitate viral spreading and induce antibacterial resistance in neighboring plants.//PLoS Pathogens. 2012. V. 8 (4). el002640.

2. Комарова T.B., Шеваль E.B., Поздышев Д.В.. Колесникова B.C., Дорохов IO.JL Интенсивный синтез зеленого флуоресцирующего белка ведет к формированию Y-тел включения в растительной клетке // Биохимия (Москва). 2012. Т. 77 (6). С.742-749.

3. Комарова Т.В., Поздыптев Д.В.. Петруня И.В., Шешукова Е.В., Дорохов Ю.Л. Метанол, генерируемый пектинметилэстеразой, может участвовать в росте и развитии листьев табака // Биохимия (Москва). 2014. Т.79 (2). С.144- 153.

Тезисы докладов

1. Pozdyshev D.V., Komarova T.V., Sheshukova E.V., Dorokhov Y.L. Pectin methylesterase in plant growth and immunity: model of methanol feedback. II EMBO Workshop: Intercellular communication in plant development and disease. BischofTsheim. France. 2014. P. 103

2. Поздышев Д.В., Ершова H.M., Шешукова E.B. Белок NCAPP юлггролирует синтез пектинметилэстеразы клеточной стснки растений. // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоиосов-2014». Москва 2014. С. 241

3. Komarova T.V., Pozdyshev D.V., Dorokhov Y.L. Methanol controls plant bacteria-host interactions.// FEBS Journal. 2013. V. 280. № suppl. 1. P. 247-247.

4. Pozdyshev D.V., Komarova T.V., Dorokhov Y.L. Non-cell-autonomous pathway protein binds tobacco mosaic virus movement protein. // FEBS Journal. 2013. V. 280. № suppl. 1. P. 509-509.

5. Pozdyshev D.V., Komarova T.V., Petrania I.V., Dorokhov Y.L. Plant wounding influences on neighboring plant immunity. // FEBS Journal. 2012. V. 279. № suppl. 1. P. 73-73.

6. Pozdyshev D.V. The novel methanol induced genes of Nicotiana benthamiana. II Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology. Valencia. Spain. 2010. P. 138-139

Подписано в печать:

12.03.2015

Заказ № 10618 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \уилу.аи1.огсГега1:. ги