Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Типирование риккетсии группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки на основании анализа полиморфизма хромосомной ДНК

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Типирование риккетсии группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки на основании анализа полиморфизма хромосомной ДНК"

российская академия медицинских наук

научно-исследователшшл ордена трудового красного знамени институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика

Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

РЫДКШ1А Елена Борисовна

типирование риккетсии группы сыпного тифа и клнцевол пятнистой лихорадки на оснований анализа полиморфизма хромосомной ши.

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в 1-ШЭМ им. почет, акад. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Н.М.БАДАЕВА.

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.Н.ПАУТОВ доктор медицинских наук Е.П.ЛУКИН

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

в "11_"ч9Сов на заседании Специализированного совета К 001.07.01 в научно-исследовательском институте эпидемиолонии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМИ (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18)

С диссертацией иокнс ознакомиться в библиотеке НИИЗМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится

1993 г.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е.И.КОПТЕЛОВА

Актуальность исследований,. направленных на решение вопросов идентификации и дифференциации риккетсий, определяется необходимостью совершенствования-методов контроля за риккетсиозами.

Инфекции, вызываемые риккетсиями, продолжают сохранять свое значение в инфекционной патологии человека. Среди них в силу потенциальной эпидемической опасности и зависимости от социальных условий центральное положение занимает эпидемический сыпной тиф. Вместе с этим начиная с 70-х годов, наблюдается активизация проявлений эндемических риккетсиозов, причины которой остаются невыясненным';. Практически одновременно увеличилась заболеваемость эндемическими риккетсиозами группы клещевой пятнистой лихорадки -пятнистой лихорадкой Скалистых гор в США, Средиземноморской лихорадкой - в Италии, Франции, Испании, Португалии. При этом, чаще отмечается атипичное, более тяжелое течение Средиземноморской лихорадки (Grcss et al., 1982: Mansueto et al., 1986; Otero et al., 1982; Wlsseman, 1983). Обнаружены очаги клещевых риккетсиозов з неизвестных для них ранее регионах, таких, как Япония, Израиль (Gross et al., 1982; Uchida et al., 1989). В начале.GO-X годов выявлен новый пр!гродный очаг клещевого риккетсиоза на территории России в Астраханской области (Балаева и Игнатович, 1989; Макарова и Тарасевяч, 1989). Возбудитель этого риккетсиоза, как установлено, серологически и генетически близок комплексу видов, родственных R.conorll (Drancourt et al., 1992). Наблюдается повышение заболеваемости и изменение локализации очаго» заболевания лихорадки цуцугамуш в Японии, а также смена штаммов циркулирующей популяции (Taraura, 1987).

Активизация проявлений эндемических риккетсиозов вновь вызвала интерес к их изучению. В связи с этим были начаты работы по выделению риккятснй в очагах клещевых.риккетсиозов. В результате выделен ряд штаммов, отличающихся по своим биологическим и серологическим свойствам от типовых. Таким образом проблема идентификации и дифференциации' риккетсий приобрела новое значение. Достижения современной молекулярной биологии способствовали развитию новой методологии типировашш риккетсий, основанной на изучении структуры генома. Этот подход, базирующийся на анализе полиморфизма длин рестрикциокных фрагментов (АГЩРФ) ДНК, включает такие методы, как рэстряхцисннкй анализ хромосомной и плаз-икдной ДНК, ДНК-зондирование и рестрикционный анализ продуктов амплификации с праймзрами определенной специфичности в ПНР. Эти методы идентификации, как показали первые полученные данные, об-

ладают наиболее высокой чувствительностью по сравнению с известными на сегодняшний день в риккетсиологии биологическими и серологическими методами (Hendrlx et al., 1991; Regnery, 1990; Regnery et al., 1985; 1987; 1991; Tringali et al., 1987).

Имевшиеся к нзчалу нашх исследований единичные сообщения, выполнение на небольшом количестве шташов, свидетельствовали о наличии структурных особенностей ДНК у некоторых представителей риккетсий, но были недостаточны для их использования в целях ти-пирования (Regnery et al., 1984; 1985; 1987).

Разработанные наш приемы исследования хромосомной ДЕК рик-кетсий методом рестрикционного анализа и ДНК-зондирования предусматривали возможность изучения полиморфизма генома этих шгкро-органпзмов и использования этого маркера для генотипичесхой идентификации риккетсий.

Исходя из - этого целью исследования являлось определение критериев идентификации риккетсий на основании анализа полинор-физма длин рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК и типирова-ние риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки с использованием этих критериев.

Основные задачи исследования включали:

1. Изучение характере расцепления хромосомной ДНК риккетсий эндонуклеэзами рестрикции к отбор зндонуклеаз рестрикции для проведения анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК.

2. Сравнительное изучение полиморфизма дан рестрикщокных Фрагментов ДК риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки с использованием набора штаммов, различающихся по происхождению и б'/«.-логическим свойствам.

3. Изучение дифференциально-диагностической специфичности набора ДНК-зондов, представляющих собой фрагменты ДНК, несущие как определенные геш, так и случайные фрагменты ДНК R.prowa2ekii.

1. Изучение генотипа неидентифицированного ркккетсиального изолята, серологически относящегося к груше клещевой пятнистой лихорадки, с использованием, предяокегашх критериев титрования.

Исследование проведено с использованием коллекции Национального музея риккетсиозных культур, функционирующего на базе лаборатории молекулярной биологии и генетики рикккетсий НИИЗМ им. Н.Ф.Гамалеи.

. Решению основных задач предшествовали работы но их методическому обеспечению, которые включали:

- определение условий проведения электрофореза в агарознои геле для обеспечения оптимального распределения фрагментов рик-кетсиальной ДКК, расщепленной эндонуклеазами рестрикции;

- отработку способа получения биомассы риккетсий из ограниченного количества биоматериала для целей изучения хромосомной ДНК риккетсий методом ДНК-зондирования.

Основным положением, выносиши на защиту, является возможность проведения типирования риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки с применением рестрикционного анализа хромосомной ДНК и ДКК-зондирования по Cayзерну с ДНК-зондами, несущими различную генетическую информацию.

Научная новизна работы.

Впервые определен характер расщепления хромосомной ДНК риккетсий с широким набором эндонуклеаз рестрикции, обладающих различными сайтами узнавания, и установлены злектрофоретические профили рестрикциокных фрагментов ДНК для риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekil, R.typhi, R.canada) и клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica; R.conorii), имеющие видовые и, в случае R.pio-wazekli, R.typhi, R.conorii, итаммовые особенности.

Охарактеризованы новые" по дифференциально-диагностическим особенностям ДКК-зонда (РВН11, РЕН13, Ш218), представляющие собой различные по структуре фрагменты ДНК R.prowazekil; ДНК-зонды обладают специфичностью в отношении ДНК риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки и способной ¿ю к дифференциации видов рикетсий внутри этих групп.

На основании полученных впервые данных анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДКК и результатов ДНК-зондирования предложены новые критерии генотипической идентификации риккетсий группы сыпного тифа я клещевой пятнистых лихорадок, позволяющие: .

- определить вид риккетсий и дифференцировать штаммы R.prowazekil, R.typhi, R.corícrli,

- впервые объединить в группы патогенные для человека штамиы R.prowasekii; получить первые на генетическом уровне доказательства изогенности иалопатогенкого штамма Е R.prowazekii и его высоковирулентного ревертанта штамма ЕВир;

- впервые установить генетическую гетерогенность ытаммов R.typhi; •

.- подтвердить генетическую гетерогенность штаммов R.conorii и установить, что отечественный штамм М-1 R.conorii отличается по генотипу от протстипных индийского к африканского штаммов R.conorii - Indian tick typhus и Kenya tick typhus;

установить подобие генотипа вирулентных штаммов R.sibirica, изолированных в разное время, в различных регионах нозоареала клещевого тифа Северной Азии, из разных источников;

- выявить новый для территории СНГ генотип риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки для изолята, выделенного в Крыму;

Практическая ценность работы

Впервые охарак'; сразованы генотипы штаммов патогенных риккетсий с известной видовой принадлежностью, выделенных на территории СНГ и депонированных в коллекции Национального музея риккетсиоз-lfflx культур.

Генотипические характеристики введены в паспортные данные изученных штаммов риккетсий группы сыпного тифз (R.prowazekii, R,typhi, R.canada) и группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii, R.akari).

Предложенные критерии использованы для генотипнческой характеристики риккетсиальных изолятов с неустановленной видовой принадлежностью, депонированных в коллекция Национального музея рик-кетсиозных культур.

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдала медицинской микробиологии КйИЗМ кн. К.Ф. Гамалеи РАШ 9 декабря 1992 года. Основные положения работы доложены на ззседа.'ми Всесоюзного центра по риккетсиозаи (1987 г.), на Всесоюзной конференции по ризскетсиоззи (1983 г.), представлены на конкурсе молодых ученых НЖЗ.Ч км. Н.Ф.Гамалеи в 1987 г., включены руководителем диссертации д.к,к. Бадаевой Н.М. в доклад на международной конференции ршскетсиологов (Италия, 1987 г.),. на 4-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии (Фракция, 1989 г.), на IV международном симпозиуме "Rickettsiae and Rickettsial Diseases (Чехсслозакия» 1991 г.); включены в доклад академика АМН СССР А.Г.Скавронской и члена-корреспондонта АМН СССР А.А.Воробьева

робьева "Генетическая инженерия в микробиологии и иммунологии" на LXII сессии общего собрания АМН СССР (19-23 марта 19Э1 г.).

' По теме диссертации опубликовано Э работ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 194 страницах, иллюстрированы 28 рисунками и 10 таблицами. Диссертация состоят из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов, 3 глав собствен! сих исследований, главы обсуждения результатов выводов и/ списка литературы, вклячащего 30 советских и 177 зарубехшнх источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Ытаммы риккетсий

В работе использовали риккетсии группы сыпного тифа (СТ): 10 птаммсв R.proRazekii - Брейнль, Е, ЕЕир, Ананьев, Владыко, Г, ICa-цгшян, Кузина, Л, Черникова; 5 штаммов R.typhi - Вильиингтон, Б-1, Гер, Мусеибов, X; R.canada штамм 2678; риккетсии группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ): б штаммов R.sibirica ~ К-1, Алтай 81/08, Горный 54/88, Нецветаев, Приморье 20/04, Чзта 18/85; 3 штамма R.conoril - М-1, Indian tick typhus (Itt), Kenya tick typhus (Ktt); 2 иташа R.akari - M-3 и ШС; рпккетсии группы цуцуга-муш: R.tsutsugamushi штамм Jillian; представители рода Coxiella - С.burnetii птамм М-44. Риккетсии культивировали в келточных месках (ЗМ) развивающихся куриных эмбрионов (КЗ). Паспортные данные исследованных штаммов представлены и табл. 1.

Выделение риккетсий, освобожденных от ткзнп хозяина проводили с использованием модифицированного метода Aniskovich et al. (1989), а такке специально разработанным нами эффективным способом частичной очистки риккетсий от ткани клетки-хозяина из ЗЫ со скудным накоплением риккетсий. Ршасетсии, очищенные от ткани Ш КЗ, суспендировали в буфере ТЕ (0,01M трис-HCl РН 8.0; 1тМ ЭДТА, Serva).

Таблица 1. Паспортные данные штаммов риккетскй, использованных в исследовании

Вид, ытамм I

Место выделения Авто^

Дата III

Источник выделения IV

Пассвигная история V

R.pro'ífazekil игейкль(не клонир, АТГС VR-142 Брейнль(клонир.)

Е(Я8 клонир.) АТСС VR-233

Е(клонир.)

ЕВпр(не клонир.)

ЕВир(клонир.) Ананьев

Владыко

Г

) Польша; Wolbach S.

1922 больной эпяд,сыпи.тиф

Испания; 1943

Clavero С., Pere?,-Gallardo Р. получен из США

от npo$.rcisseman С.Е. в 1968г.

Россия, Москва; 1971

Бадаева Н.М. ИЭМ им.Гамалеи.

Россия, Москва; 1952

Васильева Л.В. ИЭМ им.Гамалэи Велорусия, Минск: 1960

Рытик П.Г. Минский ИЭМ Россия, Москва; 1943

Здродовстай П.Ф. Ко-М им.Гамалэи

экспер.получ.пря пассир кташда Мадрид-l в КЗ

экспер.получ.13пас. з легких О,и. штамма Е

больной б-нь Бриллл-Цинссепа

больной зпид.сыпн.ткф больной зпид.сыпн.'.иф

134 КЭ

?н.св.+9КЭ+ЗКЭ (п/р) +2КЭ

282-285КЭ

278КЗ+1к.т.(бляшки) +6КЭ

7 КЭ . i

13K3-f3K3(n/p)+1K3 I 1П.В.+1И.СВ+ 71КЗ+ЗКЭ(П/р)+2КЭ Зкрол.В.тЗм.СВ. +7КЭ

?м.св+7б.м.+?м.св. +98КЭ+ЗКЭ (п/р)+1 КЭ

ирилч^ьлелие "i'üUJi. I

i

ii

ш

IV

Каданян

Кузина

Л

Черникова

R.typhi В-1

Вильмингтон АТСС VR-144 Гер

Мусенбов X

R.canada 2678

АТСС YR-610

Армения, Ереван; 19G3

Коцинян М.И.

Россия, Москва; 1950

Голиневич Е.М. ИЭМ им.Гамалеи Украина, Львов; 1946

Мосинг Г.С. Львовский КЗМ Белорусия, Минск; 1967

Рытик П.И. Минский ИЭМ

1928 1946

Грузия, Батуми; Солитерман П.Л. ЮМ им.Гамалеи ■ США, Сев.Каролина; Махсу R.Y. Грузия, Батуми; Солитерман П.Л. ИЭМ им.Гамалеи Азербайджан, Баку; Кулагин С.М. ИЭМ им.Гамалеи Грузия, Батуми; 1946

Солитёрман П.Л, ИЭМ им.Гамалеи

Канада, Онтарио; McKiel Y.A.

больной ЭПИД.сыпи.тиф

больной зпид.сыпк.тиф

больной зпид.сыпн.тиф

больной б-нь Брилля-Цинссера

1946 Rattus norvegicus

больной крыс.сыпн.тиф больной крыс.скпн.тиф

1963

Xenopsylla cheopis снятых с R.norvegicus

Haemaphisalis leporlspalustris

Зм.св+4КЭ+ЗКЭ(п/р) +1КЭ

?м.св+?б,м.+1м.св. +6КЭ

?п.в.+?б.м. +4М.св.+7КЭ 15крол.в.+ЗКЭ +1М.СВ+6КЭ

? + 31КЭ

200м.св.+107-112КЭ

?м.са.+?б.м. +1м.св.+8КЭ

1S4S больной крыс.сыпн.тиф ?м,св.+10КЭ

?м.св.+?б.и. 1м.св.+6КЗ

16 КЗ

Продолжение табл. 1

II

III

IV

R.sibirica Алтай 81/88

Горный. 54/83

К-1 (246)

АТПС VR-151 Нецветяев (232)

Приморье 20/84

Читн 18/65

¡'золят Крым-108

R.conorii М-1

Kenya tick typhus (HI)

Россия, Алтайский край; 1988

Рудаков Н.В..Саиойленко И.Е. Омский НШН

Россия, Алтайский край;, 1980 Рудаков Н.В..Шпынов С.Н. Омский ШИПИ

Россия, Краснояр.край; 1949

Голиневич Е.М. ЙЭМ им.Гамалеи Россия, Алтайский край; 1946 Кулагин С.М..Коршунова О.С. КЗМ им.Гамалеи

Россия, Приморский край; 1984 Решетникова Т.А. Омский НИМ

Россия, Читан.обл.; 1985

Решетникова Т.Д. 1

Омский НИИПИ

Россия, Москва; 19Т7

Воронцова Т.А. ИЗМ им.Гамалеи

Грузия, Сухуми; "1947

Голиневич Е.М. ИЗМ им.Гамалеи Афшка, Найроби; 1953

получен от Phillip С.З. в 1953

Dermacentor silvarum Dermacentor nuttalli

Dermacentor nuttalli

больной клещ.риккет-сиозом Сев.Азии

Haemaphysalis concinna Dermacentor nuttalli Dermacentor marginatus

RhipicephalUB sanguineus / , Haemaphysalis leacM снятых с собаки

3и.св.+3-5кэ

1М.СВ+4-10КЭ

7 + 6-7КЭ ? +30-32КЭ

7u.cB.+11-16КЭ

5М.СВ+12-18КЭ

2клещи+8-11КЭ

7+82КЗ ?+7КЭ

Продолжение табл. 1

II

III

IV

Indian tick typhus ATCC VR-r.97

R.akari КЗ

Ж (Kaplan) ATCC Vn-148

R.tsutcugaroushi Gilliam ATCC VR-312 C.burnetii M-44

Индия, Кашмир; 1950 Rhipicephalus

получен от Piiillip C.B. в 1953 sanguineus

Украина, Донецк; Кулагин С.М. ИЭМ ш.Гамалеи Нью-Йоркг США «

Huebner R.

Индокитай, Assam-Burma; Bennet R. Россия, Москва; Гениг В.А.ИЗМ им.Гамалеи

1950 Mas rausculus 1946 больной

1944 больной лих.цуцугамуши

1954 экспер.получ.при пассир. в КЗ штамма Грита

7+7КЭ

7+бКЭ 7+11-14КЭ

?и.св.+10КЭ 62КЭ

I

из I

Условные обозначения

цифры - количество пассажей;

КЭ - пассирование в желточных мешках куриных эмбрионов;

м.св. - пассаки на морских свинках;

б.м.- пассааи на белых мышах;

п.в.- пассажи на платяных вшах;

крол.в.- пассажи на кроличьей расе вшей;

клещи - пассажи в клещах;

?- количество пассажей неизвестно;

ЗКЭ(п/р) - пассирование в КЭ методом предельных разведений = клонирование; 1к.т*(бляшки) - пассирование в культуре ткани = клонирование методом бляшек; (246>', (232), (HL), (Kaplan) - имя штамма в иностранных работах; АТСС - номер в американской коллекции типовых культур.

Молекулярно-гьнетйческие метода

Выделение бактериальной хромосомной ДЕК риккетсий проводили согласно метода Frieieç et al. (1984). Расщепление риккетсиальной ДНК проводили согласно Maniatis et al (1982) с использованием эн-донуклеаз рестрикции производства НПО "Фермент", Вильнюс, и буферов для рзстрикши фирмы Boehrlnger Mannheim GmbH,- ФРГ.

Электрофоретическое разделение рестрицированных фрагментов ДНК проводили в горизонтальном агарозном геле (Агароза тип II, Sigma, США). Выбор концентрации згарозы и режим электрофореза зависел от целей эксперимента и определен в процессе исследования.

Выделение фрагментов риккетсиальной ДНК из агарозного :еля проводили методом электроэлюции согласно Maniatls et al. (1902), используя буфер ТВЕхО.5 и диализные трубки "Servapor" (ФРГ) Режим, электроэлюции - 4 В/см / 1 час/ комнатная температура. Элюат очищали от компонентов агарозы и концентрировали ДНК с использованием колонок Elutip-d (Serva) в соответствии с инструкцией производителя.

Выделение пяазмидной ДНК проводили щелочным методом согласно Blmboim and Doly (1979). Эксперименты по дот-гибридизации проводили с с использованием камеры для шкрофильтрацжз Bio-Dot (Bio-Rad).

В экспериментах по Слот-гибоидазэцця исследуемую ДНК растри-цкровалн зндонуклеазой HindIIÍ или EcoRI ([ПО "Фермент".Вильнюс). Перенос ДНК из агарозкых гелей ня фильтры Zeta-Probe (Elo-Raù) проводили щелочным методом согласно инструкции фирмы-производителя фильтров.

Использованы следующие ДНК-зонда: специфичные для R. prowa-zekii HindIII-фрагменты, в составе гибридних плазмид' РЕШ1 и РВН13 (Рыдкина и Демкин, 1930), а также любезно' предоставленные проф, D.Wood, США, плазмида рЖ64 (ïiood et al., 1987) и pMÏ/218 (Krause et al., 1985), несущие соответственно ген цитрат-синтезы R.prorasekii и ген белка R.prowazekii с молекулярной массой 51 KD.

Радиоактивное мечениэ ДНК-зовдов проводили, используя набор для радиоактивного мучения с олигокуклеотидными пр'аймерами, согласно стандартному протоколу фирмы-производителя (Pharmacia).

Эксперимента по гибридизации фильтров с ДНК-зондзма прово-(илн согласно инструкции фирмы-пропзводителя фильтров Zeta-Probe ;BIo~Rad). Режим гибридизации соответствовал уровня гомологии

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка возможностей метода рестрикционного аналипа для типи-ювания риккетсий проведена на типовом представителе рода Ric-:eUsia - возбудителе сшшого тифа R.prowazekii. В исследование жлючены штаммы, различающиеся по вирулентности и, как было уота-говлено Regnery arid Spruill (1984), по структуре геиома. Это про-'отнпный высокорируленткый штамм Брейнль и малопатогенный вакцинной ытанм Е. В исследование был включен такяе стабильный внру-юнтный ревертант штамма Е - штамм ЕВир (Бадаева, 1SG9).

Проведенный анализ позволил определить число сайтов рестрикции на хромосоме R.provvazekt i для широкого спектра эндонуклеаз, >бладающих различными сайтами узнавания. Было установлено, что, в (елом, геном риккетсий характеризуется относительно небольшой фрагментацией ДНК - от нескольких до 20, «когда более 30 сайтов, i достаточно большим диапазоном рзспргделения рестрикционных фрагментов - от 50 до 0.5 тпн (табл. 2). Это обстоятельство поз-юлило подобрать условия электрофореза, позволяющее четко акалн-¡ировать рестриктограммы в высоко- и среднемолекулярной области, [аилучшее разделение фрагментов в области от 23 до 2 т.п.к. было юстигнуто при использовании 0,6-0,7% агарозного геля и рекимз ¡родолкительного электрофореза (50-70 часов) при низких значениях апряташя 1-2 Уем/ час,

В ходе исследования установлено, что в «случае 9 из 17 эндо-■уклеаз выявляются отличия в структуре генома у штамма Брейнль от таммов Е и ЕВир. Это эндонуклеазы - ВалШ, Bgll, Cír13I, EcoB-, indIII, MopI, Uval, Potl, Xhol (тябл. 2). С целью иезелюченил озмокной генетической гетерогенности изучаемых популяций была pc'oi-дена специальная серия опытов с другимл субшкипми итзмчов рейнль, К и ЕВир, "клонированными" предварительно катодом про-„■льных разведений ьли методом "бляшек" для гомогенизации состава .муляцчи (табл. 1). Как видно из данных иеследовагил рестрикци-■urue картины ДНК "клонированных" и "неклоырованкых" сублишй гедого из штампов бил1, идентичны макду собой (табл. 2), что сви-?тзльг.тьуэт о стабильности структуры генома у риккетсий в провесе пассирования в КЗ.

Проведенное тишрование набора патогенных шташов R.prowazekil с использованием отобранных эндонуклеаз показало, что рестрик-ционные картины, полученные для прототиотого штамма Брейнль типичны для 6 других штаммов R.prowazekil - Ананьев, Владыко, Г, Кузина, Л, Черникова. Рестриктограммы, типичные для штаммов Е и Евир, получены для штамма Кацинян (табл. 2).

Как следует из данных о происхождении исследованных шташов ' (.табл. 1), наблюдаемые различия в структуре ДНК не связаны с характером вызываемого'заболевания. Так, штампы, сходные со штаммом Брейнль, выделены как от больных эпидемическим сыпным тифои (Владако, Г, Кузина, Л), так и от больных рецидивной формой сыпного тифа - болезнью Брилля-Цанссера (Ананьев, Черникова).. Штамм Каци-кян, принадлежащий к одному, генотипу со штаммом Е, выделен от . больного эпидемическим сыпным тифом. Выявленные различия не коррелируют такке с-различима в вирулентности. Так, вирулентные штаммы ЕВир и Кацинян отличаются от вирулентного штамма Брейнль и принадлежат к одному генотипу с авирулентным штаммом Е.

По-видимому, наблюдается корреляция мекду принадлежностью штамма к определенному генотипу и регионом его выделения, поскольку все штаммы сходные со штаммом Брейнль выделены в Европейской части4-России, в одном географическом регионе с Варшавой (50°С.Ш.), где был выделен штамм Брейнль. Штамм Кацинян, выделен в Армении, в географическом регионе с той же шпротой,(40°С.Ш.), что и Испания, где был выделен штамм Мадрид-1 , являющийся роги-тельским для штамма Е.

Б итоге наших исследований с использованием метода АПДРФ ДНК впервые осуществлена дифференциацчя патогенных штаммов R.prowase-kii.

Рестрикционный анализ ДНК был приманен для,изучения штаммов другого представителя риккетсий сыпнотифозной группы - R.typhi, возбудителя эндемического сыпного тифа. Было исследовано 5 штаммов R.typhi. С помощью двух эндонуклеаз - Mspl и FstI - были найдены отличия штамма Вильшкгтон от других штаммов R.typhi (табл. 3). Генетическая гетерогенность штаммов R.typhi была установлена впервые. Как и в случае R.prowazekil, выявленные различия, гю-Еидимому, отражают клональкость шташов R.typhi, связанную с регионом выделения, поскольку, штамм Еильш^чгтон. выделен в Америке, а отличающиеся о? него штамм Б-1, Гер, Мусеибсв, X - на Кавказе.

Проведенное с использованием АПДРФ типирование риккетсий группы КИЛ (R.sibirica и R.conorii) показало, что по диапазону рас-

ределения рестрикционных фрагментов ДНК риккетсии группы КШ1 яодны'между собой и отличаются от риккетсий.группы СТ.

Был исследован полиморфизм генома б штаммов R.sibirica, вы-;еленных на территории Сибири и Дальнего Востока, в разное время из разных источников. Полученные данные показали, что все ис-ледованные штаммы R.sibirica не различались по генотипу (табл. ). Наши результаты говорят о высокой консервативности генома у того вида риккетсий.

В отличие от R.sibirica, сравнительное исследование методом ПДРФ Зх штаммов R.conorii - штамма М-1, выделенного на побережье ерного моря в г.Сухуми, прототипного индийского штамма Indian ick typhus и прототипного африканского штамма Kenya tick typhus оказало, что в распределении рестрикционных фрагментов при рас-еплеиии ДНК зндонуклеазами Hindlll и Pstl наблюдаются Еыраженные азличия между 3-мя штаммами, и каждый из них может быть индиви-уально идентифицирован по наличию специфических-диагностических рагментов ДНК (табл. 5). Поскольку изученные штаммы. R.conorii цделены в удаленных друг от друга географических регионах, мы редполагаеМг что выявленные у них особенности структуры ДНК от-акают региональную клокальность этого вида риккетсий..

Таким образом, в цзлом с использованием рестрккционного анэ-яза получены объективные характеристики, позволяющие типировать группировать штаммы риккетсий. Решение зтой задачи имеет исклю-ательно'вакное значение в риккетсиологии, поскольку до настояпде-о времени подобных характеристик не существовало и статус штамма элучал каждый вновь выделенный изолят.

Для разработки критериев титрования риккетсий, прянздлека-т.х к разным видай, был использован метод ДНК-зондирования.

Поскольку успех этого метода определяется выбором ДНК-зонда, ¡иго проведено тестирование 4-х различных ДНК-зсндов: были иссле-шакы специфичные для R.prowazekii ШлаШ-фрагменты ДНК, вклю-:ннь:э в состав 2х гибридных плазмэд р?ВН11 и рРВН'З (Рыдкина и >мкин, 1990). Наряду с этими был! исследованы 2 гибридные плаз-дн - плагмида рЬГ£2б4, несущая ген цитрат-пинтазы R.prowasekii ооа et al,, 1987), плазмида pKW218, кодирующая балок R.prowase-1 молекулярной массой-51 kD (Krause et al., 1985). Все зонды с шаковоЗ интенсивностью гибридазовались с ДИК риккетсий, входя-х как в группу CT, так и в группу КИЛ. Зонда не гибридпзовались ДНК иктактного ÄM, фага X, E.coli и ДНК широкого спектра пато-ннах шкрооргагагамов.

- u -

He ' одон из исследованных зондов не гибридазовался с ДНК С.burnetii и R.tsutsugamushi, что согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что С.burnetii и R.tsutsugamushi генетически удалены от риккетсий группы СТ и КПЛ (ffelsburg et al., 1985; 1989).

Проведенное методом ДНК-зондирования исследование показало, что зонды обладают различными дифференциальным возможностями в отношении рассмотренных представителей риккетсий (табл. 6).

Наиболее эффективно различия в структуре генома у изученных видов риккетсий определялись при гибридизации с зондами РВН11 и MVT218. Зонд РБН11 очень четко выявлял полиморфизм генома у видов риккетсий внутри группы сыпного тифа. Зона гибридизации ДНК R.prowazekii находится в области 4,0 ток, R.typhi - в области 3,1 и 1,5 тин, R.canada - в области 2,3 и 1,2 тпн. С помощью этого зонда легко можно отличить риккетсии групш сыпного тифа от риккетсий группы КПЛ, а также внутри группы КПЛ R.akarl от близко родственных меяду собой R.sibirica и R.conorii, Зонд РВН11 ке дифференцировал R.sibirica от R.conorii (табл. 6).

Наилучшими дифференциальными возможностями обладал зонд №7218, несущий ген белка 51 kD R.prowazekii. С помощью этого зонда четко.дифференцировались все изученные виды риккетсий, включая близкородственные виды R.sibirica, R.conorii.

Дифференциальные возможности зондов РВН13 и №7264 были ограничены, что говорит о том, что они включают консервативные для рассмотренных видов риккетсий участки генома (табл. 6).

С помощью зондов РВН11 и MW218 проведено типирование ряда ытаммов каждого вида риккетсий, включенных в исследование. Положение зоны гибридизации с зондом РВН11, как и с зондом MW218, типично для всех изученных изолятов того вида, к которому принадлежит данный штамп. Например, различные по структуре генома штаммы R.prowazekii имеют одинаковые гибридязациояные картины при взаимодействии с зондом РВН11. В отношении изученных штаммов R.conorii было установлено, что зонд MW218 не только дифференцирует этот вид от других представителей группы КПЛ, но и обладает способностью к дифференциации ытаммоз R.conorii - получены совпадающие картины для' штаммов fJ-1 и Ktt и отличающаяся от них картина для штамма Itt. Этот результат; может быть объяснен выраженной генетической гетерогенностью штаммов R.conorii по сравнению с другими изученными видам? риккетсий.

Таким образом, положение зон гибридизации с зондами Ш218 и

РЕП11 иояет служить крйтяриен при идентификации изученных видов риккетсий.

Полученные в ходе работы критерии типировакил риккетсий группы CT а КПЛ были применены для изучения изолята Крым-108 (Воронцова и др., 1980) с неустановленной втдовой принадлежностью, и имеющего антигенную общность с риккетсияки группы КПЛ. Данные проведенного наш рестрикциошгого анализа с использованием эндонуклааз Pstl и Hindlll показсли, что изолят Крым-108 сходен по общему характеру ползморфпзма длин рестрзкционных фрагментов ДШС с риккетсиямп группы КПЛ, а в пределах этой группы его тип 'полиморфизма отличается как от R.sibirica, так .и от Зх исследованных штакмси R. conorii.

Изучение генотипа изолята Крьга-108 с помощью ДНК. зондирования показало, что, несмотря на разные дифференциальные возмоиюста ДНК-зондов РВН11, РБН13, Ш264 и Ж18, с помогла каадого пз гак пзоля? КршМСЗ четко отличался ото всех исследованных видоз риккетсий группы CT и группы КПЛ (табл. 6).

Выявленные с помощью рестрикционпого анализа к ДНК-зондкрозаккя гекотлппческие характеристики изолята Крым-108 показывает его особое положение по отношении к изучзккым вядаи риккетсий. Получензше результаты позволили нам говорить о том, что изолят Крыи-108, актигенно родственный риккетсиям группы КПЛ, отличается от них по генотипу и является новый представителем рода Rickettsia на территории СНГ.

На основании полученных нама данных для решения вопроса о вадовой принадлежности изолята Крым-108 было предпринято спеця-эльноо исследование по его геноттгопческсй идентификации, выполнено е в Национальной центре ВОЗ Транши, в лаборатории риккетсио-зов, руководимой проф. D.Raoult. Исследование было проведено Н.М.Бадаевой, руководителе« лаборатории молекулярной биологии а генетикн риккетсий ШИЗМ ии. Н.Ф.Гамалэи, и научным сотрудником этой лаборатории ¡I.E.Еремеевой. В результате было показано, что изолят Крил-108 идентичен по генотипу недавно охарактеризованному виду - R.slovaka (Regnery et al., 1991). Результаты зтих исследований подтвердили сделанный нами вызод о том, что изолят Крым-108 является новым для территории СНГ видом риккетсий.

Таблица 2. Полиморфизм дан рестрикционннх фрагментов ДНК штаммов Rickettsia prowacekli

ондонуклеаза рестрикций

Визуально вагличимые Величина диагностических фрагментов ДНК (т.п.н.) фрагменты ДНК

-Штаммы

■Кол-во Диапазон Брейшгь Ананьев, Владыко К ЕВир кацинлн

сайт распред. кл.некл. Г Кузина, Л кл.некл. кл, некл.

растр. (т.п.н.) Черникова

ВалтН! G'GATCC 9 50 - 7 0 0 0 h/o 9, 5 9,5 9, 6 9,5 9,i

Bgll GCCmm'NGGC 9 50 - 10 20 20 h/o h/o 23 23 23 23 h/o

Ciri3I G'GHCC >30 15 - 1 8 8 8 h/o 0 0 0 0 0

EcoRI G'AATTC >30 25 - 2 0 0 0 k/o 18 18 18 18 18

Hindll'i A'AGCTT >30 15 - \ 9 9 3 9 0 0 0 0 0

ttspl G'CGG >30 .15 -0.5 9 9 9 9 8 8 8 8 8

i.ival CC'(AT)GG >30 CTGCA'G >30 20 - 1 10 18 18 ■ 18 0 0 0 0 0

PstI 30 — 1 15 15 15 15 20 16 20 16 20 16 20 16 20 16

Xliol G'TCGAG 13 50 - 6 0 0 0 0 15 15 15 15 15

Bcnl CC'(CG)GC 19 CC'GG >30 50 - 8 - - h/o h/o - - - _ _

BspRI 30 - 1 - - k/o h/o - - - - -

Girl(T/C)'GGCC(A/G)>30 25 - 2 - - ii/ 0 h/o - - - - h/o

№91 C'CCGGG I 30 - - Jl/c h/o - - - - h/o

Eco81I CO'TNAGG >2.0 25 - 5 - - H/O k/o - - - _ H/o

PvuTI CAG'CIG >30 30 - 2 - - h/o 11/0 - - - h/o

ball G'TCGAC 3 30 - 10 - - к/ 0 h/o - - - _ h/o

Smal CCC'GGG 1 40 - 30 - - н/о h/o - - - - h/o

01 I

Условные обозначения:

- нет отлти'лй; "О" - диагностический фрагмент отсутствует; "к/о" - нэ определяли; кл. - клонированная субпопуляцкя штата; некл. - не клонировлшгая суйпоауляция шташла; т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов;

Таблица 3. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК штаммов Rickettsia typhi

Эндонухлеаза рестрикции

Визуально различимые фрагменты ДНК

Величина диагностических фрагментов ДНК (т.п.к).

Кол-во

Диапазон распределения . (т.п.н.)

Шташы Вильшнгточ В-1, Гер,

Мусеибов, X

EcoRI Hindlll

Xbal

>30 >30 >30 >30 >30

25-2 15 ~ 1 15 -0,5 30 - 1 30 - 1

12 О

Таблица 4. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК штаммов Rickettsia sibirica

Зндонуклеаза Визуально различите . Наличие некомигрируадих фраг-рестрикции фрагменты ДНК ментов у сравниваемых штаммов

Кол-во Диапазон распред. (т.п.н.J

Штамш Горный 54/88, К-Нецзетаев, Чита Приморье 20/84,

Штамш ■1, К~1, 18/85, Алтай 81/88

Egll

EcoRI Kindiii

msdl

Ps^tl Pvull Xbal '

10 >30 >30 20 >30 >30 >30

50-4 50 - 1,5 1Q - 0,5 4 - 0,5 30 - 0,5 50 - 0,5 16 - 1

K/o ir/o

H/O

н/а h/O

Таблица 5. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК штаммов Rickettsia conorii

Зндонуклеаза Визуально лазигацмне Величина диагностических рестрикции фрагменты*ДКХ фрагментов ДНК (т.п.н.)

Кол-во Диалззон распред. (т.ц'.н.) М-1 Штаммы Ktt Itt

Hindlll >30 1С - 0,5 7 ■ т,з 8,5

5,7 6 7,5

5

?sti >30 30-0,5 20 20 0

Условные обозначения: - нет отличий;

"О" - диагностический фрагмент отсутствуй

н/о - не определяли;

т.п.н. - тысяча пар нуклеоглдоз.

Таблица б. Количество и положение зон гибридизации зсндов с Н1пс1111-рестрицированной риккетсиальной ДНК

- Зонды

Виды

риккетсий

R.prowaze- В.typhi П.canada R.sibiri- R.conorii R.akari R.tsutsu- C.burne- Крым108

Kii . са gafiiushi til

К-Бо Полок К-во Полок.К-во Полок.К-во Полок.К-во Полож.К-во Полол.К-во Полож.К-во Полок.К-во Пол.

(тпн) (тпн) (тпн) (тон) (ТПН) (тпн) (ТПН) (тпн) (тпн)

РЕ'111 1 4.0 2 3.1 2 2.3 2 3.4 2 3.4 1 2.5 0 - 0 1 3.8

1.5 1.2 1.8 1.8

РВН13 1 4.0 1 3.7 2 1.7 1 4.8 11/0 1 5.2 0 - н/о 2 3.7

0.6 0.9

Ш264 1 2.4 2 1.0 1 2.0 1 2.2 1 2.2 1 2.0 0 - 0 1 2.7

0.7

Ш218 4 4.4 4 3.5 5 4.2 5 2.6 4 2.6 3 3.3 0 - 0 5 2.7

2.9 2.5 2.6 2.3 2.2 2.7 2.2

2.1 1.2 2.1 2.2 1.5 1.8 2.0

1.7 0.8 1.7 1.5 1.4 1.5

0.7 1.4 1.4

со i

Штаммы, использовашше в исследовании: R.prowazekii

R.typhi R.canada R.siblrica R.conorii R.akari

- штамм Брейнль,

- штамм Вильмингтон,

- штамм 2678,

- штамм К-1,

- штамм М-1,

- штамм М-3,

Условные обозначения: н/о - не определяли, 0 - нет зоны гибридизации, тын - тысяча пар нуклеотидов.

ВЫВОДЫ

1. Определены критерии титрования риккетсий группы сыпного ' тифа и клещевой пятнистой лихорадки, - основанные на полиморфизме структуры ДНК, позволяхяцие определить вид и подгруппу штаммов, к которой относится исследуемый объект.

2. Установлены электрофоретнческие прсфили рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК риккетсий группы сыпного тифа (R.prowasekii, R.typhi, R.canada) и группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii), имеющие видовые и для R.prowazekii, R.typhi, R.conorii - шта:п!овые особенности.

3. С помощью новых по дифферэтщиадыго-диагонсстическим возможностям зондов на' основе ДНК R.prowazekii установлена видоспеци-фижость в - расположении зон гибридизации .для риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R.typhi, R.canada) и риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii, R.akari).

4. Выявлены различия в структуре ДНК патогенных для человека штаммов R.prowazekii и впервые проведено объединение эти* штаммов в группы с учетом выявленных различий.

5. Впервые выявлена генетическая гетерогенность штаммов R. typhi. Установлено, что штамм американского происхождения отличается по рестрикциснкыи прсфилям ДНК от штаммов европейского происхождения.

6. Установлено, что вирулентные стаииы R.sibirica, изолированные в нозоареале клещевого рикхетсиоза Северной Азии, принадлежат к одному генотипу. -

7. Изученные штаммы R.conorii различного географического происхождения характеризуются вараненным полиморфизмом структуры ДНК.

8. С помощью предложенных генотипических критериев определен новый для территории СНГ генотип риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки. • •

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИСЕ ДИССЕРТАЦИИ!

1. Балаева Н.М., Рыдккна Е.Б., Артемьев И.И. Анализ ДНК малопатогенного штамма Е, его ревертанта и штамма Брейнль Rickettsia prowazekii рестрикционными эндонуклеазами // Вопросы риккетсиологии: Сб. научных трудов. - М., 1988. - С. 10-13.

2. Балаева Н.М., Артемьев, М.И., Игнатович В.Ф., Лиходед'-Л.Я., Рыдкина Е,Б. Дифференциация риккетсий различных видов методом рестриктдаонного анализа хромосомной ДНК // Иммунобиологические препараты нового поколения и методы их контроля:

- го -

Сб. научных трудов НИКОМ пи. Н.Ф.Гамалеи. - М., 1938. - С. 104-109.

3. Restriction, endonuclease analysis ol the DHA of Rickettsia prowasekii vaccine strain E and its revertant / Balayeva N.M., Rydkina E.B., Artemtey H.I., Ignatovich V.F. // Acta virol. - 1539. - V. 33, a 5. - P. 454-464.

4. Бадаева K.M., Игнатович В.Ф., Артемьев M.И., Рыдкина •E.B., Демк;т B.B. Дифференциация штаммов риккетсий Лровачека методом рестрпкцнонного анализа ДНК // Тезисы XYII съезда Всесоисн, общества зпидемпол., микробиол. и парагитол.им. К.И.Мечникова. -Алма-Ата, 1589. - Т. 2. - С. 105-106.

. • 5. Валаева Н.М., Игнатович В.Ф., Попов В.Л., Еремеева М.Е., Артемьев М.И., Рыдкина Е.Б. Развитие учения о патогенных риккет--сиях - биологические и молекулярные характеристики // Риккатсии- и риккетсиозы: Сб. трудов поев. ЮО-лети» П.Ф.Здродовского. - М., 1990. - С. 41-49.

6. Рыдкина Е.Б., Артемьев М.И., Балаева K.M., Игнатович В.Ф. Изучение генома ркккетсий методом рестрикци.онного анализа ДНК.// Журн. шкробиол. - 1990. - й 3. - С. 85-89.

7. Рыдкина Е.Б., Демкин В.В. Исследование генома риккетсий с использованием ДКК-проб // Бактериальные плазмиды: Тезисы докладов / Под ред. И.В.Домарадского. - Нальчик, 1990. - С. 91.

8. Arteraiev M.I., Ignatovich V.F., Rydkina Е.В., Lichoded L.J.., Balayeva N.M. Demkin V.V. Restriction Fragment Lenght Polymorphism analysis or the DNA оI typhus group Rickettsiae // Acta virol., - 1931. - № 35. - P. 526-530.

9. Demkin V., Rydkina E., Ignatovich V., Lichoded L.J.,„ Genig V.A., Balayeva N.M. Use oi DNA probes for differentiation of Rickettsiae // Abs. 5th Eur Congress oi Clinical Microbiology and Infectious Diseases - Oslo, Norway, 1991. - Л 1109. - P. 85.

i/ I'U^f _