Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видоспецифические антигенные эритроцитарные диагностикумы для определения антител к Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалева, Татьяна Сергеевна, Пермь

61 ■■ eg- 3/7$?- н

На правах рукописи

КОВАЛЕВА Татьяна Сергеевна

ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕННЫЕ ЭРИТРОЦИТ АРНЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi 03.00.07- микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.Ф.Петров

доктор медицинских наук А.Н.Пантюхина

Пермь -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список основных сокращений 3

Введение 4

Глава I. Основные принципы конструирования

антигенных риккетсиальных эритроцитарных диагностикумов (обзор литературы) 11

1.1. Реакция непрямой гемагглютинации 11

1.2. Основные принципы приготовления АЭД 13

1.3. Особенности сенсибилизации эритроцитов

антигенами полисахаридной и белковой природы 17

1.4. Место РИГА среди регламентированных серологических тестов и ее диагностические возможности 23

1.5. Антигенная структура риккетсий группы СТ 28 Глава II. Материалы и методы 30

2.1. Материалы 30

2.2. Методы 34 Глава III. Разработка методов конструирования АЭД

на основе разных сенситинов, полученных из риккетсиальной клетки 39

3.1. Выбор основы для получения

полноценных гемосенситинов 39

3.2. Приготовление поверхностных

риккетсиальных антигенов и их характеристика 42

3.2.1. Изучение иммунохимических свойств

поверхностных и мембранных антигенов 47

3.2.2. Оценка гемосенсибилизирующих свойств

поверхностных и мембранных антигенов 52

3.2.3. Определение серологических свойств СЭ

на основе поверхностных и мембранных антигенов 55

3.3. Разработка антигенного эритроцитарного

диагностикума на основе группового сенситина 57

3.3.1. Получение диагностических сывороток

и изучение динамики антителообразования с

помощью группового АЭД. 64

3.4. Получение видоспецифического сенситина 68

3.4.1. Приготовление иммуносорбента для

адсорбции групповых специфических антител 70

3.4.2. Выделение видоспецифических антигенных

комплексов риккетсий (ВАКР) и их характеристика 72

3.5. Разработка видоспецифических АЭД на

основе ВАКР Rprowazekii и R. typhi 74

3.6. Оценка диагностических возможностей

полученных АЭД 75

3.7. Аспекты дальнейшего использования разработанной

методики получения видоспецифических АЭД 78

Глава IV. Заключение 82

Выводы 89

Библиографический список использованной литературы 90

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

АЭД - антигенный эритроцитарный диагностикум ВАЭД - видоспецифический антигенный эритроцитарный диагностикум

ВАКР - видоспецифические антигенные комплексы риккетсий

ГСА - гемосенсибилизирующая активность

ЖЭСД - жидкий эритроцитарный сыпнотифозный диагностикум

ИЭД - иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум

КПЛ - клещевая пятнистая лихорадка

МАКР - мембранные антигенные комплексы риккетсий

нМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител

ПАКР - поверхностные антигенные комплексы риккетсий

РА - реакция агглютинации

РНАг - реакция нейтрализации антигена

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

РТНГА- реакция торможения непрямой гемагглютинации

СТ - сыпной тиф

СЭСД - сухой сыпнотифозный эритроцитарный диагностикум ФТЭБ - формалинизированные танизированные эритроциты барана

ХСВ - химическая сыпнотифозная вакцина ЭД - эритроцитарный диагностикум

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Сегодня все чаще отмечается рост количества случаев новых (emerging) и возвращающихся (re-emerging) риккетсиозных заболеваний, в том числе и эпидемического сыпного тифа (СТ) [92,176].

В прошлом постоянный спутник войн, голода и социально-экономических потрясений - СТ и в настоящее время тесно связан с политическими и экономическими катаклизмами. Подтверждением этому являются эпидемия СТ среди беженцев в Бурунди (заболело 33 тыс. человек с летальностью 30%), очаги тюремного СТ, вспышка СТ в психиатрической больнице Липецкой области, охватившая 29 человек [87,113,165].

В России в 1998 году заболеваемость сыпным тифом, по сравнению с предыдущим годом, возросла в 4 раза (ЗНиСО, №1, 1999). Наблюдаемое в наши дни ухудшение социально-экономического положения в стране, снижение материального благополучия населения, появление бездомных и рост педикулеза, локальные конфликты и поток беженцев значительно осложнили проведение контроля и слежение за этой инфекцией.

В создавшихся условиях проведение серологического мониторинга с целью активного выявления больных, переболевших СТ и болезнью Брилля-Цинссера, приобретает все большую значимость в эпиднадзоре за возвращающимися риккетсиозными инфекциями [176]. На примере локализации и ликвидации очага эпидемического СТ в Липецкой области наглядно продемонстрирована значимость различных серологических тестов (РНГА, РСК, РНИФ, ИФА) в распознавании этой инфекции [87]. Показано, что среди них высокой диагностической значимо-

стью при определении специфических антител в сыворотках больных и переболевших из очага сыпного тифа по чувствительности и выявляемое™ обладала реакция непрямой гемагглютинации. РИГА проста в постановке и не требует применения специального оборудования, что позволяет использовать ее в практических лабораториях любого уровня оснащенности.

Однако, применяемые для постановки РИГА эритроцитарные ди-агностикумы (ЭД) не удовлетворяют требованиям, предъявляемым ВОЗ к современным диагностическим препаратам, в частности, они непригодны для изучения напряженности иммунитета у лиц привитых сыпнотифозными вакцинами, для оценке уровня антител в период реконва-лесценции и внутригрупповой дифференциации риккетсиозов группы СТ. Последнее требование приобретает особую актуальность в настоящее время, в связи с появлением риккетсиозов, вызываемых новыми возбудителями этой группы: R.canada и R.felis [75,144,145,156,179].

Анализ литературы по изучению антигенной структуры риккетсий позволяет предположить, что решение этой проблемы возможно при использовании видоспецифических антигенов риккетсий [130,133,183].

В литературе нет данных, касающихся приготовления ЭД на основе видоспецифических антигенов риккетсий.

Цель настоящих исследований - выделение группо- и видоспецифических антигенов R.prowazekii и R. typhi и создание на их основе антигенных ЭД, обеспечивающих раннюю диагностику эпидемического и крысиного СТ, их межвидовую дифференциацию а также изучение иммунологической перестройки макроорганизма в период реконвалесцен-ции и вакцинации.

Основные задачи:

1.Разработать методику выделения поверхностных антигенов рик-кетсий группы СТ, изучить их иммунохимические и антигенные свойства.

2.Изучить гемосенеибилизирующие свойства поверхностных антигенов, сконструировать на их основе АЭД, провести оценку его специфических свойств.

3.Оптимизировать методику приготовления иммуносорбента для удаления группоспецифических антигенов риккетсий.

4.Изучить возможность получения видоспецифических антигенных комплексов риккетсий (ВАКР), определить их специфическую активность и гемосенеибилизирующие свойства.

5.Сконструировать видоспецифический антигенный эритроцитар-ный диагностикум (В АЭД) Кртоугагеки и В АЭД ЯЛурЫ, оценить их диагностические возможности.

Научная новизна работы.

Впервые разработана технология получения сенситинов из Я-ргоу/агеки, обладающих групповой и видоспецифической активностью. Использование аналитических методов сравнительного изучения периферических структур (поверхностных и "мембранных" антигенных комплексов) риккетсиальной клетки позволило выявить различия в содержании белков, фосфолипидов и гликолипидов. Установлено, что более высокой гемосенсибилизирующей активностью обладают поверхностные сенситины.

Приготовлен оригинальный иммуносорбент на основе геля гидроокиси алюминия и групповых перекрестно-реагирующих иммуноглобулинов, иммобилизованных с помощью глутарового альдегида. Показана его эффективность для удаления группоспецифических антигенов из поверхностных риккетсиальных препаратов.

Впервые разработана методика получения видоспецифических антигенов R.prowazekii и R. typhi. Эти антигены, по данным РИГА с видос-пецифическими F(ab)2 иммуноглобулиновыми ЭД R.prowazekii и R. typhi, не содержат групповых антигенных структур. Методом электрофореза в ПААГ у видоспецифических антигенов R.prowazekii зафиксировано наличие белков с молекулярной массой 100, 120 кД.

Установлена высокая гемосенсибилизирующая активность видоспецифических антигенов, что определило возможность их использования в качестве сенситинов для конструирования ВАЭД.

С помощью разработанных оригинальных ВАЭД показана возможность проведения полной межвидовой дифференциации риккетсиозов группы СТ в РЫТА.

Положения, выносимые на защиту:

1. Поверхностные солюбилизаты содержат групповые и видоспе-цифические антигены, а сенсибилизация ими ФТЭБ позволяет получать АЭД, обладающие широкими диагностическими возможностями, пригодные для ранней диагностики эпидемического и крысиного СТ, межвидовой дифференциации этих риккетсиозов, изучения иммунологической перестройки макроорганизма при реконвалесценции и при вакцинации.

2.Видоспецифические антигены R.prowazekii и R. typhi, выделенные из поверхностных сенситинов методом истощающей иммуно-сорбции, обладают высокими дифференцирующими свойствами и строгой специфичностью.

3.Конструирование ВАЭД на основе В АКР R.prowazekii и R. typhi позволяет не только повысить эффективность диагностики эпидемического и крысиного СТ, но и проводить полную межвидовую дифференциацию этих риккетсиозов в простом диагностическом тесте - РИГА.

4.Целесообразность сочетанного использования групповых и ви-доспецифических АЭД для диагностики риккетсиозов группы СТ, обеспечивающей на первом этапе установление принадлежности инфекции к заболеваниям группы СТ, на втором этапе -определение вида сыпнотифозной инфекции с целью проведения соответствующих противоэпидемических мероприятий.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В теоретическом плане проведенное исследование расширяет рамки существующих представлений о возможности создания препаратов нового типа, обеспечивающих внутригрупповую диагностику риккетсиозов в РНГА.

Полученный автором фактический материал может представлять интерес для конструирования высокочувствительных и специфичных АЭД для видоспецифической диагностики не только риккетсиозов группы СТ, но и риккетсиозов других таксономических групп.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработана технология получения антигенных эритроцитарных диагностику-мов на основе группо- и видоспецифических антигенов R.prowazekii и R. typhi, позволяющих проводить в РНГА раннюю и внутригрупповую диагностику риккетсиозов группы СТ, определять уровень специфических антител на разных стадиях реконвалесценции и вакцинации.

На препарат составлена и оформлена нормативно-техническая документация в виде экспериментально-производственного регламента, Временной фармакопейной статьи и инструкции по применению на "Комплект эритроцитарных диагностикумов для выявления типо- и видоспецифических антител группы СТ в РНГА".

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на пленарном заседании Пермского общества микробиологов, эпидемиологов и инфекционистов 19 января 1999г.

Диссертация прошла экспертизу и апробирована на заседании Научно-технического совета Пермского НПО "Биомед" и на расширенном заседании лаборатории экологической генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и кафедры микробиологии Пермской медицинской академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 12 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, главы экспериментальной части, заключения и общих выводов. Список литературы включает 183 наименования работ отечественных и зарубежных авторов.

Приведенные в диссертации материалы выполнены при непосредственном участии автора в лаборатории эндемических риккетсиозов ПНИИВС НПО "Биомед" в соответствии с "Отраслевой программой НИР по бактерийным и вирусным препаратам в институтах вакцин и сывороток" (номер государственной регистрации темы 01.958 005346).

Опыты по аминокислотному анализу Я.ргом'агекИ проведены совместно с к.м.н. Л.А.Баратовой (МГУ, НИИФХБ им.Белозерского), по изучению белкового состава антигенов методом электрофореза в ПААГ и специфической активности полученных белков в иммуноблоттинге - с д.м.н., профессором Н.М.Балаевой (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи), исследование полученных антигенов методом электронной микроскопии - с к.б.н. Л.В.Диденко (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи), изучение фосфолипид-ного и белкового состава антигенов - с к.м.н., с.н.с. В.П.Коробовым (ИЭГМ УрО РАН).

Приношу глубокую благодарность всем участникам совместных исследований.

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ АНТИГЕННЫХ РИККЕТСИАЛЬНЫХ ЭРИТРОЦИТАР-НЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ

Обзор литературы

1.1. Реакция непрямой гемагглютинации.

Среди современных методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний широко применяются тесты, основанные на феномене агглютинации эритроцитов, нагруженных антигенами или антителами с гомологичными сыворотками или антигенами [44,52,60,76]. Этот феномен получил название реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Высокая чувствительность и специфичность этой реакции, простота применения, минимум ингредиентов, необходимых для ее постановки, возможность визуальной регистрации - все это способствовало широкому использованию РНГА для выявления риккетсиозных антигенов и антител к ним [ 11,37,84,100,101].

Развитие и становление РНГА как метода серологического анализа тесно связано с работой А.Т.Кравченко и М.И.Соколова [55,89]. Они показали, что эритроциты, на которые предварительно адсорбированы полисахаридные антигены, приобретают способность агглютинироваться на предметном стекле в присутствии гомологичных сывороток.

Позднее Е.Кео^ е!а1 [149], а затем О.М1ск11еЬгоок, К.ОиЬоэ [157] видоизменили РНГА по Кравченко и Соколову, предложив пробирочный вариант реакции.

Однако, широкое использование РНГА в качестве диагностического теста было ограничено из-за слабой сенсибилизации нативных эрит-

роцитов иммунореагентами белковой природы (полноценными микробными антигенами, сывороточными иммуноглобулинами).

Позже, исследованиями S.Bojden [116] было установлено, что антигены белкового происхождения приобретают способность адсорбироваться на эритроцитах, предварительно обработанных таниновой кислотой. Таким образом, расширились возможности использования РИГА для выявления антител. В дальнейшем, в расширении сферы применения РИГА определенную роль сыграли исследования T.Rycaj [170]. Он предложил сенсибилизировать танизированные клетки красной крови сывороточными иммуноглобулинами, что позволило использовать РИГА для индикации антигенов в материалах различного происхождения.

На основе этих двух методических подходов РИГА были предложены ее многочисленные варианты [76].

Для всех предложенных модификаций РИГА необходимо иметь два типа диагностикумов, представляющих собой эритроциты, на поверхности которых экспонированы антигены или антитела.

Эти диагностикумы, в зависимости от иммунохимической природы сенситина, присоединенного к эритроцитам, обозначают "антигеннные" эритроцитарные диагностикумы, предназначенные для выявления сне-цифических антител и " иммуноглобулиновые" эритроцитарные диагностикумы, предназначенные для обнаружения микроорганизмов и их антигенов [11].

Впервые принципиальная возможность применения РИГА для диагностики ЭСТ была продемонстрирована S.Chang et al. [120,121]. Авторы на модели антигенов риккетсий различной таксономической принадлежности изучили процесс выделения полисахаридных антигенов, их прикрепления к эритроцитам человека и некоторых животных и детально разработали постановку РИГА при риккетсиозах.

В последующем, в качестве сенситина рядом авторов были использованы различные антигенные реагенты: фосфолипидные антигенные комплексы (ФЛАК), белковые антигены, ЛГТС [19,42,48,93,95].

Прежде, чем перейти к оценке таких зритроцитарных диагности-кумов, рассмотрим основные принципы их приготовления.

1.2. Основные принципы приготовления АЭД.

Разработка высокоспецифичных и чувствительных АЭД, стабильных при хранении, является важнейшим условием полной реализации потенциальных достоинств РИГА. Этот серологический тест относится к простым серологическим двухкомпонентным реакциям. В этой реакции участвуют искомые антитела и антиген, сорбированный на поверхности носителя-эритроцита[57].

Процесс приготовления АЭД состоит из ряда последовательных этапов, основными из которых являются:

- выбор эритроцитов;

- их фиксация;

- получение сенситина;

- сенсибилизация эритроци