Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Типирование риккетсиии группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки на основании анализа полиморфизма хромосомной ДНК

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Типирование риккетсиии группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки на основании анализа полиморфизма хромосомной ДНК"

ст:.г<

•• : российская академия медицинских наук ндучно-исследовательскии ордена трудового красного знамени ¡нступх1 эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика

н.ф.гамалеи

На правах рукописи

РЦЩСШ1А Елена Борисовна

ТИПИРОВАНИЕ РИККЕТСИИ ГРУППЫ СЫПНОГО ТИФА И КЛЕШЕ ВОЛ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ НА ОСНОВАНИИ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ХРОМОСОМНОЙ ДНК.

,03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисхакие ученей степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Н1ИЭМ им. почет, акад. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Научный руководитель: доктор ыедшцшскпх наук Н.М.БАДАЕВА.

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.Н.ПАУТОВ доктор медицинских наук Е.П.ЛУКИН

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится "/£> МуиС'И<1/\ 1993 г. в н^^Ч9Сов на заседании Специализированного совета К 001.07.01 в научно-исследовательском институте эпидемиолонии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г.Москва, ул.Гаиалеа, .18)

С диссертацией мокнс ознакомиться в библиотеке ШШ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан ^_ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е.И.К0ПТЕЛ0ВА

-х-

Актузльность исследований,, направленных на решение вопросов щентификации и дифференциации риккетсий, определяется необходи-юстыо совершенствования методов контроля за риккетсиозани.

Инфекции, вызываемые рихкетсиями, продолжают сохранять свое ¡начение в инфекционной патология человека. Среди них в силу по-енциальной эпидемической опасности и зависимости от социалышх словий центральное полонез ¡ие- занимает эпидемический сыпной тиф. месте с этим начинал с 70-х годов, наблюдается активизация продлений эндемических рнккетсиозов, причины которой остаются невы-снешшмп,- Практически одновременно увеличилась заболеваемость вдемическиия риккетсиозаии группы клещевой пятнистой лихорадки -нтнистой лихорадкой Скалистых гор в США, Средиземноморской лихо-адкой - в Италии, Франции, Испании, Португалии. При этом, чаще тмечается атипичное, более тяжелое течение Средизеигоморской лхорадки (Grcss et al., 1982; Mansueto et al., 1986; Otero et 1., 1982; Wisseman, 1983). Обнаружены очаги клещевых ркккетси-зов в неизвестных для них ранее регионах, таких, как Япония, зраилъ (Gross et al., 1982; Uchida et al., 1989). В начале 80-х адов выявлен новый природный очаг клещевого риккетсиоза на тер-1тор::и России в Астраханской области (Балзева и Игнатович, ?39; Макарова и Тзрасевич, 1989). Возбудитель этого риккетсио-i, как установлено, серологически и генетически близок хомплек-' видов, родственных R.conorli (Drancourt et al., 1992). Каблю-!етсл повышение заболеваемости и изменение локализации очагоъ рболерания лихорадки цуцутамуши в Японии, а также смена штаммов |ркулирующей популяции (Татшга, 1987).

Активизация проявлений эндемических рнккетсиозов вновь выз-ла интерес к их изучению. В связи с этим были начаты работы по делению риккетсий в очагах клещевых рнккетсиозов, В результате делен ряд штаммов, отличающихся по своим биологическим и се-логическим свойствам от типовых. Таким образом проблема иден-Фикации и дифференциации' риккетсий приобрела новое значение, стижения современной молекулярной биологии способствовали раз-тию новой методологии типирования риккетсий, основанной на учении структуры генома. Этот подход, базируюдайся на анализе аморфизма длин рестрикционных фрагментов (АПДВ2) ДНК, включа-Taw.2 метода, как рестрякционний анализ хромосомной и плаз-«цой ДНК, ДКК-зондироваш1е и рестрикционный анализ продуктов плификации с праймерамн определенной специфичности в ПцР. Эти годы идентификации, как показали первые полученные данные, ой-

ладают наиболее высокой чувствительностью по сравнению с извесч ными на сегодняшний день в риккетсиологии биологическими и серс логическими методами (Непс1г1х е1 а1., 1991; Ие^егу, 1390; Нее пегу ег а1., 1985; 1587; 1991; ТПлеаИ е1; а1., 1987).

Имевшиеся к началу наших исследований единичные сообшешя выполненные на небольшом количестве шташов, свидетельствовали наличии структурных особенностей ДНК у некоторых представителе риккетсий, но были недостаточны для их использования в целях ти пировэния (Кезпегу ег а1., 1934; 1985; 1987).

Разработанные нами приемы исследования хромосомной ДНК р;п: кэтсий методом рестрикционного анализа и ДНК-зондирования предусматривали возмоеность изучения полиморфизма генома этих микроорганизмов к использоватш этого маркера для генотипическс; идентификации риккетсий.

Исходя из этого целью исследования являлось определена критериев идентификации риккетсий на основании анализа полиморфизма д;щк рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК и типирова-ние риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятшстой лихорадш. с использованием этих критериев.

Основные задачи исследования вклнчали:

1. Изучение характера расщепления хромосомной ДЕК рикгетсн эвдонуклеззани рестрикции и отбор эндонуклсаз рестрикции для про ведения анализа полиморфизма длин рестрнкциоккых фрагментов ДНК,

2. Сравнительное изучение полиморфизма длин рестршщионкы фрагментов Д?К риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнисто лихорадки с использованием набора шташов, различающихся по про исховденаго и Оологическим свойствам.

3. Изучение дифференциально-диагностической специфичное^ набора ДНК-зондов, представляющих собой фрагменты ДНК, несущи как определе1Шые геш, так и с.пучайные фрагменты ДШ К.ргоиагекИ.

1. Изучение генотипа неидентифацдрованного раккетсиальног< изолята, серологически относящегося к группе клещевой пятнистой лихорадки, с использованием предложенных критериев тиопрования.

Исследование проведено с использованием коллекции Национального музея риккетсиозных культур, функционирующего на базе лаборатории молекулярной биологии и генетики рихккетсий НИШ им. Н.5.Гамалеи.

Решению основных задач предшествовали работы но их методическому обеспечению, которые включали:

- определение условий проведения электрофореза в агарозном геле для обеспечения оптимального распределения фрагментов рик-{етсиальной ДНК, расщепленной эндонуклеазами рестрикции;

- отработку способа получения биомассы риккетсий из ограш-1енного количества биоматериала для целей изучения хромосомной ЩК риккетснй методом ДНК-зондирования.

Основным положением, выносимым на защиту, является возмок-юсть проведения типировяния риккетсий группы сыпного тифа и клеевой пятнистой лихорадки с применением рестрихционного анализа ромосомной ДНК и ДНК-зондирования по Cay зерну с ДНК-зондами, не-ущими различную генетическую информацию.

Научная новизна работы.

Впервые определен характер расщепления хромосомной ДНК рик-етсий с широким набором эндонуклеаз рестрикции, обладающих раз-ичными сайтами узнавания, и установлены злектрофоретические про-или рестрнкцнонных фрагментов ДНК для риккетсий группы сыпного ифа (R.prowazekii, R.typhi, R.canada) и клещевой пятнистой лнхо-адки (R.sibirica; R.conorii), имеющие видовые и, в случае R.p*o-îzekii, R.typhi, R.conorii, штаимовые особенности.

Охарактеризованы новые по дифференциально-диагностическим зобенностян ДКК-зонда (РБН11, РЕН13, Ш218), представляющие со-)й различные по.структуре Фрагменты ДНК R.prowazeki1; ДНК-зонды 5ладают специфичностью в отношении ДНК риккетсий группы сыпного ¡фа и клещевой пятнистой лихорадки и способности к дифферешщ-ц1и видов рикетсий внутри этих групп.

На основании полученных впервые данных анализа полиморфизма тан рестрикционных фрагментов ДНК и результатов ДНК-зондирования ¡едлокены новые критерии генотипической идентификации риккетсий уппы^сыпкого тифа я клещевой пятнистых лихорадок, позволяющие:

- определить вид риккетсий и дифференцировать штаммы R.pro-zeklí, R.typhi, R.coricrii.

-4- впервые объединить в группы патогенные для человека штам R.prowasekii; получить первые на генетическом уровне доказател ства изогенности малопатогенкого штамма Е R.prowazekil и его в соковирулентного ревертанта шташа ЕВир;

- впервые установить генетическую гетерогенность штамм R.typhi;

.- подтвердить генетическую гетерогенность штампов R.conor .и установить, что отечественный штамм Н-1 R.conorii отличается генотипу от протстипных индийского и африканского штаммов R.con rii - Indian tick typhus и Kenya tick typhus;

установить подобие генотипа вирулентных штат R.sibirica, изолированных в разное время, в различных регион нозозреалэ клещевого тифа Северной Азии, из разных источников;

- выявить новый для территории СНГ генотип риккетсий груп; клещевой пятнистой лихорадки для изолята, выделенного в Крыму;

Практическая ценность работы

Впервые охарак-; :ризоваш генотипы штаммов патогенных ринке1 сий с известной видовой принадлежностью, выделенных на территср] СНГ к депонированных в коллекции Национального музея риккетсио: ных культур.

Генотипические характеристики введены в паспортные дзшп изученных штаммов риккетсий группы сыпного тифз (R.prowazeki: R. typhi, R.canada) и группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii, R.akari).

Предложенные критерии использованы для гекотпппческой хараз теристики риккетсиалышх изолятов с неустановленной видовой npi надгеккостью, депонированных в коллекции Национального музея рш кетсиозных культур.

Апробация диссертации состоялась на научной конференции оч дела мцдвдинской микробиологии HKKSM ки. Ы.Ф. Гамалей РАШ 3 декабря 1992 года. Основные положения работы долокены на ззееданш ■Всесоюзного центра по риккетсиозаи (19В7 г,), на Всесоюзной конференции по ряккетсиоззм (1933 г.), представлены на конкурсе молодых ученых ЕМИЗМ к:.:. Н.Ф.Гамалеи в 1537 г., вклклекы руководителем диссертации д.м.к. Балаевой Н.М. в доклад на маздунарэдноС конференции риккетсиологов (Италия, 1987 г.), на 4-ом Евроизйскс конгрессе по клинической микробиология (Франция, 1939 г.), на IV международном симпозиуме "Rickettsiae and Rickettsial Diseases (Чехословакия, '1991 г.); включены в доклад академика АМН СССГ А.Г.Скаврокск.ой и члена-корреспондента АМН СССР А.А.Воробьева

;бьева "Генетическая инженерия в микробиологии и иммунология" на Я1 сессии общего собранна АМН СССР (19-23 марта 1991 г.).

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации (ло::ены на 194 страницах, иллюстрированы 28 рисунками и 10 ¡блицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 швы), описания материалов и методов, 3 глав собственных ¡следований, главы обсуждения результатов выводов и/ списка ¡тературы, включающего <30 советских и 177 зарубекных источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы нсследова!ШЯ.

Штаммы риккетспЯ

В работе использовали рпккетсии группы сшного тифа (СТ ) : 10 ■амиов R.provsazekii - Брейнль, Е, ЕЕнр, Ананьев, Владако, Г, Ка-нян, Кузина, Л, Черникова; 5 штаммов R.typhi - Вильиингтон, 1, Гер, Мусепбов, X; R.canada штамм 2678; риккзтсии группы клевой пятнистой лихорадки (КПЛ): 6 штаммов R.sibirica - ЕС—1. Ал-й 0П/83, Горнай 54/88, Нецветаев, Приморье 20/84, Чита 18/85; 3 гша R.conorii - М-1, Indian tick typhus (Itt), Kenya tick typ-я (Ktt); 2 штампа R.akari - M-3 и КС; риккетсии группы цуцуга-ш: П.tsutsugainushi штамм Jilliara; представители рода Coxiella С.burnetii шташ М-44. Риккетсии культивировали в келточных шках (2М) развивающихся куриных эмбрисксв (КЭ). Паспортные дэя-s исследованных штамысв представлены з тчбл. 1.

Выделение риккетскй, освобожденных от ткаш хозяина сводили с использованием модифицированного метода Anínkovlch

al. (1989), а также специально разработанным наш сффективзшм особом частичной' очистки риккетсий от ткани зслетки-хозяина из со скудным накоплением риккетсий. Риккетсин, ?чкщенны8 от тка-ВМ КЗ, суспендировали в буфере ТЕ (0,01M трис-HCl РН 8.0; 1 irJJ ГА, Serva).

Таблица 1. Паспортные данные штаммов риккетсий, использованных в исследовании

Вид, ытаым I

Место выделения Автс^

Дата III

Источник выде тения IV

Пассагшая история V

К.ргоу.'агеКИ ь-рейкль (не клонир.) ЛТГС '«Р,-142 Брейнль(клонир.)

Е(не клонир.) АТСС УП-233

Польша; ГСо1Ьас11 Б.

19.22 больной эпнд.ояш.трф

Е(клонир.)

ЕВнр(не клонир.)

ЕБир (клонир.) Ананьев

Владако

Г

Испания; 1943

С1ауего С., Регег-СаПагсЮ Р. получен из США

от прсф.Уг1ееегсвп С.Е. в 1963г.

Россия, Мосг-зэ; 1971

Бадаева II.Н, ИЭМ ин.Гамалеи,

Россия, Москва; 1952

Васильева Л.Б. КЗМ им.Гамалеи Белорусия, №кск; 1968

Рытик П.Г. ¡Лшский КЭМ Россия, Москва; 1943

Здродовсжий П.Ф. ИЭМ нм.Гамалеи

зкспер.получ.при пассир штамма Мадрид-1 в КЗ

экспер.получ.13пас. в легких б.и. штамма Е

больной б-кь Бриллл-Цинссера

больной зпид.енпн.ткф больной зшзд.екпн.'.иф

134 КЭ

?н. св. +9КЭ+ЗКЭ (п/р) +2КЭ

282-285КЭ

278КЭ+1К.Т.(бляшки) +6КЭ

7 КЭ •

13КЭ+5КЭ(п/р)+1КЭ ,

1П.В.+1Н.СЗ+

71КЭ+ЭКЭ (п/р )+21СЭ

Зкрол.в.+Зм.св.

+7КЭ

?м.св+7б.м.+?м.св. +98КЭ+ЗКЭ (П/в Н1 КЭ

Кацинян

Кузина

Л

Черникова

П.typhi Б-1

Вильшнгтон АТСС YR-144 Гер

[Лусеибов X

R.canacla 2573

АТСС VR-610

Армения, Ереван;

Коцинян М.И.

Россия, Москва;

Голиневич Е.М. ИЭМ им.Гамале

Украина, Львов;

Мосикг Г.С. Львовский ИЗМ

Белорусия, Минск:

Рытик П.И. Минский ЕЗМ

Грузия, Батуми;

Солитериан П.Л.

ИЭМ им.Гамалеи ■

США, Сев.Каролина;

Махсу R.Y.

Грузия, Батуми;

Солитермая П.Л.

ИЭМ.им.Гамалеи

Азербайджан, Баку;

Кулагин С.М. ИЗМ им.Гамалеи

Грузия, Батуми;

Солитерман П.Л.

ИЭМ им.Гамалеи

Канада, Онтарио; McKiel Y.A.

III

IV

V

1363 Сольной эпид.сыпн.тиф

1950 больной зпид.сыпк.тиф

и

1946 больной эпид. сыпн.тиф

1967 больной б-нь Брилля-Цинссера

1946 йа^ие погуей1сиэ

1928 больной крыс.сыпн.тиф 1946 больной крыс.скпн.тиф

1943 больной крыс.сыпн.тиф

1946 ХепорБуПа с11еор1е

снятых с Р..погуе§1сиз

1963 НаетарМБа! 1з

1ерог1Бра1и51;1,1з

Зм.СВ+4КЭ+ЗКЭ(п/р) +1КЭ

?м.св+?б.м.+1м.св. +6КЗ

?п.в.+?б.м. +4и.св.+7КЭ 15квол.в.+ЗКЭ +1м*.св+6КЭ

? + 31КЭ

200и.св.+107-112КЭ

?ы.св.+?б.м. +1И.СВ.+8КЭ

?М.св.+10КЭ

?н.св.+?б.н. 1М.СВ.+6КЭ

16 КЗ

Продолжение табл. 1

II

III

IV

fi.Pibirica Алтай 31/88

Горный'54/83

К-1 (246)

ЛТГС VR-151 Нецветяев (232)

Приморье 20/84 Читя 18/85 Умолят Крум-108

R.conorii М-1

Ктауа tick typhus (1ГХ >

Россия, Алтайский край;

Рудаков Н.В..Самойлеико И.Е.

Омский ШЯ1ПИ

Россия, Алтайский край;

Рудаков Н.В.,Шпынов С.Н.

Омский ШИШ

Россия, Краснояр.краЙ;

:ч Е.М. ЙЗМ им.Гамалеи

1988 Dermacentor silvarum 1980 Dermacentor nuttalli

Голиневич Россия, Алтайский край; 1946 Кулагин С.М..Коршунова О.С. ИЗМ им.Гамалеи

Россия, Приморский край; 1984 Решетникова Т.А. Окский НШПЛ

Россия, Читин.обл.; 1985

Решетникова Т.Д. Омский ШИПИ

Россия, Москва; . 197?

Воро^щова Т.А. ИЗМ им.Гамалеи

1949 Dermacentor nuttalli

больной клещ.риккет-сиозом Сев.Азии

Haemaphysalis concinna Dermacentor nuttalli Dermacentor marginatus

Грузия, Сухуми; "1947

Голиневич Е.М. ИЗМ им.Гамалея Африка, Найроби ; 1953

получен от l'hilllp C.B. в 1Э53

Rhipicephalus sanguineus

Haemaphysalis leacM снятых с собаки

Зм.св.+З-БКЭ

1м.св+4-10КЭ

? + 6-7КЭ ? +30-32КЭ

7м.св.+11-16КЭ

5м.св+12-18КЭ

2клещи+8-11КЭ

7+82КЭ 7+7КЭ

I

' а> I

I

ii

III

V

Indian tick typhus , ATCC VR-597

R.akari M3

US' (Kaplan) ATCC 7R-143

R. tsutsugareushi Gilliam ATCC VR-312 C.burnetii M—44

Индая, Кяшир; 1950 Rhipicephalus

получен от Phillip C.B. в 1953 sanguineus

Украина, Донецк; Кулагин С.М. it3M им.Гамалеи Нью-Йорк, США Huebner В..

Индокитай, Assaro-Burma; Bennet R. Россия, Москва; Гениг В.А.ИЗМ им.Гамалеи

1950 Mus musculus 1946 больной

1944 больной лих.цуцугамуша

1954 экспер.получ.при пассяр. в КЗ штамма Грита

7+7кэ

7+6КЭ ?+11-14КЭ

7М.СВ.+10КЭ 62КЭ

I

VC I

Условные обозначения

цифры - количество пассажей;

КЗ - пассирование в желточных мешках куриных эмбрионов;

м.св. - пассата на морских свинках;

б.м.- пассажи на белых мышах;

п.в.- пассажи на платяных вшах;

крол.в.- пассаки на кроличьей расе вшей;

клащи - пассаш в клещах;

?- количество пассадей неизвестно;

ЗКЭ(п/р) - пассирование в КЭ методом предэлышх разведений = клонирование; 1к.т. (бляшки) - пассирование в культуре ткани = клонирование методом бляшек; (246у, (232), (HL), (Kaplan) - имя штамма в иностранных работах; АТСС - номер в американской коллекции типовых культур.

Молекулярно-гь на тйчески е ме тода

Выделение бактериальной хромосомной ДНК риккетсий проводили согласно метода Frieier et al. (1984). Расцепление риккетсиальной ДкК проводили согласно Maniatis et al (1982) с использованием зн-донуклеаз рестрикции производства НЛО "Фермент", Вильнюс, и буферов для рестрикции фирмы Boehringer Mannheim Сп.ЬК, ФРГ.

Злектрсфоретическое . разделение рестрицировэнных фрагментов ДНК проводили в горизонтальном агарозном геле (Агарозэ тип II, Sigma, США). Выбор концентрации эгарозы и режим электрофореза зависел от целей эксперимента и определен в процессе исследования.

Выделение фрагментов риккетсиальной ДНК из агарозного ;еля проводили методой электрозлхндаи согласно Maniatis et al. (1902), используя буфер ТВЕхО,5 и диализные трубки "Servapor" (ФРГ) Режим электроэлюцин - 4 В/см / 1 час/ комнатная температура. Элюат очищали от компонентов агарозы и концентрировали ДНК с использованием колонок Elutip-d (Serva) в соответствии с инструкцией производителя .

Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методой согласно BImbolm and Doly (1979). Эксперименты по дот-гибридизации проводили с с использованием камеры дяя иикрофильтрации Bio-Dot (Bio-Rad).

В экспериментах по блот-гибридизащш исследуемую ДНК рэстри-цировали зкдонухлеазоЛ Hindllí или EcoRI (НПО "Фермент",Вильнюс). Перекос ДНК из агарозкых гелей на фильтры Zeta-Probe (Eio-Rad) проводили щелочным методом согласно инструкции фирмы-производителя фильтров.

Использованы следующие ДНК-зонда: специфичные для R. prowa-zekii HinâIII-фрагменты, в составе гибридных плазмид РВН11 и РБШЗ (Рыдкина и Демкик, 1990), а такке любезно предоставленные проф. D.Wood, США, плазмиды рЖб4 vïïood et al., 1907) и )AW218 (Krause et al., 1985), несущие соответственно ген цитрат-синтазы R.prcvvazekii и ген белка R.prcwazekii с молекулярной массой 51 KD.

Радиоактивное мгчениз ДНК-зондов проводил«. используя набор для радиоактивного мечения с олигонуклеотидныии праймерами, согласно стандартному протоколу фнрмы-производатрля (Pharmacia).

Эксперименты по гибридизации фильтров с ДНК-зондами прово-1 согласно инструкции фирмы-производителя фильтров Zeta-Probe • )-Rad). Рехим гибридизации соответствовал уровню гомологии

РЕЗУЛЬТАТЫ Ii ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка воз;локностей метода рестрикциокного ьналигз для типи-шня риккетсий проведена на типовом представителе рода Ric-taia - нозбудчтеле сыпного тифа R.prowasekii. В исследование эчены штаммы, различающиеся по вирулентности и, как было уота-tgho Regnery and Spruill (1984), но структуре геьоча. Это про- . шный высоколирулентный штамм Брейнль и малопатогенный вакцин-штамм Е. В исследование был включен также стабильный виру-пи ft ревертант штамма Е - штамм ЕВир (Бадаева, 1SG9).

Проведенный анализ позволил определить число сайтов рестрик-на хромосоме R.prowar,ek.i 1 для широкого спектра эвдснуклеаз, ¡дающих различными сайтами упнявашя. Было установлено, что, в >м, геном риккетсий характеризуется относительно небольшой 'ментацией ДНК - от нескольких до 20, »иногда более 30 сайтов, юстаточно большим диапазоном распределения рестрикцнонных ■ментов - от 50 до 0.5 тпн (табл. 2). Это обстоятельство поз-иго подобрать условия электрофореза, позволяющее четко акали--юать рестриктогрзммы в высоко- и среднамолекулярьой области, г/чшее-разделение Фрагментов в области от 23 до Z т.п.н. было ■ипг/то при использовании 0,6-0,7% агзрозного геля и рекимз [олжнтельного электрофореза (50-70 чассв) при низких значениях шнения 1-2 Уем/ час.

В ходе исследования установлено, что в случае 9 из 17 эндо-шаз выявляются отличил в структуре генома у штампа Брейнль от :мов Е и ЕВир. Это эндонуклеазы - ВатЛ1, Bgll, Cfr13I, EcoR", IUI, IK.pI, Hval, rotl, Xhol (табл. 2). С целью исключения южной генетической гетерогенности изучаемых популяций была •едена специальная серия опытов с другими сублинипш птамчоэ ичь, Е ii ЕВир, "клош'ровз'гични" предварительно методом пре-•кых разъеданий ыга методом "блямзк" для гомогенизации состава 'л я ими (табл. 1). Как видно из дошшх исследования рестрнкци-е картин» ДТП' "клонированных" и "неклозыровакшх" сублиний ,oro in arravMon были вденти'пш мзкду собой (табл. 2), что сви- '•' .■¡ьг.твует о стабильности структуры генсма у риккетсий в про-е пассирования в КЗ.

Проваленное типирование набора патогенных шташоз R.pror/aze-kii с использованием отобранных эндонухлеаз показало, что рестрик-ционные картины, полученные для прототипного итамма .Брейнль ти-пич!Ш для 6 других штаммов R.prowazekii - Ананьев, Владыко, Г, Кузина, Л, Черникова.. Рестриктограммы, типичные для штаммов Е и Евир, получены для штамма Кацинян (табл. 2).

Как следует из данных о происхокдении исследованных штаммов • (.табл. 1), наблюдаемые различия в структуре ДНК не связаны с характером вызываемого заболевания. Так, штаммы, сходные со штаммом Брейнль, выделены как от больных эпидемическим сыпным тифом (Владыко, Г, Кузина, Л), так и от больных рецидивной формой сыпного тифа - болезнь"» Брилля-Цинссера (Ананьев, Черникова). Штамм Каци-кян, принадлежащий к одному, генотипу со штаммом Е, выделен от . больного эпидемическим сыпным тифом. Выязленные различия не коррелируют такие с-различиями в вирулеш.юсти. Так, вирулентные штаммы ЕБир и Кацинян отличаются от вирулентного штамма Брейнль и . принадлежат к одному генотипу с авирулентным штаммом Е.

По-видамому, наблюдается корреляция мекду принадлежностью штамма к определенному генотипу и регионом его выделения, поскольку все штаммы сходные со штаммом Брейнль выделены в Европейской части' России, в одном географическом регионе с Варшавой (50°С.Ш.), где бал выделен штамм Бргйкль. Штамм Кацинян, выделен в Армении, з географическом регионе с той яе шпротой (40°С.Ш.), что и Испания, где был выделен штамм Мадрид-1 , являющийся родительским. для штамма Е.

В итоге наши исследований с использованием метода АПДРФ ДНК впервые осуществлена дифференциация патогенных штаммов R.prowazekii.

Рестрикционный анализ ДНК был применен для изучения штаммов другого представителя риккетсий сыпнотифозной группы - П.typhi, возбудителя эндемического сыпного тифа. Было исследовано Б штаммов R.typhi. С помощью двух эндонуклеаз - Mspl и PstI - были найдены отличия штамма Еильмингтон от других штаммов R.typhi (табл. 3), Генетическая гетерогенность штаммов R.typhi была установлена впервые. Как ив случае R.prowazekii, выявленные различия, по-видимому, отражают клональкость ытаммов R.typhi, связанную с ре-

TiUTTOTtQtXIJLa "nnfQlnl Ртг rrtlrri-irrtfrfx« TJOlTQTTOtJ T) Aiicnravo

. Uu^uVlUIUl.l , VJf ,U(UMJII J__1 i —1 7 tJ ПП^^ШНл ,

а отличающиеся от него штаммы Б-1, Гер, Мусеибов, X - на Кавказе,

Проведенное с использованием АПДРФ типирование риккетсий группы К1Ш (R.sibirica и R.conorii) показало, что по диапазону рас-

деления рэстрккционных фрагментов ДНК риккетсии группы KIL/I дны'между собой и отличаются от риккетсий.группы СТ.

Был исследован полиморфизм генома б штаммов R.sibirica, вы-енных на территории Сибири и Дальнего Востока, в_разное время з разных источников. Полученные дэнные показали," что все ис-цозанные птаммы R.sibirica не различались по генотипу (табл. Наш результаты говорят о высокой консервативности генома у го вида риккетсий.

В отличие от R.sibirica, сравнительное исследование методом iXJ Зх штаммов R.conorii - штамма М-1, выделенного на побережье того моря в г.Сухуми, прототипкого индийского птэмма Indian с typhus и прототипного африканского штаьша Kenya tick typhus ¡зало, что в распределении рестрикционных фрагментов при рас-гении ДНК зндонуклеазами Hindlll и Pstl наблюдаются выраженные жчия между 3-мя спаинами, и каждый из них может быть индивя-гьно идентифицирован по наличию специфических диагностических •ментов ДНК (табл. 5). Поскольку изученные штамка R.conorii ¡лекы в удаленных друг от друга географических регионах, ш полагаемг что выявленные у них особенности структуры ДНК ог-т региональную клональность этого вида ряккгтеий.. Таким образом, в целом с использованием рестрикцпонного ана-получены объективные характеристики, позволяющие тппировать ушшровать штаммы риккетсий. Решение этой задачи имеет исклх>-льно важное значение в риккетсиологии, поскольку до настояще-ремени подобных характеристик не существовало и статус штамма чал каждый вновь выделенный пзолят.

Для разработки критериев титрования риккетсий, принадлежа -к раз:шн видан, был использован метод ДНК-зондирования. Поскольку успех этого метода определяется выбором ДИК-зонда,' проведено тестирование 4-х различных ДКК-зсндов: были иссле-и специфичные для R.prowacekii HindIII-фрагиенты ДНК, вклп-. ;а в состав 2>; гибридных плазмд j.-?BH11 и рРЗШЗ (Рыдкина и га, 1990). Наряду с этими были исслздоваин 2 гибридные плаз- плэзкида рьГ£264, несущая ген вдтрат-сгатазы R.prowazekii i et al., 1987), плаэмида plffi'218, кодирующая бэлок R.proivaze-'олекулярной массой -51 kB (Krause et al., 1925). Все зонда с i.-совой гштеиспвностиэ гибридизоваяись с ДНК риккгтеий, зходя-:-л: в грушу CT, так и в группу КИЛ. Зонды не гибридпзовались : интакткого SM, фага X, E.coli и ДНК широкого спектр? паго-

!Х 1Л1КрООрГ21ШЗМОВ,

Ни.' один из исследованных зондов не гибридизовался с ДНИ С.burnetii и R.tsutsuganrushi, что согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что С.burnetii и R. tsutsugajnushi генетически удалены от риккетсий группы СТ и КПЛ (Weisburg et al., 1985; 1989).

Проведенное методом ДНК-зондирования исследование показало, что зонды обладают различными дифференциальными возможностями в отношении рассмотренных представителей риккетсий (табл. 6).

Наиболее эффективно различия в структуре генома у изученных видов риккетсий определялись при гибридизации с зондами РВН11 и Ы7>218. Зовд РБН11 очень четко выявлял полиморфизм генома у видов риккетсий внутри группы сыпного тифа. Зона гибридизации ДКК R.prowasekii находится в области 4,0 тпн, R.typhi - в области 3,1 и 1,5 тин, R.canada - в области 2,3 и 1,2 тпн. С помощью этого зонда легко мокно отличить риккетсии группы сыпного тифа от риккетсий группы КПЛ, а тзкхе вщ'три группы КПЛ P.akari от близко родственных мекду собой R.sibirica и R.conorii. Зонд РЗН11 не дий^решдаровал R.sibirica от R.conorii (табл. 6).

Наилучшими дифференциальными возможностями обладал оонд Ш218, несущий ген белка 51 kD R.prowazekii. С помощью этого зонда четко дифференцировались все изученные виды риккетсий, включая близкородственные виды R.sibirica, R.conorii.

Дифференциальные возможности зондов РВН13 и Ш'2б4 были ограничит, что говорит о том, что они включают консервативные для рассмотренных видев риккетсий участки генома (табл. 6).

С помощью зондов РВН11 и Ш218 проведено типирование ¡.яда штаммов каждого вида риккетсий, включенных в исследование. Положение зоны гибридизации с зондом РБН11, как и с зондом №218, типично для всех изученных изолятов того гида, к которому принадлежит данный штамм. Например, различные по структуре генома штаммы R.prowazekii имеют одинаковые гибридизациошше картины при взаимодействии с зондом РВН11. В отношении изученных штаммов R.conorii было установлено, что зонд Шг'218 не только дифференцирует этот вид от других представителей группы КПЛ, ко и обладает способность» к дифференциации штаммов R.conorii - получены совпадающие картши для' штаммов й-1 и Ktt и отличающаяся от них картина для штамма Itt. Этот результат, может быть объяснен в.чрзташой генетической гетерогенность» ита>,«ов R.conorii по сравнению с другими, изученными видами риккетсий.

Таким образом, положение зон гибридизации с зекдзми Ш218 и

31111 может слуяить критерием при идентификации изученных видов гккетсий.

Полученные в ходе работы критерии тппировакия риккетсий )уппа СТ и КПЛ были применены для изучения изолята Крым-108 Воронцова и др., 1580) с неустановленной вядозо:! принадлежать», и имеющего антигенную общность с риккетсияии группы КПЛ. :юше проведенного нага рзстрикционного анализа с использованием шонуклояз Рб1;1 и Н1пс1111' показали, что пзолят Крым~1С8 сходен ) общему характеру полиморфизма длин рзстрнкцкокных фрагментов ЕС с риккетснякп группы КПЛ, а в пределах этой группы пго т:ш глинорфпзма отличается как от П,в1Ь1г1са, тпк .и от З.т исследо-,нных штаммов К. сопогП.

Изучений генотипа взолята Крым-1СЗ с помогтью ДНК-мдароваиия показало, что, несмотря на разные дафферекцпалыме •знокиосга ДЕПС-зовдоз РВН11, РВН13, МЯ264 п МК218, с помоцыо здого из них изолят Крым-108 четко отличался ото всех псследо-шшх видов риккетсий группы СТ и группы ЕОТЛ (табл. 6).

Выявленные с поыошью рестрикционного анализа и ДКК-ндкровакля гснотипические характеристик! изолята Кр;:м-103 показа»! его особое положение по стносггаю к изученным задай рик-тснй. Полученные результаты позволили нам говорить о том, что олят Крым-108, актигенно родствегскй рикхетсиям группа КПЛ, отчается от них по генотипу и является новым представителем рода скеиэ1з на территории СНГ.

На основании получения намп данных для решения вопрсса о довой принадлежности изолята Крим-1С8 было предпринято специ-ьксе исследовг?де по его генотишгческой идентификации, выполне-э в Национальном центре ВОЗ Франции, в лаборатории рихкетсио-а, руководимой проф. В.ПаоиИ. Исследование было проведено ■.{.Бадаевой, руководителем лаборатории молекулярной биологии н нетики риккетсий НИИЗМ им. Н.Ф.Гамалеи, и научный сотрудником эй лаборатории М.Е,Еремеевой. В результате было показано, что мят Крым-108 идентичен по генотипу недавно' охарактеризованному щг - й.э1оуака (Ие^пегу а1., 1991). Результаты зтих исследо-тй подтвердили сделанный нами вывод о том, что изолят Крым-108 чяется новым для территории СНГ видом риккетсий.

Таблица 2. Полиморфизм длин рестрикцноинкх фрагментов ДМС штаммов Раске1;1;Б1а ргоу.'агекИ

дндонуклеаза рестрикции

Визуально различимые Величина диагностических фрагментов дьпс (". фрагменты ДНК

-Штаммы

.п.к.)

— -Кол-во Диапазон Брейнль Ангньев, Владдао Е ЕВир Кацинян

сайт распред. кл.некл, Г Кузина, Л кл.некл. кл. иекл.

рестр. (т.п.н.) Черннкозз

ВаглНГ С'СА'ГСС 9 В/*11 СССНШГШСС 9 С1г131 С «100 >30 О'ААТТС >30 'АССТТ >30 СССв >30 СС'(АТ)СС >30 СТССА'С >30

ЕсоИ ЩпйШ Мэр1 Муп! РзИ

Х)ю1

Всп1

ВэрПГ

С1гЦ:

СП-91

ЕС081

Р\'и11

5а11

Бгла!

СТСЙАС 13 СС'(СС)СС 19 СС'СС >30 Т/С)'СССС(А/С)>30

С'ССССС

ссошк;

САССТС С'ТССАС ссссас

I >20 >30 3 1

50 50 15 25 1Б .15 20 30

50 50 30 25 30 25 30 30 40

7 0 0

10 20 20

8 8

О О

9 9

9 9 18

- 1 - 2 - 1 -0,5 - 1 - 1

5 2 10 30

18 15 15

О О

О н/о 8 О 3 9 18 15

О

н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о

II/о

к/о н/о н/о 9 9 • 18 15

о

и/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о и/о

9;5 9,5 9,5 9,5 9,5

23

0 0

18 18

О О

8 8

О О

20 20

16 16

15 15

18 18 О О

8 О 20

16 16 15 15

н/о О 18 О 8 О 20 16 15

н/о н/о н/о н/о н/о н/о

Условные обозначения:

"-" - нет отлший;

"О" - диагностический фрагмент отсутствует; "н/о" - не определяли; кл. - клонированная субпояуляция штамма; некл. - да. клонироЕанкЕЯ субпопуляция штамма; т.п.н.- тысяча пар нуклеотндов;

- IT -

Таблица 3. Полиморфизм длин рестрикционннх фрагментов ДНК штаммов Rickettsia typhi

Эндонуклеаза рестрикции

Визуально различимые фрагменты ДНК

Величина диагностических фрагментов ДНК (т.п.н).

Кол-во Диапазон

распределения . (т.п".н.)

Штампы Вильмингточ Б-), Гер,

Кусеибов, X

icoRI

iindlll

ispl

'stl

ibal

>30 >30 >30 >30 >30

25-2 15 - 1 15 -0,5 30 - 1 30 - 1

12 0

0 12

'аблицз 4. Полиморфизм длин рестрикционннх фрагментов ДНК штзмыоз Rickettsia sibiiica

¡ндонуклеаза Визуально различимые .Наличие кекомигрярувдзх йрзг-1естрикЩ5и фрагменты ДНК центов у сравниваемых птакков

Кол-во Диапазон распред. (т.п.н.;

Штаммы Штаммы

Горный 54/ßa, К-1, К-1, Нецветзев, Чита 18/35, Алтай 81/83 Приморье 20/84,

Sil 10 50 - 4 _ H/O

CORI >30 50 - 1 , ,5 - K/O

indlll >30 10 - o; ,5 - -

& 20 4 - o, ,5 - h/o

>30 30 - 0, ,5 _ -

vull >30 50 - 0, ,5 _ •£/0

bal >30 16 - 1 - il'o

аблтща 5. Полиморфизм длин рестргшмоннкх фрагментов ДКК етзуя/ob Rickettsia conorii

донуклеаза Визуально различимые Величина диагностических зстрикции фрагменты ДНК фрагментов ДНК (т.п.н.)

Кол-во Диапазон metres д. (т.п.н.) М-1 Штаммы Ktt Itt

.ndTII >30 10 - 0,5 7 . 7,3 а; 5

5,7 6 7,5

;tl >30 30 - 0,5 20 20 0

ловкые обозначения: - нет отличий;

"О" - диагностический Фрагмент отсутствуз?;

¡i/o - зге определяли;

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов.

Таблица б. Количество и положение зон гибридизации зондов с ¡Шк1111-рострицированиой риккетсиальной ДНК

Виды риккетсий

Зонды----:-----:-----

R.prowaze- R."typhi R.canada R.Bibiri- R.conorii R.akari R.tsutsu- C.burne- Крым 108

kii . ca ' gamuslvi tii

K-Bo Полоя K-BO Полок.K-BO Полож.К-во Полок.К-во Полож.К-во Полож.К-во Полож.К-во Полож.К-во Пол.

(тпн) (тпн) (тпн) (тпн) (ТПН) (тпн) (тпн) (тпн) (тпн)

РВИ11 1 4.0 2 3.1 1.5 2 2.3 1 .2 2 3.4 1.8 2 3.4 1.8 1 2.5 0 - 0 1 3.8

РВН13 1 4.0 1 3.7 2 1.7 0.6 1 4.В 11/0 - 1 5.2 0 - н/о 2 3.7 0.9

№264 1 2.4 2 1 .8 0.7 1 2.0 1 2.2 1 2.2 1 2.0 0 - 0 1 2.7

№7218 4 4.4 2.9 2.1 1.7 4 3.5 2.5 1.2 0.8 5 4.2 2.6 2.1 1.7 0.7 5 2.6 2.3 2.2 1.5 1.4 4 2.6 2.2 1.5 1 .4 3 3.3 2.7 1.8 0 - 0 5 2.7 2.2 2.0 1.5 1.4

Штаммы, использованные в исследовании: R.prowazekii - штамм Брейнль,

R.typhi - штамм Вильыингтон, R.canada - штамм 2678, R.Bibirica - штамм К-1, R.conorii ' - штамм М-1, R.akari - штамм М-3, Условные обозначения: н/о - не определяли, 0 - нет зоны гибридизации, тин - тыслчя пяп нуклйптилпп

выводи

1. Определены критерии типирования риккетсий группы сыпного • нфа и клещевой пятнистой лихорадки, основанные на полиморфизме труктуры ДНК, позволяющие определить вид к подгруппу штаммов, к эторой относится исследуемые объект.

2. Установлен электрофоретичэские профили рестрикцпогашх эагмэнтоз хромосомной ДНК риккетсий группы сыпного тифа it.prowasekii, R.typhi, R.canada) и группы клещевой пятнистой ли-эрадки (R.sibirica, R.conorii), имеющие гпдовыс и для .prowazekii, R.typhi, R.conorii - птаммовыэ особенности.

3. С помощью новых по дифференциально-диагоностичесзош воз-япгсстям зондсп на основе ДНК R.prowasekii установлена видоспеци-5чнссть в располсзенки зон гибридизации для риккетсий группы иного тифз (R.prowasekii, R.typhi, R.canada) и риккетсий группи гещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii, R.akari).

4. Выявлены рэзлггчия в структуре ДНК патогенных для человека •аммов R.prowazekii н впервые проведено объединение этих штаммов группы с учетом выявленных различий.

5. Впервые выявлена генетическая гетерогенность штаммов typhi. Установлено, что птаым американского происхождения стли-ется по рестрихцйогаши профилям ДНК от штаммов европейского оисхоэдения.

6. Установлено, что пирулентные штампы R.sibirica, изолиро-ккие в нозоареале клещевого рпккетсиоза Северней Азии, принад-кат к одному генотипу. .

7. Изучешше штаммы R.conorii различного географического прохождения характеризуются вырахеннкм полиморфизмом структуры ДНК.

8. С помощью предложенных генотипических критериев определен ei'ft для территории СНГ генотип риккетсий группы клещевой ш.т-зтой лихорадки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балаева Н.М., Гыдкина S.B., Артемьев М.К. Анализ ДНК ¡¡опатогекного штамма Е, его ревертанта и штамма Брейнль :kettsi.a prowazekii рестрикционными эндонуклеазами // Вопросы скетсиологии: Сб. научных трудов. - М., 1988. - С. 10-13.

2. Бадаева Н.Н., Артемьев М.И., Игнатович ' В.5., Лиходед -I., Рыдкина Е.Б. Дифференциация риккетсий различных видов мето-

! рестрикционного анализа хромосомной ДНК // Иммунологические препарата нового поколения и методы их контроля:

Сб. научных трудов НИКЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. - M., 1S38. - I 104-109.

3. Restriction endonuclease analysis of the DMA of Ricket sia prowasekii vaccine strain E and its revertant / Balaye' N.M., Rydkina E.B., Artemiev M.I., Ignatovich V.F. // Acta viro: - 1939. - V. 33, К 5. - P. 454-464.

4. Балаева H.H., Игнатович В.Ф., Артемьев M.И., Рыдкш •Е.Б., В.В. Дифференциация штаммов риккетсий Лровачека Mi тодом рестр.ищ'онного анчлиза ДгН // Тезисы XVII съезда Всесоып общества эпидемнол., микробиол. и иаразитол.им. К.И.Мечникова. Алма-Ата, 1989. - Т. 2. - С. 105-106.

5. Бчлаева Н.М., Игнатович В.Ф., Попов В.Л., Еремеева М.Е, Артемьев М.И., Рыдкина 2.Б. Развитие учения о патогенных рнккеч сиях - биологические и молекулярные характеристики // Риккетсии риккетсиозы: Сб. трудов поев. 100-летию П.Ф.Здродовского. - М, 1930. - С. 41-49.

6. Рыдкин2 Е.Б., Артемьев М.И., Балаева Н.М., Игнатович В.С Изучение генома риккетсий методом рестрикционного анализа ДНК / Яурн. иикробиол. - 1990. -ИЗ. - С. 85-89.

7. Рыдкина Е.Б., Демкин В.В. Исследование генома риккетсий использованием ДНК-проб // Бактериальные плазмиды: Тезисы доклг дов / Под ред. И.В.Домарадского. - Нальчик, 1990. - С. 9!'.

8. Artemiev M.I., Ignatovich V.F., Rydkina' Е.В., Lichode L.J., Balayeva N.M. Demkin V.V. Restriction Fragment Lenght Poly rrorphisn analysis of the DNA ol typhus group Rickettsiae // Act Virol., - 1991. - Si 35. - P. 526-530.

9. Demkin V., Rydkina E., Ignatovich V., Lichoded L.J. Genig V.A., Balayeva N.M. Use oi DNA probes .for difierentiatio oi Rickettsiae // Abs. 5th Eur Congress oi Clinical Microbiolog and Infectious Diseases - Oslo, Norway, 1991. - К 1109. - P. 85.

I/ л (fV — i/