Генетическая гетерогенность Borrelia spp. Западной Сибири

Фоменко, Наталия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическая гетерогенность Borrelia spp. Западной Сибири
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая гетерогенность Borrelia spp. Западной Сибири"

На правах рукописи

ФОМЕНКО Наталия Владимировна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ BORRELIA spp. ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

03.00.07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск-2008

003457899

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: академик РАН, доктор химических наук

профессор Власов Валентин Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор (Лимнологический институт

СО РАН) Беликов Сергей Иванович

доктор биологических наук, профессор (Новосибирский

государственный университет) Нетесов Сергей Викторович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « ¿Г »гШ г. в « ур » часов на заседании диссертационного ¿бвета Д бо 1.038.01 при ГУ «Научный центр медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН» по адресу: г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; почтовый адрес: 664025,г. Иркутск,а/я 539.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научный центр медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН»

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник В.М. Коган

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) - природно-очаговые трансмиссивные заболевания, занимающие по широте распространения и уровню заболеваемости значительное место среди природно-очаговых заболеваний. Возбудитель ИКБ - спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.), -передаются человеку клещами рода Ixodes (Korenberg E.I., 2002; Wang G., 1999). Помимо боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в клещах рода Ixodes выявлены боррелии Borrelia miyamotoi, генетически относимые к клещевым возвратным лихорадкам (КВЛ) (Fukunaga М., 1995). Встречаемость В. miyamotoi на территории России на сегодняшний день не изучена.

ИКБ протекают в острой, а чаще в хронической форме и проявляются в виде множественных органных повреждений (Aguero-Rosenfeld М., 2005; Воробьева Н.Н. 2000, 2003; Ананьева Л.П., 2000; Wilske В., 2003). Боррелиоз поддается терапии на ранней стадии заболевания, при переходе в хроническую стадию лечение становится более длительным и сложным, поэтому актуальной проблемой является своевременная диагностика этого заболевания (Ананьева Л.П., 2002; Wilske В. 2002; Dumler J., 2001). Вопрос о приемлемости метода ГТЦР для выявления ДНК в крови больных ИКБ не однозначен, все чаще говорится о возможности применения ПЦР для диагностики ИКБ (Рудакова С.А., 2007; Nowakowski J., 2001; Wilske В., 2002, 2003). Однако четкого представления о сроках и целесообразности применения данного метода нет.

Для идентификации боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. применяются лабораторные методы: фенотипические, серологические и молекулярно-генетические (Wang G., 1999; Wilske В., 2005; Ананьева Л.П, 2002; Steere А., 2004; Merljak Skocir L, 2007). Наиболее распространены серологические методы, основанные на определении антител к антигенам возбудителя, поэтому изучению поверхностных белков боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. уделяется особое внимание. У больных ИКБ наблюдаются отличия в реагировании антител с белками разных видов боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. (Casjens S, 1993). Вероятно, это связано с высокой вариабельностью иммунодоминантных белков, поэтому изучение структуры и свойств белков имеет большое значение для разработки эффективных средств диагностики и профилактики.

Анализ клиники ИКБ в различных регионах России указывает на преобладание неврологической симптоматики (Воробьёва Н.Н., 1998, 2000), в то же время принято считать, что вид Borrelia garinii связан с неврологическими проявлениями ИКБ (Liveris D, 2002). Однако в большинстве проводимых в настоящее время работ по изучению генетической гетерогенности и патогенных свойств В. garinii западносибирские штаммы не используются. Изучение в основном проводится с использованием штаммов, изолированных в Европе от клещей Ixodes ricinus. За рамками рассмотрения остается большая генетическая подгруппа вида В. garinii - NT29, переносимая только клещами Ixodes persulcatus (Korenberg E.I., 2002; Wang G., 1999).

Целью работы являлось изучение генетической гетерогенности спирохет рода Borrelia, переносимых клещами I. persulcatus в Западной Сибири.

В процессе исследования были поставлены следующие задачи:

• Выявить региональные особенности видового состава и встречаемости боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в клещах I. persulcatus и мелких млекопитающих, а также в крови больных иксодовыми клещевыми боррелиозами.

• Оценить выявляемость и генетическую гетерогенность боррелий вида

miyamotoi в клещах I persulcatus и мелких млекопитающих. Провести выявление В. miyamotoi в крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе.

• Провести молекулярно-генетический анализ генов, кодирующих иммунодоминантные белки Р83/100 и OspA. Оценить возможность определения видовой принадлежности боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. по последовательностям гена р83/100. Изучить возможные корреляции определения видовой принадлежности западносибирских изолятов по последовательностям генов р83/100 и ospA.

• Провести сравнительный анализ выявления ДНК и антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. у больных ИКБ, клещевым энцефалитом и с лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В ходе выполнения работы показано, что помимо широко распространенных видов В. garinii и В. afzelii, циркулирующих в клещах и мелких млекопитающих, детектируются боррелии с нетипичной структурой межгенного спейсера 5S-23S рРНК, относимые к виду В. garinii. Установлено, что возбудителями ИКБ в Новосибирской области являются виды В. garinii и В. afzelii, однако независимо от формы ИКБ у больных чаще выявляется В. garinii подгруппы NT29. Впервые определена последовательность гена р83/100 изолятов В. garinii подгруппы NT29. Обнаружена высокая гетерогенность гена р83/100 боррелий вида В. garinii, поэтому при использовании белка Р83/100 для диагностики необходимо учитывать иммунореактивные свойства белка. Для боррелий вида В. garinii показана высокая гетерогенность гена ospA, впервые показано наличие не только гомологичной рекомбинации, но и латерального переноса плазмиды 1р54 кодирующей белок OspA для западносибирских изолятов В. garinii. Впервые на территории Западной Сибири в I. persulcatus выявлены боррелии вида В. miyamotoi, относящиеся к группе клещевых возвратных лихорадок. В крови больных с острыми лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе не только детектирована ДНК В. miyamotoi, но также получены изоляты, не сохраняющие способность к дальнейшему росту при дальнейшей культивации. Показано, что на стадии раннего ИКБ до начала лечения метод ПЦР применим в комплексной диагностике ИКБ.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 12 статьях и 14 тезисах докладов, в том числе 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов докторских и кандидатских диссертаций, из них 3 международные. Результаты представлены на Российских и международных конференциях: "Актуальные вопросы современной медицины", Новосибирск, 2004; «Ежегодная научно-практическая конференция невропатологов и инфекционистов», Новосибирск, 2004; «Фундаментальные науки медицине», Новосибирск, 2005, 2006, 2008; «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке», Томск, 2006; IX International Jena Symposium on Tick-borne Diseases «Climate change and tick-borne diseases», Йена, Германия, 2007; Russian-Great Britain workshop of young scientists «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza», Новосибирск, 2007; «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», Иркутск, 2007; «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития», Алматы, Казахстан, 2008.

Основные положения, выносимые на защиту:

■ Структура популяции боррелий в природных очагах иксодовых клещевых боррелиозов Западной Сибири гетерогенна. Помимо широко распространенных видов высока вероятность выявления боррелий с нетипичной организацией генома как в переносчиках, так и в резервуарных хозяевах. В. garinii подгруппы NT29 - основной этиологический агент ИКБ в Западной Сибири.

■ Таежные клещи в Западной Сибири участвуют в поддержании циркуляции В. miyamocoi. В одном природном очаге возможна циркуляция не только боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., но и В. miyamotoi.

■ Гены иммунодоминантных белков р83/100 и ospA В. garinii Западной Сибири высоко гетерогенны. Группы, выделенные на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов р83/100 и ospA, соотносятся между собой.

■ Метод ПЦР, наряду с иммунологическими методами анализа, применим на ранней стадии диагностики ИКБ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 147 страницах, содержит 25 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 305 литературных источников, из которых 78 работы отечественных и 227 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выявление боррелий в образцах от клещей /. persulcatus, крови мелких млекопитающих и людей

В настоящей работе детекция ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.i. методом ПЦР проведена в 680 образцах голодных имаго таежных клещей, 258 образцах крови мелких млекопитающих и 601 образце крови людей, заболевших в результате присасывания клещей. Выявление ДНК В. burgdorferi s.l. проводили с использованием праймеров, соответствующих консервативным участкам генов 5S и 23S рРНК. Кроме того, проведено выделение боррелий от клещей I. persulcatus на среде BSK-H.

Определение видовой принадлежности боррелий, изолированных от клещей /. persulcatus, а также боррелий, ДНК которых была детектирована в образцах от клещей, крови мелких млекопитающих и людей, проведено на основании ПЦР-ПДРФ анализа и определения нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера. В случае, когда при анализе межгенного спейсера установить видовую принадлежность не удавалось, проводился анализ последовательностей генов 16S рРНК и ospA. Для 48 изолятов боррелий проведено определение и последующий анализ генов 16S рРНК, р83/100, ospA и межгенного спейсера 5S-23S рРНК. Для всех изолятов и образцов В. miyamotoi проведено определение генов 16S рРНК и рбб. Определенные последовательности депонированы в базе данных GenBank под номерами: DQ023308, AY862885-AY862890, AY741543-AY741547, AY603349-AY603351, AY583361, DQ016664-DQ016666, AY583360, AY643482, DQ916319-DQ916346, DQ479275-DQ479312, DQ469878-DQ469926, EF541175, EF54U74, EU635982-EU635999, EF488985-EF488992.

Выявление антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. проведено в РНИФ в образцах крови 468 больных с применением корпускулярного антигена, приготовленного из отечественного штамма 1р-21 вида В. afzelii (НИИЭМ им. Н.Ф.

Гамалеи РАМН). Диагностически значимыми с поливалентным коньюгатом считали титры, начиная с 1:80, для IgM - 1:20 и выше. Изучение иммунологических свойств антигенов боррелий видов В. burgdorferi s.s., В. afzelii и В. garinii проведено методом иммуноблот анализа с сыворотками крови больных ИКБ. Иммуноблот анализ проводили с использованием цельноклеточного лизата боррелий штаммов: В31 В. burgdorferi s.s., BgVir-1 В. garinii и 1р21 и Тот 3401 В. afzelii.

Изоляты и штаммы, использованные в работе, любезно предоставлены F. Cabello (New York Medical College, Valhalla, США), Э.И. Коренбергом (ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва), О.В. Строниным (НПО «Вирион», филиал ФГПУ НПО «Микроген», г. Томск), М.А Хаснатиновым и Г.А. Данчиновой (Институт микробиологии и эпидемиологии ГУ НЦ ВСНЦ СО РАМН, г. Иркутск).

Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l в крови больных, образцах от таежных клещей и крови мелких млекопитающих

ДНК выделяли из 3-5 мл плазмы крови, выявление ДНК боррелий проведено методом двухраундовой ПЦР. Максимальное количество положительных проб, выявлено с 14 по 21 день после присасывания клещей. ДНК-фрагменты, соответствующие межгенному спейсеру 5S-23S рРНК В. burgdorferi s.l., обнаружены в 63 образцах. ДНК боррелий детектирована как у больных с эритемной формой (ЭФ) ИКБ, так и у больных с подтвержденным диагнозом клещевой энцефалит (КЭ).

В образцах крови больных ЭФ ИКБ, ДНК боррелий детектирована в 35 пробах крови, что составило 25,2+3,7% случаев. У больных с серологически подтвержденным диагнозом КЭ, ДНК боррелий обнаружена в 11,4+3,1% случаях. В образцах крови больных, госпитализированных с подозрением на КЭ (лихорадка, факт присасывания клещей), у которых в ходе дальнейшего обследования диагноз не подтвердился, ДНК обнаружена в 3,7+1,1% случаях. В группе больных с хроническим течением боррелиоза ДНК в крови не детектирована.

Выявление и последующее молекулярное типирование ДНК боррелий в образцах от клещей проведено в те же годы, что и выявление ДНК в крови больных. Клещей I. persulcatus собирали в мае-июне на территории Новосибирской области (НСО), подавляющее большинство больных ИКБ и КЭ, чья кровь исследована в данной работе, были инфицированы в этих районах области. ДНК В. burgdorferi s.l. выявлена в 267 образцах таежных клещей. Процентное соотношение положительных проб за время исследования варьировало от 35,5% до 45,8% и в среднем составило 39,3+1,8%.

ДНК В. burgdorferi s.l. детектирована в 9,7+1,9% образцов крови мелких млекопитающих и выявлена преимущественно у зверьков родов Apodemus, Sorex и Myodes, значительно реже у зверьков родов Sicista и Microtus. Полученные результаты согласуются с данными по выявлению ДНК В. burgdorferi s.l. в тканях внутренних органов зверьков, отловленных на территории НСО (Ливанова H.H., 2003).

Изоляция боррелий от клещей /. persulcatus методом культивирования в искусственной среде

Для сравнения числа получаемых изолятов и положительных в ПЦР проб от клещей, одновременно проводилась изоляция и выявление ДНК боррелий от таежных клещей отловленных в Свердловской (СО) и Новосибирской областях. Для этого клещей делили пополам, одну часть использовали для детекции ДНК, другую для

изоляции боррелий. При изоляции боррелий от таежных клещей из НСО (306 клещей) на питательной среде ВБК-Н получено 60 первичных изолятов, однако только 35 из них сохранили способность к росту при последующих пересевах (табл. 1). От таежных клещей из СО (258 клещей) получено 17 первичных изолятов, 10 из которых сохранили способность к дальнейшему росту (табл. 1).

Таблица 1

Изоляция и выявление ДНК боррелий в образце от одного таежного клеща

Методы анализа Число положительных (%±mn)

Новосибирская область Свердловская область

ПЦР-положительные образцы, 16S рРНК 117 (38,2+2,8%) 52 (20,1+2,5%)

Из них В. burgdorferi s.l. 15S-23S рРНК) 110(35,9+2,7%) 48 (18,6+2,4%)

Другие 7 (2,3+0,8%) 4 (1,6+0,7%)

Первичные изоляты 60(19,6+2,3%) 17(6,6+1,5%)

Из них В. burgdorferi s.l. 56(18,3+2,2%) 16 (6,2+1,5%)

Другие 4 (1.3+0,6%) 1 (0,4+0,4%)

Стабильные изоляты 35(11,4+1,8%) 10(3,9+1,2%)

Из них В. burgdorferi s.l. 35 (11,4+1,8%) 10 (3,9+1,2%)

Другие - -

Для оценки соотношения доли боррелий, способных к росту на среде BSK-H по сравнению с числом, выявляемых методом ПЦР, было проведено одновременное выявление ДНК методом ПЦР с использованием родоспецифичных праймеров, направленных к гену 16S рРНК. Праймеры к гену 16S рРНК позволяют детектировать ДНК всех видов рода Borrelia, выявляемых в I. persulcatus. При исследовании образцов ДНК боррелий выявлена в 38,2+2,8% и 20,1+2,5% образцов из НСО и СО, соответственно. ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., выявлена в 35,9+2,7% и 18,6+2,4% образцов из НСО и СО, соответственно, что соответствует полученным ранее результатам по выявлению ДНК боррелий в таежных клещах в этих областях (Ливанова Н.Н., 2003,2005; Рябченко А.В, 2005).

Анализом первичных изолятов с праймерами, направленными к генам 5S и 23S рРНК, установлено, что 56 изолятов из НСО и 16 из СО являются В. burgdorferi s.l. (табл. 1). В тоже время, для 5 изолятов (4 из НСО и 1 - СО) не сохранивших способность к росту, подобный анализ дал отрицательные результаты (рис. 1).

Рис. 1. ПЦР-анализ ДНК 4 изолятов борелий, не сохранивших способность к росту.

Дорожки 1-5 ПЦР с праймерами, к гену 16S рРНК, ожидаемая длина фрагмента 1373 п.н. (1 - В. burgdorferi s.s. штамм В31, 2 - 5 изоляты). Дорожки б -10 ПЦР с праймерами, к генам 5S рРНК и 23 рРНК, ожидаемая длина фрагмента 256 п.н. (6-9 изоляты, 10 - В. burgdorferi s.s. В31). М - Hi-Lo™ DNA маркер, размеры фрагментов ДНК-маркера приведены справа.

Однако при микроскопии с предварительной окраской акридиновым-оранжевым во

1 2345М6789 10

: щ - ~ • »

14(1(1

100(1

75(1

500

4IXI

300

20(1

всех этих изолятах определялись спирохетоподобные клетки. Кроме того, при проведении ПЦР с использованием праймеров S1 и S4, направленных к гену 16S рРНК, были получены ПЦР фрагменты ожидаемой длинны (рис. 1).

Для установления видовой принадлежности 5 изолятов проведено определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК (1200 п.н.). Анализ последовательностей показал, что все они идентичны друг другу и соответствуют последовательности В. miyamotoi штамма FR64b, выделенного от Apodemus argenteus на острове Хоккайдо, Япония (Fukunaga М., 1996). В. miyamotoi - вид, генетически относимый к группе KBJI, был впервые изолирован от клещей I. persulcatus в Японии (Fukunaga М., 1995). Таким образом, впервые в таежных клещах из Новосибирской и Свердловской областей обнаружены В. miyamotoi, относимые к группе KBJI.

В связи с обнаружением В. miyamotoi в первичных изолятах и образцах от таежных клещей мы провели исследование, направленное на выявление этого вида боррелий в таежных клещах, крови мелких млекопитающих и клинических образцах собранных на территории НСО. Для дифференциального выявления В. miyamotoi выбраны праймеры, направленные к гену рбб и специфичные для боррелий группы КВЛ.

Выявление ДНК В. miyamotoi в образцах от таежных клещей и крови мелких млекопитающих

При проведении анализа с использованием родоспецифичных праймеров, направленных к гену 16S рРНК получено 212 положительных образцов таежных клещей, что составило 41,5% (табл. 2). Восемь из них были положительны с праймерами к гену рбб, что свидетельствует о присутствии в образце ДНК В. miyamotoi, 190 - с праймерами к генам 5S и 23S рРНК, что указывает на наличие ДНК В. burgdorferi s.l. Одновременно ДНК В. burgdorferi s.l. и В. miyamotoi были выявлены в 14 образцах.

Таблица 2

Частота выявления ДНК В. miyamotoi и боррелий комплекса В. burgdorferi s.l.

Источник выделения ДНК (число образцов) Число положительных образцов (%±га„)

Общее: В. miyamotoi В. miyamotoi + В. burgdorferi s.l. В. burgdorferi s.l.

/. persulcatus (511) 212 (41,5+2,2) 8 (1,6+0,5) 14 (2,7+0,7) 190 (37,2+2,1)

Мелкие млекопитающие (100) 12 (12,0+3,2) 7 (7,0+2,6) 1 (1,0+0,9) 4(4,0+1,9)

Кровь больных (174) 22 (12,6+3,3) 18(10,3+2,3) - 4 (2,3+1,3)

ДНК В. miyamotoi выявляется значительно реже, чем В. burgdorferi s. 1. Полученные результаты согласуются с результатами выявления В. miyamotoi в других иксодовых клещах и наиболее близки результатам, полученным при исследовании клещей I. ricinus, где выявление ДНК В. miyamotoi варьирует от 0,2 до 5%, тогда как ДНК В. burgdorferi s.l. - от 10 до 33% (Fraenkel С J., 2002; Richter D„ 2003).

В образцах крови мелких млекопитающих в семи случаях детектирована ДНК В. miyamotoi, в четырех - В. burgdorferi s.l. (табл. 2). Одновременно ДНК В. burgdorferi s.l. и В. miyamotoi обнаружена в одном образце крови обыкновенной бурозубки S. betulina. ДНК В. miyamotoi выявлена только у зверьков родов Microtus, Myodes и Sicista, что может быть объяснено малым числом проанализированных образцов. В

настоящее время данных о резервуарных хозяевах В. тгуатоШ мало; известно, что В. ппуатоШ изолирована из крови А. а^еМеив (Рикипа§а М., 1996). Для понимания взаимодействия В. тгуатоШ с резервуарными хозяевами - мелкими млекопитающими необходимы дальнейшие широкомасштабные экологические исследования.

Выявление ДНК и изоляция В. пиуатоШ из крови лихорадящих больных

Обнаружение В. т1уатоШ в таежных клещах ставит вопрос о возможном инфицировании людей. Хотя патогенные свойства В. т1уатою1 на сегодняшний день не изучены, детекция В. т1уато1о1 в /. регзикаШз дает основание предположить возможность попадания возбудителя человеку. Для проверки данного предположения проведено ретроспективное изучение 174 образцов ДНК крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе. Образцы были отобраны в соответствии с клинической картиной, наблюдавшейся у больного в момент взятия пробы крови (на пике лихорадки). Помимо анализа проб крови на присутствие ДНК В. т1уатоШ, из 96 образцов была проведена изоляция боррелий на среде ВБК-Н.

Выявление ДНК В. т1уатоШ в крови больных проведено методом однораундовой ПЦР с использованием праймеров, направленных к гену рбб. ПЦР-фрагменты соответствующей длины получены в 18 образцах крови (табл. 2). ДНК В. пйуатоШ выявлена в 6 пробах крови больных с диагнозом КЭ и в одном образце крови больного со смешанной формой заболевания - КЭ и ЭФ ИКБ. Остальным 11 больным были поставлены диагнозы, не связанные с последствиями присасывания клещей.

Анализ последовательностей фрагмента гена 16Б рРНК показал, что все они идентичны друг другу и соответствуют со 100% уровнем гомологии последовательности гена 16Э рРНК штамма РЯ64Ь В. пйуатоШ, изолированного в Японии. Проведение филогенетического анализа подтверждает близость полученных нами последовательностей В. т1уатоШ с ранее определенными (рис. 2).

-II-

. //

R.mtfimolol FR64I) 57Nsk Ш1

1053My

- B.aityamoMimi

I-£.0utf«rfDQ872186

"«T-B-knestari AYI6671S

[-------------------B.ptrsicaU41197

- B.coriactat MIIOIU

- B.htmstiU4X191 -B.turicat<uV42299

- B.parkeri AF307099 r-B-UsprnkaVim*

¡jl B-avcUurat 1142233 -B.burgdmfiri AE0007S3

Jr-i "Li

Рис. 2. Дендрограмма филогенетического сходства, построенная на основании фрагмента гена 16S рРНК (1200 п.н.) боррелий группы KBJI с использованием метода UPGMA. Определенные нами

последовательности приведены без номеров GenBank, 1053Му - образец крови красной полевки, 57Nsk -первичный изолят от таежного клеща, Del - образец крови больного.

-и-

0.015 "

Все полученные последовательности фрагмента гена рбб также идентичны и соответствуют последовательности гена рбб штамма РЯ64Ь В. т1уатоШ (уровень гомологии 100%).

Образцы крови (96), взятой на пике лихорадки у больных, госпитализированных в 2006 г., были использованы для выделения боррелий на искусственной среде BSK-H. Получено 3 первичных изолята В. miyamotoi, которые утратили способность к росту при последующих пересевах. Детекции ДНК В. miyamotoi в крови больных, с присасыванием клеща в анамнезе, может говорить о потенциальной патогенности данного вида боррелий. Однако для подтверждения патогенности В. miyamotoi необходимо проведение дальнейших исследований.

Установление видовой принадлежности боррелий комплекса В. burgdorferi s.L

Показано, что все образцы, представлены двумя видами - В. garinii и В. afzelii. Помимо часто встречаемых последовательностей, характерных для этих видов, получены изоляты с мало распространенными или ранее неизвестными генетическими вариантами последовательностей межгенного спейсера 5S-23S рРНК.

Вид В. garinii представлен двумя генетическими подгруппами - NT29 и 20047. Во всех исследованных образцах крови больных преимущественно детектирована ДНК В. garinii (74,6+5,5%), ДНК В. afzelii выявлена в 20,6+5,0% и в 4,8+2,7 отмечено одновременное присутствие ДНК обоих видов. ДНК В. garinii выявлена достоверно чаще (р<0,05) у больных с ЭФ ИКБ. В крови больных с проявлениями поражения ЦНС обнаружена ДНК В. garinii подгруппы NT29, как в случае моноинфекции ИКБ, так и в случае одновременного ИКБ и КЭ. В крови мелких млекопитающих помимо ДНК В. garinii и В. afzelii детектируется ДНК боррелий с нетипичной структурой межгенного спейсера (Rut-217, рис. 3). ДНК В. garinii подгруппы NT29 (48,0+9,9%) детектируется чаще, чем ДНК В. garinii подгруппы 20047 (24,0+8,5%) и В. afzelii (20,0±8,0%).

В. а. VS461 CltPPACCTTGAATTTATTTTfipiATGTTTATAT-------TATTTG----------------ААТ

В. а. NT28 CTfspÄCCTTGMTTTATTTTWpAT-TTTATAT-------TATTTG----------------ААТ

NOV115Q6 ClffiÄACCTTGAATTTATTTTiTAftATGTTTATAT-------TATTTG----------------ААТ

Tom 1103 СТ^ТМАСС^ЩАТТТАТТТТРЩАТСТТТАТАТ-------TATTTG----------------ААТ

B.g. Chyl3p CTfJÄACATTGATTTTATTTTTTA--------TAT-------TATTTG----------------ААТ

NOV7006 CTfTÄAACATTGATTTTATTTTTTA--------TAT-------TATTTG----------------AAT

Rut-217 crataACATTGATTTTATTTTTTA--------TAT-------TATTTG----------------AAT

B.g. NT29 CTJtSSACATTGATTTTATTTTTTATGTTTTTAGATGTTCATGTTTTTG----------------AM

B.g. 20047 CT»|§ACATTGATTTTATTTTTTATGTTTTTAGATGTTCATGTTTTTG----------------AAT

Nov3305 CTfM^CATTGATTTTATTTTTTATGTTTTTAGATGTTTATGTTTTTG----------------AAT

B.g. Z61592 CTftft&ACATTGATTTTATTTTTTATGTTTTTAGATGTTCATGTTTTTG----------------AAT

H220 CTfTMACATTGATTTTATTTTTTATGTTTTTAGATGTTCATGTTTTTG----------------AAT

Nov9906 CTE^ACATTGATTTTATTTTTTATGTTTTTAGATTTTCATGTTTTTAGATTTTCATGTTTT^®T

B.a. VS461 AAAACATTCAAATAATATAAAAAATAATATATATAT—TGACATGGAtrafeCAAAGATATATATTAT

B.a. NT28 GTTTTATjCSSlATMTATAAAAAATAATATATATAT—TGACATGGAttAijACAAAGATAT-TATTAT

NovllSOß GTTTTATTCAAATAATATAAAAAATAATATATATAT—TGACATGGAlffi&ftACAAAGATATATATTAT

Tom 1103 GTTTTATTCAAATAATATAAAAAATAATATATATAT—TGACATGGAftASACAAAGATATATATTAT

B.g. Chyl3p AAftACATTCAAA-AACATAAAAAATAAAATATATAT—TGACATGGATTSAACAAAGATATATATTAT

Nov7 006 AAAACATTCAAA-MCATAAAAAATAAAATATATAT-TGACATGGA^t^^CAAAGAT AT AT ATT AT

Rut-217 CT333|lACATTGATTTTATTTTTTA--------TAT-------TATTTG----------------AAT

B.g. NT29 GTT T ТАТ^ЩАТААТАТ AAAAAAT AAAAT AT AT AT—TGAC AT GGAj^SJUiACAAAGATATATAT TAT

B.g. 20047 GTTTTATTCAAATAATATAAAAAATAAAATATATAT--TGACATGGAjKriüiACAAAGATATATATTAT

NOV3305 GTTTTATTCAAATAATATAAAAAATAAAATATATATATTGACATGGMT&^iCAAAGATATATATTAT

B.g. 261592 GTTTTATTCGAATAATATAAAAAATAAAATATATATATTGACATGGAlnFAÄACAAAGATATATATTAT

H220 GTTTTATGCAAATAATATAAAAAA--AAATATATAT—TGACATGGAfcf&SACAAAGATATATATTAT

NOV9906 GTTTTAT|^gATAATATAAAAAATAAAATATATATATTGACATGGA|^|ACAAAGATATATATTAT

Рис. 3. Сравнение муклеотидных последовательностей фрагмента межгенного спейсера 5S-23S рРНК видов В. garinii и Ä afzelii.

В.а. - В. afzelii, B.g. - В. garinii. Жирным шрифтом отмечены последовательности, полученные в данной работе и инсерция AT. Жирным и подчеркнутым- GTTTT мотив, серым оттенены сайты узнавания эндонуклеазой рестрикции Msel.

Как и в ранее опубликованных работах, тесной связи определенного вида боррелий с определенным видом мелкого млекопитающего не наблюдалось (Нефедова В.В., 2005, 2007; Коренберг Э.И., 2002).

В образцах от клещей преимущественно детектирована ДНК В. garinii - в 66,1+3,5%, В. afzelii детектирована в 23,9+3,1%, в 5,2+1,6% выявлена ДНК обоих видов. Вид В. garinii представлен двумя генетическими подгруппами - NT29 и 20047, вид В. afzelii - VS461 и NT28. Распределение видов боррелий совпадает с ранее опубликованными данными по НСО (Ливанова H.H., 2001). ДНК боррелий с нетипичной структурой межгенного спейсера 5S-23S рРНК детектирована в 4,8+1,6% образцов.

Изоляцией боррелий от таежных клещей, отловленных в НСО, В. garinii выявлены в 48,6+8,4%, В. afzelii в 22,8+7,0%, в 14,3+5,9% случаях получены изоляты с нетипичной структурой межгенного спейсера 5S-23S рРНК. Установление видовой принадлежности изолятов боррелий, полученных от клещей I. persulcatus, отловленных в Свердловской и Томской областях, показало, что они представлены В. garinii и В. afzelii. Для изолятов из Монголии ранее было проведено установление видовой принадлежности на основании анализа фрагмента гена 16S рРНК (Хаснатинов М.А., 2004), однако определение групповой принадлежности (внутри видов) проведено не было. Показано, что монгольские изоляты В. garinii представлены генетическими подгруппами -NT29 и 20047, В. afzelii- VS461 hNT28.

Для В. garinii подгруппы 20047 выявлено два генетических варианта межгенного спейсера 5S-23S рРНК, отличающихся от последовательности типового штамма. Последовательность первого варианта отличалась от последовательности типового штамма В. garinii 20047 инсерцией двух нуклеотидов (ТА), в то время как во втором варианте обнаружена деления двух нуклеотидов (AT), данный вариант выявлен лишь в трех случаях (рис. 3). Анализ положения сайтов узнавания эндонуклеазой рестрикции Msel, как и филогенетический анализ позволяет отнести эти изоляты к В. garinii подгруппы 20047 (рис. 3,4).

4«Г

-н-

r—Nov7006, 14506, Rut217 В. garinii D67018 B.garintt Х85202 LNovI 05 Nov3305

B.gartnä AB007450 Nov9906 У... Nov-105

_B.lusüanilac X98228

_B.tanukü DG7023

_B.btssettU AJ224 338

1—B.burgdnrferi AE000783

-В.ШгШ D67022

-B.spielmanii AF102056

-B.valablana X98232

rNovl 1506 93] ,Novll05 тРВ.а/leUi AYS74639 B.mfyanwlol D45192

Рис. 4. Дендрограмма филогенетического сходства, построенная на основании фрагмента гена 16S рРНК боррелий комплекса В. burgdorferi $.). с использованием метода UPGMA. Определенные нами последовательности приведены без номеров GenBank

Последовательности межгенного спейсера, содержащие инсерцию, имеют высокий уровень гомологии 98,0-99,5% с последовательностями В. garinii штамма Z61592 (Z77177), изолированного от клешей /. ricinus в Германии и Ipv-5007 (AY772203), - /. pavlovskyi в Казахстане.

Для последовательностей межгенного спейсера 5S-23S рРНК изолятов В. afzelii также отмечены некоторые отличия от типовых последовательностей. В частности показано, что изоляты В. afzelii подгруппы NT28 не содержат сайтов узнавания (ТТАА) эндонуклеазой рестрикции Miel, расположенного непосредственно за GTTTT мотивом (рис. 3), а в некоторых случаях присутствует дополнительный сайт узнавания (ТТАА), который не имеет аналогов в ранее опубликованных последовательностях.

Помимо выше перечисленных генетических вариантов межгенного спейсера 5S-23 S рРНК выявлено два варианта, существенно отличающихся от последовательностей типовых штаммов. Первый генетический вариант, имеющий последовательность межгенного спейсера длинной 271 п.н., обнаружен в трех изолятах от клещей /. persulcatus. При проведении ПЦР-ПДРФ анализа для всех изолятов получен одинаковый набор фрагментов рестрикции - 108, 61, 50, 40, 12 п.н., не соответствующий типичному набору MseI фрагментов, получаемому для В. burgdorferi s.l. Последовательности Nov9906, UrI317 и ТошЮОЗ содержат инсерцию 16 п.н. относительно последовательностей штаммов В. garinii NT29 и В. garinii 20047 и 23 п.н. - с последовательностью В. afzelii VS461 (рис. 3). Данный генетический вариант не был ранее описан для боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. Анализ положения сайтов узнавания эндонуклеазой рестрикции Msel, предложенный D. Postic, также не позволяет соотнести данные изоляты с видами комплекса В. burgdorferi s.l. (Postic D, 1994).

Последовательность второго генетического варианта, имеющего длину 237 п.н., выявлена в четырех изолятах от клещей и в крови красной полевки М. rutilus (Rut-217). При проведении ПЦР-ПДРФ анализа для всех пяти образцов получен набор фрагментов рестрикции 108, 79, 50 п.н., который также не соответствует набору фрагментов, типичному для В. burgdorferi s.l. Сравнение этих пяти последовательностей с типовыми последовательностями межгенного спейсера 5S-23S рРНК позволило выявить делецию 8 п.н. по сравнению со штаммом В. afzelii VS461 и 15 п.н. - с В. garinii NT29 и В. garinii 20047 (рис. 3). Данные последовательности, гомологичны последовательности межгенного спейсера штамма В. garinii ChY13p (АВ007450), изолированному от 1. persulcatus в Китае (рис. 3,4) (Ishiguro F., 2005).

Определение последовательности фрагмента гена 16S рРНК (1294 п.н.) показало, что изоляты, содержащие и делецию, и инсерцию в последовательности межгенного спейсера 5S-23S рРНК, относятся к виду В. garinii и на филогенетическом дереве группируются вместе с последовательностями вида В. garinii (рис. 4).

Молекулярно-генетический анализ генов ospA и р83/100

Молекулярно-генетический анализ генов, кодирующих иммунодоминантные белки OspA и Р83/100, проведен для изолятов боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., выделенных от таежных клещей, отловленных в НСО и Томской области, а также в Монголии. В соответствии с регионом, в котором были отловлены клещи, каждому изоляту было присвоено следующее обозначение: Nov изоляты из НСО, Тот -Томской области и Mng- Монголии.

Ген от4 В данной работе определено 48 полных нуклеотидных последовательностей гена ospA, 22 - для изолятов В. afzelii и 26 - для В. garinii. Степень гомологии гена ospA исследованных изолятов варьировала от 83,1 до 100% внутри вида В. garinii и от 99,2 до 100% - внутри вида В. afzelii. Последовательности ospA гена В. garinii характеризуется как большим числом нуклеотидных замен, так и наличием делеций и инсерций.

Филогенетический анализ показал, что изоляты В. garinii образуют четыре хорошо различимые субкластера (индекс поддержки >95) (рис. 6). Первый субкластер (I), в который вошло 5 изолятов из Западной Сибири и 2 - из Монголии, в филогенетическом отношении весьма далек от других субкластеров, образуемых последовательностями вида В. garinii (рис. 5). Вместе с нашими изолятами в I субкластер попадают преимущественно штаммы, полученные в Хабаровском крае, Японии и Китае.

garnii Khab-2119 AY260462 Nov1006 1ov2005

B.garinii K24I AB007107 B.garinii JEM5 U93708 Mug 4702 Гот 5102,3803, Nov 14606 B.garinii JEM2 U93706 j, B.garmiiWtf AB007106 >: B.garinii Khab-24 AY339605 Mug 1602

> I

B.garinii Khab-448 AY260454 1 ^Tom 1003, Nov 9906 nr B.garimi Khab-560 AY260461 f~ Nov405

-B.garinii K269 AB007109 l TT

Tom 3101 Г I*

-B.garimi JEM6 U93 709

-B.garinii F5I8 AB00710I " \ B.garinii Khab-506 AY339611 Nov2006

BgVir-1 ^

-B.gainii T25 X80254 ]

Bgnhnii JHM4 AB(X>1041 I

Tom 1«05,7105 Г 111

B.garinii рВг X80256 I Nov 105 J

m I—B.garimi khab 616 AY502601 «Lpt-Toni 2903

1-Nov7006, 14505, 15506, 54306

)j B.garinii pBi X80257 nÄg®V™TROX65598 j Nov3305, Tom 3005 1 Tom 203, 303 L B.gaimii WABSou X85441 - B.garinii PHei X80251 cor B.garinii Khab-489 AY339609 'Tum 5

4iN

-¡S-P-B

> IV

Tom 5202

B.garinii DK29 X63412 B.garimi K48 X62624 B.garinii Goe2 X60300 n'lB.gurinii N34 Y10894

- B.garinii B29 M88764 J

- B.vatmiana VS116 AF095940

-B.mrdi Ya501 AB016975

-Rkisselii 25015 AF230516

_r B.btirgJorferi B-31 XI4407 ПB.hnruJ,irfL'ri 297 X85442

im* B.burgjwfm 297 X85442

- B.spielmanii Af 102057

rB.afiM VS46I Z29081

_I Nov 3005,11506, Tom 603,703 1503,2303

i»l Tom 3401, 2403, 2803,3703,4703, 5403 та1 B.ttfxlii XJ23 U78301

B.qfxlii Khab-625 AY502599 nliNovllOi, 12406, Mng 3602, Tom 1103, 1303 « Wng 702, 4302,6702, Tom 6303,2504

— Bjaponica HO 14 Y10863

-B.lmilaniiae PotiB2 YI0838

Рис. 5. Дендрограмма филогенетического сходства, построенная на основании полных нуклеотидных последовательностей гена ospA В. burgdorferi s.l. с использованием метода NJ.

Жирным шрифтом отмечены последовательности гена ospA, определенные в данной работе.

Изоляты, входящие во второй субкластер (II), также группируются с изолятами из Хабаровского края, Японии и Китая. Во II субкластер вошли шесть наших изолятов,

два из них, содержат инсерцию в последовательности межгенного спейсера 5S-23S рРНК. Третий субкластер (III) представлен наименьшим числом изолятов из Западной Сибири; в него вошли всего три исследуемых изолята, кроме того, в данный субкластер вошли изоляты из Японии и Европы. Четвертый субкластер (IV), наиболее многочисленный, образован изолятами из Европы, Хабаровского края и Западной Сибири, но в него не вошло ни одного изолята из Японии и Китая. В этот субкластер вошло 10 западносибирских изолятов, четыре из них, содержат делецию в последовательности межгенного спейсера 5S-23S рРНК. Уровень гомологии последовательностей гена ospA данных изолятов составил 100%.

Последовательности гена ospA вида В. afzelii не столь гетерогенны, как В. garinii', для 11 изолятов показана их полная идентичность. Для 9 последовательностей показано наличие двух нуклеотидных замен в позиции 114 и 150 п.н., однако лишь замена в позиции 114 приводит к аминокислотной замене. Изоляты В. afzelii из Западной Сибири группируются с изолятами из Хабаровского края и Китая (рис. 5).

Анализ полученных и известных ранее аминокислотных последовательностей белка OspA показал, что аминоконцевая часть белка является более консервативной чем карбоксиконцевая. Ранее было показано, что участки белка 85-103 а.о. и 229-248 а.о. важны для прикрепления боррелий к клеткам кишечника клеща (Pal U., 2000). При анализе наших последовательностей белка OspA на этих участках показано, что более вариабельным является участок 229-248 а.о., на котором лишь только 8 позиций оказались консервативными для всех проанализированных последовательностей.

Мы провели сравнение последовательностей белка OspA изолятов вида В. garinii, из Западной Сибири и Монголии, с последовательностью штамма ВЗ1. Для сравнения выбран регион 180-273 а.о., в котором локализованы ранее определенные антигенные детерминанты (Ding W., 2000; Jiang W„ 1994), Ранее были показаны отличия в реагировании антител с белком OspA боррелий видов В. afzelii и В. burgdorferi s.s., а также некоторых штаммов В. garinii. Анализ 19 вариантов последовательностей выявил наличие большого числа замен в местах локализации антигенных детерминант. Помимо замен, у 13 проанализированных последовательностей в позиции 209 наблюдается делеция I а.о. Для трех вариантов определена инсерция 1 а.о. в позиции 252. Большая часть обнаруженных замен приводит к изменению класса аминокислоты, в случае некоторых замен происходит смена заряда аминокислоты. Следовательно, можно предположить, что существуют отличия иммунологических свойств белка OspA этих изолятов.

Ген р83/100 К началу выполнения настоящей работы было определено лишь двенадцать полных нуклеотидных последовательности гена р83/100 В. burgdorferi s.l. (Rossler D., 1995). Среди исследованных изолятов не было ни одного, полученного от /. persulcatus, поддерживающих циркуляцию В. garinii подгруппы NT29. В данной работе определены 55 полных нуклеотидных последовательностей гена р83/100 трех патогенных видов В. burgdorferi s.l.: 31 последовательность для изолятов В. garinii, 23 - для В. afzelii и 1 - для В. burgdorferi s. s. Определение последовательности гена р83/100 для изолятов В. garinii подгруппы NT29 и В. garinii с нетипичной структурой межгенного спейсера проведено впервые; для этих групп проанализировано 12 и 6 последовательностей, соответственно.

Сравнение нуклеотидных последовательностей гена р83/100 с 12 ранее известными подтвердило, что 5-половина гена является консервативной, а З'-половина этого гена высоковариабельна и характеризуется не только большим числом

нуклеотидных замен, но и наличием делеций и инсерций. Для всех изолятов, отнесенных к В. afzelii, определена деления 90 п.н. в позициях 1272-1361 генар83/100 (относительно последовательности штамма ВЗ1 В. burgdorferi s. s.). Этим объясняется варьирование длины гена р83/100, которая составляет 1989 п.н. для вида В. afzelii', 2082 п.н. - для В. garinii и 2103 п.н. для В. burgdorferi s.s. Степень сходства нуклеотидных последовательностей между изолятами внутри вида В. burgdorferi s.s. составила 95,699,7% - для вида В. afzelii - 99,0-100% и вида В. garinii - 92,9-100%. Межвидовое сходство по гену р83/100 составило 82,9-90,6%, что значительно ниже, чем степень гомологии внутри наиболее гетерогенного по данному гену вида В. garinii.

Филогенетический анализ, проведенный с использованием последовательностей гена р83/100, подтвердил, что в соответствии с определенными ранее степенями сходства все исследованные последовательности разбиваются на три отдельных кластера, соответствующие видам комплекса В. burgdorferi s.l: В. garinii, В. afzelii и В. burgdorferi s.s. (рис. 6).

Кластер, образованный боррелиями вида В. garinii, распадается на два субкластера (рис. 6). Первый (I) представлен 16 известными ранее и полученными в данной работе штаммами и изолятами. 14 из них относятся к В. garinii подгруппы 20047, для двух - Goe2 и В29 - групповая принадлежность не определена. В I субкластер вошли четыре изолята, содержащие делецию в последовательности межгенного спейсера 5S-23S рРНК. Во второй субкластер (II) вошли как все рассмотренные нами последовательности В. garinii подгруппы NT29, так и последовательности трех изолятов В. garinii подгруппы 20047 (рис. 6). Это ранее известная последовательность штамма PBi, а также определенные в данной работе последовательности ТошЗЮ1 и Mng4702. Изоляты, содержащие инсерцию в последовательности межгенного спейсера, показали 100% уровень гомологии по последовательности гена р83/100 и оказались филогенетически близки изолятам В. garinii подгруппы NT29 и также вошли во II субкластер.

Для изучения возможности использования последовательности гена р83/100 при определении видовой и внутривидовой принадлежности боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., проведено сравнение с результатами, полученными при анализе нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера 5S-23S рРНК. Анализ полученных нами последовательностей гена р83/100 боррелий вида В. garinii показал наличие большого числа нуклеотидных замен (более 100), только 14 из которых позволяют соотнести представителей этого вида с подгруппами 20047 и NT29.

Кластер, образованный боррелиями вида В. afzelii, не столь гетерогенен, как кластер вида В. garinii (рис. 6). Это согласуется с более высокой степенью гомологии последовательности гена р83/100 вида В. afzelii. Вид В. burgdorferi s.s. образует отдельный кластер, однако говорить о выделении субкластеров не приходиться из-за малого числа проанализированных образцов.

На основании 55 нуклеотидных последовательностей гена р83/100 были выведены аминокислотные последовательности белка Р83/100. Длина белка составила 662 а.о. для вида В. afzelii, 693 а.о. - вида В. garinii и 700 а.о. - вида В. burgdorferi s. s. Сравнительный анализ выведенных аминокислотных последовательностей с известными выявил наличие RGD^g-сайта в позиции 146-148 а.о. Наличие RGD-сайта, локализованного в консервативной области и присутствующего во всех известных до настоящего момента последовательностях белка, позволяет предположить функциональную важность этого сайта. Поскольку RGD-сайт является сайтом

взаимодействия с лигандом - интегрином, предполагается участие белка Р83/100 в механизмах связывания через адгезию (Rossler D., 1995).

Tom 203,303 -v

Nov7006,54306,14506, 15506 Tom 1805,7105 Nov 3305, Tom 3005 В garinli TN X75212 B.garinii G25 AY583361 B.garini B29 U09214 > I

B.garinii K48 X69602

i-Nov 105

B.garinii N34 AY583360 ^ГЬ— Tom 2903 »— Tom 5202

B.garinii PBr X83557 B.garinii GOE2 X69604 B.garinii TRO X69604 B.garinii PBi X75213 Tom 4702 Tom 3101 Nov 1006 '" Nov 2005 1-29

Nov 405 тт

1-19 У II

Tom 1003, Nov9906 1-99 BeVir-1 Nov 2006 1-30

Tom 3803 Tom 1602 Tom 5102 Nov 14606

дг B.afzelii PKo X69803 B.afzvlii ВО X69601

Bj 1-20

Д41 Nov 1105, Tom 703,1503,2303,5403 fLMng670i

Tom 702,4302 Л- Mng 3602, Tom 1303,3703,4703 if Tom 603,2403 Г1- Tom 2803 Иг Nov 3005 «If Tom 3401 aV Tom 1103 «г Tom 2504

-B. burgdorferi sp. 25015 X70366

EB.burgdorferi s.s. PBre X81357 B.burgdorferi s.s. B31 АЕ00И74 - Burgdorferi s.s. 297 AY583359

Рис. 6. Дендрограмма филогенетического сходства, построенная на основании полных нуклеотндных последовательностей генар83/100.

Без номеров GenBank приведены последовательности генар83/100, определенные в данной

работе.

Анализ аминокислотных последовательностей белка Р83/100 показал, что наиболее гетерогенный участок локализован между 390-540 а.о. Ранее было установлено, что антигенные детерминанты локализованы в центральном гидрофильном районе белка, составляющем приблизительно 300 а.о. (позиции 250-550 а.о.) (Anda Р., 1994). Анализ 12 известных ранее и 55 определенных в данной работе последовательностей показал, что большая часть замен, приводящих к изменению класса аминокислоты для последовательностей видов В. garinii и В. afzelii, а также часть замен вида В. burgdorferi s.s. попадают в эту область. Следовательно, можно

предположить, что существуют отличия иммунологических свойств данного белка для разных видов комплекса ß. burgdorferi s.l.

Сравнительный анализ генов р83/100 и ospA

Сравнительный анализ последовательностей генов ospA и р83/100 проведен для 26 изолятов В. garinii из Западной Сибири и Монголии. Кроме того, для сравнения использованы последовательности 7 европейских штаммов боррелий В. garinii N34, К48, В29, Goe2, PBr, PBi, приведенных в GenBank. Как ранее говорилось, четкого соответствия кластеров, выделяемых для гена р83/100 с группами вида В. garinii, выделяемыми при анализе межгенного спейсера 5S-23S рРНК, не обнаружено. При сравнении кластеров, выделенных при анализе гена р83/100 с субкластерами, выделенными при анализе гена ospA, показано их совпадение

Построение дендрограмм филогенетического сходства гена ospA показало, что при использовании методов минимальной эволюции (МЕ) и максимальной парсимонии (МР) генерируются деревья, отличные от получаемых методами ближайшего соседа (NJ) и невзвешенных попарных средних (UPGMA). Использование метода МР позволяет получить вероятную картину действительного эволюционного процесса и определить как возможный латеральный перенос мобильных генетических элементов, так и участки гена, подвергшиеся гомологичной рекомбинации (Dykhuizen D., 1993, 2001; Grassly N., 1997). Для подтверждения наличия или отсутствия гомологичной рекомбинации проведен анализ дендрограмм как на основании полной нуклеотидной последовательности генов, так и последовательностей, соответствующих 5'- и 3'- половинам генов (рис. 7А, Б).

CNov7006,14506,15506,54306 Тот 2903

pBi

Тот 203,303

Nov 3305, Тот3005

Тот 5202

К48

N34

Güe2

В29

Тот 5102,3803, Nov 14606 BgVir-1 Nov 2006 Nov 405

Тот 1003, Nov9906

Тот 3101

Тот 1805,7105 pBr

Nov 105 А.

Тот 2903

Nov7006,14506,15506,54306

,-Тот 203,303

'-Nov 3305, Тот 3005

Тот 1003, Nov 99061

BgVir-I -

Wnv 7l)ilfi ■ Tom 3101 | Nov 405

Tom 5102,3803, Nov 14606 Mng 1602

У-ospA

Б.

Рис. 7. Сравнение деревьев соответствующих 5'- и 3'- половинам гена <мрЛ. А-5'-половина, Б - 3'- половина гена озрА.

При построении и сравнении деревьев, соответствующих 5'- и 3'- половинам гена р83/100, отличия в топологии не выявлено. Однако, при сравнении деревьев, соответствующих 5'- (1-534 п.н.) и 3'- (534-819 п.н.) половинам гена выявлены отличия в их топологии (рис. 7А, Б). Следует отметить, что топология дерева,

основанная на полной последовательности гена ospA, практически совпадает с топологией дерева, построенного на основании 3'- половины гена (рис. 7Б, 8А).

В основном отличия между деревьями, соответствующими 5'- и 3'- половинам гена ospA, касаются положения изолятов I и ÍI субкластера (рис. 5, 7А, Б). При построении дендрограммы филогенетического сходства методом NJ (рис. 5) показано, что изоляты Mng 1602, 4702, Tom 3803, 5102, Nov 14606, 1006 и 2005 входят в I субкластер, филогенетически отдаленный от остальных субкластеров. Сравнение положения последовательностей этих изолятов на деревьях, соответствующих 5'- и 3'-половинам гена ospA демонстрирует, что на дереве 3'- половины гена все семь последовательностей образуют отдельный кластер (рис. 7Б). Для изолятов BgVir-1, Tom 3101, 1003, Nov 9906, 405 и 2006, входящих во 11 субкластер, также отмечены различия в положении на рассматриваемых дендрограммах (рис 7А и Б).

Ранее при сравнении филогенетических деревьев, построенных на основании последовательностей р83/100 и ospA было показано, что для В. burgdorferi s.l. возможна, хотя и редко, передача плазмиды 1р54, кодирующей белок OspA (Dykhuizen D.E., 1993,). Это может быть связано с наличие у боррелий латерального переноса генов. Топология дерева, основанного на полной последовательности гена ospA, определяется вероятной гомологичной рекомбинацией (рис. 7А, Б, 8А), целесообразно проводить сравнение дерева, основанного на последовательности гена р83/100 с деревом, соответствующим 5'- половине гена ospA (рис. 7А, 8Б). Такое сравнение позволит оценить наличие латерального переноса плазмиды 1р54 без учета влияния рекомбинации (рис. 7А, 8Б).

_»-NOV7006,14506,15506,5430«

J I—1

>,-Tom 2903

1-Nov700í, 14506,15506,54306

¡>-Tom 203,303

1-Nov 3305, Tom 3005

шц-TRO

!Г~"-pBi

I-Tom 5202

B29 N34 Goe2 K48 BgVir-1 Nov 2006 Nov 405 Tom 3101

Tom 1003, Nov 9906 Mng 1602

Tom 5102,3803, Nov 14^ Mng 4702

sí

—

Tom 203, 303 Nov 3305 GOE2 K48 B»

Tom 1805 Nov 100 Nov 1005 Nov 405 Tom 1003 Mng 4702 Tom 3101 TRO PBi

a-1-99 BgVir-1

-N

p83/100

Nov 200 Tom 3803 Mng 1602

Tom 5102,3803, Nov 14606 Nov 146

-PBr

-Nov 105

j—N34 5—Tom 5202 -Tom 2903

Б.

Рис. 8. Дендрограммы филогенетического сходства построенные на основании последовательностей генов ospA ир83/100 В. garinii, методом MP.

А - ген ospA, Б - генр83/100.

Дендрограммы филогенетического сходства, построенные на основании последовательностей генар83/100 и 5'- половины гена ospA значительно различаются по топологии (рис. 7А, 8Б). Основные отличия в кластеризации отмечены для изолятов Mng 1602, 4702; Tom 3803, 5102; Nov 14606, 1006, 2005 и BgVir-1, Tom 3101, 1003, Nov 9906, 405, 2006, относящихся к I и И субкластерам гена ospA. Для изолятов,

входящих в III и IV субкластеры гена ospA, также показано изменение кластеризации на дендрограмме филогенетического сходства, построенной на основании последовательностей гена р83/100 (рис. 7 А, 8Б). Вероятно, в результате переноса линейной ллазмиды 1р54 кластеризация изолятов В. garinii изменилась, что привело к изменению топологии дерева, построенного на основании последовательностей гена ospA. Суммируя все вышесказанное можно сказать, что помимо латерального переноса линейной плазмиды на топологию дерева, образуемого на основании последовательностей гена ospA, влияет вероятная гомологичная рекомбинация, приводящая к замещению одного фрагмента гена другим. Данные изменения в основном касаются изолятов, образующих I и II субкластеры гена ospA. В эту группу попадают все изоляты В. garinii подгруппы NT29.

Выявление антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови людей, заболевших после присасывания таежных клещей

Выявление антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. проведено методами РНИФ и иммуноблот анализа. Все больные в зависимости от клинических проявлений были разделены на 5 групп (табл. 3). Группу I (100 человек) составили больные с ЭФ ИКБ, группу II (12) - с диагнозом КЭ и ЭФ ИКБ, III (96) - с серологически подтвержденным диагнозом КЭ. В Группу IV (232) вошли больные, госпитализированные с подозрением на КЭ (лихорадка, факт присасывания клещей в анамнезе), у которых в ходе дальнейшего обследования диагноз КЭ не подтвердился. В группу V (40 человек) -с подтвержденным диагнозом ИКБ с признаками поражения кожи, опорно-двигательного аппарата и периферической нервной системы. Противоборрелиозные антитела с диагностически значимыми титрами выявлены во всех рассмотренных группах (табл. 3).

Таблица 3

Выявление антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l._

Титры антител Группа/ абс. число (%±m„)

I II III IV V

отр 40 (40+2,2) 5(41,7+14,3) 55 (57,4+5,0) 139 (59,9+3,2) 3 (7,5+4,2)

£Ig 1:40 IgM 1:10 38 (38+4,9) 4(33,3+13,6) 25 (26,0+4,5) 37(15,9+2,4) 10 (25+6,8)

Iii 1:80 b\l 1:20 VUWM 2 (Ш-110,6) 10(10,4+3,1) 17(74-0 - 8(20+6 ,3)' "

Цк 1:160 ГвШ:20 3(3+1,7) 1 (8,3+7,9) 3f5 Ы.81 22 ('J.5-1.9> 9 (22,5+6,6(

stg I:32(j IgM 1:20 2(2+1,4) ' - 2(2 M.5) ; 13(5,6+1,5)- • 7(17,5+6,3)

• BB 1:640 IgM 1:2« 1 (1,0-1,0) 4(l.7±0,S> . 3(7,5+4,2)

Для изучения уровня антител к боррелиям обследована контрольная группа, состоявшая из 100 человек - жителей Новосибирской области, отрицавших факт присасывания клеща в последние 3-5 лет. Противоборрелиозные антитела в титре 1:40 определялись у 9% людей, не подвергавшихся нападению клеща, тогда как титры 1:80 выявлены только в 2% случаев. Следовательно, пограничный уровень определения антител находится между титрами 1:40 и 1 ;80.

Мы также провели выявление антител с применением корпускулярного антигена, приготовленного на основе штамма 1р-21 вида В. afzeШ, у 18 больных, в крови которых выявлена ДНК В. т1уатоШ. При использовании поливалентного коньюгата антитела с титрами 1:40 выявлены только в 6 случаях, в 12 случаях антитела не выявлены. Отсутствие диагностически значимых титров антител может быть объяснено несколькими причинами. Во-первых, ранними сроками после присасывания клеща, заболевание развилось на 5-14 сутки после присасывания клеща. Во-вторых,

генетической гетерогенностью В. afzelii и В. miyamotoi, что не позволяет эффективно выявлять антитела к В. miyamotoi.

Сравнение выявления ДНК боррелий и противоборрелиозных антител в крови больных с эритемной формой ИКБ

В настоящее время приемлемость метода ПЦР для выявления ДНК в крови больных ИКБ широко обсуждается (Рудакова С.А., 2007; Wilske В., 2005; Nowakowski J., 2001). Поскольку основным патогномоничным признаком ИКБ считается наличие эритемы, сравнение выявления ДНК боррелий и противоборрелиозных антител проведено на примере анализа результатов, полученных при обследовании больных 1 группы. Как говорилось выше, ДНК боррелий преимущественно выявлена в крови больных в первые 3-5 недель после присасывания клещей. Было показано, что с увеличением времени, прошедшего после присасывания клеща, количество проб, в которых детектируются антитела, увеличивается, а число проб, положительных в ПЦР, уменьшается. На пятой неделе после укуса число проб, в которых выявлена ДНК, достоверно меньше (р<0,05), чем число проб, в которых определены положительные титры антител.

Показано, что в 57,1+9,3% случаев, в которых детектирована ДНК, антитела не выявлены, а в 32,2+8,8% случаев антитела выявлены в титрах 1:40. Одновременно с ДНК боррелий диагностически значимые титры антител выявлены только в 10,7+5,8% случаев. В тоже время, в группе больных с ЭФ ИКБ, в крови которых ДНК боррелий не детектирована, диагностически значимые титры антител выявлены в 24,6+5,2% случаев. Таким образом, при выявлении ДНК боррелий определяемые титры антител ниже, чем у больных с той же формой ИКБ, у которых ДНК не выявлялась (рис. 9).

Рис. 9. Сравнение результатов выявления ДНК методом ПЦР и выявления антител методом рНИФ в образцах крови больных с эритемной формой ИКБ. 1 - группа, в которой получены положительные результаты в ПЦР, 2 -группа, вкоторой получены отрицательные результаты в ПЦР.

Анализ результатов, полученных для I группы, показал, что ДНК боррелий достоверно реже (р<0,05) выявляется в пробах с титрами антител 1:80 и выше при использовании поливалентного коньюгата. Подобная корреляция выявления ДНК В. burgdorferi s.l. методом ПЦР и определения противоборрелиозных антител IgG также показана в работах Кондрушика и Хмелевской с соавторами (Kondrusik М., 2007; Chmielewska J„ 2006).

Сравнение выявления противоборрелиозных антител в крови больных с ИКБ, КЭ и лихорадочными состояниями, развившимися после присасывания клещей

Статистически достоверного отличия между выявлением противоборрелиозных антител во II (58,3+14,2%) и III (42,6+5,1%) группах не выявлено, диагностически значимые титры антител в III группе выявлены в 16,7+3,8% (табл. 3). У больных IV группы антитела выявлены в 40,1+3,2% случаях, при этом пограничные титры антител 1:40 выявлены в 15,9+2,4% случаев, а диагностически значимые - в 24,2+2,8% (табл.

3). Достоверного отличия между выявлением пограничных титров антител в группах III и IV не выявлено, однако в этих двух группах отмечено отличие в выявлении диагностически значимых титров антител. Показано, что в IV группе, достоверно чаще (р<0,01) выявляются антитела в титрах 1:160 и выше, в то время как для больных III группы являются титры противоборрелиозных антител 1:80.

Ранее было показано, что развитие иммунного ответа на антигены ВКЭ и В. burgdorferi s.l. у больных со смешанной инфекцией отличается от иммунного ответа при моноинфекции КЭ или ИКБ. Мы провели сравнение выявления противоборрелиозных антител у больных I, III и IV групп (рис. 10).

Хотелось бы подчеркнуть, что во всех случаях кровь у больных была забрана в 12 день поступления в стационар, до начала проведения этиотропной терапии. Как видно из диаграммы, в трех группах значения титров противоборрелиозных антител отличаются (рис. 10). Так, при использовании поливалентного коньюгата, антитела с титрами 1:160 и выше у больных I группы выявлены в 5,0+2,8% случаев, у больных III группы - 6,2+2,5%, в то время как у больных IV группы антитела в таких титрах выявляются в 16,8+2,5% случаев. Помимо отличия в значениях титров антител в этих двух группах наблюдались отличия в протекании заболевания. У больных III и IV групп достоверно чаще (р<0,01) заболевание начиналось остро, с более выраженной интоксикацией и лихорадкой, чем у больных I группы. Кроме того, у больных IV группы, у которых обнаружены титры противоборрелиозных антител 1:80 и выше, температура тела была достоверно выше (р<0,001), чем у больных той же группы, у

которых антитела в крови не выявлены или выявлены в титрах 1:40.

Рис. 10. Частота выявления антител к белкам боррелий в крови больных с различными диагнозами.

зритемная форма ИКБ, Ц-КЭ, | - лихорадочные состояния и присасывание клеща в анамнезе.

40'

0 L

18. шЛ

отр

1:40 IgM 1:10

Tig 1:80 IgM 1:20

Титры антител

SIg 1:160 IgM 1:20 н выше

Иммуноблот анализ

Иммуноблот анализ показал наличие в сыворотках крови больных I и V групп ИКБ широкого спектра антител к белкам трех видов комплекса В. burgdorferi s.!. Наиболее полные спектры антител детектированы у больных V группы, только в этой группе у двоих больных обнаружены антитела, реагирующие со многими антигенами всех трех видов боррелий. В обеих группах нами в основном выявлены белки с молекулярной массой 35 - 66 кДа, наиболее часто детектировался белок с приблизительным молекулярным весом 39 кДа. Антитела к этому белку выявлены в 48-59% в I группе и в 93-95% в V группе. Низкомолекулярные белки с молекулярной массой менее 30 кДа выявлялись достаточно редко (10-20% сывороток). Наиболее гетерогенный спектр антител получен с применением штамма BgVir-1 В, garinii. При сравнении спектра реагирования сыворотки одного и того же больного с белками боррелий трех видов максимальное число прореагировавших белков наблюдалось при

использовании штамма В. garinii. Данные результаты могут быть объяснены большой генетической гетерогенностью иммунодоминантных белков вида В. garinii.

Антитела к белку с молекулярной массой 85 кДа обнаружены со всеми четырьмя штаммами, наиболее часто они выявлены при использовании штамма В. garinii. При использовании штаммов 1р21 и Тот 3401 антитела к высокомолекулярному белку выявлялись с одинаковой частотой. Сопоставление данных показало, что частота выявления антител к штамму В. burgdorferi s.s. В31 выше по сравнению с В. afzelii Ip21, что может быть обусловлено влиянием крупной делеции на иммунореактивные свойства белка Р83/100. Появление антител к высокомолекулярному белку регистрировалось, начиная со второй недели после присасывания клеща, на более поздних сроках наблюдалось повышение частоты их выявления.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что помимо широко распространенных генетических вариантов двух видов комплекса В. burgdorferi s.l. - В. garinii и В. afzelii на территории Западной Сибири циркулируют боррелии с нетипичной структурой межгенного спейсера 5S-23S рРНК. На основании анализа генов 16S рРНК и ospA они отнесены к виду В. garinii. Продемонстрировано, что виды В. garinii и В. afzelii - этиологические агенты иксодовых клещевых боррелиозов в Новосибирской области, при этом независимо от формы протекания заболевания В. garinii подгруппы NT29 выявлена достоверно чаще (р<0,05).

2. В таежных клещах, отловленных в Новосибирской и Свердловской областях, впервые выявлены боррелии группы клещевых возвратных лихорадок - В. miyamotoi. Анализ генов 16S рРНК и рбб показал, что западносибирские изоляты В. miyamotoi относятся к генетическому варианту, изолированному ранее в Японии. ДНК В. miyamotoi выявлена в крови больных, госпитализированных с острыми лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе. Впервые из крови больных получены первичные изоляты В. miyamotoi, которые при дальнейшем культивировании не сохраняли способность к росту.

3. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена р83/100 изолятов В. garinii подгруппы NT29. Показана возможность использования последовательности гена р83/100 для определения видовой принадлежности представителей трех патогенных видов комплекса В. burgdorferi s.l. Для вида В. garinii показана высокая гетерогенность генов р83/100 и ospA, установлено наличие корреляции между кластерами, выделенными для этих генов. Впервые продемонстрировано наличие не только гомологичной рекомбинации, но и латерального переноса плазмиды 1р54, кодирующей ген ospA для западносибирских изолятов вида В. garinii.

4. Показано, что на стадии раннего ИКБ метод ПЦР применим в комплексной диагностике заболевания наряду с иммунологическими методами анализа. Использование ПЦР для детекции ДНК в крови на поздних стадиях и при хроническом течении заболевания нецелесообразно. Показано, что на ранних сроках заболевания противоборрелиозные антитела в диагностически значимых титрах выявляются как у больных с диагнозом клещевой энцефалит, так и с острыми лихорадочными заболеваниями и не подтвердившимся КЭ, причем антитела с титрами 1:160 и выше достоверно чаще (р<0,01) выявляются у больных с лихорадочными заболеваниями.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Участие фоновых видов мелких млекопитающих в циркуляции боррелий в лесостепном Приобье / H.H. Ливанова, Н.В. Фоменко, А.К. Добротворский и др. // -Сибирский экологический журнал. - 2004. - №4. - С. 567-570.

2. Генетическая характеристика боррелий у различных видов иксодовых клещей в западной Сибири / С.А. Рудакова, A.A. Матущенко, Н.В. Фоменко и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - №2. - С. 227-230.

3. Молекулярно-генетический анализ инфекций, переносимых клещами, у больных Новосибирской области / Н.В. Фоменко. В.А. Pap, E.B. Романова и др. // Молекулярная медицина. - 2005. - №4. - С. 48-52.

4. Tick-borne pathogen detection, Western Siberia, Russia / V.A. Rar, N.V. Fomenko, A.K. Dobrotvorsky et al. // Emerging infection diseases. - 2005. - V. И. - P. 1117- 111 9.

5. Разнообразие Borrelia burgdorferi sensu lato в природных очагах Новосибирской области / Н.В. Фоменко. Е.В. Романова, Ю.Ю. Караваева и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2006 - №5. Приложение 1. - С. 93-98.

6. Детекция ДНК боррелий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato в крови больных иксодовыми клещевыми боррелиозами / Н.В. Фоменко. Е.В. Романова, О.В. Мельникова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №7. - С. 35-37.

7. Детекция ДНК спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, циркулирующих в Новосибирской области / Н.В. Фоменко. H.H. Ливанова, Е.В. Романова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2006. - №7. - С. 22-28.

8. Гетерогенность гена р83/100 боррелий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato / H.B. Фоменко. Ю.В. Сабитова, М.А. Хаснатинов и др. // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. - 2007. - №4. - С. 31-37.

9. Выявление антител к Borrelia burgdorferi sensu lato и Anaplasma phagocytophilum у больных госпитализированных с диагнозом клещевой энцефалит I Н.В. Фоменко, В.А. Pap, Т. И. Елихина и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - №3, Приложение 1. -С. 177-180.

10. Fomenko N.V. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato in natural foci of Novosibirsk region / N.V. Fomenko, N.N. Livanova, N.Y. Chernousova // International Journal of Medical Microbiology. -2008. -V. 298. Supplement I. - P. 139-148.

11. Molecular-genetic analysis of tick-transmitted pathogens revealed in patients of Novosibirsk region, Russia / S.E. Tkachev, N.V. Fomenko, V.A. Rar et al. // International Journal of Medical Microbiology. - 2008. - V. 298. Supplement l.-P. 365-367.

12. Выявление антител к боррелиям комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato / H.B. Фоменко, O.B. Мельникова, Н.Я. Черноусова и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - №7, Приложение 1. - С. 78-84.

Изд. лиц. ИД №04060 от 20.02.2001 Подписано к печати и в свет 16.10.2008 Формат бумаги 60x84/16. БумагаХ» 1. Гарнитура "Times New Roman". Печать оперативная. Печ. л. 1,2. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 120. Заказ № 162 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН. Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фоменко, Наталия Владимировна

-Введение

1. Актуальные аспекты изучения иксодовых и аргасовых клещевых боррелиозов; проблемы лабораторной диагностики (обзор литературы)

1.1 Боррелии

1.1.1 Таксономия

1.1.2 Морфология

1.1.3 Организация генома

1.1.4 Белки OspA и Р83/100 боррелий комплекса В. burgdorferi s.l.

1.2 Экология и эпидемиология

1.2.1 Экология боррелий переносимых клещами

1.2.2 Эпидемиология

1.3 Молекулярные механизмы патогенеза

1.4 Патогенез

1.4.1 Иксодовые клещевые боррелиозы

1.4.2 Аргасовые клещевые боррелиозы

1.5 Диагностика боррелиозов

1.5.1 Прямые методы

1.5.2 Серологические методы

2. Экспериментальная часть (материалы и методы)

2.1 Реактивы и материалы

2.1.1 Реактивы

2.1.2 Синтетические олигонуклеотиды

2.1.3 Буферы и основные растворы

2.1.4 Бактериальные штаммы и коньюгаты

2.1.5 Образцы крови больных

2.1.6 Клещи I. persulcatus и образцы крови мелких млекопитающих

2.1.7 Базы данных и программы

2.2 Методы

2.2.1 Изоляция боррелий от таежных клещей на среде BSK-H

2.2.2 Изоляция боррелий на среде BSK-H из крови больных

2.2.3 Выделение нуклеиновых кислот из различных биологических источников

2.2.4 Амплификация фрагментов ДНК

2.2.5 Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции ПЦР фрагментов (ПДФР)

2.2.6 Подготовка ПЦР-фрагментов для проведения определения нуклеотидных последовательностей

2.2.7 Очистка продуктов реакции секвенирования ДНК

2.2.8 Определение нуклеотидных последовательностей

2.2.9 Филогенетический анализ

2.2.10 Денатурирующий электрофорез белков в SDS-ПААГ

2.2.11 Иммуноблот анализ

2.2.12 Выявление антител в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ)

2.2.13 Статистический анализ

3. Результаты и обсуждение

3.1 Выявление боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в образцах от клещей

I. persulcatus, крови мелких млекопитающих и людей

3.1.1 Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе

3.1.2 Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови мелких млекопитающих

3.1.3 Выявление ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в образцах от клещей I. persulcatus

3.1.4 Изоляция боррелий от клещей I. persulcatus методом культивирования в искусственной среде

3.2 Выявление ДНК В. miyamotoi в образцах из Новосибирской области

3.2.1 Выявление ДНК В. miyamotoi в образцах от клещей I. persulcatus и крови мелких млекопитающих

3.2.2 Выявление ДНК В. miyamotoi в крови лихорадящих больных

3.2.3 Изоляция боррелий из крови лихорадящих больных

3.2.4 Анализ нуклеотидных последовательностей В. miyamotoi

3.3 Установление видовой принадлежности боррелий комплекса

В. burgdorferi s.l.

3.3.1 В. burgdorferi s.l. с типичной последовательностью межгенного спейсера

3.3.2 В, burgdorferi s.l. с нетипичной последовательностью межгенного спейсера

3.4 Молекулярно-генетический анализ генов, кодирующих иммунодоминантные белки OspA и Р83/

3.4.1 Молекулярно-генетический анализ гена ospA

3.4.2 Молекулярно-генетический анализ генар83/

3.5 Сравнительный анализ генов р83/100 и ospA

3.6 Выявление антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в крови людей, заболевших после присасывания клещей

3.6.1 Сравнение выявления ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. и противоборрелиозных антител в крови больных с эритемной формой ИКБ

3.6.2 Сравнение выявления противоборрелиозных антител в крови больных с КЭ и лихорадочными состояниями, развившимися после присасывания клещей!

3.6.3 Иммуноблот анализ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая гетерогенность Borrelia spp. Западной Сибири"

Иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) - природно-очаговые трансмиссивные заболевания, занимающие по широте распространения и уровню заболеваемости значительное место среди природно-очаговых инфекций [35, 34]. Сибирский федеральный округ (СФО) занимает третье место по заболеваемости ИКБ среди регионов России, уступая Уральскому и Северо-Западному федеральным округам. С 1992 по 2004 гг. среднегодовой показатель заболеваемости в СФО составил 10,08 на 100 тысяч населения, Новосибирская область занимает пятое место по заболеваемости ИКБ в СФО [63].

Возбудители ИКБ — спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.), -передаются человеку клещами рода Ixodes [203, 224]. Помимо боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в клещах рода Ixodes выявлены боррелии Borrelia miyamotoi, генетически относимые к клещевым возвратным лихорадкам [166]. Встречаемость В. miyamotoi на территории России на сегодняшний день пе изучена. Клещи рода Ixodes являются основными переносчиками не только боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., но также и вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Ареалы распространения ИКБ и клещевого энцефалита в значительной степени совпадают, что обуславливает развитие смешанной инфекции, которая в Новосибирской области выявляется в 13,5% от общего числа заболевших клещевым энцефалитом [21].

ИКБ протекают в острой, а чаще в хронической форме, и представляют серьезную опасность для здоровья человека, поскольку проявляются в виде множественных органных повреждений [1, 6-8, 144, 224, 301]. Боррелиоз поддается терапии антибиотиками на ранней стадии заболевания, при переходе в хроническую стадию лечение становится более длительным и сложным, поэтому актуальной проблемой является своевременная диагностика этого заболевания [1, 23, 68, 152, 303].

Наличие мигрирующей эритемы при ИКБ является достаточным критерием для постановки диагноза, диагностика безэритемных форм зачастую затруднена. Данные о сроках формирования иммунного ответа и о динамике титра противоборрелиозных антител противоречивы. До настоящего времени в литературе обсуждается вопрос о том, когда в крови больных при различных формах ИКБ выявляются диагностически значимые титры антител. Вопрос о приемлемости метода ПЦР для выявления ДНК в крови больных ИКБ не однозначен, все чаще говориться о возможности применения ПЦР для диагностики ИКБ [63, 205, 249, 303]. Однако четкого представления о сроках и целесообразности применения данного метода нет.

Для идентификации боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. применяются лабораторные методы: фенотипические, серологические и молекулярно-генетические [23, 29, 122, 196, 205, 224, 249, 271, 301, 302]. Наиболее распространены серологические методы, основанные на определении антител к антигенам возбудителя, поэтому изучению поверхностных белков боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. уделяется особое внимание. У больных ИКБ наблюдаются отличия в реагировании сывороточных антител с белками разных видов боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. [110]. В связи с такой высокой вариабельностью изучение структуры и свойств иммунодомипантных белков имеет большое значение для разработки эффективных средств, как диагностики, так и вакцинопро фил актики.

Анализ клиники ИКБ в различных регионах России указывает на преобладание неврологической симптоматики [6, 7], в тоже время принято считать, что вид Borrelia garinii связан с неврологическими проявлениями ИКБ [249]. Однако в большинстве проводимых в настоящее время работ по изучению генетической гетерогенности и патогенных свойств В. garinii западносибирские штаммы не используются. Изучение В. garinii в основном проводится с использованием штаммов, изолированных в Европе от клещей I. ricinus и больных заболевших ИКБ, в результате присасывания клещей I. ricinus. За рамками рассмотрения остается большая генетическая подгруппа вида В. garinii — NT29, переносимая только клещами Ixodespersulcatus [203, 213, 224].

Таким образом, большое значение имеет изучение региональных особенностей видового состава, генетической гетерогенности, структуры и свойств иммунодоминантных белков видов боррелий, циркулирующих на данной территории, и принимающих участие в патогенезе.

Целью работы являлось изучение генетической гетерогенности спирохет рода Borrelia, переносимых клещами Ixodespersulcatiis Западной Сибири. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи.

1. Выявить региональные особенности видового состава и встречаемости боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в клещах I. persulcatus и мелких млекопитающих, а также в крови больных иксодовыми клещевыми боррелиозами.

2. Оценить выявляемость и генетическую гетерогенность боррелий вида В. miyamotoi в клещах I. persulcatus и мелких млекопитающих. Провести выявление В. miyamotoi в крови больных, госпитализированных с признаками инфекционных заболеваний и присасыванием клещей в анамнезе.

3. Провести молекулярно-генетический анализ генов, кодирующих иммунодомннантные белки Р83/100 и OspA. Оценить возможность определения видовой принадлежности боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. по последовательностям гена р83/100. Изучить возможные корреляции определения видовой принадлежности западносибирских изолятов по последовательностям генов р83/100 и ospA.

4. Провести сравнительный анализ выявления ДНК и антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. у больных иксодовыми клещевыми боррелиозами, клещевым энцефалитом и с лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе.

Публикации и апробация работы. Материалам диссертации опубликованы в 12 статьях н 14 тезисах докладов. Результаты работы представлены на Российских и международных конференциях: «Ежегодная научно-практическая конференция невропатологов и инфекционистов», Новосибирск, 2004; "'Актуальные вопросы современной медицины", Новосибирск, 2004; «Фундаментальные науки медицине», Новосибирск, 2005, 2006, 2008; «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке», Томск, 2006; IX International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (formerly IPS) «Climate change and tick-borne diseases». Йена, Германия, 2007; Russian-Great Britain workshop of young scientists «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza», Новосибирск, 2007; «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», Иркутск, 2007; «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновацнонного развития», Алматы, Казахстан, 2008.

Основные положения, выносимые на защиту:

Структура популяции боррелий в природных очагах иксодовых клещевых боррелиозов Западной Сибири гетерогенна. Помимо широко распространенных видов высока вероятность выявления боррелий с нетипичной организацией генома как в переносчиках, так и в резервуарных хозяевах. В. garinii подгруппы NT29 - основной этиологический агент ИКБ в Западной Сибири.

Таежные клещи в Западной Сибири участвуют в поддержании циркуляции В. miyamotoi. В одном природном очаге возможна циркуляция не только боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., но и В. miyamotoi.

Гены иммунодоминантных белков Р83/100 и OspA В. garinii Западной Сибири высоко гетерогенны. Группы, выделенные на основании анализа нуклеотидных последовательностей геновр83/100 и ospA, соотносятся между собой.

Метод ПЦР, наряду с иммунологическими методами анализа, применим на ранней стадии диагностики ИКБ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 147 страницах, содержит 25 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 305 литературных источников

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Фоменко, Наталия Владимировна

выводы

2. В таежных клещах, отловленных в Новосибирской и Свердловской областях, впервые выявлены боррелии группы клещевых возвратных лихорадок — В. miyamotoi. Анализ генов 16S рРНК и рбб показал, что западносибирские изоляты В. miyamotoi относятся к генетическому варианту, изолированному ранее в Японии. ДНК В. miyamotoi выявлена в крови больных, госпитализированных с острыми лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе. Впервые из крови больных получены первичные изоляты В. miyamotoi, которые при дальнейшем культивировании не сохраняли способность к росту.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа является комплексным исследованием выявления спирохет рода Borrelia в клещах Ixodes persidcatus, крови мелких млекопитающих и людей, пострадавших в результате присасывания таежных клещей. Существенно дополнены представления о структуре популяций боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. в очагах иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) в Новосибирской области. Показано, что наряду с часто встречаемыми генетическими вариантами В. garinii и В. afzelii на данной территории циркулируют боррелии с мало распространенными или ранее неизвестными генетическими вариантами последовательностей межгенного спейсера 5S-23 S рРНК. Нами установлено, что возбудителями иксодовых клещевых боррелиозов в Новосибирской области являются виды В. garinii и В. afzelii, однако независимо от формы ИКБ у больных достоверно чаще (р<0,05) выявляется В. garinii подгруппы NT29.

Установление видовой принадлежности 78 изолятов боррелий, полученных от клещей I. persulcatus, отловленных в Свердловской, Новосибирской, Томской области, а также Селенгинском аймаке (Монголия) показало, что от таежных клещей отловленных на всех рассмотренных территориях изоляцией на среде BSK-H, выявляются боррелии двух видов: В. garinii и В. afzelii. Вид В. garinii представлен двумя генетическими подгруппами: NT29 и 20047, вид В. afzelii также представлен двумя подгруппами: VS461 и NT28. На основании анализа генов 16S рРНК и ospA установлена видовая принадлежность изолятов с нетипичной структурой межгенного спейсера 5S-23S рРНК, все они отнесены к виду В. garinii.

К началу выполнения настоящей работы было определено лишь двенадцать полных нуклеотидных последовательности гена р83/100 для изолятов боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., полученных от I. ricinus и I. scapularis. В данной работе определено 55 полных нуклеотидных последовательностей генар83/100 трех патогенных видов комплекса В. burgdorferi s.l. Определение последовательности гена р83/100 для изолятов В. garinii подгруппы NT29 и В. garinii с нетипичной структурой межгеиного спейсера 5S-23S рРНК проведено впервые. Результаты сравнительного и филогенетического анализов подтвердили возможность использования гена р83/100 для определения видовой принадлежности представителей трех патогенных видов комплекса В. burgdorferi s.l. Анализ последовательностей боррелий вида В. garinii подтвердил гетерогенность гена р83/100 и выделение групп внутри вида, однако полного соответствия с группами, выделяемыми при анализе межгенного спейсера 5S-23S рРНК, не обнаружено. Для нуклеотидных последовательностей представителей вида В. afzelii отмечена высокая степень гомологии. Поскольку наиболее вариабельный участок кодирует область белка, включающую антигенные детерминанты, при использовании белка Р83/100 в диагностических целях необходимо учитывать возможные отличия его иммунореактивных свойств. Данные, полученные в этой работе, могут быть использованы для получения рекомбинантных белков Р83/100, применимых для средств диагностики и вакцинопрофилактики ИКБ.

В ходе исследования направленного на изучение генетической гетерогенности поверхностных иммунодоминантных белков боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., проведено определение и анализ 48 полных нуклеотидных последовательностей гена ospA западносибирских изолятов. Показано, что западносибирские изоляты В. garinii отличаются большой генетической гетерогенностью гена ospA. Основные различия рассмотренных генетических вариантов гена ospA выявлены на участках, кодирующих антигенные детерминанты белка OspA. Белок OspA является основным поверхностным белком боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., его используют для создания вакцины против боррелиоза [92]. Ранее говорилось о том, что иммунизация белком OspA одного штамма не предохраняет от заражения гетерогенным штаммом боррелий [103]. Полученные результаты также подтверждают, что ни одна моноштаммовая вакцина не может обладать надежным защитным эффектом при столь выраженной гетерогенности популяции боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., циркулирующих на территории Западной Сибири.

Мы провели сравнительный анализ последовательностей генов ospA и р83/100 для 27 изолятов В. garinii из Западной Сибири и Монголии, для сравнения были использованы последовательности семи штаммов боррелий, приведенных в GenBank. Проведение сравнительного анализа кластеров, выделенных при анализе гена р83/100 с субкластерами, выделенными при анализе гена ospA, показано их совпадение (табл. 16). Изоляты, образующие I и II субкластеры гена ospA, попадают во второй кластер, выделенный при анализе гена р83/100, а изоляты III и IV субкластера - в первый. Мы применили ранее предложенный метод построения и сравнительного анализа дендрограмм филогенетического сходства не только на основании полной нуклеотидной последовательности генов, но и с использованием последовательностей, соответствующих 5'- и Зл- половин гена. Основываясь на полученных результатах, впервые продемонстрировано наличие не только гомологичной рекомбинации, но и латерального переноса плазмиды 1р54, кодирующей ген ospA. Одновременно гомологичная рекомбинация и перенос плазмиды присутствует у 48% западносибирских изолятов вида В. garinii. Выявление и анализ изменений, происходящих в результате мутаций, рекомбинаций и переноса генов, особенно важно в связи с потенциальной возможностью появления новых и модификации существующих антигенных детерминант.

В ходе настоящей работы было проведено выявление противоборрелиозных антител в крови больных пострадавших в результате присасывания таежных клещей, а также проведено сравнение выявления антител и ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. Противоборрелиозные антитела выявлены на ранних сроках заболевания как у больных с эритемной формой ИКБ, так и у больных с хроническим течением ИКБ, а также у больных с КЭ. Кроме того, антитела в диагностически значимых титрах выявлены у больных с лихорадочными состояниями. Мы провели сравнение выявления антител у больных с диагнозами эритемная форма ИКБ, КЭ и у больных с лихорадочными состояниями, которым не был поставлен диагноз, связанный с присасыванием клеща. В трех рассмотренных группах значения титров противоборрелиозных антител отличаются, антитела с титрами 1:160 и выше у больных с эритемной формой ИКБ выявлены в 5,0+2,8%, у больных с КЭ - в 6,2+2,5%, а у больных с лихорадочными состояниями — в 16,8+2,5% случаев. Показано, что в группе больных с лихорадочными состояниями, достоверно чаще (р<0,01) выявляются антитела в титрах 1:160 и выше, в то время как для больных с КЭ преобладающими являются титры антител 1:80.

Поскольку основным патогномоничным признаком ИКБ принято считать мигрирующую эритему, сравнение выявления ДНК боррелий и противоборрелиозных антител проведено на прпмере анализа результатов, полученных при обследовании больных с эритемной формой ИКБ. При сравнении результатов отмечено, что с увеличением времени, прошедшего после присасывания клеща, количество проб, в которых детектируются антитела, увеличивается, а число проб, положительных в ПЦР, уменьшается. На пятой неделе после укуса число проб, в которых выявлена ДНК, достоверно меньше (р<0,05), чем число проб, в которых определены положительные титры антител. Кроме того, показано, что ДНК боррелий достоверно реже (р<0,05) выявляется в пробах с титрами антител 1:80 и выше. Подобная корреляция выявления ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s.l. методом ПЦР и определения противоборрелиозных антител IgG также показана в работах Кондрушика и Хмелевской с соавторами [131, 220].

Таким образом, на стадии раннего ИКБ до начала лечения метод ПЦР применим в комплексной диагностике заболевания наряду с иммунологическими методами анализа. Использование метода ПЦР для детекции ДНК боррелий в крови на поздних стадиях и при хроническом течении заболевания нецелесообразно.

Особый интерес представляют исследования, направленные на выявление В. miyamotoi в клещах-переносчиках, мелких млекопитающих и у больных, пострадавших в результате присасывания таежных клещей. В данной работе впервые в клещах I. persulcatus, отловленных на территории Новосибирской и Свердловской областей, обнаружены боррелии В. miyamotoi, генетически относимые к группе клещевых возвратных лихорадок. Сравнительный анализ показал, что в таежных клещах ДНК В. miyamotoi выявляется значительно реже, чем ДНК боррелий комплекса В. burgdorferi s. 1. Полученные результаты согласуются с результатами выявления В. miyamotoi в других иксодовых клещах и наиболее близки результатам, полученным в Германии при исследовании клещей I. ricinus.

Обнаружение В. miyamotoi в таежных клещах ставит вопрос о возможном инфицировании людей. Хотя патогенные свойства В. miyamotoi на сегодняшний день не изучены, детекция данного вида в клещах I. persulcatus дает основание предположить возможность попадания возбудителя человеку. Исследования, направленные на выявление В. miyamotoi в крови больных с лихорадочными состояниями и присасыванием клещей в анамнезе позволили выявить ДНК в 10,3+2,3%, а в 3,1+1,8% случаях - первичные изоляты В. miyamotoi, не способные к дальнейшему росту. Детекция В. miyamotoi в крови больных, может говорить о потенциальной патогенности данного вида боррелий. Однако для подтверждения патогенности В. miyamotoi необходимо проведение широкомасштабных исследований.

Мы также провели выявление антител с применением корпускулярного антигена, приготовленного на основе штамма 1р-21 вида В. afzelii, у больных, в крови которых выявлена ДНК В. miyamotoi. При использовании поливалентного копыогата выявлены антитела с титрами 1:40 в 33,3+11,0% случаев. Отсутствие диагностически значимых титров антител может быть объяснено как ранними сроками после присасывания клеща, так и генетической гетерогенностью В. afzelii и В. miyamotoi. Таким образом, для изучения иммунного ответа В. miyamotoi необходимо использовать штаммы или изоляты В. miyamotoi.

Полученные результаты еще раз подтверждают, что для повышения чувствительности методов детекции антител к белкам боррелий комплекса В. burgdorferi s.I. целесообразно использовать штаммы, эпидемически значимые для данной территории. Проведенное исследование показало, что на изучаемой территории циркулируют два вида боррелий комплекса В. burgdorferi s.l., представленные не только несколькими генетическими группами, но и множеством генетических вариантов, отличающихся по набору иммунодоминантных белков. Основываясь на полученных результатах, можно сделать вывод, что необходимо разрабатывать и применять многокомпонентные диагностические средства, опираясь именно на генетическую гетерогенность иммунодоминантных белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фоменко, Наталия Владимировна, Новосибирск

1. Ананьева Л.П. Иксодовые клещевые боррелнозы (Лаймская болезнь). Экология, клиническая картина и этиология / Л.П. Ананьева // Тер. арх. — 2000. №5. — С.72-78.

2. Ананьева Л.П. Определение антиборрелиозных антител методом иммуноблоттинга при боррелиозе Лайма / Л.П. Ананьева, Е.Е. Студепцов, Э. Левин // Клин. лаб. диагп. 2002. - №6. - С. 45-47.

3. Ананьина Ю.В., Кореиберг Э.И. Вакцины против ИКБ: итоги исследования и перспективы создания / Ю.В. Ананьина, Э.И. Коренберг // Клещевые боррелиозы: Матер, науч.-практ. конф. Ижевск, 2002. С. 55-59.

4. Болезнь Лайма в Северо-Западном регионе России / Ю.В. Лобзин, B.C. Антонов, С.С. Козлов и др. // Журн. Инф. Патол. 1996. - №3. - С. 32-34.

5. Взаимоотношения компонентов паразитарных систем иксодовых клещевых боррелиозов на юге Западной Сибири / Н.Н. Ливанова, А.К. Добротворский, В.В. Панов и др. // Снб. экол. журнал. 2003. - №5. - С. 581-590.

6. Воробьёва Н.Н. Иксодовые клещевые боррелиозы / Н.Н. Воробьева // Росс. мед. журн. 2000. - №6. - С. 33-38.

7. Воробьева Н.Н. Клиника, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов / Н.Н. Воробьева-П.: Урал-Пресс, 1998. — 136 с.

8. Воробьева Н.Н. Клинические варианты иксодовых клещевых боррелиозов в остром периоде заболевания / II.H. Воробьева, О.Н. Сумливая // Мед. паразитол. — 2003. -№4. С. 3-7.

9. Выявление новых клинических форм клещевых инфекций в Красноярском крае / С.А. Шетекаури, И.А. Ольховский, Н.М. Марьина и др. // Неврол. журн. 2005. -№3. - С. 10-13.

10. Генетические варианты Borrelia afzelii одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов / И.А. Фадеева, В.В. Нефедова, Э.И. Коренберг и др. // Мол. ген. вирусол. - 2005. - №3. - С. 18-22.

11. Генетическая гетерогенность Borrelia garinii в природном очаге Среднего Урала / В.В. Нефедова, Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2007. -№3. С. 139-143.

12. Генетическая характеристика патогенных для человека боррелий, изолированных от клещей Ixodes trianguliceps Bir. и Ixodes pavlovskyi Pom. / В.В. Нефедова, Э.И. Коренберг, И.А. Фадеева и др. // Мед. паразитол. 2005. - №2. - С. 9-12.

13. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. М.: Изд-во МГУ, 1985.-376 с.

14. Дифференциальная экспресс-диагностика и экстренная специфическая профилактика трансмиссивных клещевых инфекций в городе Иркутске / И.В. Козлова, В.И. Злобин, М.М. Верхозипа и др. // Бюллет. сиб. мед. 2006. - №5 Приложение 1.-С. 154-160.

15. Заболеваемость клещевым возвратным тифом в Намангане / З.И. Абидов, И.С. Васильева, Н.Р. Рахимов и др. // Мед. паразитол. 1993. -№1. - С. 32-35.

16. Зараженность иксодовых клещей боррелнями в Челябинской области / В.Н. Тарасов Э.В. Ульянченко, О.Н. Кондрашова и др. // Мед. паразитол. 2000. - №4. - С. 48.

17. Зараженность клещей Ixodes persulcatus возбудителями болезни Лайма и клещевого энцефалита одновременно / Э.И. Коренберг, С.В. Щербаков, Г.Г. Баннова и др. // Паразитол. 1990. - №2. - С. 102-105.

18. Злобин В. И. Горин О. 3. Клещевой энцефалит: Этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири / В.И. Злобин, О. 3. Горин — Н.: Наука. Сиб. изд. Фирма РАН, 1996.- 177 с.

19. Избранные вопросы состояния клеточных факторов резистентности при клещевых природно-очаговых микст-инфекциях / Н.П. Пирогова, М.Р. Карпова, В.В. Новицкий и др. // Бюллет. сиб. мед. 2006. №5.Приложение 1. — С. 144-153.

20. Изоляция п генотипировапие Borrelia burgdorferi sensu lato из клещей в Республике Монголии / М.А. Хаснатипов, Г.А. Данчинова, С.И. Беликов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2004.-№1.- 197-201.

21. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит / А.П. Иерусалимский; Руководство для врачей. Н.: Гос. мед. акад. МЗ РФ, 2001. - 360 с.

22. Иммунологический гуморальный ответ у больных Лаймской болезнью / И.А. Скрипникова, Л.П. Ананьева, В.Г. Барскова и др. // Тер. арх. 1995. - №11. - С. 5356.

23. Клиника и течение безэритемной формы иксодовых клещевых боррелиозов / Н.Н. Воробьёва, Г.М. Волегова, А. Бурылов и др. // Мед. паразитол. 1995. - №3. - С. 12-15.

24. Клинико-лабораторная характеристика иксодового клещевого боррелиоза в Прибайкалье / Л.И. Черногор, Е.В. Арбатская, Г.А. Данчинова и др. // Журн. микробиол. эппдемиол. 2005. — №6. - С. 60-62.

25. Клинические варианты Лайм-боррелиоза в Кемеровской области / Л.Н. Кравчук, Э.И. Коренберг, М.И. Калинин и др. // Мед. паразитол. 1993. - № 1. - С. 29-31.

26. Клинические проявление Лайм-боррелиоза на Среднем Урале и их ассоциации с геновидами Borrelia burgdorferi / О.М. Лесняк, О.Ю. Истомина, Ш. Рипкема и др.// Тер. арх, 1997,-№5.-С. 9-12.

27. Клинические проявления и дифференциальный диагноз иксодовых клещевых боррелиозов / Л.В. Лукашова, А.В. Лепехин, Н.Г. Жукова и др. // Бюллет. сиб. мед — 2006. №5. Приложение 1. - С. 99-105.

28. Клинико-серологическое изучение болезни Лайма на Северо-Западе СССР / Л.П. Ананьева. Э.И. Коренберг, И.А. Скрипникова и др. // Мед. Паразитол. 1990. -№6. -С. 28-31.

29. Клиническая характеристика клещевого энцефалита при его сочетании с Лайм-боррелиозом / М.Л. Амосов, О.М. Лесняк, Р.Г. Образцова и др. // Вопросы вирусол. 2000.-№3,-С. 25-28.

30. Комплексная экстренная диагностика и специфическая профилактика природно-очаговых трансмиссивных клещевых инфекций в г. Иркутске / И.В. Козлова, М.М. Верхозина, М.А. Хаснатинов и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН 2004. - №1. -С. 134-139.

31. Колчанова Л.П. Спонтанная зараженность клещей боррелиями и степень их индивидуальной инфицированности в различных ландшафтных подзопах Тюменской области / Л.П. Колчанова// Мед. Паразитол. 1997. — №1. - С. 49-50.

32. Коренберг Э.И. Данные по распространению болезни Лайма в СССР / Э.И. Коренберг, С.В. Щербаков, В.Н. Крючечников // Мед. паразитол. — 1987. — №1. — С. 71-73.

33. Коренберг Э.И. Иксодовые клещевые боррелиозы как группа заболеваний человека и главные итога ее изучения в России / Э.И.Коренберг // Журнал инф. патол. — 1997.-№2-3.-С. 22-24.

34. Коренберг Э.И. Инфекции группы Лайм боррелиоза иксодовые клещевые боррелиозы в России / Э.И.Коренберг // Мед. паразитол. — 1996. - №3. - С. 14-18.

35. Коренберг Э.И. Микст-инфекции, передающиеся иксодовыми клещами: современное состояние проблемы / Э.И. Коренберг // Успехи, совр. биол. — 2003. -№5.-С. 455-486.

36. Коренберг Э. И. Насонова В.А. Методические указания по эпидемиологии, диагностике, клинике и профилактике болезни Лайма / Э. И. Коренберг, В.А. Насонова М.: Наука, 1991. - 84 с.

37. Коренберг Э.И. Основные черты природной очаговоеiи иксодовых клещевых боррелиозов России / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова, Ю.В. Ковалевский // Паразитол. -2002. -№3. С. 177-191.

38. Коренберг Э.И., Первые итоги и задачи изучения болезни Лайма в СССР / Э.И. Коренберг, В.Н. Крючечников, Ю.В. Ковалевский // Вестник АН СССР. — 1990. — №6.-С. 52-57.

39. Коренберг Э.И. Таксономия, филогенетические связи и области формообразования спирохет рода Borrelia, передающиеся иксодовыми клещами / Э.И. Коренберг // Успехи, совр. биол. 1996. - №116. - С. 389-406.

40. Лабораторная диагностика весеннее-летних инфекций в Екатеринбурге в эпидемический сезон клещевого энцефалита / В.Г. Мельников, Е.А. Андреева, Л.В. Власова и др.// Клин. лаб. дпагн. 1998. -№7. - С. 21-23.

41. Лесняк О.М. Лайм-боррелиоз / О.М. Лесняк Е.: Уральск, гос. мед. акад, 1999. -125 с.

42. Лесняк О.М. О классификации Лайм-боррелиоза (Лаймской болезни) / О.М. Лесняк, Е.С. Беликов // Тер. арх. 1995. -№11. - С. 49-51.

43. Мандракова Н.В. Некоторые аспекты иммунопатогенеза острых иксодовых боррелиозов в Приморском крае / Н.В. Мандракова, Е.А. Мадич // Дальнев. журн. инф. патол. 2007. - №11. - С. 90-97.

44. Матущенко А.А., Рудакова С.А. Природные очаги болезни Лайма в отдельных ландшафтных зонах Западной Сибири / А.А. Матущенко, С.А. Рудакова // Проблемы клещевых боррелиозов. М.: Наука, 1993. - С. 133-136.

45. Оберт А.С. Иксодовые клещевые боррелиозы (нозогеографические и медико-экологические аспекты) / А.С.Оберт, В.Н.Дроздов, С.А.Рудакова // Новосибирск.-Наука, 2001,- 110 с.

46. Оптимизация серологической диагностики Лайм-боррелиоза / В.В. Базарный, Корнкова М.Ю., Волкова Л.И. и др. // Клин. лаб. диагн. 2003. - №12. - С. 49-50.

47. Особенности поражения периферической нервной системы при Лайм-боррелиозе в эндемичном районе России / Н.С. Баранова, О.М. Лесняк, Р.Г.Образцова и др. // Терапевт. Архив. 1997. - №5. - С. 20-25.

48. Оценка возможностей лабораторной диагностики трансмиссивных заболеваний в Красноярском крае / С.А. Шетекаури, И.А. Ольховский, Н.М. Марьина и др. // Сиб. мед. журнал. 2004. - №5. - С. 33-36.

49. Первый случай гранулоцитарного эрлихиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации / Ю.Н. Сидельников, О.Ю. Медянников, Л.И. Иванов и др. // Клин, мед -2003,-№8.-С. 67-68.

50. Переносчики и возбудители трансмиссивных клещевых инфекций на юге Восточной Сибири и севере Монголии / Г.А. Данчинова, М.А. Хаснатинов, О.В. Сунцова и др. // Бюллетень ВСИЦ СО РАМН. 2004. - №1. - С. 107-112.

51. Плохинский Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский Н.: Сиб. отд. АН СССР, 1961. -364 с.

52. Полиморфизм клинических проявлений при болезни Лайма / Е.П. Деконенко, К.Г. Уманский, Л.В. Куприянова и др. // Клин, медицина. 1991. - №4. - С. 68-70.

53. Получение рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) ЗападноСибирских изолятов Borrelia garinii NT29 и исследование их иммунохимическихсвойств / B.C. Караваев, И.Д. Иванов, А.В. Рябченко и др. // Мол. генетика. 2008. — №1. — С. 18-22.

54. Покровский В.И., Лобан К.М. Руководство по инфекционным болезням / В.И. Покровский, К.М. Лобан. М.: Изд-во МГУ, 1986. - 211 с.

55. Различия в аминокислотной последовательности поверхностно-экспонированного белка Р66 у различных изолятов Borrelia afzelii / А.В. Морозов, Э.И. Коренберг, И. А. Фадеева и др. // Мол. Генетика. 2008. -№1. - С. 38-41.

56. Разнообразие паразитарных систем с участием мелких млекопитающих и Ixodes persulcatus Schuelze на Северном Урале / Н.Н. Ливанова, В.А. Рар, С.Г. Ливанов и др. // Сиб. экол. журн. 2005. - №6. - С. 1079-1084.

57. Резервуарные хозяева и переносчики боррелий-возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов в России / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова, Д. Постик и др. // Журн. микробиол. эпидемиол. 1997. - №6. - С. 36-38.

58. Роль мелких млекопитающих в циркуляции боррелий в природных очагах клещевого боррелиоза на Юго-Западе Сибири / А.А. Матущенко, B.C. Венедиктов, В.В. Якименко и др. // Журн. инф. патол. 1997. - №2-3. - С. 37-39.

59. Рудакова С.А. Новые данные о генотипировании возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов в Азиатской части России и Казахстане / С.А. Рудакова, Н.В. Рудаков, Н.К. Токаревич // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2002. - №4. - С. 99101.

60. Рудакова С.А. Иксодовые клещевые боррелиозы в сочетанных природных очагах трансмиссивных инфекций Западной Сибири: Автореф. дис. докт. мед. наук: 14.00.30 / НИИПИ Омск. 2007. - 40 с.

61. Рудакова С.А. Иксодовые клещевые боррелиозы в сочетанных природных очагах Западной Сибири / С.А. Рудакова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2007. - №3. - С. 151-155.

62. Скрипникова И.А. Результаты клинико-серологического обследования 60 пациентов с болезнью Лайма / Скрипникова И.А., Ананьева Л.П., Барскова В.Г. // Тер. Арх. 1992. - №5. С. - 93-98.

63. Семенов В.А. Клиническая характеристика смешанной энцефалитно-боррелцозной инфекции у взрослых в кемеровской области / В.А. Семенов // Вестник ВолГМУ. -2005.-№2.-С. 64-66.

64. Сравнительный анализ методов лабораторной диагностики болезни Лайма на ранней стадии инфекции / М.И. Курдина, Л.П. Ананьева, Л.А. Макаренко // Клин, лаб. диагн. 2003. - №4. С. 45-46.

65. Сравнительное изучение результатов серологической диагностики Лайм-боррелпоза в реакции непрямой иммунофлюоресценции и иммуноферментпом70.

Информация о работе

Фоменко, Наталия Владимировна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генетическая гетерогенность Borrelia spp. Западной Сибири - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы