Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование иммунохимической индикации вирусных антигенов и антител к ним

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование иммунохимической индикации вирусных антигенов и антител к ним"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи УДК —578.832.1:578.74:083.3

ЛЕОНОВ Сергей Викторович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИММУНОХНМИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ К НИМ

(03.00.03 — молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук в форме научного доклада

Москва — 1990

Работа выполнена в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского

АМН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор И. Г. Харитоненков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В. В. Меспнжинов, доктор биологических наук Е. В. Сидорова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ — Научный Центр по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики МЗ СССР.

заседании Специализированного Ученого Совета (Д.001.20.01) при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР.

Защита состоится « •>

1990 г. в часов на

Автореферат разослан «

»

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

Актуальность проблемы. Индикация возбудителей различных ярусных заболеваний человека и животных на основе иммунохи-ических методов анализа играет ведущую роль в медицинской иагностике и изучении вопросов патологии. Среди иммунохими-еских методов наибольшее значение придается совершенствова-ига методов, позволяющих за короткое время с высокой точ-остью определять антигены и антитела в концентрациях 10-'1 эль/л. К ним относятся радиоимыунологические(РИА), иммуно-эрментные(ИФА) и иммунолгаминесцентные(ИЛА) ■ методы анади-а. Последние два метода получили в настоящее время наиболь-эе распространение благодаря тому,что используют значительно злее стабильные реагенты( ферменты и люминофоры) по сравнению радиоактивными изотопами и не представляют опасности для цоровья оператора при работе с ними.

Среди массовых инфекций вирусные гепатиты(БГ) и грипп знимают одно_. из ведущих мест по распространенности и указателям заболеваемости. Изучение этиологической роли яруса простого герпеса(ВПГ) при нейроинфекциях продолжает эхранять свою актуальность для практики здравоохранения, ак как характерной особенностью герпетической инфекции яв-ается возможность прехода ее в латентную фазу с последующи-л рецидивами, часто сопровождающимися менингоэнцефалитом. гбор серопозитивных больных может способствовать усовер-знствованию методов клинической диагностики, успешной вак-то- и химиотерапии заболеваний, обусловленных этим вирусом, жим образом, прогресс в изучении вопросов диагностики, гиологии и патогенеза этих заболеваний в значительной степе-и определяется совершенствованием экспериментальных подходов иммунохимической индикации как соответствующих вирусных ятигенов, в частности, НЕэ-антигена вируса гепатита В, эмагглютинина( НА) и белка нуклеокапсида( ГО3) вирусов гриппа ипа А и В, так и противовирусных антител, в частности, ятител к ВПГ первого и второго типов.

Дель исследований: совершенствование методов иммунохимической индикации вирусах антигенов, а также противовирусных антител путем упроще-ия и повышения специфичности и чувствительности анализа.

- г -

Е задачи исследования входило:

1. Разработать оптимальный способ получения иммуносор-бента на основе F(ab')2-фрагментов специфических антител, усиливающего специфическое извлечение антигенов из исследуемых образцов в твердофазном иммуноферментном анализе(ТФИФА).

2. Оценить специфичность определения и минимальную концентрацию вирусных антигеновС на примере НА и NP-белков вируса гриппа типа А и HBs-антигена вируса гепатита Б) с помощью иммуносорбента на основе F(ab')2-фрагментов специфических антител и коньюгата А-белка из St. aureus с перокси-дазой з непрямом методе ТФИФА.

3. Отработать оптимальные условия синтеза коньюгатов антител с пенициллиназой, позволяющих проводить визуальную индикация вирусных антигенов в ТФИФА, используя отечественные препараты фэрмекта, полученные из бактерий и генно-инженерным способом.

4. Определить минимальную детектируемую концентрацию вирусных антигеновС на примере НА и NP-белков вируса гриппа типа А и HEs-антигена вируса гепатита типа В) с помощью пени-циллияазных коньюгатов антител,направленных к этим вирусным антигенам.

5. С помощью твердофазной иммуноферментной тест-системы на основе одного из сконструированных пенишшшназных конь-югатов( например анти-HEs), а также аналогичных коммерческих тест-систем на основе пероксидазных коньюгатов провести сравнительный анализ клинических образцов .от больных вирусными гепатитами.

5. Разработать условия и изучить возможность применения коньюгата белка А из St. aureus с пероксидазой в твердофазной иммуноферментной тест-системе для определения антител к БПГ, где з качестве иммуносорбента используется лизат зараженных БПГ клеток.

Еровеети анализ клинических образцов от больных различными формами герпетической инфекции с помощью сконструированной тест-системы в сравнении с одним из тради-пионных серологических методов исследованийСнапример РОК).

Научная, новизна :

1. Усовершенствован метод получения иммунологически ктивных Р(аЬ')2-фрагментов антител путем использования аф-инной хроматографии на А-белок сефарозе CL-4B.

2. Впервые использован иммуносорбент на основе F(ab')2-рагментов специфических антител и коныогат А-белка из t. aureus с пероксидазой в непрямом методе твердофазного им-уно-ферментного анализа НА и NP-белков вируса гриппа типа А,

также HBs-антигена вируса гепатита R Показана высокая увствительность(0,3-1 нг/мл) и специфичность этого метода.

3. Впервые сконструированы коньюгаты анти-НА, анти-NP и кти-HBs антител с пеницшшшазой( "генно-инженерией"), поз-эляющие осуществить визуальную детекцию этих антигенов

концентрациях 1-2 нг/мд .

4. На примере HBs-антигена вируса гепатита В показано, го тест-система на основе пенициллиназы с визуальной ре-истрацией результатов анализа позволяет выявить все клини-еские образцы, положительные по данным иммуно-ферментных иагностикумов фирм "АВВОТТ'ЧСША) и "SEVAC4 ЧССР).

5. Показано, что применение коныогата А-белка из t. aureus с пероксидазой обеспечивает более высокую чувстви-ельность( по сравнению с РСК) определения уровня специфи-еских антител к ВПГ 1-го и 2-го типов с помощью иммунофер-ентной тест-системы, в которой для формирования иммуносор-ента использован лизат зараженных ВПГ клеток.

Практическая ценность:

1. Определены оптимальные условия ( концентрация, теМ-ература, время,рН) адсорбции F(ab')2-фрагментов антител, аправленных к вирусным антигенам( на примере НА,NP-белков яруса гриппа типа А и HBs-антигена вируса гепатита В) на вух наиболее широко используемых материалах твердофазного осителя - полистироле и поливинилхлориде.

2. Определены следующие оптимальные условия иммобилиза-ии двух отечественных препаратов пенициллиназы(ПЮ(выделен-ой из бактерий и генно-инженерным способом) на молекулах ммуноглобулина класса G(IgG) с помощью наиболее простого

метода - глутаральдегидного: концентрация глутарового алъде-гида=0,02-0,05%; рВ=8,0; соотношение концентраций IgG: Щ»1:2.

Усовершенствованные экспериментальные подходы - иммуно-сорбенты на основе F(ab')2-фрагментов специфических антител, ферментные коныагаты на основе А-белка из St. aureus и маркирование специфических иммуноглобулинов пенициллиназой являются основой для создания простых и экономичных методов, позволяющих осуществлять высокочувствительную иммуноферментную индикацию как вирусных антигенов, в частности НА и NP-белков вируса гриппа типа А и HBs-антигена вируса гепатита В, так и противовирусных антител, в частности , антител к ЕПГ 1-го и 2 -го типов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Всесоюзных конференциях молодых ученых "Современные проблемы медицинской вирусологии"( Рига, 198?г.), "Структура и функции биополиме-ров"( Львов, 1989г.), а также на конференциях молодых ученых Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР в 1985 и 1987 гг.

I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КШУНОСОРБЕНТОВ НА ОСНОВЕ F(ab*)2 -ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ В НЕПРЯМОМ МЕТОДЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНО-ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ.

Принципиальные схемы некоторых методов гетерогенного твердофазного иммуно-ферментного анализа вирусных антигенов изложены в таблице N 1;

/////////////////////////////////////////////////////////

конь»гат А-белка

Р.ргЖ'Й

henvsMo;:

1ГЧ'"- МеТОЗ

т>

• Одним из преимуществ непрямого "сэндвич"- метода по равнению с прямым, является то, что "детектирующие" антите-:а(ATII)'используются в "нативной" форме, т.е. авидность их :е подвержена изменениям ни в результате экранирования ак-ивного центра антитела( ответственного за связывание с ан-игеном) молекулами пришитого фермента , ни в результате оздействия различных "сшивающих" агентов(Ishikawa, 1984) ри синтезе коньюгата. Другим преимуществом являются возмож-ости оптимизации условий проведения анализа. Дело в том, то в прямом методе выбор оптимальной концентрации AT II (в оставе коньюгата) диктуется не только оптимумом их специфи-еской активности, а также количеством фермента, иммобилизо-анного , на поверхности этих антител. В результате эта кон-ентрация оказывается завышенной, что чаще всего приводит к ОЕЫшению уровня неспецифических реакций( Clark,1984). В лучае непрямых методов концентрация AT 11 может бьггь легко птимизирована на различных этапах, при этом оптимальная энцентрация коньюгата может выбираться независимо.

Данный раздел исследований был посвящен усовершенство-анию непрямого метода твердофазного иммуноферментного ана-иза. Необходимость усовершенстования была продиктована:

1. наличием неспецифического взаимодействия между ком-энентами твердофазных иммунохимических систем для обнаруже-ия вирусных антигенов( de Savigny and Voller, 1980; Husbay, 385;Pesce,1986;Dietzgen,1987).

2. сложностью процедуры получения компонентов систем:

а) нескольких специфических анти-сывороток( в качестве уточников ATI ,АТП, антивидовых антител)

б), а также индивидуальных коньюгатов ( либо ДТП ,лп<5о 1тивидрвых антител)(Ishikawa et al,1983).

Усовершенствование заключалось в усилении специфичес-зго извлечения искомого антигена путем использования в ка->стве альтернативной формы иммуносорбента(обычно испсльзу-?ся целые молекулы IgG) адсорбированных на твердой фазе ab')2-фрагментов антител, направленных к этому антиге-г(см.таблицу N. 1 А,В,В).

1.1. Получение компонентов для проведения анализа.

Одним из основных требований, предъявляемых к твердофазным иммуно-ферментным тест-системам, является простота и экономичность анализа. Прежде всего это касается технологии получения компонентов системы: иммуносорбента, "детектирую-щих'ЧАТП) антител и конъюгата ("индикаторного комплекса"). Для выбора наиболее технологичного метода получения Я ab')2-фрагментов IgG(кролика, осла и человека) сравнивались две схемы выделения, основанные на протеолитическом расцеплении IgG с помощью пепсина по методу Nissonof,1968. Различия между схемами заключалось в использовании либо метода аффинной хроматографии, либо традиционных методов гель-фильтрации и ионообменной хроматографии для очистки исходных IgQ и продуктов их протеолиза. Кроме того, отрабатывалось оптимальное соотношение IgG: пепсин для иммуноглобулинов различной видовой принадлежности. Проведенные исследования показали, что применение аффинной хроматографии на А-белок сефарозе CL-4B наиболее технологично, поскольку позволяет осуществить всю процедуру получения F( ab') 2-фрагмен-тов в течении 24 часов, что соответствует по времени этапу выделения IgG традиционными методами ионообменной хроматог-рафии(Peterson,Sober,1956). Кратко оптимальную схему выделения Flab')2-фрагментов можно изложить следующим образом:

а. выделение IgG на А-белок сефарозе CL-4B.

б. протеслитическое расщепление IgG пепсином(соотношение концентраций IgG: пепсин в зависимости от видовой , принадлежности IgG берется либо 5:1 либо Ю-,1).

в. очистка Р(аЬ')2-фрагментов от остальных компонентов протеолиза на А-белок сефарозе CL-4B.

"Промежуточным" продуктом аффинной хроматографии, 'как видно из схемы, являются очищенные "детектирующие" igu.

Использование F(ab') 2-фрагментов антител делает возможным применение белка А из St. aureus в составе конъюгата вместо ашивидовых антител. Белок А обладает повышенным сродством к константной областиС Fc-фрагмент) IgG человека и

большинства видов лабораторных aMBOTHbix(Suroila,et al. ,1981; Lindmark, et al. ,1983). Применение такого универсального коныогата, обладающего высокой активностыо( рабочие разведения 1:4000-1:5000), 'повышает воспроизводимость и экономичность анализа

Таким, образом, процедура получения компонентов для проведения анализаС иммуносорбента на основе F(ab')2-фрагментов антител ."вторичных" антител и коныогата) достаточно проста и экономична

В связи с вше изложенным , представляло интерес проверить обеспечивает ли данная Форш, иммуносорбента необходимый уровень чувствительности и специфичности индикации вирусных антигенов( на примере определения НА и NP-белка ЕГА, а тага© HBs-антигена вируса гепатита В) в твердофазном ишунофермент-ном анализе. ~

1.8. Оптимизация условий проведения анализа

Цель этого этапа исследований состоит в выборе условий, обеспечивающих максимальную чувствительность и специфичность анализа Чувствительность прежде всего определяется . минимальной детектируемой концентрацией "вторичных"("детектирующих") антител,, связанных с иммуннда комплексом, образовавшимся на поверхности твердой фазы. При этом поликлональные антитела( '"детектирующие" и ишуносорбента), направленные к различным вирусным адтигенам( Anderson,1983; Butler,1986), в частности, к антигенам вируса гриппа А ( Berg-, 1980; Harmon,1982; Phillips, 1982), оказывались предпочтительнее моноклональных. Другими словами, в оптимальных условиях концентрация "детектирующих" антител должна быть подобрана таким образом , чтобы наиболее полно иммунологически соответствовать содержанию антигена, извлеченного иымувосорбентом. Теоретический анализ чувствительности твердофазного имму-но-ферментного анализа(Рincus and Rendell,1981; Clark,1984;) показал, что в области низких концентраций- "детектирующих" антител происходит в основном наиболее прочное бивалентное

связывание с антигеном( Clark and Barbara, 1987), а минимальная детектируемая концентрация этих антител не зависит от их a№iHHocTH(Nimmo et al,1984).

Существо использованного в данной работе • комбинированного метода оптимизации условий анализа состояло в одновременном определении и области низких концентраций "детектирующих" антител и оптимальной концентрации F(ab*)2-фрагментов этих же антител. Определение последнего параметра необходимо, поскольку избыточное количество( выше некоторой "насыщающей" концентрации) антител( антигена) на поверхности твердой фазы, как было показано( Rosental et al. ,1978), приводит к снижению чувствительности анализа за счет их десорбции и конкуренции за связывание с антигеном(антителом) на последующих этапах анализа. В настоящей работе было показано( См. рис.1 А,Б), что "насыщающая" концентрация F(ab')2-фрагментов антител - 5-25 мкг/мл - оказалась несколько выше таковой для целых молекул IgG (1-5 мкг/мл)( Voller,1980). Это объясняется, по-видимому, снижением адсорбционной спсобности фрагментов в результате протеолитического отщепления значительной части гидрофобного участка, расположенного в Fc-области IgG. В то же время, при оптимальной концентрации "детектирующих" антител, как это видно на примере выявления антигенов вируса гриппа А ( См. рис. 1(A), можно снизить концентрацию F(ab')2 -фрагментов без потери чувствительности. Продолжительность и другие условия(0,05М бикарбонатный буфер рН=9,6 ; 20 час. при +4'С) адсорбции F( ab') 2-фрагментов на твердую фазу( полистирол и поливинилхлорид) были теми же, что и у целых молекул IgG.

На чувствительность анализа антигенов в составе вирио-нов, имеющих липидную оболочку, оказывают влияние некоторые дополнительные факторы. Так, увеличения чувствительности можно добиться путем увеличения доступности этих антигенов! особенно это касается внутренних белков вирионов) для взаимодействия с антителами иммуносорбента и "детектирующими" антителами. Это эффект был продемонстрирован на примере ангигеноЕ различных вирусов, в частности, вирусов гриппа А

(Веселов с соавт. ,1985;Synjakov et al,1986; Загиддулин с со-авт.,1987). Теоретический анализ чувствительности твердофазных иммуноферментных MeTOflOB(Griswald,1987) показал, что тот же эффект может быть достигнут путем увеличения эпитопной плотности на молекуле антигена( Rubin,1980; Lew,1984). По-видимому, эти два фактора взаимосвязаны, поскольку эффект увеличения доступности и эпитопной плотности( за счет,например, изменения конформации молекулы антигена) лежит в основе широко используемого подхода при анализе вирусных антигенов -сольюбилизации вирионных белков с помощью различных детерген-тов( ионного и неионного типов). Очевидно, что используемый детергент не должен изменять структуру иммунодоминантных эпи-топов на молекуле антигена и препятствовать его связыванию с антителом. В связи с вышеизложенным, было проведено определение времени инкубации, а также условий сольюбилизации,обеспечивающих оптимальное извлечение вирусного антигена из тестируемого образца Г(аЬ')2-фрагментами иммуносорбента. Критерием оценки являлся хромофорный ответ реакции - величина оптической плотностиСизмеренной при 492 нм) раствора субстрата в лунках, содержащих исследуемый образец.

Данные по отработке этих параметров в отношении NP-белка ВГА( внутренний белок вириона) представлены на рис. 2 (Б). Как видно из рисунка, высокий хромофорный ответ наблюдался уже зссле 5-ти часовой инкубации в растворе 47.-го н-октилглюкози-ца("Sigma",США). Увеличение времени инкубации до 18 часов не триводило к значительному увеличению хромофорного ответа реакции. Поскольку разрушение вирионов смесью детергентов -Тритона Х-100(1Х) и дезоксихолата натрия(ОД%) - в течении 5 гасов при 37° С также обеспечивало высокий хромофорный ответ )еакции( кривая 2), то в дальнейших экспериментах использова-тись именно эти условия, как оптимальные для выявления белка JP ВГА. Оба эти детергента широко применяются в лабораторной фактике при проведении различных методов иммунологического шализа вирусных антигенов (Voodhead et al,1974; Sarkkmen et il,1979).

Описанную выше смесь детергентов использовали для опре-

Ряс. 1. Влмяияе концентра-ими Р(аЬ) г фрагментов антител, адсорбированных ва яолистярол, ва определение ггжлгглктниии »яруса гриппа.

— номцеятращм »0. Д. < шкг/шл свотаетег*»**. Эдеь я* рж. не «см ордип*т —

оятжческм плотность кр« 492 т "О «с« «бсвмсс — концентрация гемагглотмнмм (а нг/нд).

Рис. 2, Влитие времени нмсу&вдмм с актмгеиом на ояредслеиие гемвгглютм»и-ил вируса грнияя. !—* — ммуб^им при •

течение |в. 3. 1. 0.5 « СЬОТШСТСГ-

Ркс. 1. Вджянве хошдегракм Р{аЬ)гфр*Г' иеетов ва хромофорашыД ответ реакцяв дза различны* коадеитрзди* вируса. Коямятраява Р(яЬ)гф»«пк*гД*: 4 —-еоеветст-мам «0. «. 10. С мг/м. г. Г. 4" ~ свотмпст-яукмцяе краяые дм >мгл1ши11 яммм» оетяче-сков п.тпипча ар« кшошшп мишн* см-яорегяя |ах»»пш» мтвтши) ■ вря ясвоп беэяятвгеямг» еяет>о*ж (см.* «Матерями . вы»). По ося суднят — овтмчаежя« иоямсп ар« 492 як: во «с* шЛщкх — явяавгтрдди »яруса

{• »Г/ЖЛ1.

Рве. 2. Вдеяияе различных детергентов ва км-аетмку выявления белка КР вируса гриппа с помощью Р(аЬ|гтест-с*сте*ы. I — в-фктяшмюкоэид И % конечна« кояцегтрщня); Э—смесь ДФтергеггоа тритона Х-100 О %> ■ деаок-

-------- Мтрая <0.1 З — Трятеи Х-100 И \ ко-

яошшктраияя); 4 — сдрко»ял N1,-97 '(0.1 % ; мшдатрм**). По оск ордимат — оптиче-| ялотвость яри 492 п-. во оси абсцисс — ерем« яякуФмшя с актягяяоа (я ч|.

Рис. 3. Определение гемагглютиннаа вируса гриппа с исаольэованмеи двух иимуийфериемт-иых тест-систем.

1.3 — определение гемаггаютвимиа < кюд м ром »«его, /) ■ а состам ямриояа (3} я Р(яЬ)|-т*ст*сясте»е, е исоольаоааммея иммунной « «емммуямок {Г) сыао-ротки. 2. 9" —- определмяе ген агглютинин« (изола* рояанноп» » сягтеме дяо&ных аятятсл ярн всполь*©« алиям вммуиной М я яемммувноД У} сыяороток.

Рве. 3. Выявление различных конаекгрзций очищенного белка КР (/) в Оелка КР в составе вврнона {2} с поыощыо, Р^ЬУгтест-сас-текы,

К — максимальное аиаяекяе овтячеогоА плотности » коятроляк (с«. «Матсрналы « мётши»). По ося ор-дямт — оогячесцая пдотноси ври 4% им; по ося *6£цясс — к>вз Кийки градом «кткгека (а игу мл).

деления тех же параметров в отношении изолированного гемагг-лютинина( НА) ВГА. Как видно из приведенных данных( рис. 2(A), инкубация в течение 1 часа при 37*С оказывается вполне достаточной для индикации НА ВГА в концентрациях от 5 до 16 нг/мл.

Аналогичная серия экспериментов по выявлению различных концентраций HBs-антигена позволила выбрать следующие оптимальные условия: инкубация с антигеном 3 часа при 40-4б*С.

1.3. Определение минимальной концентрации вирусных антигенов с помощью иммуносорбента на основе F(ab'^-фрагментов антител в ТФИФА. Специфичность анализа.

Как уже упоминалось в предидущем разделе, неоптимальная концентрация "детектирующих" антител приводит к снижению чувствительности и специфичности анализа вирусных антигенов как прямым, так и непрямым методом. Поскольку в непрямых методах ТФИФА обязательно использование двух сывороток(- ATI и AT II) от разных видов животных, то определенный вклад в снижение чувствительности и повышение неспецифических реакций вносит различие в авидности(Clark, 1981) и неспецифическое взаимодействие (Kfehta et а1,1972) между антителами иммуносорбента и "детектирующими" антителами(Harmon et al,1983). Для повышения чувствительности и специфичности анализа вирусных антигенов, в частности антигенов вирусов гриппа А и В и HBs-антигена вируса гепатита В, используется несколько традиционных подходов:(1) предварительное истощение сывороток ге-терологичными антигенами(Phillips et al,1982; Synjakov et al, 1986); (2) выделение антител с помощью аффинной хроматографии ( Harmon et а1,1983; Аракелов с соавт. ,1984; Загиддулин с со-авт. ,1987); (3) введение в рабочие растворы дополнительных белковых и других добавок( нормальной сыворотки человека, желатина, детергентов и др.) (Sarkkinen et al, 1981; Harmon et al,1983; Kenna.1985; Аракелов,1988). Однако, реализация этих подходов, как правило, приводит к усложнению'и повышению стоимости анализа в целом.

Минимальная концентрация НА, детектируемая с помощью иммуносорбента на основе F(ab')2-фрагментов анти-НА антител и коньюгата белка А из St. aureus с пероксидазой, как представлено на рис. 3(A), составляет 1нг/мл. Для сразнения те же препараты НАС аффинно изолированный НА А/Филиппины/2/82(H3N2) и суспензия очищенных в градиенте плотности сахарозы вирионов гриппа того же штамма) анализировались в параллельных опытах с помощью твердофазной иммуноферментной тест-системы, использующей в качестве иммуносорбента целые молекулы igG и принципиальную схему непрямого"сэндвич"-метода.

Определение минимальной концентрации белка NP ВГА( изолированного и в составе вирионов) с помощью иммуносорбента на основе F(ab')2-фрагментов анти-NP антител проиллюстрировано на рис.З(Б).В качестве контроля использовали алантоисную жидкость из незараженных куриных эмбрионов( концентрация по белку в сто раз превышает соответствующие концентрации очищенного ВГА ("антигенный контроль") , а также не содержащую анти-NP антител сыворотку кролика("сывороточный контроль"). Минимальная детектируемая концентрация очищенного ВГА и изолированного белка NP составила 1,2-1,5нг/мл( общий вирусный белок) и 0,3 нг/мл соотвественно.

Для определения минимальной концентрации HBs-антигена вируса гепатита В использовали два препарата: положительный стандарт производства фирмы "Abbott"(CfflA)( содержание HBs-антигена »20 нг/мл)(сплошная линия на рис. 3(B) и препарат плазмы крсви с известным содержанием HBs-антигена ( препарат любезно предоставлен профессором Е А.'Ананьевым). В качестве контроля брали плазму крови человека, не содержадото HBs-анти-ген( "антигенный контроль") и сыворотку осла, не содержащую анти-НВз антител(средняя величина оптической плотности 'в контролях обозначена на рис.3(B) пунктиром). Минимальная концентрация HBs-антигена, детектируемая в твердофазном иммуно-ферментном анализе с помощью иммуносорбента на основе F(ab')2 -фрагментов, составила 1 нг/мл.

1,0

0,5

- - 2 4 6 8 10

кондектрапгя НВЗ -антигена, кг/кя

Таким образом, чувствительность твердофазного имму-ио-ферментного анализа вирусных антигенов - НА и ИР-белка ВГА, НВэ-антигена вируса гепатита В, - с помошью иммуносор-5ента на основе Р(аЬ')2-фрагментов антител была не ниже чувствительности определения этих же антигенов с помощью других трямых и непрямых методов твердофазного иммуно-ферменткого анализа. Все анализы, проведенные с помощью Р(аЬ')2- иммуно-зорбента характеризовались крайне низкими значениями оптической плотности (0ПС492 нм) < 0,05) в коктролях( безантигенный контроль, контроль с сывороткой не содержащей антител и р.д.). Следует отметить, что этих результатов удалось добиться без применения вышеперечисленных традиционных подходоь ■ Повышение специфического извлечения вирусных антигенов : помощью ?{аЬ' )2-иммуносорбентз было показано(рис. 4 А, 5) на фимере определения различных концентраций гемагглютинина ;НЗ) вируса гриппа А(ВГА) в присутствии избыточных концент-адш; различных клеточных белков( лизаты незаракенных клеток • фибробластов эмбрионов кур(ФЭК), почки собаки( МОСК); алан-?оисная жидкость незараженных куриных эмбрионов).

Специфичность определения антигенов ВГА в ТФИФА с помощью иммуносорбента на основе Р(аЬ* )2-фрагментов специфических антител( антиН1,анти-НЗ и шти-НР) оценивалась по результатам анализа препаратов очищенного вируса-гриппа типа А и В, рибонуклеопротеидного комплекса( РНП) вируса гриппа типа В, а также индивидуальных вирусных антигенов(Ш-белок, № -белок, гемагглютинин -НА). Результаты экспериментов суммированы в таблице N2.

ТАБЛИЦА 2

5 V £ го

Рис. 4. Опрелеленне геыагглютниииа вирус« гриппа в различных клеточных системам при прямой сорбции антигена на полистирол (б) и при сорбции на Р(а£>)гфрагмемты специфических антител к гемаггдюгинину (о).

/—гемагглютинин к ФПБ. 2—I — гем.гглыткммм. разведенный до указанный концсктравмя с ооммцыо елланюнскил жидкости. ли«» иемрлженних клеток ФЗК. лимта некрашенных нлето* МДСК сиответст-

Шяьжнме вирусных аиткгенов с аоиодо мммуиосорбеита на освоен Г/аЬ')2-4рйГмевто1 специфически аипегел в твер&Саэнш ишухаЬецсвтвва тест-сктснш.

АВТХПЕШ I

I

I ь

Вирус иш еиш I

1. М ( а дали) «а I А/сшштш/г/вз&ю) I ж/жахпшиэвг^ск вас) I длоюю/з/б?<|ае) I л/чшл/гэоам) I в/оостоо/вз I

а/Скигапур/222/7Э_

Сствчвскм плотность при 432 их

«-в тест-систеиад ахтм-й! 1 антм-НЭ Т анти-№

0.027 1 0.480 I 0.021 *

0.023 1 ; е^т 1 0,011 *

0.0» 1 0,018 1 0,014 *

0.4В1 1 о.огг 1 0,010 *

0.034 1 [ 0,040 1 о.ого *

0.031 1 0.028 1 0.018 *

ЭД1-Ле.ш(100 кг/ка) «31 I I

д/йшшмш/г/едизю) I о.огг I о.оэо I о,оз1

алокяы&епяав) I о,ом < о.агз I о.огг

*/ч>ш1/1/83(К1К1) | о,оо9 I о.сез 1 о.и?

8/СССР/1 СО/83 I О,ого I 0.033 I 0.010

в/стгвпго/ггг/ту_I о.те I о.озб I о.он

3. ИР-вммМООвг/ш) I I

*/аи>тшшш-г/82(ШМ2) | 0.027 1 0,040 1 0,400 ~

4/тояю/з/б7(К21г) | о.озг I а.скг I о.зао»«

Д/Чих/1/83( Н1К1) 1 0.045 I 0,033 I 0.365 —

в/ссср/100/гз I о.ие I с.оэб I о.ш? —

е/стггаув/ггг/тя_> 0.СЕ4 I о.дг! I о.иг

Вируса концентрация НА- I вкт/ш во методу СИЩ) I

А/Вмев/59/79(Н1К1) I 0.5а

4Ломю/3/67(Н2»2) I 0,038

А/йишшшш/гюхвав) I о.огг

В/СССТ/100/ВЗ_I 0.017

0,041 0.035 0.445

0.031

I

I

I 0.520

I 0.533 1

I 0.015

- концентрация ГА - 100 вт/ш.

- ншиектрашГ НР-белка - 10 кг/ил.

■ • использовал препарат 7Ш > концентрации ■

Как видно из приведенных данных, иммуносорбенты на основе F(ab')2-' фрагментов дают возможность выявлять только гомологичные антигены - либо гемагглютиюга одного из субтипов(Ш или КЗ), либо NP-белок ЕГА. Такой же уровень специфической индикации.этих антигенов по данным разных авторов достигался либо путем предварительного истопения антител вирусами, имеющими НА гетерологичного субтипа( Brady and Griffiths,1982; Харитоненков с соавт. ,1984;. Sinjakov et al, 1986), либо за счет использования моноклональных антитед( Vails,1986; Walls and Harmon,1986; Coonrod,1988; Slebinga and de Boer,1989). Следует подчеркнуть, что при использовании F(ab')2-иммуносор-бентов дифференциированного определения субтипов гемагглюти-нина ВГА, можно добиться с помощью поликлональных антител без предварительного их истощения.

3 заключении можно сказать, что высокая чувствительность и специфичность твердофазного иммуноферментного анализа вирусных антигенов(как изолированных, так и в составе вирио-нов) с помощью F(ab')2-иммуносорбента достигается благодаря нескольким факторам. Во-первых, за счет правильного выбора оптимальной концентрации "детектирующих" антител. Во-вторых, благодаря тому, что сведены к минимуму различия з авидности и неспецифические взамиодейетвия между F(. ab') 2-фрагментами антител и "детектирующими" антителами, поскольку источником тех и других служит одна и та же сыворотка В-третьих, благодаря отсутствию взаимодействия между коньюгатом( белок А из St. aureus, маркированный пероксидазой) и F(ab') 2-фрагментами антител иммуносорбента. В-четвертых, благодаря адекватным условиям сольюбилизации вирусных антигенов.

II. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕНИЩШИНАЗЫ( БЕТТА-ЛАКГАМАЗЫ) ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ИНДИКАЦИИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ.

Целью этого раздела наших исследований было упрощение иммуно-ферментной индикации вирусных антигенов' за счет использования фермента -пенициллиназы- в качестве метки в сос-

таве индикаторного комплекса( коньюгата) и визуальной регистрации результатов анализа Этот фермент гидролизует бет-та-лактамное кольцо пенициллина(или цефаллоспорина) и его производных с образованием" пенициллоновой кислоты( Ross, 1984; Knowels,1985). Субстратная система для пенициллиназы состоит из смеси пенициллина, крахмала, иода и иодистого калия. Компоненты этой системы в отличии от других( например, субстраты для пероксидазы) не обладают ни канцерогенным, ни мутагенным действием. С точки зрения чувствительности и удобства, субстрат пенициллиназы особенно привлекателен для использования в ТФИФА, благодаря использованию иодно-крахмального реагента в качестве свидетеля ферментативного гидролиза бетта-лактама антибиотика. Результат этой ферментативной реакции проявляется в обесцвечивании ярко-синего раствора субстрата за счет превращения 32 в 3~в присутствии пенициллоновой кислоты в растворе крахмала. Таким образом, данная субстратная система является альтернативной обычным субстратным системам, при использовании которых результат -ферментативной реакции, проявляется в увеличении окраски( оптической плотности) раствора субстрата Данная субстратная система позволяет регистрировать результаты ТФИФА как визуально, так и с помощью обычного фотокопирующего оборудования!;Prasal, 1984; Yolken,1984;Sudarshana and Reddy,1989). В связи с вышеизложенным, представляло интерес определить обеспечивают ли пенк-циллиназные коньюгаты специфических антител необходимый уровень чувствительности при визуальной оценке результатов твердофазного иммуноферментного анализа вирусных антигенов на примере NP-белка ВГА и HBs-антигена вируса гепатита В.

В работе использовали два препарата пенциллиназы: "бак-териальная"( БПЦ) и "генно-инженерная"(ГПЦ) пенициллиназы. В качестве БЩ был взят .коммерческий препарат "Пенициллиназа для аналитических целей'Ч производства предприятия НИИ антибиотиков, г.Москва), получаемый из пенициллинустойчивого штамма В.cereus и имеющий активность 1000000 Ед/мг. ГЩ (типа ТЕМ-1) была любезно предоставлена проф. ЕА. Кордюмом (Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР, г.Киев);

Сянтез её был осуществлен фагозависимым способом, основанным на инфицировании плазмидсодержащего штамма Е. col i фагом, в геном которого встроен структурный ген фермента N Ыа Qamll7Ram54. Выход фермента в оптимальных условиях составлял бООмг/литр культуральной жидкости с активностью 2000000Ед/мг.

II.1. Оптимальные условия иммобилизации пенициллиназы на молекулах IgG с помощью глутарового альдегида.

Сравнивали два метода, описанные для иммобилизации пе-роксидазы на IgG с помощью бифункционального агента - глутарового альдегида- одностадийным Avrameas et al, 1969) и двухс-гадийный( Engval1,1971). Процедура получения коньюгатов с [томощью этого агента наиболее проста и доступна, однако зависит от правильного выбора концентрационных соотношений реа-гентов( Boorsma, 1976; Avraneas,1971). Поэтому прежде всего цля каждого из методов определяли следующие параметры:' оптимальную концентрацию глутарового альдегида и оптимальное со-этношение реагентов(IgG: фермент) в реакционной смеси при формировании коньюгата Отработка этих параметров проводилась на тримере "бактериальной" пенициллиназы и антивидовых антител [сыворотка против IgG человека с титром 1:32 в реакции ДИД).

Проведенные исследования показали, что при одностадийном «тоде наибольшей ферментативной и иммунологической актив-гастыо облад-али коньюгаты, синтезированные в условиях, когда ^отношение по белку IgG: пенициллиназа равнялось 1:2 ( оптимальная концентрация 10:20 мг/мл реакционной смеси), а конеч-1ая концентрация глутарового альдегида в реакционной смеси равнялось 0,02-0,05%. В этих условиях во фракциях коньюгата )бнаруживалось до 65-70% от общей пенициллиназной активности, шятой для коньюгирования. Полученные пенициллиназные конь-згаты сохраняли свою иммунологическую и ферментативную актив-юсть в течении 1,5-2 лет при хранении в присутствии азида [атрия( 0,0ZZ) при +4'С. Выбранные оптимальные условия синтеза [вухстадийным методом не давали значительных преимуществ в юказателях ферментативной и иммунологической активности син-

тезированных коныагатов. Шэтому в дальнейшей работе мы использовали одностадийный метод, как наиболее простой и технологичный метод иммобилизации пенициллиназы на молекулах

11.2. Конструирование коныогатов анти-ГОз и анти-КР антител с пенициллиназой и их использование в ТФИФА. •

Синтез коныогатов на основе "генно-инженерной" и "бактериальной" пенициллиназ проводили по одностадийному методу. Иммунологическую активность коныогатов проверяли методом ДИД с соответствующим антигеном. Ферментативную активность пенициллиназы в составе коныогата определяли иодометрическим ме-тодомС. ЧайковскаяС. М., Венкина Т. Г., 1962г.).

Сконструированные на основе "генно-инженерной" пенициллиназы коныогаты были использованы для индикации белка ИР ВГА и НВз-антигена вируса гепатита К Для сравнения были синтезированы коньюгаты тех же антител с пероксидазой по известному методу(В. VI 1зоп,1978). Постановка анализа осуществлялась по схеме прямого "сэндвич"-метода( ОАЭ). В качестве иммуносорбен-та использовали адсорбированные на полистироле либо целые молекулы тест-система 1), либо Р(аЬ')2-фрагменты тех же

(тест-система 2), направленных против соотвествуюших вирусных антигенов.

На рис. 5(А) проиллюстрировано определение минимальной концентрации вируса гриппа А/$шшппины/2/в2( 1Ш2), детектируемой с помощью двух коныагатов на примере тест-системы 2. В качестве "антигенного" контроля использовали алантоисную жидкость из незараженньи куриных эмбрионов( концентрация по белку в 100-200 раз превышает концентрации очищенного ВГА) , а также препарат очищенного вируса гриппа В/Сингапур/222/79). Величину "порогового** аначения( си^-о^Р") рассчитывали как среднюю величину оптической плотности в десяти лунках "антигенного" контроля плюс два стандартных отклоненияС для нени-щшшазного коньюгата - минус два стандартных отклонения-сии.оГГ'Ь'* ).Как видно из приведенных данных, с помощью пени-

циллиназных (кривая 1) и лерокеи-дазных (кривая 2) коньюгатов можно определять вирус гриппа типа А в концентрациях , 1нг/мл. С помощью тест-системы 1 были получены аналогичные результаты, однако следует отметить более высокие значения оптической плотности для "антигенного" контроля по сравнению с тест-системой 2. На рис. 5(В) показано определение минимальной концентра" --|ции НВз-антиге-

1.0 I РИС.5 А / .

э /

оЛсй X' /

м ч /

X /

X а. а /

$ X А'52

X \ м

о А /

с *

5 а уС

V

£ Ё Г- ■ I О^С« У ■

О 1

I Г . 4 16 « 128

гонцентрвцк» вирусе гриппа, иг/их

1.0

о

0,5

• X * 16

концентрация -антигена,

256 нг/ил

на вируса гепатита В( использован "положительный" стандарт пр-ва фирмы" АВВОТТ'Ч США), содержание НШ-антигена в котором =20нг/мл). В качестве "антигенного" контроля брали ' образец плазмы крови человека, не содержащий • Шз-антиген "отрицательный"

стандарт фирмы "АВВОТТ'ЧСША). Из представленных данных видно, что с помощью пенициллиназного (кривая 1) и пероксидазного (кривая 2) коньюгатов можно определять НВзантиген в концентрации 1нг/мл при использовании тест-системы 2. • При анализе с помощью тест-системы 1 отмечался более высокий уровень фоновых значений оптической плотности в "антигенном" контроле, который удалось значительно снизить при введении в буфер для разбавления коньюгата нормальной сыворотки крови человека^, е, сыворотки, не содержащей ни HBs -антигена, ни анти-HBs антител) до концентрации 2Z. Чувствительность также = 1нг/ мл.

II.3. Использование коньюгатов анти-HBs антител с пенициллиназой для визуальной идентификации HBs-антигена вируса гепатита В в клинических образцах с помощью ТФИФА.

Анализ 76 образцов плазмы крови больных вирусными гепатитами осуществляли с помощью тест-системы 1(1ТГС). В качестве референс-тестов для анализа тех же образцов использовали имму-ноферментные диагностикумы "Auszyme II"("ABBOTT",США) и "Seva-test HBs-Ае ELISA"("SEVAC",ЧССР) согласно инструкциям, прилагаемым к ним и используя те же временные и температурные параметры, как и в случае ПГС. В качестве контроля брали "положительный" (с концентрацией HBs-антигена = 6 нг/мл) и "отрицательный" стандарты фирмы "АВВОТТ'ЧСША). Результаты ТФИФА на основе пениииллиназных коньюгатов считали достоверными при наличии четко видимой глазом разницы между лунками с "положительным" (светлый раствор) и "отрицательяым'Чтемно-синий раст-Еор) стандартами. Результаты приведены в таблице N3 :

•Образцы з ! Те же образцы по результатам тестов

гесте !---------------------------------------

"А В В О Т Г' ! П Т С ! "S Е У А С"

---------------1-----------------------1---------------

48 ("-") ! 48 ! 34

1 ! 28 ("+") 1 28 ! 28

Как видно из данных таблицы, с помощью пеиициллиназкого «шьюгата были выявлены все образцы, позитивные в тест-системе фирмы" "ABBOTT".

Таким образом, использование пенициллиназных коньюгатов { визуального учета результатов твердофазного иммунофермент-юго анализа позволило без потери чувствительности идентифи-даровать HBs-антиген в клинических образцах плазмы крови от юльных вирусными гепатитами.

В заключении следует выделить несколько переспективных [аправлений использования пенициллиназы в качестве метки:

1. Генно-инженерный способ синтеза пенициллиназы и её (алая молекулярная масса (28,9 Кд) позволяет предположить юзможность синтеза коньюгатов нового типа - гибридных поли-■.ептидов, включающих полные или частичные последовательности ермента и антигена одновременно.

2. Синтетические пептиды, коньюгированные с пенициллина-ой. Примером может служить использование таких пептидов для яализа уровня антител к npe-S области поверхностных белков ируса гепатита В (Neurath A. R. ,1986).

3. Иммобилизация пенициллиназы на молекулах нуклеиновых ислот с помощью гвидин-биотиновой технологии позволит полу-ать высокоактивные гибридизационные зонды для обнаружения ируе-специфических нуклеотидных последовательностей.

III. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОНЪЮГАТА БЕЛКА А СТАФИЛОКОККА С

ПЕР0КСЗДА30Й ДЛЯ КШУНОФЕРМЕНТНОЙ ИНДИКАЦИИ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА.

Разработанные к настоящему времени иммуноферментные ме^ эды определения специфических антител к вирусу простого reo-?еа(ВПГ) требуют наличия 'ферментных коньюгатов соответствующей специфичности, а также препаративных количеств очищенного ярусного антигена(б111 jam et ai, 1971,1585;.Johansson, 1684;. юцедура очистки ВПГ 1-го и 2-го типов или вирусных полипен-адов остается 'до настоящего времени достаточно трудоемкий и зрогой. Существенным уеовершенстоЕанием яеилось бы кспользо-

вание в качестве иммуносорбента неочищенных или подуочищенных лизатов зараженных ВПГ клеток,адсорбированных на твердую фазу, а также универсального коныогата, позволяющего оценить уровень специфических антител на любом этапе течения• герпетической инфекции. Однако, наличие на поверхности зараженных ВПГ клеток рецепторов, имеющих сродство к константной области! Fc- фрагмент) иммуноглобулинов класса 6 человека! Kimmel et al,1982; Johamsson et al,1985), делает с одной стороны невозможным использование коньюгатов на основе "античеловеческого" IgG ,а с другой стороны, не дает возможности оценить.уровень специфических антител! поскольку с Fc-рецептром будут связываться все IgG из анализируемой сыворотки).

В данном разделе исследований для преодоления указанных выше трудностей предложено использовать коньюгат белка А из St. aureus q пероксидазой и неочищенный лизат зараженных ВПГ клеток'в целях упрощения и повышения сйе'цифичности индикации антител к ВПГ. ■ .

III. 1. Оптимизация условий проведения анализа

Прежде всего выясняли оптимальную концентрацию вирусных белков для адсорбции на твердую фазу, которая обеспечивает максимальное выявление противовирусных" антител на примере иммунных сывороток, кролика к ВПГ 1-го и 2 -го типов. ' Зта концентрация составила 2 мкг/мл . Достоверной разницы между иммунными сыворотками к ВПГ1 и ВПГ2 отмечено не было. "

Сравнение пероксидазных коньюгатов'антител против иммуноглобулинов кролика и белка А по кинетике, выявления кроличьих антител к ВПГ1 и ВПГ2 показало: (1) адсорбция антигена свыше 3 час. при 37 С не приводит к увеличению чувствительности индикации антител; (2) фоновые значения оптической плотности для коньюгата белка А ( 0Щ492нм)«0,01-0,02) были значительно ниже, чем у антикроличьего коньюгата! 0П(492нм)-0,2).

В целях упрощения постановки анализа была, изучена возможность применения в качестве тест-антигенов неочищенных экстрактов зараженных ШГ клеток различных линий! фибробласты

эмбриона человека($Q4) и Vero). Применение коньюгата антивидовых антктел(антикроличьих) не позволяло проводить индикацию антител к ВПГ1 из-за высокого уровня неспецифических реакций в контрольных лунках, содержащих неочищенный лизат незараженных клеток("антигенный" контроль) и неиммунную кроличью сыво-ротку("сывороточный" контроль). В то же время, усиления специфической индикации антител к БПГ1 удалось добиться при сочетанном использовании повышенной концентрации хлорида нат-рия(до-3,5М) в буфере для адсорбции (сравни рис.6(А) и (Б) и коньюгата белка А. По-видимому, этот эффект может быть объяснен с одной стороны повышенной избирательной адсорбцией антигенов ВПГ при увеличении ионной силы буферного раствора. С другой стороны, тем, что использование коньюгата белка А позволяет регистрировать только те молекулы иммуноглобулинов, у которых экспонирована константная область, в то время как вариабельная область связана с антигеном, адсорбированным на поверхности твердой фаза При этом иммуноглобулины, связанные неспецифически или связанные с Fe -рецепторами клеток, с коньюгатом взаимодействовать не будут. Таким образом, применение коньюгата белка А с пероксидаэой и модифицированных условий адсорбции позволили в дальнейших экспериментах использовать в качестве тест -антигена неочищенные лизаты зараженных ВПГ1 клеток <334 для серологического анализа клинических образцов.

II 1.2. Анализ клинических образцов от больных различными формами герпетической инфекции.

Проведено сравнительное серологическое исследование 22 образцов сывороток от больных менингознцефалитом и рецидивирующим герпесом кожи и слизистых оболочек гениталий с неврологическими осложнениями с помощью предлагаемого метода твердофазного иммуноферментного анализа(ТФИФА) и реакции связывания комплемеята(РСН). Кроме того, обследовано 5 образцов спиномозговых жидкостей(СМЖ) от больных с менингознцефалитом. Результаты этих экспериментов суммированы в таблице N4

l;5i200 »643? U600 on.<92 Ht»

2J> *

• S

Таблица N 4>

Результаты серологического мсследоыни* у боль* иых кешыпгсзнцефллшюы и с различными фор-иамм герпеса

а да? /äi>

Pajâeâ&*uç л^аогод

Ркс. б- Зависимость величины хромофорного ответа от концентрации лизатов зараженных клеток.

л — *дсир6м.м* • Ф11Б, £ — «дсор&цм» « ФИ Б с Ji M NaCJ. в. Л' — ФЭЧ л иеиражениые; О,

6' — Vera ijpjMrHiikie и »«зарджеямые.

Как видно из приведенных данных.

2 1 2 Дк»гм» Ï1.7Î. » РСК Титр к ТФ ИТ Л

Сыворотки

1 Герпес геннталь- 1.20 1:100

иыи

2 Г«рп?с лицевой 1.20 1:100

3 , ) 1:40 1:3 200

4 » ^еииталь- . 11 ы и 1:20 1:6 400

5 Герпес липа, шеи 1:20 1:6 400

6 Герпес геннталь-

ИЫЙ 0 1:100

7 . Герпес гепиталь-

иый 1:20 1:100

8 Герпес геинталь-

ный 1:20 1:100

9 Герпес днцевои - 1:20 1:800

10. 1 » » 1:40 1:1 600

II Герпес гениталь-

ИЫЙ ' о 0

.12 Герпес гениталь-

ный 1:20 1:25 600

13 Герпес лица, яго-

диц 1:80 1.25 600

14 Герпес лица, ягодиц . 1:80 1.-6 400

15 Герпес лица, яго-

диц , 1:20 1:6400

16 Герпес лица, яго-

ДВД - 1:20 1:4 096

17 Мелингоэпцефалит 1:80 1:1 024

18 Герпес гениталь-

НЫЙ 1:40 1:160

19 Менищ-оэнцефалит 1:80-1:100 1:4 096

20 ■ , 0 1:640

21 1:20 1:4 096

22 » 1:20 ■ 1:2 048

23

24

25

СМЖ Меиикгоэнцефалат

1:4 1:4-1:8 О О О

1:8 1:16 1.10 1:4 1:16

предлагаемый метод ТФИФА позволил » выявить' антитела к ВПГ1 практически во всех пробах сывороток кроме, одной,"и во всех пробах СМЖ. Необходимо отметить, что сыворотка больного N11 была также се-ронегативна-по данным РСК., Во всех серопозитивных сыворотках, по данным .ТФИФА, отмечались значительно большие титры антител, чем по данным РСК, что. свидетельствует о более высокой чувс- . твительноети ТФИФА и согласуется с данными литературы^Fortier et al, 1982). Отсутствие прямой.корреляции между титрами в РСК "и:ТФИФА связано-скорее всего с тем'фактом, что, как показа-, носGi11jam et al,1985), в РСК участвует в основном IgG3 подкласс ймммуноглобулиноь человека, который практически не взаи-

ш

as

модействует с белком А из St. aureus. Сравнительно невысокий уровень антител, зарегистрированный в образцах СМЙ, видимо, свидетельствует о том, что пробы взяты на более поздних этапах инфекции, когда в СМЖ наблюдается, как показано! Kimmel et al, 1982), лишь невысокий уровень антител класса G.

Если повышение уровня специфических антител класса М в крови и СМЖ людей является крайне информативным фактом в острый пеиод инфекции, то обнаружение специфических антител класса 6 имеет определенное значение для диагностики обусловленной ВПГ инфекции на более поздних ее этапах и, в частности, в латентной- фазе.' Шесте с тем, для целей клинико-лабораторной диагностики герпетической инфекции во многих случаях информативным является уже сам факт повышенного уровня специфических антител всех классов. Использование в ТФИФА белка А стафилококка, коньюгированного с пероксидазой, который как показано! Balint et al,1981), взаимодействует с человеческими IgM, lgG(кроме3gG3) и IgA, позволяет проводить быструю оценку общего количества специфических антител на любом этапе течения герпетической инфекции. Другим преимуществом использования белка А является его универсальное реагирование с Ig большинства видов лабораторных животных. Это позволит использовать данный коньюгат для изучения динамики иммунного ответа, для контроля эффективности противогерпетических вакцин, а также при экспериментальной герпетической инфекции на различных видах лабораторных животных.

Резюмируя, можно сказать, что разработанная тест-система лоэволяет с достаточно высокой чувствительностью проводить одновременное серологическое исследование большого числа клинических образцов сыворток и СМЖ от больных различными формами герпетической инфекции.

ВЫВОДЫ:

1. Определен оптимальный способ получения иммуносорбента

- F(ab')2-фрагментов специфических антител, адсорбированных на цвух наиболее распространенных типах твердых фаз - полистироле л поливинилхлориде.

2. Применение иммуносорбента на основе F(ab')2-фрагментов специфических антител и коньюгата А-белка из St. aureus с

пероксидазой в непрямом исэндвйч"-методе(Г(аЬ')2-тест) твердофазного иммуноферментного анализа антигенов(НА и НР) вируса гриппа А, а также НВв-антигена вируса гепатита В позволяет осуществить индикацию этих антигенов в минимальных концентрациях - 0,3 - 1НГ/МЛ.

3. Определены оптимальные условия иммобилизации двух отечественных препаратов пенициллиназыС выделенной из бактерий и генно-инменерным способом) на молекулах с помощью наиболее простого метода - глюгаральдегидного.

4. Сконструированные коньюгаты анти-ЫР и анти-НВг антител с пенициллиназоЖ "генно-инженерной") позволяют осуществить визуальную идентификацию этих антигенов при минимальных концентрациях - 1-2 нг/мл в прямом исэндвич"-методе твердофазного иммуноферментного анализа.

5. Применение пенициллиназного коньюгата и визуального учета результатов анализа позволяет идентифицировать НЕб-ан-тиген вируса гепатита В в клинических образцах ( плазма крови от больных вирусными гепатитами) с чувствительностью, не уступающей коммерческим иммуноферментным диагностикушм фирм "АВВОТТ'ЧСША) И "БЕУАСГЧЧЗСР).

6. Усовершенствование индикаторного комплекса(коньюгата) путем использования в его составе белка А стафилококка обеспечивает более высокую( по сравнению с РСЮ чувствительность индикации уровня антител к ВИГ в ТФЙФА, использующем в качестве тест-антигена неочищенный лизат зараженых ВПГ клеток.

Список научных работ,опубликованных по материалам доклада:

1. Л. Г. Харитоненков, С. К Леонов, М. Л. Христова, В. А. Кор-дюм. Иммуноферментная индикация вирусных антигенов с использованием коньюгатов на основе -лактамазы. В сб.: "Актуальные вопросы общгй и медицинской вирусологии". .Москва, 1986,с. 15-21

2. С. К Леонов, Т. А. Посевая, ¡й А. Закомырдин, Т. Б. Семенова, Е. П. Деконенко,И. Г. Харитоненков, И. Ф. Баринский. Использование коньюгата белка А стафилококка с пероксидазой в иммунофер-ментной тест-системе для определения антител к вирусу простого герпеса. Вопр. вирусологии, 1986, N3,0.321-325.

3. И. Г. Харитоненков, В.А.Кордюм, ¡£ JL Христова, С. В. Леонов, В. .С. Кириллова, С. И. Черных. Иммуноферментная индикация вирусов и вирусспецифических антител с использованием коньюгатов на основе -лактамазы, полученной генно-инженерным способом. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины., 1S87 г., CIII.N -5, с. 627-630.

4. С. В. Леонов, M. Е Соколова, Ю. А. Закомкрдин. Получение "(ab')2-фрагментов и их применение в иммуноферментном анализе ja примере тест-системы для определения гемагглктинина и NP-5елка вирусатриппа А.В сб.: Методы исследования в молекуляр-зой, общей и медицинской вирусологии. .Шсква, 198?г., с. 152-159.

5. С. В. Леонов. Иммуноферментная индикация ьирусов гриппа í гепатита с использованием коньюгатов на основе пенициллиназы. Тезисы докладов Коференции молодых ученых "Современные проблемы медицинской вирусологии"., Рига, 1987г. , с. 27.

6. С. В. Леонов. Использование F( ab' ) 2-фрагментов антител зри создании иммуноферментной системы для определения гемагг-истинина и белка NP вируса гриппа. Тэм хе.е. 26.

7. С. В. Леонов, Ю. А. Закомырдин, Г-КЭггерт, М. В. Соколова, I Л Христова, }L Г. Харитоненкор, Г. Зиннекер. Иммуноферментная гест-система на основе F(ab')2-фрагментов антител для индика-дии гемагглютинина вируса гриппа. Вопр. вирусологии, 1987г. , U, с. 498-502.

8. С.В.Леонов, М. Л. Христова, M. Е. Соколова,. JL Деннер, 1 Г. Харитоненкоз. Иммуноферментлая тест-еиетеу.а на основе г( ab' ) 2-фрагментов антител для выявления белка KP вируса 'риг.па. Вопр. вирусологии , 19&Рг. , К 1, с. 18-21.

9. Т. 3. Сорочинекая, С. В. Леонов. Использование -лакта-¿а?ы TEMI из Escherichia coli в твердофазном иммунофермент-юм анализе. Тезисы докладов сколй-ксьференции "Структура и функции биополимеров"(г. Львов, 1989), Киев, 1988г.. с. 73.

10. С. В. Леонов, Я.Оюунбилег, X Цацрал, П. Нимдаваа. Конструирование коньюгатов анти-HBs антител с ченициллиназой, гозволяюших проводить визуальную идентификацию KBs-антигена зируса гепатита В в" клинических образцах с помощью ELISA. В íh. : "Молекулярная биология и генетическая инженерия внру-:ое", Москва, 1989 г., с. 112-118.