Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфолипидные антигены риккетсий группы сыпного тифа

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фосфолипидные антигены риккетсий группы сыпного тифа"

На правах рукописи

ТИМАШЕВА Ольга Анатольевна

РГб од

2 3 ШОН 1997

ФОСФОЛИПИДНЫЕ АНТИГЕНЫ РИККЕТСИЙ ГРУППЫ СЫПНОГО ТИФА

(экспериментальные материалы по выделению, характеристике и аспектам практического использования)

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск - 1997

Работа выполнена в Пермском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте вакцин и сывороток НПО "Биомед"

Научные консультанты:

академик РЭА и МАНЭБ, доктор медицинских наук В.ФЛетров

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор И.В.Тарасевич

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор О.В.Бухарин доктор медицинских наук, профессор М.С.Воробьева доктор медицинских наук Н.В.Рудаков

Ведущая организация:

Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова

Защита состоится 1997 г. в часов

на заседании специализированного совета Д. 084.04.02 в Челябинской государственной медицинской академии (454092, Челябинск, ул.Воровского,64)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан " лю^, 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук,

профессор А.В.Зурочка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Непременным условием всех современ-к работ по созданию и усовершенствованию профилактических и ¡агностических препаратов являются исследования в области антенной структуры микроорганизмов и определения функциональ-|й роли биомолекул, составляющих клеточную организацию микро-

'В.

Несмотря на то, что риккетсиология располагает большим :спериментальным материалом, позволяющим составить представле-[е о морфогенезе, репродукции, биологических свойствах, мета-шизме и химическом составе риккетсий, сведения о липидной ютавляющей риккетсиальной клетки ограничены.

Анализ химического состава риккетсий, проведенный еще в >46 году В.й.Товарницким и М.К.Кронтовской и в более поздних ¡следованиях, свидетельствовал о значительном удельном весе в ■руктуре риккетсиальной клетки фосфолипидов, содержание кото-[х достигает 16% от сухого веса риккетсий (В. И. Товарниц-й.М.К.Кронтовская, 1946; TovarnicKiJ V. I., Krontovskaja M.K., 146; Cohen S. S., Chambers L.A.,Clawson J.H.,1950; Winkler H.H., Her E.T. ,1978; Е.Г.Зезеров, В.С.Логинов, А. С.Березнева, 1985).

Многие исследователи, занимающиеся в области липидологии ¡кроорганизмов. в частности, O'Leary (1977), склонны считать, ■о "состав липндов, их обмен и, вероятно, их функции представит собой именно те особенности, по которым микроорганизмы и. обенно, бактерии, наиболее отличаются от других форм жизни... что именно в этом могут скрываться объяснения многих непонят-х до конца аспектов изучения микроорганизмов, включая таксо-мическую индивидуальность и дифференциацию видов, тип патоге-■за и чувствительность или резистентность к антибиотикам и .огие другие особенности".

Исходя из того, что липиды, в частности, фосфолипиды, яв-ются основным и обязательным компонентом клеточных мембран ех типов микробных клеток в последние годы возрос интерес к яснению структурно-функциональной роли бактериальных липидов жизнедеятельности микроорганизмов. Показано, что многие пекты химической природы, биосинтеза бактериальных жирных слот разных видов имеют значение как таксономические критерии

для идентификации микроорганизмов. А механизмы и пути их биосинтеза рассматриваются как многообещающие мишэни для химиотера-певтического воздействия (0'Leary,l967; Г.А.Грибанов,1975; Е. Л.Рубан, 1980; Б. В. Каральник, М.П. Разбаш, Е. А. Ахметова, 1981; Л.М.Пинчук, Е.А.Воронова,1982; 3.П.Васюренко,1982; Т.С.Саатов, Э. И. Исаев, С. А. Бурханов, 1990).

Известно также, что фосфолипидные фракции таких микроорганизмов, как коринебактерии, микобактерии, микоплазмы и хлами-дии, обладают выраженной антигенной активностью, что определило их применение в серологической диагностике инфекций, вызываемых этими возбудителями -(Takahashi Y., Опо К., 1961;Е.К.Алимова,А.Т. Аствацатурьян, 1970;И. С.Николаева, Ю.В. Езепчук, Ю.В.Вертиев, 1970; Brett S.J. et al.,1972; С.Н.Головачева с соавт., 1975; Н.П,Разбаш, Б.В.Каральник,1973,1975,1978; Andrew А.Т.,Carter P.B. ,1977; Morris J. A., Stevens A.E.,1977; Reggiardo Z. .Vazguez E.,1981; Ю.М.Краснопольский с соавт.1986).

В то же время, оценивая современные сведения об антигенных компонентах риккетсий группы сыпного тифа, следует указать, что роль этих соединений в формировании антигенных свойств риккетсий не изучена.

В этом плане особого внимания заслуживали исследования M.Volkert и Р. Moller-Christensen (1955), выделивших фосфатидные серологически активные антигены для реакции связывания комплемента из хламидий пситташ, микроорганизмов близких риккетсиям группы сыпного тифа по условиям культивирования и некоторым биологическим свойствам (Bergey, 1974; Weiss Е., Moulder J. Vi. ,1984).

При конструировании хламидийного эритроцитарного диаг-ностикума с использованием метода M.Volkert и Р.Moller-Christensen для получения специфического антигена хламидий нами ранее в соавторстве с Э.С.Горовицом была изучена не только гемосенсиби-лизирущая активность этого антигена, но и подтверждена его фосфолипидная природа (Э.С.Горовиц, 0.А.Тимашева, 1976,1978,1979).

Фосфолипиды характеризуются весьма своеобразными физико-химическими свойствами, выделяющими их из общего класса ли-пидов. В силу своей амфифильности фосфолипиды обладают уникальной способностью в водной фазе формировать бислойные структуры - липосомы, которые рассматриваются в последние годы как модели природных биологических мембран.

Эта особенность фосфолипидов определила и аспекты их изучения в области биомедицинских исследований: во-первых, использование их для изучения или модификации поведения биологических клеток, механизмов межклеточных взаимодействий, и, во-вторых, на основе этих данных применение липосом с целью улучшения действия лекарств и иммунопрофилактических препаратов, основываясь на адъювантных свойствах липосом (Gregoriadis G.,Allison А.С.,1983).

В литературе мы не встретили данных, касающихся изучения фосфолипидов риккетсий группы сыпного тифа в составе липосомальных препаратов.

Исходя из вышеизложенных предпосылок, нам представлялось актуальным и обоснованным определить возможность выделения фосфолипидных фракций из риккетсий группы сыпного тифа и изучить их свойства.

Цель настоящего исследования

Выделение и иммунобиологическая характеристика фосфолипидных антигенов риккетсий группы сыпного тифа и оценка перспектив их практического использования.

Основные задачи исследования

1. Разработка метода выделения фосфолипидных антигенов (ФЛА) риккетсий группы сыпного тифа и сравнительный анализ химического состава ФЛА риккетсий Провачека и хламидий пситтаци.

2. Изучение антигенной активности и специфичности ФЛА риккетсий группы сыпного тифа.

3. Изучение ФЛА риккетсий группы сыпного тифа в качестве специфического иммуносорбента и оценка перспектив его практического использования.

4. Разработка способа получения липосомальных риккетсиальных

композиций на основе ФЛА риккетсий Провачека.

5. Изучение иммунобиологических свойств липосомальных риккетсиальных препаратов.

Научная новизна исследования

Впервые получены фосфолипидные антигены из культур рик-кетсий Провачека и риккетсий тифи, репродуцированных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов, в легких белых мышей и в кишечнике переносчика - платяных вшей. В составе фос-фолипидных антигенов риккетсий Провачека идентифицированы 4 основных и 2 минорных фосфолипида, а также углеводный компонент, представленный 3-мя моносахарами. Определяющая роль фосфолиш-дов подтверждена редукцией специфической активности ФЛА фосфо-дипазами.

Впервые установлены качественные и количественные различия фосфолипидных композиций и углеводного компонента риккетсий Провачека и хламидий псигтаци при одних и тех же условиях выделения фосфолипидных фракций.

Впервые определена специфическая природа и высокая серологическая активность фосфолипидных антигенов риккетсий группы сыпного тифа, показана их высокая гемосенсибилизирующая активность. Показано, что ФЛА. в составе риккетсиальной клетки проявляют себя как антигенная детерминанта.

Впервые на основе ФЛА риккетсий группы сыпного тифа сконструирован оригинальный иммуносорбент (авт. свидетельство N 1007676, приоритет от 30.03.1981), с использованием которого разработан метод выделения "чистых" антител и метод истощающей иммуносорбции, благодаря которой были получены модифицированные иммунные сыворотки, обеспечивающие видоспецифическую дифференциацию риккетсий Провачека и риккетсий тифи в РСК и нМФА. Показано, что в специфическом пуле иммуноглобулинов иммунной сыворотки присутствуют антитела, комплементарные к ФЛА риккетсий.

Разработан и рекомендован для внедрения метод получения фосфолипидных антигенов из промышленных отходов субстрата культивирования риккетсий Провачека (авт.свидетельства N 782201, приоритет от 06.06.1979 и N 1330786, приоритет от 11.03.1985). Применение ресурсосберегающей технологии позволило повысить рентабельность производства риккетсиальных диагностических препаратов.

Впервые получены липосомальные риккетсиальные препараты на основе протеинового и фосфолипидного антигенов риккетсий Прова-

чека. Электронномикроскопическими исследованиями подтвержден факт образования липосом фосфолипидными антигенами и включения в липосомы протеинового антигена риккетсий.

Впервые показано, что риккетсиальные фосфолипидные антигены в сочетании с химической сыпнотифозной вакциной (липосомаль-ные риккетсиальные препараты) усиливают ее иммуногенную активность, для характеристики которой изучены не только показатели гуморального иммунного ответа, но и клеточного иммунитета. Выявлены определенные закономерности формирования иммунного ответа на ранних сроках после введения различных иммуногенов. Установлена иммунологическая безвредность липосомальных препаратов в отношении иммунной системы экспериментальных животных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Фосфолишдная фракция риккетсий Провачека дифференцируется в виде комплекса, представленного 4-мя основными и 2-мя минорными фосфолипидами и углеводным компонентом. Для риккетсий Провачека и хламидий пситтаци характерны качественные и количественные различия фосфолипидных композиций и углеводного компонентов.

2. Фосфолипидные антигены риккетсий группы сыпного тифа характеризуются специфичностью, антигенной и гемосенсибилизирую-щей активностью. Фосфолипидный компонент в составе ФЛА необходим для реализации антигенных свойств.

3. Метод повышения видоспецифической дифференцирующей активности иммунных сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа на основе иммуносорбента, имеющего в качестве специфического лиганда фосфолипидные антигены риккетсий группы сыпного тифа.

4. Фосфолипидные композиции в составе клеточной мембраны риккетсий как антигенные детерминанты индуцируют выработку комплементарных специфических антител.

5. Гуморальная и иммуноклеточная характеристика эффективности липосомальных риккетсиальных препаратов как иммуногена.

Практическая значимость работы

Предложена ресурсосберегающая технология на основе разработанного метода получения фосфолипидных антигенов из промышленных отходов субстрата культивирования риккетсий Провачека.

Разработан метод повышения видоспецифической дифференцирующей активности иммунных сывороток с применением истощающей им-муносорбции с оригинальным иммуносорбентом.

Предложен способ повышения эффективности иммуногенного материала для получения высокоактивных иммунных сывороток к рик-кетсиям группы сыпного тифа (авт.свидетельство N 1733004, приоритет от 09.01.1990).

Внедрение в практику

На основе проведенных исследований разработаны "Изменения к регламенту производства сухого "цельного" антигена для РСК", одобренные Ученым Советом Пермского НИИ вакцин и сывороток (протокол N И от 13.12.1986 г.), прошедшие экспертизу в ГИСК имени Л.А.Тарасевича и реализованные в условиях производства Пермского НПО "Биомед".

Принцип способа получения высокоактивных иммунных сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа был использован в производстве для получения хламидийных иммунных сывороток в НПО "Биомед".

Материалы работы были использованы в лекционном курсе кафедры микробиологии для студентов Пермской государственной медицинской академии и врачей на курсах повышения квалификации.

Апробация работы

Материалы исследований доложены и обсуждены на:

- пленарных заседаниях Пермского филиала Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (1981,1982,1987, 1991, 1994);

- научных конференциях Пермского НИИ вакцин и сывороток (1983,1984.1985,1986,1988);

- Всесоюзной конференции "Эпидемиология, диагностика и

профилактика риккетсиозов" (Москва,1985);

- Международном симпозиуме "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине" (Уфа,1995);

- научной сессии Пермской медицинской академии (Пермь,1997).

Диссертация прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета Пермского НПО "Биомед".

Публикации

По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе, "4 авторских свидетельства на изобретения".

Структура и объем работы

Проведенные исследования выполнены под руководством и непосредственном участии автора в лаборатории хламидий и рик-кетсий ПНИИВС НПО "Биомед" в рамках "Отраслевой программы НИР по бактерийным и вирусным препаратам в институтах вакцин и сывороток" по госзаказу (ММ гос. регистрации 80025865; 01.82.0.084.259; 01.82.0.084264 и 01.86.0.032811) при содействии лаборатории биохимии микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УО АН РФ- (зав.лаб. к.м.н. В.П.Коробов), кафедры микробиологии Пермской медицинской академии (зав.каф. д.м.н., проф. Э. С.Горовиц), кафедры гистологии ПМА (зав.каф. к.м.н., доц. В.А.Четвертных),лаб.электронной микроскопии ЦНИЛ ПМА (зав.лаб. к.б.н. Л.Е.Глазачева).

Диссертация состоит ,из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 347 страницах машинописного текста, включая 64 таблицы, 53 рисунка, в том числе, 6 фотографий, 3 электроннограммы, 13 микрофотографий. Указатель цитируемой литературы содержит 588 источника, из них 309 отечественных и 279 иностранных авторов.

Автор признателен всем участникам совместных исследований, особенно доктору медицинских наук, профессору Э.С.Горовиц и кандидату биологических наук А. В. Тупицыну.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Материалы

Микроорганизмы. a) R. prowazekii штаммы

Брейнль и Е: б) R.typhi (R.mooseri) штамм Исаханян, в) Chlamydia psittaci штамм Лори. Получены из ИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи РАМН и Института Вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Антигены. Для серологических исследований использовали антигены R.prowazekii для РСК, РА, РИГА; R.typhi для РСК; R.sibirica для ?СК; В.quintana для РСК; C.burneti для РСК производства НПО "Биомед". Антигены хламидий для РСК готовили по методу V.Volkert, Р.Moller-Christensen (1955).

Сыворотки. В экспериментах использовали сыворотки к R.prowazekii, R.typhi, C.burneti производства Пермского НПО "Биомед"; сыворотку для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков лошади; люминесцирующие сыворотки против глобулинов морской свинки, кролика, лошади; люминесцирующие иммунные сыворотки против риккетсий Провачека, тифи; бычий альбумин, меченый родамином производства ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН;хламидий-ные иммунные сыворотки для РИГА и РСК и антитканевые (против ткани желточного мешка) собственного приготовления.

Эритроцит арные диагностикумы. В серологических исследованиях, для изучения фагоцитарной активности нейтрофилов, при постановке реакции иммунного розет-кообразования применяли эритроцитарные диагностикумы с различными гемосенситинами:фосфолипидным, протеиновым и полисахарид-ным собственного приготовления, а также иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум Провачека производства НПО "Биомед".

Профилактические препараты. В качестве препаратов сравнения и для конструирования липосомальных риккетсиальных препаратов использовали химическую сыпнотифозную вакцину (ХСВ), сухую производства ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, а также живую комбинированную сыпнотифозную вакцину Е производства Пермского НПО "Биомед".

Экспериментальные модели. Исследования проводили на беспородных белых мышах весом 6-8 г и 17-20 г, морских свинках (вес 250-300 г), кроликах породы шиншилла (вес от 2 до 2,5 кг), а также куриных эмбрионах от кур породы Леггорн и оригинальной "кроличьей" расе платяных вшей.

В опытах использовано 906 белых мышей, 884 морских свинок, 96 кроликов, 20 тыс. куриных эмбрионов, 850 млн. особей "кроличьей" расы платяных вшей.

Объекты исследования. Для выделения фос-фолипидных антигенов R.prowazekii, R.typhi использовали культуры возбудителей, выращенных в эпителии желточных мешков куриных эмбрионов, в легких белых мышей и в кишечнике платяных вшей. Объектами исследования служили также сыворотки; лейкоциты из крови и спленоциты иммунизированных препаратами сравнения экспериментальных животных, которые получали в соответствии с рекомендациями Д.К.Новикова и В.И.Новиковой (1979); а также тимус.

Методы

Методы культивирования. Риккетсии и хламидии культивировали в куриных эмбрионах по методу H.R.Cox (1941), в легких белых мышей по способу М.М. Маевского (1948) и при внутримозговом заражении (А.К.Шубладзе, С.Я.Гайдамович,1954), а также в кишечнике платяных вшей "кроличьей" расы методом эпи-дермомембран (А.В.Пшеничнов, Б.И.Райхер,1943).

Определение токсических свойств липосомальных препаратов проводили по методу, регламентированному "Инструкциями по общим методам контроля МИБП" (1983).

Серологические методы. В работе использовали реакцию связывания комплемента (РСК) по методу П.Ф. Здро-довского и Е. М.Голиневич (1972), реакцию непрямой гемагглютина-ции (РИГА) с ЖЭСД (0.А.Касатова,1969), РИГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом (П.С.Барбан,А.В.Мисенжников,1979), реакцию нейтрализации антигена (РНАг) по методике А.В.Мисенжни-кова, Н.А.Бривкальн (1974), реакцию нейтрализации антител (РНАт) (В.А.Яблонская, С.С.Панфилова,1978; М.М.Леви,1967), прямой метод флуоресцирующих антител (A.Coons, М.Kaplan,1950; Р. Б. Гольдин с соавт.,1977), непрямой метод флуоресцирующих антител (T.Weiler, A.Coons,1954; Р.Б.Гольдин с соавт.,1961,1967).

Физик о-х имические и иммунохимии е-ские методы. Определяли спектры поглощения объектов исследования при длине волны 280 нм на спектрофотометре СФ-26, а также в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (длины волн от 200 до 800 нм) на приборе "Specor UV VIS", на фотоэлектроко-лориметре КФК-2М при длине волны 750 нм, 830 нм и 635 нм. Содержание фосфолипндов в пробах оценивали на основании денситог-рафии негативов хроматограмм на денситометре G-11. Площадь отдельных пиков денситограмм рассчитывали, используя рекомендации Й.Тодорова (1963).

Применяли методы иммуноэлектрофореза по Р.Grabar, С.Williams (1953), электрофореза в полиакриламидном геле по H.Maurer (1971), тонкослойной гель-хроматографии на сверхтонком сефадексе G-200 (К.Bergstrom, 1966; П.С.Барбан, Л.И.Сухорослова, 1973), тонкослойной хроматографии на пластинах "Silufol" в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4 и 75:22:3) по V.Kates (1975). Определение фосфолипндов проводили с помощью специфического обнаружителя (J.Dittmer, R.Lester,1964). Для гидролиза ФЛА использовали фосфолипазы А2 и D. Качественное определение углеводов осуществляли методом тонкослойной хроматографии в системе Н-бута-нол-уксусная кислота-вода (4:1:5) (Е.К.Алимова,1955).

Методы химического анализа. Суммарный фосфор и азот в препаратах ФЛА определяли в соответствии с рекомендациями M.Kates (1975), редуцирующие сахара по методу H.Hagedorn, B.Jensen (1922), белок по методу O.Lowry (1951).

Физические методы. Лиофильное высушивание препаратов проводили на сублимационной установке LZ-45 по отработанной нами технологии.

Электронномикроскопические методы. Исследование препаратов химической сыпнотифозной вакцины, ФЛА и липосомальных препаратов проводили в соответствии с рекомендациями В.И.Чернышова с соавт.(1987). Препараты просматривали на электронном микроскопе JEM-100 SX (JE0L,Япония) при инструментальном увеличении 20000 х.

Методы изучения иммуноклеточных реакций. Реакцию специфического розеткообразования осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями O.Zaalberg (1964) в нашей модификации (0. А.Тимашева,1995), ре-

акцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). (В. R. Bloom,P.R.Glade, 1974; Е.П.Киселева с соавт.,1985; Н.Л.Самойлина,1970), фагоцитарную активность нейтрофилов по методу В.Н.Каплина, Е.И.Само-делкина (1969,1987) в нашей модификации (0.А.Тимашева с соавт., 1986).

Гистологические исследования проводили в соответствии с рекомендациями A.G. Pearse (1960), изучали реакцию селезенки и тимуса белых мышей, примированных регламентированными дозами препаратов сравнения.

Статистические методы. Обработка экспериментальных данных проведена методами вариационной статистики по И.П.Ашмарину, А.А.Воробьеву (1962), разностным методом по И.А.Ойвину (1960), В.И.Левенсону (1968). Пределы доверительных интервалов средних величин рассчитаны до уровня вероятности 99 и 95 %. Достоверность различий -Р оценивали, используя t-крите-рий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение ФЛА риккетсий группы сыпного тифа.

При выделении фосфолипидных антигенов из риккетсий за основу был принят принцип метода, предложенного М.Volkert и Р.Moller-Christensen (1955) для получения фосфатидных компле-ментфиксирующих антигенов хламидий.

Оригинальный метод включает экстрагирование общей липидной фракции из предварительно прогретых при 100 С овокультур возбудителя с помощью диэтилового эфира и последующей преципитацией фосфолипидной составляющей ацетоном.

В модельных экспериментах при использовании этого метода для дифференциации фосфолипидных фракций из овокультур риккетсий Провачека проведена оценка влияния на этот процесс различных физических и химических факторов таких, как кипячение, замораживание и оттаивание, воздействие формалином и фенолом. Установлено, что, как и при обработке культур хламидий, непременным условием выделения фосфолипидных антигенов является термическое воздействие на овокультуры при 100 С. Контроль выхода специфического антигена в РСК показал, что ни один из других вариантов метода не обеспечивал выход достаточного коли-

чества фосфолипидных антигенов из овокультур риккетсий Провачека.

В то же время в ряде специальных экспериментов нами было показано, что выход специфически активной субстанции существенно увеличивался в результате предварительной обработки овокуль-туры риккетсий фенолом. Наибольший эффект достигался при воздействии концентрациями фенола от 2 до 3 %. при которых стабильно отмечалось 4-5-кратное увеличение выхода целевого продукта.

Анализ этой группы наблюдений позволил нам высказать предположение об особенностях локализации фосфолипидных фракций риккетсий. Мы установили, " что эфирная экстракция без предварительной термической обработки не приводит к -освобождению фосфо-липидов из риккетсиальной клетки, хотя известно, что эфир вызывает серьезные морфологические повреждения риккетсий, в частности, отторжение от клеточной стенки микрокапсулы, являющейся поверхностным растворимым антигеном (Н.М.Бадаева, С.А.Гулевская, 1972). Следовательно, можно предполагать, что фосфолипидные антигены риккетсий Провачека локализованы не в поверхностном слое клеточной стенки риккетсий-микрокапсуле, а в более глубоких ее слоях.

Нами было отмечено, что эффект выделения антигенного целевого продукта резко возрастает при совместном воздействии на клетки высокой температуры и фенола. Известно, что фенол способствует дифференциации из микробной клетки липополиеахари-дов и полисахаридов (Г.И.Костина,1981; И.Я.Захарова, Л.В.Косен-ко,1982), что было подтверждено нами при изучении химического состава антигенов.

Учитывая, что способы и условия культивирования риккетсий оказьюают существенное влияние на их биологические свойства были проведены исследования по дифференциации серологически активных фосфолипидных фракций у риккетсий Провачека и тифи, адаптированных к иной среде культивирования, нежели куриные эмбрионы.

В этой связи по методу М. Уо1кегЧ и Р.МоПег-ОтгЗ^епзеп и модифицированному варианту этого метода было получено 130 серий препаратов фосфолипидных антигенов риккетсий Провачека, в том числе, 87 - из яичных, 4 - из энтомологических и 5 - из легочных культур риккетсий Провачека штамма Брейнль, а также 6 серий

препаратов из овокультур риккетсий Провачека штамма Е. Из яичных и легочных культур риккетсий тифи было выделено соответственно 23 и 5 серий фосфолипидных препаратов. Для сравнительной оценки химического состава и серологической специфичности изучаемых антигенов было приготовлено 17 серий ФЛА из овокультуры хламидий пситтаци штамма Лори.

Независимо от субстрата культивирования все 130 серий ФЛА характеризовались высокой специфической активностью, имели в РСК превалирующие титры с гомологичными иммунными сыворотками от 1:128 до 1:256. Контрольные препараты, дифференцированные аналогичным методом из интактного тканевого субстрата, были серологически инертны в РСК.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что специфические свойства изолированных ФЛА и "фенольных" ФЛА определялись не природой тканевого субстрата, использованного для репродукции риккетсий группы сыпного тифа, а только присутствием последних в исходном материале.

Перекрестное титрование ФЛА риккетсий Провачека и хламидий пситтаци с иммунными сыворотками к этим возбудителям подтвердило специфическую природу ФЛА риккетсий и хламидий.

Для стандартизации ФЛА риккетсий группы сыпного тифа был использован показатель удельной серологической активности, выраженный в ЕС на мг сухого веса антигена. Результаты специальных исследований показали, что- достоверным показателем концентрации ФЛА является оптическая плотность их растворов. Калибровочные графики, построенные на основании изучения зависимости оптической плотности от концентрации антигенов, в дальнейшей работе были использованы нами для расчета удельной активности исследуемых антигенов.

Решение методических вопросов стандартизации позволило применить объективные критерии оценки в исследованиях по повышению степени очистки риккетсий от субстрата культивирования при выделении ФЛА, что имело важное значение для изучения взаимосвязи химического состава ФЛА и их серологической и иммунобиологической активностью.

В модельных экспериментах установлено, что предварительное дифференциальное центрифугирование гомогенатов инфицированных желточных мешков куриных эмбрионов позволяет получать ФЛА рик-

кетсий Ировачека с более высокой удельной активностью. Удельная серологическая активность ФЛА риккетсий Провачека из очищенной культуры в 12,2 - 23,0 раза превышала таковую ФЛА, приготовленных из неочищенного материала.

■Принципиально важными для более полной .характеристики природы изучаемого нами антигена были исследования по определению химического состава 15 серий ФЛА и 15 серий "фенольных" ФЛА. Химический анализ выявил наличие в их составе азота, фосфора и редуцирующих Сахаров. Следует отметить, что азот был небелкового происхождения. Сопоставительный анализ химического состава ФЛА и "фенольных" ФЛА показал, что "фенольные" препараты содержали меньшее количество фосфора, чем ФЛА, выделенные по методу М.Volkert & P.Moller-Christensen, 37,9 мкг/мг сухого веса против 41,7. Содержание азота было несколько выше 13,8 мкг/мг против 11,8. ' Почти в 2,5 раза они содержали больше редуцирующих Сахаров при превосходящей в 2,3 раза удельной серологической активности.

Статистическая обработка данных установила сильную степень связи между содержанием фосфора в ФЛА и удельной серологической активностью (УСА) этих препаратов (г=0,673 > г min=0,641 для вероятности 99 %), умеренную степень связи между содержанием азота и УСА (г=0,485), обратную связь между содержанием редуцирующих Сахаров и УСА (г= -0,259). Иная закономерность была зарегистрирована для "фенольных" ФЛА. Умеренная степень связи отмечена между содержанием редуцирующих Сахаров и УСА фенольных препаратов (г=0,425), слабая степень связи между содержанием фосфора и УСА (г=0, 084) и отрицательная зависимость - между содержанием азота и УСА (г= -0,106).

Исходя из полученных данных, можно было судить о том, что модификация метода выделения ФЛА привела не только к различию количественного соотношения составляющих их химических компонентов, но и обусловила иную качественную характеристику антигенной активности, что нашло отражение- в результатах сравнительного изучения серологической активности ФЛА и "фенольных" ФЛА в РСК с гомологичной иммунной сывороткой.

Предположение, что высокое содержание фосфора в препаратах ФЛА могло зависеть не только от фосфолигшдов, но и присутствия в изучаемых препаратах нуклеиновых кислот, не нашло подтвержде-

ния при изучении характера поглощения у ФЛА в ультрафиолетовом спектре. Максимум поглощения обнаруживался при длине волны 210-220 нм, тогда как для нуклеиновых кислот максимум поглощения находится в области длины волны 260-265 нм (Т. В. Венкстерн, Е.А.Баева,1965; Г.В.Юинг,1960). Следует отметить также отсутствие поглощения у ФЛА в видимой области спектра при длине волны 548 нм. что характерно для КДО липополисахарида (Б. Бсйгатек, И. ВгеБШа, 1976).

При определении состава ФЛА риккетсий Провачека методом одномерной тонкослойной хроматографии на пластинах "БПиГоГ' в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4 и 75:22:3) определено шесть фосфолипидных фракций, которые были идентифицированы по величинам их относительных подвижностей №П на основании данных других авторов для указанной системы растворителей (М.КМеБ, 1975; Е.Г.Зезеров с соавт.,1985).

Основными фосфолипидными компонентами были фосфатидилгли-церин (60,2%), кардиолипин (24,15?), фоефатидилхолин (6.8%). Два минорных фосфолипида обладали подвижностью, аналогичной сфинго-миелину (2,7%) и фосфатидилинозиту (2,4%) и один неидентифици-рованный фосфолипид, возможно, это М-метилфосфатидилэтаноламин (5,8%).

Химический анализ фракции, неподвижной в примененной системе растворителей и остававшейся на линии старта, показал наличие в ней редуцирующих Сахаров. Хроматографический анализ выявил наличие 3-х моносахаров, один из которых по значению кг близок к рибозе, два других - неидентифицированы. Существенная информация для уточнения значения фосфолипидов в построении антигенных свойств ФЛА риккетсий Провачека была получена при изучении влияния некоторых ферментов на их серологическую активность. Расщепление препаратов ФЛА риккетсий Провачека фосфоли-пазами А2 и В приводила к редукции специфических комплемент-фиксирующих свойств ФЛА. Воздействие трипсином не вызывало изменения их антигенной активности. Утрата антигенных свойств изучаемыми антигенами под влиянием фосфолипаз подтверждает роль фосфолипидов в формировании антигенной активности ФЛА. Однако не исключено, что эта роль реализуется лишь в присутствии минорного углеводного компонента.

Аналогично проведенный сравнительный химический анализ ФЛА

хламидий пситтаци свидетельствовал о различии не только качественной композиции фосфолипидов в составе ФЛА риккетсий Проваче-ка и хламидий пситтаци, но и относительного содержания идентичного фосфолипида -фосфатидилхолина, относительное содержание которого в ФЛА риккетсий Провачека соответствует 6,8%, в то время, как в ФЛА хламидий пситтаци - 60,3%. Редуцирующие сахара в ФЛА хламидий пситтаци представлены 2-мя моносахарами - рафи-нозой и маннозой.

На основании результатов этих исследований можно полагать, что качественные и количественные отличия фосфолипидных и углеводных композиций риккетсий Провачека и хламидий пситтаци лежат в основе формирования антигенной специфичности ФЛА каждого из них.

- Модифицированный метод М.УоХкеП & Р.Мо11ег-СЬг1з1епзеп был реализован наш в разработке ресурсосберегающей технологии, предусматривающей получение "фенольных" ФЛА из отходов производства цельнорастворимого, корпускулярного антигенов и растворимого антигена - компонента ЖСБ Е, в частности, из эфирных и тканевых фракций, образующихся при очистке овокультур риккетсий Провачека.

Принимая во внимание, что "фенольные" ФЛА риккетсий Провачека, полученные из отходов производства, по всем качественным характеристикам не отличались от цельнорастворимого антигена, наиболее рациональным было использование их комбинаций с коммерческим препаратом риккетсий Провачека для РСК.

По разработанной технологии было получено 37 серий "фенольных" ФЛА из отходов производства различных препаратов риккетсий Провачека при хорошей воспроизводимости их основных качественных показателей. Средний выход антигена из отходов производства вакцины ЖКСВ Е соответствовал 41,36 ЕС/мл, из отходов цельнорастворимого антигена - 21,81 ЕС/мл, из отходов корпускулярного антигена - 6,82 ЕС/мл.

Предлагаемые технологические решения были оформлены в виде "Изменений к регламенту производства сухого "цельного" антигена риккетсий Провачека для РСК", одобренных Ученым Советом ПНИИВС, прошедших экспертизу в ГИСК имени Л.А.Тарасевича и реализованных в условиях производства НПО "Биомед".

Способ получения ФЛА и "фенольных" ФЛА защищен авторскими

свидетельствами N 782201 от 06.06.1979 г. и N 1330786 от 11.03.1985 г.

Изучение серологических свойств ФЛА риккетсий группы сыпного тифа

Сопоставительный анализ ФЛА и "фенольных" ФЛА параллельно с цельнорастворимым, корпускулярным и растворимым антигенами риккетсий Провачека, проведенный методом "шахматного" титрования с гомологичными иммунными сыворотками различных животных и больных болезнью Брилля, выявил определенные различия серологических свойств ФЛА и "фенольных" ФЛА риккетсий Провачека.

ФЛА образовывали меньшую зону положительных взаимодействий с гомологичными иммунными сыворотками, чем "фенольные" ФЛА, цельнорастворимый, корпускулярный и растворимый антигены риккетсий Провачека. В широком диапозоне разведений ФЛА фиксировали комплемент со специфической сывороткой, содержащей только 4 СЕ и выше, не реагируя с 1 и 2 СЕ.

"Фенольные" ФЛА проявляли антигенную активность, аналогичную целькорастворимому и растворимому антигенам риккетсий Провачека, формируя более обширный профиль положительных реакций и взаимодействуя с иммунными сыворотками, содержащими даже 1 СЕ.

Корпускулярные антигены характеризовались наиболее выраженной зоной положительного реагирования со всеми использованными в эксперименте иммунными сыворотками к риккетсиям Провачека, включая и концентрации последних, соответствующие 0,5 СЕ.

Выявленные различия в комплементфиксирующей активности ФЛА и "фенольных" ФЛА отражали неоднозначность их серологических свойств, в частности, авидности. ФЛА риккетсий Провачека обладали меньшей авидностью, чем "фенольные" ФЛА, авидность которых была близка растворимому антигену.

Более полная характеристика серологической активности изучаемых антигенов была получена в результате испытания их в различных иммунодиагностических тестах - РСК, РИГА и РНАт параллельно с корпускулярным, растворимым и полисахаридным антигенами риккетсий Провачека. Исходная активность всех исследуемых препаратов была уравновешена предварительным титрованием в реакции нейтрализации антител (РНАт). ФЛА и "фенольные" ФЛА спе-

цифически реагировали во всех примененных серологических тестах. Однако в сравнении с другими антигенными препаратами выявлены определенные различия. ФЛА и "фенольные" ФЛА риккетсий Провачека были более активны в РСК, но менее активны, чем растворимые антигены, в реакции непрямой гемагглютинации с иммуног-лобулиновым эритроцитарным диагностикумом. Причем "фенольные" ФЛА в этом тесте имели более выраженную активность, чем ФЛА.

Важные для серологической характеристики ФЛА и "фенольных" ФЛА риккетсий Провачека и риккетсий тифи результаты получены при изучении их видоспецифической активности. При перекрестном титровании иммунных сывороток в РСК с "фенольными" ФЛА риккетсий Провачека средняя геометрическая титра специфических антител иммунных сывороток к риккетсиям гомологичного вида составила 1:145,2; к риккетсиям гетерологичного вида - 1:82,3. В то же время в РСК с "фенольными" ФЛА риккетсий тифи титр гомологичных иммунных сывороток был равен 1:75,4; гетерологичных -112,4. Эти данные свидетельствуют об общности иммунодетерми-нант, присутствующих в "фенольных" ФЛА риккетсий Провачека и тифи, но обладающих видоспецифичностью, присущей риккетсиям Провачека.

Индекс специфичности, вычисленный по методу Сергиева (П.Н.Кашкин с соавт.,1959) для ФЛА риккетсий Провачека и тифи и представляющий собой отношение числового выражения интенсивности реакции антигена с гомологичной сывороткой к аналогичному показателю с гетерологичной сывороткой, соответствовал 1,11 для ФЛА риккетсий Провачека и 1,19 - для ФЛА риккетсий тифи, что указывало на отсутствие у ФЛА риккетсий группы сыпного тифа видоспецифической дифференцирующей активности.

При сравнительной оценке серологической специфичности ФЛА риккетсий Провачека и ФЛА хламидий пситтаци методом прямого и перекрестного титрования указанных антигенов в РСК с 145-ю хла-мидийными иммунными сыворотками (от больных людей и иммунных кроликов, лонадей и овец) и 90 сыворотками, иммунными к риккетсиям Провачека (от больных болезнью Брилля и иммунных морских свинок, кроликов и лошадей) не было зарегистрировано перекрестнореагирующих антител между ФЛА риккетсий Провачека и ФЛА хламидий пситтаци.

В специальной серии экспериментов определена достаточно

высокая гемосенсибшшзирующая активность ФЛА риккетсий Проваче-ка и разработан оптимальный режим сорбции ФЛА на формалинизиро-ванных танизированных эритроцитах барана: концентрация ФЛА -2,5 мг/мл, температура реакционной среды - 45 С при экспозиции - 60 минут. Показано, что ФЛА с удельной серологической активностью не ниже 40 ЕС на мг сухого веса обеспечивают получение эритроцитарных диагностикумов, обладающих высокой специфической активностью. Специфичность эритроцитарных диагностикумов была подтверждена в РТНГА с использованием для ингибирования реакции диагностических антигенов различных видов риккетсий (Проваче-ка,тифи,сибирика, коксиелл Бернета, бартонелл квинтана) и хла-мидий пситтаци. Разработанный ФЛА-эритроцитарный диагностикум был использован нами при изучении иммунобиологических свойств ФЛА риккетсий Провачека.

Изучение ФЛА риккетсий Провачека в качестве специфического лиганда иммуносорбента и оценка перспектив его практического использования

Основьюаясь на физико-химических свойствах ФЛА риккетсий группы сыпного тифа и хламидий, в частности, способности растворяться в органических растворителях без изменения антигенной активности, мы предприняли исследования, имеющие целью конструирование иммуносорбента на основе ФЛА.

В модельных экспериментах, учитывая способность ФЛА растворяться в хлороформе, иммобилизацию антигена на носителе проводили с помощью полиметилметакрилата, растворенного в том же растворителе. В качестве инертных носителей использовали картофельный крахмал, широкопористый полиакриламидный гель и сефаро-зу 4В.

Исходя из того, что растворение полиметилметакрилата в органическом растворителе ведет в зависимости от концентрации раствора к переходам от густых сетчатых структур к разветвленным редким трехмерным сеткам и даже разобщению полимера на линейные цепи молекул при сохранении высокой склонности макромолекул полимера к структурированию даже в разбавленных растворах (А.П.Писаренко с соавт.,1981), можно было предположить, что это свойство лежит в основе механизма фиксации ФЛА на поверхности

инертного носителя, поскольку при отгонке растворителя происходит обратный процесс, приводящий к формированию трехмерной кристаллической решетки за счет восстановления сил межмолекулярных связей. С нашей точки зрения этот метод иммобилизации является частным случаем одного из известных принципов - механического включения антигена в структуру инертного полимера.

В результате многоплановых исследований нами был разработан способ приготовления иммуносорбента, обладающего высокой механической прочностью, стабильностью и пригодного для колоночной иммуноаффинной хроматографии.

Все варианты иммуносорбента, независимо от типа использованного носителя, позволяли выделять "чистые" антитела с высокой удельной серологической активностью, которая в 22,7 - 30,3 раза превышала УСА исходных иммунных сывороток. Выход "чистых" антител по отношению к специфическим антителам, связанным с им-муносорбентом, составил 30-40 %.

Наиболее продуктивными из испытанных были иммуносорбенты на основе сефарозы 4В, которые позволяли выделять в 1,4 раза больше специфических антител, чем иммуносорбенты на основе крахмала. Приготовленные иммуносорбенты обладали высокой стабильностью. Общий выход антител практически не снижался при 40-50-кратном их использовании в течение 6 месяцев.

На способ получения ФЛА-иммуносорбента получено авторское свидетельство N 1007676, приоритет от 30. 03.1981 г.

Иммунохимическое изучение препаратов "чистых" антител методами иммуноэлектрофореза, тонкослойной хроматографии в сефа-дексе С-200, электрофореза в полиакриламидном геле установило высокую степень их очистки, гомогенность и принадлежность к иммуноглобулинам класса С.

Учитывая, что гемагглютинационные тесты являются одними из наиболее чувствительных, мы использовали выделенные "чистые" антитела к ФЛА риккетсий Провачека в качестве гемосенситина для приготовления эритроцитарного диагностикума и изучения характера взаимодействия этого препарата с различными типами антигенов риккетсий Провачека в сравнении с эритроцитарным диагностику-мом, приготовленным на основе специфических иммуноглобулинов, представляющих собой глобулиновую фракцию, выделенную солевым осаждением из той же гомологичной иммунной сыворотки.

Результаты сравнительных исследований показали, что "чистые" антитела обладали более высокой гемосенсибилизирующей активностью, чем глобулиновая фракция этой же иммунной сыворотки. Оптимальная сенсибилизация "чистыми" антителами достигалась при значительно меньшей концентрации, равной (15±5) мкг белка/мл, чем при использовании глобулиновой фракции иммунной сыворотки, необходимая концентрация которой соответствовала (275±25)мкг белка/мл, то есть в 18 раз больше, что согласуется с данными других авторов в отношении гемосенсибилизирующей активности "чистых" антител, выделенных из антибактериальных иммунных сывороток (Ф. С.Носков, А.В.Жебрун, Г.А.Баяр и др.,1981)

При анализе полученных результатов обращал на себя внимание тот факт, что чувствительность РИГА при индикации антигенов риккетсий Провачека зависела не только от вида использованного гемосенситина, степени его очистки, но и типа выявляемого антигена.

Активность эритроцитарных диагностикумов на основе "чистых" антител с корпускулярным и растворимым антигеном риккетсий Провачека была в 2 - 4 раза выше, чем препарата сравнения, и значительно выше (в 8-16 раз) при индикации ФЛА риккетсий Провачека, что отражает избирательную чувствительность этого диагностикума при детекции последнего.

Если учесть, что "чистые" антитела и глобулиновый препарат выделены из сывороток, полученных при гипериммунизации лошадей живой культурой риккетсий Провачека, выращенных в органах белых мышей, можно утверждать, что в составе специфического пула иммуноглобулинов присутствуют антитела к фосфолипидам рик-кетсиальной клетки. Они при селективном выделении и использовании в диагностическом препарате проявляют выраженную комплементарную активность к ФЛА риккетсий Провачека.

Сконструированный иммуносорбент открыл перед нами возможность применения его и для повышения видоспецифичности иммунных сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа.

Основываясь на особенностях специфической активности ФЛА риккетсий группы сыпного тифа, мы использовали исключающую им-муносорбцию для редукции группоспецифической активности иммунных сывороток к риккетсиям Провачека к тифи.

Результаты прямого и перекрестного вариантов иммуносорбции

свидетельствовали об эффективности применения разработанного иммуносорбента для этих целей. После истощения на иммуносорбен-тах иммунных сывороток и последующей их концентрации на мембранах "Владипор" были получены препараты с высокой видоспецифи-ческой активностью.

Индекс специфичности, рассчитанный по методу Сергиева, для адсорбированных иммунных сывороток Провачека с гомологичным антигеном и антигеном тифи был в 35,3 раза вше, а для адсорбированных иммунных сывороток тифи - аналогично в 19,4 раза выше, чем для тех же иммунных сывороток до адсорбции. Адсорбированные иммунные сыворотки, взятые в рабочей дозе, соответствующей 2-4 СЕ, реагировали в РСК с гомологичным цельнорастворимым антигеном риккетсий (Провачека или тифи) до его титра и не реагировали с антигеном риккетсий (тифи или Провачека) другого вида.

Дифференцирующая активность адсорбированных иммунных сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа была подтверждена и в реакции непрямой иммунофлуоресценции - тесте, более чувствительном, чем РСК, при индикации корпускулярных антигенов риккетсий Провачека и тифи, самих риккетсий группы сыпного тифа, репродуцированных в различных биологических субстратах (яичная и легочная культуры риккетсий Провачека и тифи, энтомологическая культура риккетсий Провачека).

Сравнительная оценка показала равнозначный уровень активности в нМФА исходных и адсорбированных иммунных сывороток с гомологичными корпускулярными антигенами риккетсий группы сыпного тифа ( и самими риккетсиями в биосубстратах) при выраженном различии во взаимодействии с антигенами (или риккетсиями) другого вида адсорбированных иммунных сывороток.

Заключая этот раздел исследований, необходимо отметить, что использование разработанного нами иммуносорбента является, с одной стороны, технологичным способом получения диагностических риккетсиальных сывороток, обладающих выраженной дифференцирующей способностью по отношению к риккетсиям группы сыпного тифа. С другой стороны, метод перекрестной истощающей аффинной иммуносорбции с использованием иммуносорбентов с различной узкоспецифической активностью лигандов является перспективным методом в изучении антигенной структуры риккетсий.

Изучение ФЛА в составе риккетсиальных липосом

Фосфолипиды характеризуются весьма своеобразными физико-химическими свойствами, выделяющими их из общего класса ли-пидов. В силу своей амфифильности фосфолипиды обладают уникальной способностью формировать в водной Фазе бислойные структуры, называемые липосомами и рассматриваемые в последние годы как модели искусственных клеточных мембран (A. D. Bangham,1978; Л.Д.Бергельсон,1982; G.Gregoriadis, А.С.Allison,1983).

Основываясь на этой способности фосфолипидов, нам представлялись важными и перспективными исследования по созданию липосомальных риккетсиальных препаратов и изучению ях иммунобиологических свойств.

В качестве альтернативного метода приготовления липосомальных препаратов, исходя из поставленных задач, мы использовали метод механического диспергирования фосфолипидов в водной фазе, поскольку он прост, обеспечивал сохранение исходных биологических свойств липосомальных составляющих и позволял готовить препараты в стерильных условиях, в отличие от апробированного нами также метода получения липосом с помощью ультразвуковой обработки. Стандартизацию фосфолипидной составляющей осуществляли по ранее разработанному методу.

При формировании липосомальных препаратов за основу был принят протеиновый антиген, в качестве которого использовали химическую сыпнотифозную вакцину (ХСВ), в сочетании с ФЛА риккетсий Провачека.

Злектронномикроскопические исследования ФЛА, липосомальных препаратов и химической сыпнотифозной вакцины позволили констатировать факт образования риккетсиальными ФЛА в водной фазе липосом, а также включение протеинового антигена (ХСВ) в фосфоли-пидные везикулы при формировании липосомальных препаратов.

В специальных экспериментах изучено влияние количественного соотношения - ФЛА:протеиновый антиген на модельных сериях липосомальных препаратов. Имея постоянную величину протеинового антигена, равную 48 ЕС/0,5 мл и варьируя в составе препаратов фосфолипидную составляющую (от 1 до 200 мкг с УСА=2 ЕС/мкг в 0,5 мл), мы имели возможность сравнительно оценить иммунобиологические свойства липосомальных препаратов с различным содержа-

нием ФЛА и сопоставить с контролем - химической сыпнотифозной вакциной (48 ЕС/0,5 мл).

При изучении гемолитической активности ФЛА риккетсий Провачека и липосомальных препаратов показано, что очищенные ФЛА и липосомальные препараты на их основе не обладали гемотоксич-ностыо. но незначительно ее проявляли (цельный + и 1:2 + при исходной концентрации 400 мкг/мл ФЛА) лишь в определенных условиях, благоприятных для протекания окислительных процессов фосфслипидов и связанных, возможно, с образованием и накоплением лизоформ этих соединений. В этой связи все исследования по выделению, очистке и изучению фосфолипидов мы проводили в атмосфере азота.

При определении токсического действия ФЛА риккетсий Провачека и липосомальных препаратов показано, что дозы ФЛА от 1 до 100 мкг как per, se, так и в составе липосомальных препаратов не обусловливали токсического эффекта у белых мышей при внутрибрю-шинном введении и подкожной инъекции у морских свинок. Дозы, соответствующие 150 и 200 мкг ФЛА, при подкожном введении морским свинкам индуцировали незначительные общие (кратковременное повышение температуры) и местные реакции (гиперемия и припухлость) лишь в первые сутки после инъекции, затем полностью исчезающие.

В этой связи в дальнейших исследованиях при изучении иммунобиологических свойств липосомальных препаратов в качестве рабочего мы приняли следующее соотношение компонентов: 50 мкг ФЛА с УСА, равной 2 ЕС/мкг, плюс 48 ЕС протеинового антигена в 0,5 мл в одной прививочной дозе. В качестве препаратов сравнения использовали химическую сыпнотифозную вакцину (производства ИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи РАМН) в дозе, соответствующей 48 ЕС/0,5 мл, и живую комбинированную сыпнотифозную вакцину Е - ЖКСВ Е (производства НПО "Биомед", Пермь), прививочная доза которой в 0,25 мл содержала 4 lg МИДЭ + 16 ЕС растворимого антигена риккетсий Провачека.

Изучение иммунобиологических свойств липосомальных риккетсиальных препаратов

Сопоставление гистологических изменений лимфоидной ткани

центрального (тимуса) и периферического (селезенка) органов иммунитета у белых мышей, внутрибрюшинно примированных ФЛА риккетсий Провачека,липосомальными препаратами (ЛСП) и препаратами сравнения - ХСВ и ЖКСВ Е, выявило определенные различия в реактивности лимфоидной ткани на введение животным указанных препаратов. ФЛА риккетсий Провачека не индуцировали изменения в тимусе. в селезенке реакция лимфоидной ткани могла быть расценена как слабо положительная. Примирование белых мышей липосомальными препаратами обусловливало развитие гистологической картины преобразования лимфоидной ткани и в том. и в другом органе по классическому варианту с быстрой активизацией в селезенке всех клеточных элементов, участвующих в развитии иммунных реакций. Ответная реакция лимфоидной ткани и тимуса, и селезенки на введение ХСВ была выражена, но по силе уступала реакции на липосо-мальные препараты. Изменения в лимфоидной ткани селезенки и тимуса на введение ЖСВ Е характеризовалась, наряду с развитием классических реакций, усилением кровенаполнения селезенки, увеличением массы клеточного детрита, сопровождающееся активными процессами макрофагоцитоза.

Для оценки реактивности иммунокомпетентшх клеток экспериментальных животных в различные сроки после иммунизации липосомальными препаратами и препаратами сравнения нами была применена реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с использованием в качестве специфических стимуляторов ЛСП и ХСВ (20 мкл прививочной дозы). В опытах на морских свинках и кроликах показано, что статистически достоверный (р< 0,05 - р< 0,001) наиболее выраженный трансформирующий эффект достигался на тот и другой специфический стимулятор у экспериментальных животных, примированных ЛСП, во все сроки наблюдения, начиная с 3 по 50 сутки после иммунизации. Он характеризовался как наиболее высоким уровнем РБТ лимфоцитов, так и более длительными сроками сохранения реактивности этих клеток. Следует отметить также и то, что ЛСП во всех наблюдениях отличались и наиболее выраженным митогенным эффектом. Эта закономерность прослеживалась в культурах лимфоцитов всех экспериментальных животных независимо от вида использованного для их иммунизации препарата. Полученные данные свидетельствовали о том, что ЛСП обусловливали выраженную активизацию клеточных механизмов иммунного ответа у экспе-

риментальных животных.

В этой связи следующая серия экспериментальных наблюдений была посвящена изучению еще одного звена клеточной защиты организма - фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) у сравниваемых групп экспериментальных животных.

Основываясь на полученных нами данных о специфичности фосфолипидных антигенов риккетсий группы сыпного тифа, а также данных о гетерогенности специфических антител, индуцированных различными антигенными детерминантами риккетсий Провачека,в том числе и ФЛА, было проведено изучение ФАН крови экспериментальных животных, примированных ЛСП и препаратами сравнения, в отношении различных антигенов риккетсий Провачека. С этой целью использовали оригинальную методику с разработанными нами эрит-роцитарными диагностикумами: фосфолипидным, протеиновым и по-лисахаридным, служившими объектами фагоцитоза.

Анализ показателя индекса специфического фагоцитоза (ИСФ) выявил двуфазный характер ФАН в отношении всех изученных объектов фагоцитоза с повышением активности через час после введения иммуногенов и на 14-21 сутки. Отмечена неравнозначная по степени выраженности ФАН у различных групп экспериментальных животных к изучаемым объектам фагоцитоза, сохраняющаяся в течение длительного времени. ИСФ на 40 сутки превосходил фоновые показатели у кроликов, примированных ЛСП, к ФЛА в 5,2 раза, к протеиновому антигену -6,2 раза, к полисахаридному -3,8 раза. У кроликов, иммунизированных ХСВ, эти значения были равны соответственно 2,9; 3,09 и 2, 7; а у привитых ЖКСВ Е - 3,5; 4,5 и 3,3. Аналогичные результаты получены в экспериментах на морских свинках.

По мнению ряда исследователей, ранняя фагоцитарная реакция обусловлена направленностью специфического микробного стимула непосредственно на реагирующую клетку, основным эффектом которого является усиление специфической адгезии с участием рецеп-торного механизма распознавания антигенных детерминант микроорганизмов (В.М.Земсков,1984,1990; А.Н.Маянский с соавт.,1986; G.Marchai,1979; W.E.Paul,1974). Исходя из этих суждений и основываясь на наших данных, можно полагать, что в качестве специфического стимула способны выступать антигенные детерминанты микробной клетки, отличающиеся по физико-химической природе, в

том числе, и фосфолипидные композиции риккетсиальной клетки. Эта точка зрения подтверждается избирательной по степени выраженности ФАН в отношении различных антигенов риккетсий Проваче-ка. Вторая фаза активной фагоцитарной деятельности нейтрофилов происходила за счет опсонизирующего эффекта в соответствии с динамикой нарастания уровня специфических антител.

Полученные результаты, с нашей точки зрения, можно рассматривать как подтверждение факта участия фосфолипидных компонентов риккетсий Провачека в качестве антигенных детерминант в индуцировании иммунных реакций.

К числу методов идентификации клеток-носителей антигенсвя-зывающих рецепторов определенной специфичности относится реакция непрямого иммунного розеткообразования, в которой используют эритроциты, обработанные соответствующими антигенами.

В этой связи для изучения характера формирования клеточного механизма иммунного ответа на различные антигенные структуры риккетсиальной клетки, в частности, на фосфолипидные компоненты нами была использована также реакция непрямого иммунного розеткообразования по методу О.гааНэеге (1964) в нашей модификации с оригинальными эритроцитарными диагностикумами, которые были использованы и при изучении ФАН.

Анализ результатов определения иммунных РОК к различным антигенам риккетсий Провачека в лимфаидной ткани селезенки морских свинок и белых мышей, примированных ЛСП. ХСВ и ЖСБ Е показал увеличение числа РОК уже через сутки ко всем антигенам (фосфолипидному, протеиновому и полисахаридному) во всех группах экспериментальных животных, за исключением контрольных. Максимальное нарастание количества'РОК отмечено на 3-7 сутки с постепенным снижением иммунореактивности клеток в последующие сроки. Популяция иммунных РОК, комплементарная к протеиновому антигену риккетсий, независимо от использованного иммуногена, накапливалась несколько позднее, достигая пика на 7 сутки во всех группах как морских свинок, так и белых мышей. Однако в сравнении с иммунными РОК, имевшими рецепторы к полисахаридному и фосфолипидному антигенам риккетсий Провачека, эта популяция сохраняла более высокий уровень в отдаленный период (40-50-е сутки после иммунизации).

Сопоставление динамики сенсибилизации спленоцитов к фосфо-

липидному, протеиновому и полисахаридному антигенам риккетсий Провачека свидетельствовало о том, что ЛСП индуцируют продукцию иммунных РОК, в частности к протеиновому антигену, по интенсивности более выраженную, чем ХСВ и почти равнозначную ЖКСВ Е. Специфический характер реакции непрямого розеткообразования с исследуемыми риккетсиальными антигенами был подтвержден методом торможения розеткообразования по J.Wilson & М.Feldmann (1973).

Сравнительная оценка иммуногенности ЛСП, ХСВ и ЖКСВ Е показала, что ЛСП индуцируют клеточные механизмы специфической защиты организма экспериментальных животных, которые сохраняют активность до 50 суток (срок наблюдения), превосходя уровень контроля в 3 раза.

Полученные результаты с достаточной степенью основания позволили нам сделать заключение о том, что ФЛА в составе ЛСП обладают способностью потенцировать иммуногенную активность протеинового антигена риккетсий Провачека, проявляя при этом и иммуногенные, и адъювантные свойства.

Исходя из полученных данных при изучении клеточного звена гуморального иммунного ответа, мы сочли обоснованным и логичным этапом последующих исследований определение характера динамики антителогенеза, индуцируемого ЛСП и препаратами сравнения.

Иммуногенность ЛСП в сравнении с ХСВ и ЖКСВ Е изучена при иммунизации кроликов, морских свинок и белых мышей. Оценка степени выраженности гуморального иммунного ответа в динамике по РСК и РИГА с тремя видами эритроцитарных диагностикумов -фосфолипидным, протеиновым и полисахаридным показала наиболее высокую комплементфиксирущую активность сывороток у всех животных, примированных липосомальными препаратами и ЖКСВ Е как по высоте титров специфических антител в сроки максимального накопления, так и по продолжительности сохранения повышенного уровня комплементфиксирующей активности в отдаленные сроки наблюдения (90-е сутки после иммунизации) (Рис.1 и 2).

При сопоставлении динамики накопления специфических ге-магглютининов в зависимости от использованного иммуногенного материала более интенсивный ответ отмечен на ЛСП и ЖКСВ Е. ЛСП индуцировали высокий уровень накопления специфических антител к фосфолипидному и протеиновому антигенам и в меньшей степени к полисахаридному, а ЖСБ Е - в большей степени к протеиновому и

С(!.Гй7Г< . титры

ЛСП

Ср.гссц, титры

ЖКСВЕ

Ср. г&н .

титры

ХСВ

7 14 21 30 40 50 60 90 Срак наблюдения ( в сутках )

7 14 21 30 40 50 60 80 Срок наблюдения ( в сутках )

7 Н 21 30 40 50 60 90 Срок наблюдения ( в сутках )

Рис 1 Динамика гуморального иммунного ответа в РСК у кроликов, премированных липосомальными препаратами ЖКСВ Е и ХСВ

Ср. геоц. титры

ЛСП

ф. гели. титрм

ЖКСВЕ

Ср. Г£Л( «три

ХСВ

7 К 2? 30 40 50 60 30 Срок наблюдения { в «утках)

5 7 Н 21 30 40 50 60 80 Срок наблюдения ( б сутках)

б 7 14 21 30 40 50 во 90 Сро» наблюден«« ( в сутт )

Рис. % Динамика гуморального иммунного ответа в РИГА у кроликов, примированных липосомапьными препаратами, ЖКСВ Е И ХСВ

полисахаридному антигену, меньше, но выраженно к фосфолипидному.

Анализ результатов изучения динамики гуморального иммунного ответа на сравниваемые иммуногены подтверждал вывод, сделанный нами ранее на основании данных, полученных при изучении клеточного звена иммунного ответа, об усилении фосфолипидной составляющей ЛСП продукции специфических антител не только к фосфолипидной детерминанте, но и потенцировании иммунного эффекта на протеиновый антиген. Кроме того, фосфолипидный компонент ЛСП проявлял адъювантное действие, проявлявшееся в пролонгированной циркуляции специфических антител на более высоком уровне, чем у животных, примированных ХСВ. Выявленная тенденция прослеживалась у всех видов экспериментальных животных - кроликов, морских свинок и белых мышей.

На способ получения иммунных сывороток с использованием риккетсиальных ЛСП получено авторское свидетельство N1733004 от 09.01.1990 Г.

Результаты, представленные в данной работе, позволяют судить о значительной структурно-функциональной роли фосфолипидов в клеточной организации риккетсий группы сыпного тифа и перспективности их применения в составе иммуногенных риккетсиальных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые методом эфирно-ацетоновой экстракции дифференцированы фосфолипидные антигены из риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekll, R.typhi), репродуцированных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов, в легких белых мышей и в кишечнике переносчика-платяных вшей.

2. В составе <МА риккетсий Провачека идентифицированы 4 основных и 2 минорных фосфолипида, а также углеводный компонент, представленный тремя моносахарами. Химическим анализом показано наличие в ФЛА фосфора, редуцирующих Сахаров и азота небелковой природы. Установлена достоверная прямопропорциональ-ная зависимость между содержанием фосфора и удельной серологической активностью ФЛА. Определяющая роль фосфолипидов подтверждена редукцией антигенной активности ФЛА фосфолипазами.

3. На основании сравнительной оценки фосфолипидных антиге-

нов риккетсий Провачека и хламидий пситтаци выявлены качественные и количественные различия их фосфолипидных композиций, определяющие антигенную специфичность ФЛА каждого из них.

4. Предложен эффективный метод получения "фенольных" ФЛА из отходов производства диагностических и профилактических препаратов риккетсий Провачека, который лег в основу разработанной ресурсосберегающей технологии, отраженной в нормативно-технической документации - "Изменения к регламенту производства антигена Провачека для РСК".

5. Впервые определена высокая специфическая активность ФЛА в РСК, РИГА, РНАт. Сравнительная серологическая оценка ФЛА, "фенольных" ФЛА, корпускулярных и растворимых антигенов риккетсий Провачека выявила качественные отличия ФЛА, выражающиеся в их меньшей авидности. Констатировано, что метод выделения антигенов существенно отражается на их качественной характеристике. Установлено, что ФЛА риккетсий Провачека и риккетсий тифи характеризуются группоспецифической активностью.

6. Впервые определена высокая гемосенсибилизирующая активность ФЛА риккетсий группы сыпного тифа, определившая возможность приготовления ФЛА-эритроцитарного.диагностикума, эффективно использованного для изучения клеточного и гуморального иммунного ответа при иммунизации различными риккетсиальными им-муногенами.

7. Впервые на основе ФЛА риккетсий группы сыпного тифа разработан иммуносорбент и способ выделения с его помощью "чистых" антител к риккетсиям Провачека с высокой удельной серологической активностью, а также метод исключающей иммуносорб-ции, позволяющий повышать видоспецифические свойства иммунных сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа. Такие иммунные сыворотки обеспечивают видоепецифическую дифференциацию риккетсий группы сыпного тифа в РСК и нМФА.

8. Показана возможность применения "чистых" антител к антигенам риккетсий Провачека в качестве гемосенситина для приготовления антительного эритроцитарного диагностикума, модель которого целесообразна для изучения антигенной структуры риккетсий.

9. Впервые показана возможность приготовления риккетсиаль-ных липосомальных препаратов на основе ФЛА риккетсий Провачека и ХСВ. Электронномикроскопическими исследованиями ФЛА, ХСВ и ЛСП подтвержден факт образования фосфолипидными антигенами рик-

кетсий Провачека в водной фазе липосом, а также включения ХСВ в фосфолипидные везикулы при формировании риккетсиальных ЛСП.

10. При изучении гемолитической активности показано, что очищенные ФЛА и липосомальные препараты на их основе не обладают гемотоксичностью, которая реализуется лишь в условиях, способствующих образованию лизоформ ФЛА. В дозах от 1 до 100 мкг ФЛА не оказывают токсического действия при внутрибрюшинном введении белым мышам и подкожной инъекции у морских свинок, что подтверждено гистологическими исследованиями.

11. На основании исследования клеточного звена иммунного ответа у экспериментальных животных (кроликов, морских свинок и белых мышей), примированных подкожно ЛСП и препаратами сравнения - ХСВ и ЖКСВ Е, в РБТЛ, ФАН, иммунных РОК, а также изучения характера динамики антителогенеза показано, во-первых, факт участия фосфолипидных компонентов как антигенных детерминант в индуцировании иммунных реакций; во-вторых, выявлено потенцирующее действие ФЛА в составе ЛСП на иммуногенность ХСВ; в-третьих, констатирована их адъювантная способность, которая, в частности, проявлялась в более высоких уровнях специфических антител у животных, примированных ЛСП, в отдаленные сроки исследования по сравнению с животными, иммунизированными ХСВ.

12. Обобщенные результаты изучения антигенных и иммунобиологических свойств ФЛА риккетсий группы сыпного тифа свидетельствуют о значительной структурно-функциональной роли фос-фо-липидов в клеточной организации этих риккетсий и перспективности их применения в составе иммуногенных риккетсиальных препаратов.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горовиц Э.С., Тимашева O.A. Реакция непрямой гемагглю-тинации при парариккетсиозе-орнитозе // Сб. "Вопросы риккетсиоло-ГИИ", Пермь.-1974.-С.87-90.

2. Горовиц Э.С., Тимашева O.A. Использование реакции непрямой гемагглютинации для изучения орнитозной инфекции. Сообщение 1. Гемосенсибилизирующая активность орнитозного фосфолипид-ного антигена и методика постановки реакции с ним // Журн.микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол.-1976.-И 12. -С.120-124.

3. Горовиц Э.С., Тимашева O.A. Использование реакции непрямой гемагглютинации для изучения орнитозной инфекции. Сообще-

ние 2. Получение и апробация сухого орнитозного эритроцитарного диагностикума // Журн.микробиол. .эпидемиол.и иммунобиол.-1978.-N2.- С. 68-71.

4. Горовиц Э.С., Тимашева O.A. Использование реакции непрямой гемагглютинации для изучения орнитозной инфекции. Сообщение 3. Диагностическая ценность РИГА с орнитозным эритроцитар-ным диагностикумом // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1979.-N 3.-С. 108-112.

5. Тимашева O.A..Горовиц Э.С. .Тупицын А.В..Бурылова A.M. Способ получения растворимого антигена риккетсий Провачека // Авт.свидетельство N 782201, приоритет от 06.06.1979.

6. Тимашева O.A., Горовиц Э.С., .Тупицын A.B. Фосфолипидный антиген риккетсий Провачека, его серологическая активность // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1981.-N 7.-С.112-113.

7. Тупицын А.В., Тимашева O.A., Горовиц 3.С. Способ получения иммуносорбента // Авт.свидетельство N 1007676, приоритет от 30.03.1981.

8. Тимашева O.A., Тупицын A.B. .Выделение и характеристика фосфолипидных антигенных комплексов риккетсий группы сыпного тифа// В "Матер, научн.конф. к 85-летию ПНИИВС. -Пермь, 1983. -С. 31-32.

9. Тупицын A.B.," Тимашева O.A.., Горовиц Э.С. Метод получения иммуносорбента на основе фосфолипидных комплексов риккетсий Провачека // В тезис.докл_итог.научн.конф.ПНИИВС.-Пермь,1984.-С. 23-24.

10. Тимашева 0.А., Тупицын A.B., Горовиц Э.С. Сравнительная .характеристика эритроцитарных диагностикумов на основе "чистых" антител и специфических иммуноглобулинов к риккетсиям Провачека // Сб."Вопросы риккетсиологии", М., 1985.-С.63-65.

И. Тупицын A.B., Тимашева O.A. Зритроцитарные диагностику-мы на основе "чистых" антител к риккетсиям Провачека // Сб.тезис, докл. итог. науч. конф. ПНИИВС. -Пермь, 1985. - С. 36-37.

12. Тимашева O.A., Тупицын A.B., Горовиц Э.С. Способ получения растворимого антигена риккетсий Провачека // Авт. свидетельство N 1330786, приоритет ОТ 11..03.1985.

13. Тимашева O.A., Горовиц Э.С., ИмайкинИ. А. Особенности фагоцитарной активности нейтрофилов экспериментальных животных, индуцируемой различными антигенами риккетсий Провачека // Сб.тезис. докл.научк.конф.ПНИИВС, 1985.-С.44-45.

14. Тупицын A.B., Тимашева O.A. Оптимизация метода извлече-

ния фосфолипидных антигенных комплексов группы сыпного тифа // Сб.тезис.ДОКЛ.научн.конф. 1ШИИВС,1985.-С.42-43.

15. Тупицын A.B., Тимашева O.A. Применение иммуносорбентов на основе фосфолипидных комплексов риккетсий группы сыпного тифа для повышения видоспецифической активности антириккетсиаль-ных сывороток // Сб.тезис.докл.научн.конф.ПНШВС,Пермь, 1987.-С.44 -45.

16. Тимашева O.A. Фосфолипидные антигенные комплексы риккетсий группы сыпного тифа // Матер, научн.конф. к 90-летию ПНИИВС "Актуальные проблемы, приклад, иммунол., биотехнол.и производства бакт.препаратов".-Пермь, 1988.-С.65-67.

17. Тимашева O.A., Тупицын A.B. Использование метода истощающей иммуносорбции для повышения видоспецифической активности антисывороток к риккетсияи группы сыпного тифа // Сб."Вопросы риккетсиологии". М.,1988.-С.59-63.

18. Тимашева O.A., Горовиц Э.С. Способ получения иммунной сыворотки к риккетсиям Провачека // Авт.свидетельство N 1733004 приоритет от 09.01.1990.

19. Тимашева O.A., Горовиц Э.С., Тупицын A.B. Химический состав и иммунохимическая характеристика фосфолипидных антигенных комплексов риккетсий группы сыпного тифа // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1990.-И 2.-С. 109-110.

20. Тимашева O.A., Горовиц Э.С. Иммуногенные свойства ли-посомальных препаратов, образованных на основе фосфолипидных антигенных комплексов // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол. -1994. -К 6.-С. 70-71.

21. Тимашева O.A. Изучение и характеристика иммуногенности риккетсиальных лидосомальных препаратов // Матер.международн.симпозиума "Роль иммунобиол.препаратов в современ.медицине".-Уфа,- 1995.-С. 119-122.

22. Тимашева 0.А. Изучение некоторых показателей клеточного иммунитета у экспериментальных животных, примированных рик-кетсиальными липосомальными препаратами и препаратами сравнения // Там же, 1995.-С.122-125.

23. Четвертных В.А., Тимашева 0.А., Горовиц Э. С. Тканевые перестройки тимуса и селезенки при действии различных антигенов // Сб.тезис, докл.научн.сессии ПГМА, Пермь,1997.-С.21.

/