Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование технологии приготовления корпускулярного антигена риккетсий Провачека

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии приготовления корпускулярного антигена риккетсий Провачека"

Р Г Б Ой - б МАИ 1397

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА Лариса Владимировна

Усовершенствование технологии приготовления корпускулярного антигена риккетсий Провачека

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток НПО «Биомед»

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Академик Российской экологической академии и МАНЭБ, доктор медицинских наук В.Ф.Петров

кандидат медицинских наук А.Н.Пантюхина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор РА.Пшеничнов кандидат медицинских наук, доцент Р.С.Кузяев ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится 1997г. в "часов на

заседании диссертационного совета К 200.46.01 в Институте Экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РА Н по адресу: 614081, г.Пермь, ул.Голева, 13.

Автореферат разослан « » 1997г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РА Н

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук ^-И.Б.Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ_ПРОБЛЕМЫ. Увеличение

заболеваемости эпидемическим сыпным тифом на 33,3% в 1996г по сравнению с предыдущим обусловило необходимость повышения эффективности эпидемиологического надзора за данной группой риккетсиозов. Важная роль при этом отводится методическому уровню клинической и эпидемиологической диагностики инфекций (И.В.Тарасевич и соавт.,1990), главными особенностями которых в современных условиях являются: преобладание рецидивной формы в общей структуре сыпнотифозных инфекций, регистрация наибольшего числа нозологических форм заболевания среди населения старших возрастных групп, спорадический характер заболеваемости, отсутствие типичной для эпидемического сыпного тифа, зимне-весенней сезонности (М.М.Додонов, 1991; Н.Д.КлимчукД994; А.И.Фролова,1997). Эти особенности, а также разнообразие клинических форм проявления сыпнотифозной инфекции затрудняет и в ряде случаев делает невозможной дифференциальную клиническую диагностику (К.М.Лобан, И.В.Тарасевич, 1983). Поэтому в постановке окончательного диагноза решающее значение приобретают серологические методы исследования. Известно, что достоверность полученных результатов в основном зависит от качества специфических диагностических

реагентов. Исходя из этого стандартизацию диагностических препаратов, повышение их дифференцирующих свойств, создание и применение единых диагностических систем следует рассматривать как одну из ведущих и интенсивно разрабатываемых проблем, определяющих своевременность и эффективность всего комплекса необходимых противоэпидемических мероприятий (И.В.Тарасевич и соавт.,1990).

В России медицинской промышленностью выпускается ряд диагностических препаратов для различных серологических реакций: реакции связывания комплемента (РСК), реакции агглютинации (РА), реакции непрямой гемагглютинации(РНГА), иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). По мере углубления знаний об особенностях антигенной структуры риккетсий Провачека разрабатывались более чувствительные и специфичные лабораторные методы, позволяющие расширить возможности эпидемиологического надзора за сыпнотифозной инфекцией. Одним из них является непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА), который рекомендован ВОЗ как для диагностики, так и для широкого эпидемиологического обследования населения (В.А.Яблонская и соавт.,1984). Внедрение данного метода в практику здравоохранения тормозится из-за отсутствия коммерческих стандартизованных высокоочшценных корпускулярных антигенов для МФА.

Анализируя качество сыпнотифозных диагностических препаратов, исследователи указывают на наличие в них, помимо специфических антигенов, компонентов среды культивирования (М.Е.Еремеева, 1994). "

Широкий спектр выпускаемых антигенных диагностических препаратов для РСК, РА, РНГА, ИФРМА обусловил и многообразие технологических процессов их изготовления, общим для которых является использование этилового эфира на стадии очистки риккетсий, что позволяет, с одной стороны, удалить жировые и тканевые компоненты среды культивирования, с другой стороны, вызывает снижение специфической активности препаратов в результате элиминации активных антигенных структур - белковых и фосфолипидных комплексов. Этот нежелательный эффект, а также загрязнение окружающей производственной среды токсическими парами эфира потребовали разработки методов очистки риккетсий, исключающих его применение (Н.М.Балаева и соавт, 1968; В.А.Яблонская и соавт.,1986; Л.Л.Анискович, 1989; В.В.Демкин, И.Б.Рыдкина,1994; ЕЛМ^в ег а1.,1975; В.А.Напэоп е1 а1.,1981). Данные методы при самостоятельном использовании либо не гарантировали полной очистки риккетсий от тканевых компонентов среды культивирования, либо трудоемки в исполнении и поэтому не вышли за рамки экспериментальных исследований.

Таким образом, до настоящего времени проблема очистки риккетсий от компонентов среды культивирования с сохранением антигенной структуры на уровне нативной клетки еще не решена, что делает актуальными изыскания в этой области.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью исследований явилось усовершенствование технологии получения корпускулярного антигена риккетсий Провачека.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать способ очистки риккетсий Провачека.

2. Получить риккетсии по антигенной структуре максимально приближенные к нативной клетке.

3. Провести серологическое изучение чувствительности и специфичности антигена в РСК, РНАг, МФА в сравнении с коммерческими антигенами.

.4. Дать иммунохимическую характеристику антигену.

5. Оптимизировать технологию применительно к условиям производства.

Решению основных задач предшествовали работы по их методическому обеспечению, которые включали:

- исследование возможности применения метода мембранной фильтрации на стадии очистки антигена риккетсий;

- исследование возможности применения фотоэлектроколориметрического метода для стандартизации готового препарата;

- разработку производственной технологии антигена.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

1. Обоснована и разработана методика получения корпускулярного антигена, основанная на сочетанием использовании гомогенизаций, дифференциального центрифугирования и мембранной фильтрации.

Новизна исследований подтверждена патентом №2062110 на "Способ получения диагностикума риккетсиозного Провачека, корпускулярного".

2. Впервые применен электрофотоколориметрический метод определения количества риккетсий, для которого построена калибровочная кривая на основе метода прямого счета с помощью флуоресцирующих РаЬ-фрагментов антител к риккетсиям Провачека.

3. Экспериментально подтверждено, что корпускулярные антигены, полученные по разработанной технологии, могут быть использованы в РСК, РНАг, МФА и, в отличие от выпускаемых диагностикумов, обеспечивают более достоверные результаты межвидовой дифференциации сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Способ получения риккетсий Провачека, основанный на сочетанном использовании гомогенизаций, дифференциального центрифугирования, микрофильтрации, а также стандартизации и стабилизации лиофильным высушиванием.

2. Использование корпускулярного антигена риккетсий Провачека как единого для тестирования сывороток крови людей и экспериментальных животных в РСК, РНАг и МФА.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании проведенных исследований получен «Диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный для РСК, РНАг и МФА».

На препарат составлена и утверждена нормативно-техническая документация в виде Экспериментально-производственного регламента №401-92, Временной Фармакопейной Статьи 42-373 ВС-92 и Инструкции по применению на "Диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный сухой для РСК, РНАг, МФА".

В 1992-1993г.г. при непосредственном участии автора проведено освоение препарата в производстве НПО "Биомед".

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертационной работы доложены на научно-практической ,

конференции молодых ученых "Теоретические и прикладные исследования в иммунологии" (Пермь, 1990).

В завершенном виде диссертационная работа доложена на Ученом Совете НПО «Биомед» (19 февраля 1997г.) и рекомендована к защите.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунком и 9 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальной части, общих выводов. Список литературы включает 227 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве исходного материала для приготовления диагностикумов использовали желточные оболочки куриных эмбрионов, инфицированные риккетсиями Провачека штамм "Брейнль" по методу Н.Сох (1941).

Для определения специфической активности и чувствительности экспериментальных диагностикумов использовали коммерческие антигены риккетсий Провачека, Музера, сибирика, бартонелл квинтана и диагностические сыворотки крови экспериментальных животных к риккетсиям

сыпного тифа для РСК, РА, РИГА (производство НПО "Биомед").

Помимо этого в исследованиях применяли диагностические сыворотки животных к риккетсиям группы КПЛ, к бартонелла квинтана для РСК (производство НПО "БИОМЕД") и сыворотки крови людей (длительным лихорадочным периодом, больных болезнью Брилля-Цинссера, соматических больных, а также здоровых людей-доноров).

Для постановки МФА использовали сыворотки диагностические антивидовые люминесцирующие, а также иммуноглобулины люминесцирующие и Fab-фрагменты иммуноглобулинов флуоресцирующие для выявления риккетсий группы CT (П.С.Барбан и соавт., 1989).

Серологические исследования проводили с помощью РСК в соответствии с рекомендациями П.Ф.Здродовского и Е.М.Голиневич (1972). РНГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом осуществляли по методике

Л.А.Мельникова(1957), РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом по П.С.Барбану, А.В.Мисенжникову (1973), РНАг по А.В.Мисенжникову, Н.А.Бривкальн (1974). МФА применяли в модификации Р.Б. Гольдина (1977), ИФА в модификации Н.А.Семиной и соавт. (1995).

Электрофоретическое исследование в вертикальном слое полиакриламидного геля выполняли по методу

U.Laemmli.(1970), фракционирование методом колоночной гель-хроматографии по методу Р.Флодина (1961) в модификации Р.С.Нельзина и .М.Кульпиной (1964).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного пакета Excel 7.0 для Windows 95.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ В соответствии с поставленными задачами первоначально были отработаны параметры инактивации риккетсий. Стабилизацию возбудителя проводили до стадии гомогенизации желточных оболочек с целью сохранения антигенной структуры риккетсиальной клетки и предупреждения солюбилизации капсулоподобного слоя В.А.Яблонской с соавт. (1986). При выборе солевого раствора использовали методические рекомендации Ormsbee (1962); дезинфектанта - М.Е.Еремеевой (1989).

В первой серии опытов были определены условия и эффективность инактивации возбудителя. В этой связи, инактивированные при различных параметрах, риккетсии исследовали методом биопроб на куриных эмбрионах и проводили эксперименты по выявлению специфической активности в инактивированных и неинактивированных овокультурах в РНГА и нМФА. При сопоставлении результатов было установлено, что применение формальдегида в концентрации 0,4% при температуре 4-10° С в течение 72-х

часов обеспечивает не только полную инактивацию возбудителя, но и сохранение его специфических свойств.

Следующим этапом работы стали исследования по выделению риккегсий, в процессе которых основное внимание было уделено физическим методам, таким как гомогенизация при помощи микроизмельчителя тканей и дифференциальное центрифугирование. В ряде экспериментов было установлено, что наилучшие результаты гомогенизации достигались при измельчении оболочек при 5000 об\мин в течение 3 мин, так как при этих параметрах в контрольных мазках, окрашенных люминесцирующими антителами к риккетсиям Провачека наблюдали наибольшее количество свободнолежащих риккетсий.

С целью выделения риккетсий из гомогената желточных оболочек была исследована возможность применения метода дифференциального центрифугирования.

При сочетанном использовании высокоскоростного (10000 об\мин в течение 30 мин) и низкоскоростного (1500 об\мин в течение 5 мин) центрифугирований была получена взвесь, содержащая риккетсии и мелкодисперсный балластный материал, которую подвергали дальнейшей очистке методом микрофильтрации.

Следующий этап исследований был посвящен анализу мембран и условий фильтрации.

Исследования по разделению смеси проводили на микрофильтрационной ячейке тупикового типа с ФМ0200 с механическим перемешиванием в виде магнитной мешалки. Были апробированы мембраны фирм «МПМроге», «Бтроге», «Трекпор» и «Владипор» Подбор мембран осуществляли исходя из их способности разделять компоненты, составляющие риккетсиозную смесь: риккетсии и тканевые компоненты желточных оболочек. Наличие в фильтрате риккетсий, определяемых методом прямого счета и отсутствие в нем компонентов ткани культивирования, контролируемое в нМФА с противожелточной кроличьей сывороткой являлись основными критериями очистки.

Эксперименты позволили определить, что для фильтрации риккетсиальной смеси необходимым требованиям соответствуют мембраны «Бтроге» с размерами пор 1,5 мкм и «Владипор» марки МФАС с размерами пор 3,0мкм, а оптимальными параметрами фильтрации являются следующие: концентрация разделяемой смеси - 10%, давление инертного газа (0,4+0,1)МПа, температура (20±1)°С.

С целью удаления растворимых белков из фильтрата применили высокоскоростное центрифугирование. Осадок, представляющий собой чистые риккетсии, ресуспендировали в физиологическом растворе до конечной концентрации 2 млрд в 1мл.

е целью стандартизации препарата была исследована возможность определения количества риккетсий с помощью фотоэлекгроколориметрического метоДа. В результате исследований выявлена спектральная область измерений, при которой достигался максимум светопоглощения риккетсиальной взвеси для ФЭК-56, и построена калибровочная кривая на основе метода прямого счета риккетсий для определения концентрации антигена в 1 мл. В ходе сравнительных экспериментов . по стандартизации антигенов показано, что разработанный метод -.сопоставим с методом прямого счета риккетсий.

В следующем разделе работы представлены материалы, характеризующие специфические свойства

экспериментальных антигенов риккетсий Провачека и результаты исследований, связанные с изучением их видоспецифической активности. Развернутая характеристика специфической активности антигенов была получена в результате испытания их в различных серологических реакциях: РСК, РНГА, МФА в сравнении с коммерческими антигенами.

В РСК средняя геометрическая величина титров экспериментальных диагностикумов с сыворотками к риккетсиям Провачека составила 1:35,753, с сыворотками к

риккетсиям тифи -1:7,674; при исследовании растворимого антигена Провачека для РСК 1:41,3 и 1:31,7 соответственно.

В РНГА с ИЭД к р. Провачека экспериментальные антигены обладали большей активностью, чем корпускулярные антигены для РА, но несколько меньшей, чем растворимые коммерческие антигены.

Данные, подтверждающие высокую специфическую активность выделенных антигенов, были получены при оценке их в МФА. Ни одна из испытанных 50 серий антигенов не реагировала в пМФА с неспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами (испытано 48 серий люминесцирующих иммуноглобулинов к риккетсиям сибирика и 5 серий люминесцирующих иммуноглобулинов к коксиеллам Бернета). В то же время при исследовании в пМФА люминесцирующих иммуноглобулинов к риккетсиям Провачека (испытано 19 серий люминесцирующих иммуноглобулинов) удавалось регистрировать уровень специфических антител в диапазоне от 1:32 до 1:128, а при использовании люминесцирующих иммуноглобулинов тифи выявляемая величина титров была в 4-8 раз ниже. Таким образом, была отмечена возможность проведения относительной межвидовой дифференциации в пМФА. Кроме того, в пМФА было показано, что антигены, полученные по

разработанному способу, практически не содержат агглютинатов и компонентов ткани желточного мешка.

При перекрестном титровании сывороток группы сыпного тифа в РСК с единым диагностикумом средняя геометрическая титров специфических антител иммунных сывороток к риккетсиям гомологичного вида (р.Провачека) составила 1:335,25, а к риккетсиям гетерологичного (р.тифи) вида этой группы 1:64,09. С коммерческими диагностикумами эти величины были 1:330,7 и 1:156,2 соответственно.

При оценке их в качестве тест-антигенов для выявления антител в сыворотках крови людей в РНАг были получены равнозначные результаты при применении как коммерческих, так и экспериментальных антигенов. При оценке дифференцирующей способности сравниваемых антигенов в РНАг результаты величин титров были также сопоставимы.

При оценке испытуемых антигенов в непрямом варианте МФА с сыворотками крови инфекционных больных с длительным лихорадочным периодом, соматических больных, здоровых людей, сыворотками экспериментальных животных к риккетсиям сибирика, коксиеллам Бернета, бартонелла квинтана, интактных животных, а также к компонентам желточных оболочек куриных эмбрионов были получены негативные результаты. В то же время, при исследовании в нМФА сывороток морских свинок (156 сывороток), кроликов

(354 сыворотки), инфицированных риккетсиями Провачека, гипериммунных к риккетсиям Провачека сывороток лошадей (38 сывороток), а также 23-х сывороток больных болезнью Брилля-Цинсера было показано, что при помощи экспериментальных и коммерческих антигенов риккетсий Провачека удавалось регистрировать специфические антитела в титре от 1:10 до 1:2560. Эти данные позволили рекомендовать антиген, полученный разработанным способом для использования в нескольких серологических реакциях: РСК, РНАг, МФА.

Результаты исследований были подтверждены при Государственно-комиссионных испытаниях, проведенных в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

Заключительный этап исследований по приготовлению диагностикума касался отработки способа стабилизации и сроков хранения. Установлено, что стабилизированный лиофильным высушиванием с 10%-ной сахарозой в качестве наполнителя диагностикум при хранении при температуре (4+1)°С не теряет своих специфических свойств в течение 5 лет.

Таким образом, была экспериментально обоснована технология получения диагностикума риккетсиозного Провачека корпускулярного для РСК, РНАг и МФА (рис.1).

Схема очистки антигена риккетсий Провачека

Рис. 1

В следующем разделе работы приводятся данные исследований по детальной характеристике антигена с применением методов иммунохимического анализа. Показано, что во всех опытах по фракционированию методом колоночной гель-хроматографии антигены содержали одну фракцию, выходящую в свободном объеме колонки, специфическая активность в РНГА которой соответствовала активности исходного антигена.

В опытах по выявлению антигенной структуры риккетсий использовали электрофоретическое разделение в вертикальном слое полиакриламидного геля. Сравнительное исследование белкового состава риккетсий показало, что экспериментальные антигены не содержат примесей на уровне овальбумина, и представлены основными полипептидами наружной оболочки риккетсиальной клетки в 134, 60, 31,29, 25, и 17 кД.

Таким образом, полученные по новому способу антигены риккетсий Провачека имели антигенную структуру максимально приближенную по содержанию основных полипептидов к нативному возбудителю.

В специальной серии экспериментов изучена возможность использования единого антигена в ИФА. Показано, что разработанные антигены риккетсий Провачека обладают сорбционной способностью к твердофазному носителю, что делает возможным его применение в ИФА для

исследования сывороток крови людей (доноров; людей, больных различными инфекционными и соматическими заболеваниями, болезнью Брилля-Цинссера, а также лиц, вакцинированных против сыпного тифа). Параллельно эти же сыворотки были изучены в РСК и РНАг с коммерческими антигенами. Сопоставление результатов исследований показало, что в ИФА антигены регистрируют специфические антитела в величинах, превышающих титры в РСК в 100 раз; в РНАг - 10 раз.

Таким образом, был выявлен еще один метод, в котором можно использовать единый корпускулярный антиген риккетсий Провачека - ИФА. Эти данные подтверждают исследования А.В.Кузнецовой и соавт. (1985) о возможности использования высокоочищенных корпускулярных антигенов в ИФА.

Совокупность представленных наблюдений определяет перспективы корпускулярного антигена, полученного с использованием разработанного метода очистки риккетсий.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экологически безопасная технология приготовления корпускулярного антигена риккетсий Провачека, основанная на инактивации инфицированных желточных оболочек, сочетанном использовании гомогенизаций, дифференциального центрифугирования и

микрофильтрации, а также стандартизации и стабилизации препарата лиофильным высушиванием.

2. В результате сравнительных серологических исследовании установлено, что диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный обладает специфической активностью в РСК, РНАг и МФА; позволяет выявлять антитела к риккетсиям группы сыпного тифа как в сыворотках крови различных экспериментальных животных, так и в сыворотках крови людей; обладает выраженной внутригрупловой дифференцирующей способностью.

3. При изучении иммунохимического состава показано, что диагностикум Провачека корпускулярный представляет собой риккетсии, максимально очищенные от ткани среды культивирования и приближенные по составу основных полипептидов к нативному возбудителю.

4. На основании статистической обработки пятидесяти экспериментальных серий установлено, что выход антигена из одной желточной оболочки куриных эмбрионов составляет (8,0±0,5)мл, что в 4 раза превышает выход корпускулярного антигена, приготовленного по регламентированной технологии с применением эфира.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Александрова Л.В., Пантюхина А.Н., Коробов В.П., Юркова H.A. Изучение возможности получения очищенного корпускулярного антигена риккетсий Провачека //Теоретические и прикладные исследования в иммунологии: Тезисы докл. научно-практич. конф. молодых ученых.- Пермь, 1990.- С.23-24.

2. Пантюхина А.Н., Александрова Л.В., Тупицын A.B., Барахнина Е.В., Юркова H.A. Унификация технологии приготовления риккетсиальных препаратов // Экспериментальная и прикладная иммунология: Тез.докл.научн. конф.- Пермь, 1991,- С.25.

3. Александрова Л.В., Пантюхина А.Н., Коробов В.П. Усовершенствование технологии получения риккетсиальных антигенов // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии.- Томск, 1991.- С.130-131.

4. Пантюхина А.Н., Александрова Л.В., Петров В.Ф. Изучение диагностической ценности межвидового эритроцитарного сыпнотифозного диагностикума // Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии Пермь, 1994,- С.35-38.

5. Пантюхина А.Н., Александрова A.B., Воробьева М.С., Тарасевич И.В., Яблонская В.А., Еликоев К.А., Никитюк Н.М.,

Умнова Н.С. Сравнительная оценка серологических тестов, применяемых для диагностики риккетсиозов группы сыпного тифа//Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии,- Пермь, 1994.- С.32-35.

6. Пантюхина А.Н., Александрова A.B., Райхер Л.И., Райхер И.И., Пагнуева Л.Ю. Применение ИФА для выявления антител к риккетсиям группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки // .Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии Пермь, 1994.- С.38-41.

7. Пантюхина А.Н., Александрова A.B., Петров В.Ф. Применение иммунофлуорометрического анализа для вхгутригрупповой дифференциации риккетсиозов группы сыпного тифа // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине : Материалы международного симпозиума, посвященного 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат".- Уфа, 1995, С.192-193.

8. Петров В.Ф., Пантюхина А.Н., Александрова A.B. Способ получения диагностикума риккетсиозного Провачека, корпускулярного // Патент № 2062110, 1996г.

Редакция 'Пермского медицинского iKynnana" Тираж 100 экз.