Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поверхностные белковые антигены R. PROWAZEKII, R. TYPHI, R. SIBIRICA, C. BURNETII - как основа для создания новых диагностических и профилактических препаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поверхностные белковые антигены R. PROWAZEKII, R. TYPHI, R. SIBIRICA, C. BURNETII - как основа для создания новых диагностических и профилактических препаратов"

Министерство здравоохранения РФ Челябинская государственная медицинская академия

7 ...шь-'

ти-

На правах рукописи

1м

Пантюхина Анна Николаевна

ПОВЕРХНОСТНЫЕ БЕЛКОВЫЕ АНТИГЕНЫ

И. PROWAZEKП, Я. ТУРШ, И. ЭШПиСА, С. ВШМЧЕТН - КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ

НОВЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск, 1998

Работа выполнена в Пермском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте вакцин и сыворогок НПО "Биомед"

Научные консультанты: академик РЭА и МАНЭБ, доктор медицинских наук, профессор В.Ф.ПЕТРОВ

академик РАМН, доктвр биологических наук, профессор И.В.ТАРАСЕВИЧ

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

член - корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор О.В.БУХАРИН доктор медицинских наук, профессор Е.П. ЛУКИН доктор медицинских наук Н.В.РУДАКОВ

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоится "¿6" ЦИОИЛ^ 1998 г. в Фй часов на заседании Диссертационного Совета Д.084.04.02 при Челябинской государственной медицинской академии (454092, Челябинск, ул.Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан " 2. " Д _1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук,

профессор А.В.ЗУРОЧКА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последнее десятилетие XX века характеризуется появлением возвращающихся инфекций (re-emerging infection), среди которых значительный удельный вес занимают риккетсиозы (N. V. Rudacov et al. 1997).

Риккетсиозы являются важной проблемой инфекционной патологии всех стран мира, в том числе России и стран СНГ' (Цой Д. Ч., Рапопорт, 1995; Abramson М.А., Sexton D.J., 1995; Dupont Т.Н. et al., 1995: Rehacek J., 1996; Tarasevich et al., 1991; Walker D.H., 1996; Kazar J„ 1996; Klimchuk N. D., 1996; Raoult D., Dupont H.T., 1993).

По материалам официальной статистики и данным литературы, в России отмечается увеличение уровня заболеваемости следующими риккетсио-зами: эпидемическим сыпным тифом, клещевым риккетсиозом Северной Азии, Астраханской пятнистой лихорадкой, коксиеллезом, т.е. инфекциями, имеющими тенденцию к эпидемическому распространению (Конькова С. А. и соавт., 1994, Тарасевич И. В. и соавт., 1990; Тарасевич И. В. и соавт., 1995; Dodonov M. M. et al., 1990; Eremeeva M. E. et al., 1994; Rudakov N.V., 1996; Tarasevich I. V. et al., 1997).

Создавшаяся эпидемическая ситуация по сыпному тифу, осложненная массовой миграцией населения, ухудшением социально-экономических условий его жизни и ростом педикулеза (Фролова А.И., 1997), требуют повышения эффективности эпиднадзора за указанным риккетсиозом (Абдуллаев Ф.А. и соавт., 1994; Додонов М.М., 1991; Лукин Е.П., 1996; Паутов В.Н., 1994; Tarasevich I. V., 1996).

Значительно возросла заболеваемость риккетсиозами группы клещевой пятнистой лихорадки. На территории России появились ранее неизвестные очаги Астраханской пятнистой лихорадки (Tarasevich I.V. et al., 1991, 1997; Лукин Е.П. и соавт., 1996).

На 650% по сравнению с 1979 г. увеличилась заболеваемость клещевым риккетсиозом Северной Азии (Рудаков Н.В. 1995; Rudakov N. V. et al., 1997).

Активизируются очаги коксиеллеза, которые выявлены в 37 регионах России (Рудаков Н.В., 1995; Токаревич Н.К., 1997; Rudakov N, V., 1996).

Исходя из этого, важную роль в повышении эффективности эпидемического надзора и совершенствовании предупредительных мероприятий в отношении сыпнотифозной инфекции, клещевого риккетсиоза и коксиеллеза играет уровень их клинической и эпидемиологической диагностики.

Следует подчеркнуть, что диагностика вышеперечисленных риккет-сиозов в современных условиях значительно затруднена в силу мозаичности их клинических проявлений и увеличении числа стертых и бессимптомных форм инфекции.

В этой ситуации первостепенное значение приобретают серологические методы исследования, являющиеся единственными надежными критериями доказательства риккетсиозной природы инфекции, позволяющие изучать напряженность иммунного ответа, осуществлять межвидовую дифференциальную диагностику и оценивать иммунологическую структуру населения с целью их прогнозирования (Додонов М.М., 1991; Конькова СЛ. и соавт., 1994; Лукин Е.П. и соавт., 1996; Рудаков Н.В., 1994; Ястребов В.К., 1995; WissemanC. Н., 1973).

Создание и использование в практике конкурентноспособных диагностических препаратов по распознаванию риккетсиозов следует рассматривать как один из решающих факторов, которые определяют своевременность и эффективность всего комплекса необходимых противоэпидемических мероприятий на территории России и сопредельных государств (Додонов М. М. и соавт., 1994; Рудаков Н.В. и соавт., 1994; Фетисова Н.Ф. и соавт., 1994; Хазова Т.Г. и соавт., 1996; Tarasevich I.V., 1996).

Следует подчеркнуть, что существующие эмпирически созданные в 4050 годы диагностические препараты на основе ингактных клеток и их экстрактов в современных условиях далеко не всегда удовлетворяют нужды практики, так как обладают недостаточной чувствительностью, неоднородны по своему составу и содержат значительное количество компонентов среды культивирования, что является одной из причин появления неспецифических реакций при применении диагностических препаратов.

В настоящее время практическое здравоохранение испытывает острую необходимость в высокоспецифичных и активных препаратах для диагностики клещевого риккетсиозов Северной Азии, Астраханской пятнистой лихорадки.

Еще острее обстоит вопрос с серодиагностикой коксиеллеза, для распознавания которого отсутствует коммерческий выпуск диагностических препаратов.

В этой связи актуальной задачей является разработка на основе поверхностных белковых антигенов препаратов нового класса, пригодных для диагностики риккетсиозов группы сыпного тифа, группы клещевой пятнистой лихорадки, коксиеллеза в современных условиях.

Определенные перспективы в этом направлении открывают успехи молекулярной биологии по изучению антигенных структур риккетсий (Amano К. et al., 1995; Anacker R.H. et al., 1986; Eremeeva M. E. et al., 1996; Toman R., 1996; Weiss E., 1987; Yu X. et al., 1990).

Установлено, что поверхностные белковые структуры риккетсий и основной белок 1 R. prowazekii обладают выраженной иммуногенностью и протективной активностью, что определило использование их в качестве кандидатов в вакцины (Голиневич Е.М., 1976; Лукин и соавт., 1967; Еремеева М.Е., 1990; Dasch G.A., 1981; Dasch G.A. et al., 1984; Dasch G.A. et al., 1985).

Оценивая общую направленность работ, посвященных изучению поверхностных белковых антигенов риккетсий в качестве диагностических препаратов, следует отметить, что они до сего времени носили аналитический характер и не вышли за рамки экспериментальных лабораторных исследований (Зезеров Е.Г. и соавт.. 1986; Логинов B.C. и соавт., 1982; Лукин Е.П. и Воробьев A.A., 1967; Beati L., Raoult D„ 1996; Walker I). Н„ DaschG.A., 1995; Walker D.H., 1996; Weiss E. et al., 1987).

В литературе мы не встретили данных, касающихся производства препаратов на основе поверхностных белков риккетсий для диагностики рик-кетсиозов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Выделение и характеристика функциональных свойств поверхностных белковых антигенов R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica, С. burnetii и создание на их основе препаратов для диагностики и профилактики риккетсиозов.

Основные задачи исследования

1. Разработка технологии получения риккетсий, которые сохраняли бы основные антигенные структуры нативной риккетсиальной клетки и не содержали компонентов среды культивирования.

2. Разработка методики выделения поверхностных белковых антигенов риккетсий (периферических, мембранных и видоспецифических) и сравнительный их иммунохимический анализ.

3. Изучение гемосенсибилизирующих свойств поверхностных белковых антигенов, конструирование антигенных эритроцитарных диагности-кумов и сравнительная оценка их активности и специфичности, диагностической ценности.

4. Изучение сорбционных свойств поверхностных белковых антигенов и разработка на основе альтернативного антигена и аффинноочищенных Р(аЬ)2-фрагментов антител против иммуноглобулинов человека иммуно-ферментной тест-системы для выявления антител к R.prowazekii, R.typhi, R.sibirica.

5. Сравнительная оценка возможности использования поверхностных белковых антигенов и Fab и Р(аЬ)2-фрагментов специфических антител разной видовой принадлежности в ИФМА и разработка на их основе им-му н о ф л у о р о метр ич е с к о й тест-системы для определения риккетсий (R. prowazekii, R. sibirica, С. burnetii).

6. Изучение возможности использования полученных антигенов в качестве инактивированной комбинированной сыпнотифозной вакцины. Оценка иммуногенных, протективных и реактогенных свойств вакцины.

Научная новизна исследований

1. Впервые разработана безэфирная технология получения инактиви-рованных риккетсий (R. prowazekii. R. typhi, R. sibirica. С. burnetii), обеспечивающая получение антигенов, максимально очищенных от компонентов среды культивирования и сохранивших основные полипептиды, характерные для нативной клетки. Оригинальная технология основана на сочетан-ном использовании мембранной фильтрации и дифференциального центрифугирования. Новизна проведенных исследований подтверждена патентом № 2062110 "Способ получения диагностикума риккетсиального Провачека корпускулярного" и положительным решением о выдаче патента № 94020953/ 14 ( 020722) "Способ получения диагностикума риккетсиального си-бирика корпускулярного".

При изучении методами электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга зафиксировано наличие 6 основных полипептидов наружной мембраны, из которых специфической активностью обладали полипептиды с молекулярной массой 94 и 31 кДа.

, 2.. Впервые разработана методика получения видоспецифических антигенов R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica R.ASF. С помощью электрофореза в ПААГ в них идентифицированы полипептиды с молекулярной массой 135 и 94 кДа, специфическая активность которых подтверждена в иммуноблоттин-ге.

3. Установлена высокая гемосенсибилизирующая активность видоспецифических антигенов, определившая возможность их использования в качестве сенситина для конструирования видоспецифических АЭД с целью обнаружения специфических риккетсиозных антител.

Впервые с помощью разработанных ВАЭД показана возможность проведения межвидовой дифференциации риккетсиозных сывороток в РНГА.

Новизна проведенных исследований подтверждена патентом №2062111 "Способ получения диагностикума эритроцитарного сыпнотифозного антигенного сухого".

4. Впервые определена возможность конструирования иммунофлуоро-метрической тест-системы с использованием оригинальных риккетсиальных антигенов (R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica ) и Р(аЬ)2-фрагментов соответствующих им специфических иммуноглобулинов кролика, а также Fab-фрагментов специфических антител лошади, меченных хлоридом европия. Показана перспективность ее использования для определения антигенов риккетсий. Результаты исследований легли в основу разработки технологии на получение данной тест-системы и оформления НТД. Проведена наработка 3-х экспериментально-производственных серий.

5. Впервые экспериментально обосновано создание иммуноферментной тест-системы для определения специфических антител к риккетсиям группы сыпного тифа и группы клещевой пятнистой лихорадки. В основу ее конст-

рунроваиия положены оригинальные антигены и индикаторные аффинно-очнщенные Р(аЬ);-фрагменты антител против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена. На препарат разработана HI Д и приготовлены экспериментально-производственные серии тест-системы.

6. Отработаны схемы иммунизации по получению антириккетсиальных и антивидовых (протпв иммуноглобулинов человека и кролика) сывороток на лошадях. Показана возможность их использования в качестве диагностических сывороток, а также для изоляции и приготовления индикаторных Fab-Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулинов, меченных изотиоцианатом флуо-ресцеина или хлоридом европия (авторские свидетельства № 1503509, приоритет от 3 августа 1987 г. и №>1519369, приоритет от 30 марта 1987 г.). Применение моно- и бивалентных фрагментов иммуноглобулинов в таких высокочувствительных тестах как ИФА и ИФМА позволило значительно повысить специфичность указанных методов.

7. Разработана методика приготовления простого в использовании иммуносорбента для удаления неспецифических примесей из исследуемых биоматериалов на основе геля гидрокиси алюминия и белковых лигандов ,иммобилизованных на носителе с помощью поперечно-сшивающих реагентов. Показано, что данный иммуносорбент обеспечивает полное освобождение от перекрестно- реагирующих примесей и нежелательных компонентов, повышая тем самым специфичность иммунореагента.

8. Впервые для оценки качества полученных антивидовых сывороток (сывороток против иммуноглобулинов человека, лошади, кролика) использованы "корпускуляризованные" антигены, представляющие собой формали-низировашше и танизированные эритроциты барана, нагруженные соответствующими видами иммуноглобулинов. Показана высокая активность и специфичность разработанных тест-антигенов в непрямом МФА.

9. Впервые в эксперименте показано, что полученные корпускулярные антигены R. prowazekii в сочетании с поверхностным белковым антигеном риккетсий обладают выраженными протективными, иммуногепными свойствами и низкой реактогенностью.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Корпускулярные антигены риккетснй, полученные по оригинальной технологии, сохраняют основные антигенные структуры на уровне нативной риккетсиальной клетки и максимально очищены от компонентов среды культивирования. Новая технология является унифицированной, так как пригодна для получения антигенов различных видов риккетсий (R. prowazekii, Rtyphi, R. sibirica, R. ASF, C. burnetii). Разработанная технология обеспечивает больший (в 4-16 раз) выход антигенов, чем регламентированная технология.

2- Поверхностные белковые антигены риккетснй характеризуются высокой антигенной и гемосенсибилизирующей способностью. Установлено, что из изученных сенснтинов только видоспецифические антигены обеспечивают возможность проведения абсолютной межвидовой дифференциации риккетсиозных сывороток в РИГА.

3. Конструирование иммунофлуорометрических тест-систем с использованием оригинальных поверхностных белковых антигенов, специфических Р(аЬ)2-фрагментов и индикаторных, меченых европием, специфических Fab-фрагментов иммуноглобулинов позволяет не только повысить качество нового метода иммуноанализа, но и разработать эффективные средства для ранней диагностики (выявление риккетсий и их антигенов) и слежения за риккетсиозами.

4. Метод элиминации нежелательных примесей из антигенов с помощью иммуносорбента, носителем в котором является гель гидрокиси алюминия, лигандом - перекрестно - реагирующий иммуноглобулин, иммобилизованный на носителе с помощью поперечно-сшивающих реагентов.

5. Реализация высокой активности и специфичности иммунофермент-ного анализа возможна при условии применения видоспецифических белковых антигенов риккетсий для сорбции на планшеты, а в качестве индикаторного иммунореагента - аффинноочшценных Р(аЬ)2-фрагментов антител. Созданные по этой технологии иммуноферментные тест-системы позволяют осуществлять дифференциальную межвидовую диагностику риккетсиозов.

6. Целесообразность использования для конструирования инактивиро-ванной сыпнотифозной вакцины комбинации корпускулярного антигена и растворимого белкового антигена R. prowazekii.

Практическая значимость работы и внедрение в практику

Предложена унифицированная ресурсосберегающая технология получения риккетсиальных антигенов (R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica, С. burnetii), обеспечивающая не только увеличение выхода препарата, но и улучшающая санитарно-гигиенический мониторинг производственных помещений.

Разработан метод повышения видоспецифической дифференцирующей активности риккетсиальных антигенов с применением исключающей иммунсорбции.

. . На основе поверхностных белковых антигенов разработаны технологи! получения видоспецифических эритроцитарных диагностикумов, иммунофлуорометрических тест-систем, иммуноферментных тест-систем.

Разработано 6 новых диагностических препаратов, из которых два внедрены в производство и проводится их выпуск для практического здравоохранения. Создана нормативно-техническая документация на препараты, технология производства которых обоснована настоящими исследованиями:

1. Экспериментально-производственный регламент №401-92 на "Диагностикам риккетспозный Провачека корпускулярный сухой для РСК. Р11А.г, МФА."

2. Экспериментально-производственный регламент №400-92 на "Диагностнкум эритроцитарный антигенный сыпнотифозный сухой для РНГА"

3. Иммуноферментная тест -система для выявления антител к риккет-сиям группы сыпного тифа (находится на рассмотрении в ГИСК им. Л. А. Тарасевича)

4. Иммуноферментная тест-система для выявления антител к риккетси-ям группы клещевой пятнистой лихорадки ( находится на рассмотрении в ГИСК им. Л.А. Тарасевича )

5. Иммунофлуорометрическая тест-система для индикации риккетсий группы сыпного тифа (утверждена Генеральным директором НПО "Биомед", протокол № 2 от 11 ноября 1991 г.

6. Иммунофлуорометрическая тест-система для индикации риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки ( утверждена Генеральным директором НПО " Биомед", протокол №2 от 11 ноября 1991 г.

Полученные в процессе исследований материалы использованы при составлении соответствующих разделов методических рекомендаций "Серологические методы диагностики риккетсиозов" М., 1988 г., утвержденные МЗ СССР в декабре 1987 г.

Апробация работы

Материалы исследований доложены и обсуждены на:

- республиканской научной конференции "Перспективы использования физико-химического анализа для разработки технологических процессов и методов аналитического контроля химических и фармацевтических производств" (Пермь, 1985);

- пленарных заседаниях Пермского филиала Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов ( 1985 );

- научных конференциях Пермского НИИ вакцин и сывороток (1983, 1984,1988, 1990,1991);

- Всесоюзных конференциях по риккетсиозам (Москва 1985, 1989, 1995);

- конференции Всесоюзного научного медико-технического общества "Естественные науки - здравоохранению" (Пермь, 1987);

- на научной конференции "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии" (Томск, 1991);

- международном симпозиуме "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине" (Уфа, 1995);

- международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы" (Пермь. 1996):

Диссертация прошла экспертизу и апробирована на заседании Научно-технического совета Пермского НПО " Биомед".

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 34 научных работах, в том числе одной монографии (в соавторстве) и в 5 авторских свидетельствах и патентах.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 402 страницах машинописного текста; иллюстрирована 52 таблицами, 46 рисунками и микрофотографиями и состоит из введения, обзора данных литературы, 5 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы содержит 226 отечественных и 231 зарубежных работы.

Приведенные в диссертации материалы выполнены под руководством и при непосредственном участии автора в лаборатории эндемических рик-кетсиозов ПНИИВС НПО "Биомед" в соответствии с "Отраслевыми программами НИР по бактерийным и вирусным препаратам в институтах вакцин и сывороток" по Госзаказу (№№ госрегистрации 01. 89. 0 016 928; 01.90 0 014570; 01. 9.20 014067; 01. 9. 20 014068; 01. 9. 50. 005347; 01. 9. 70. 004807; 01. 9 7. 0027862).

Опыты по изучению аминокислотного состава риккетсиальных препаратов проведены совместно с к.м.н. JI. А. Баратовой (МГУ, НИИФХБ им. А. Н. Белозерского), по изучению полипептидного состава и специфической активности полученных фракций в иммуноблогтинге - с д.м.н., профессором Н.М. Балаевой (НИИЭИ им. Н.Ф.Гамалеи).

Приношу глубокую благодарность доктору медицинских наук П.С. Барбану, консультировавшему работу на начальных этапах выполнения.

Автор признательна всем участникам совместных исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы

Микроорганизмы: R. prowazekii, штамм Брейнль и Е; R.typhi, штамм Исаханян; R. sibirica, штаммы Нецветаев и Баев; С. burnetii, штамм М-44. Получены из музея риккетсиальных культур при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Л ii т и г с н ы: Для проведения серологических исследований использовали антигены К. prowazekii для РСК. РЛ. РНГЛ: R. typhi для РСК: R. sibirica для РСК; В. quintana для РСК; С. burnetii для РСК производства НПО "Биомед" и НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, а также антигены собственного приготовления.

Экпери ментальные модели: Исследования проводили на беспородных белых мышах массой 10-20 г, морских свинках массой 300400 г, кроликах породы шиншилла массой 2,0-3,0 кг, а также развивающихся 6-и - 7-и дневных куриных эмбрионах.

Сыворотки: В экспериментах применяли сыворотки к R. prowazekii. R. typhi, R. sibirica, С. burnetii как производства НПО "Биомед", так и собственного приготовления. Диагностические сыворотки для имму-ноэлектрофореза против сывороточных белков лошади, кролика, морской свинки; люминесцирующие антивидовые (против иммуноглобулинов человека, лошади, кролика, морской свинки) сыворотки производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Сыворотки против сывороточного альбумина, против компонентов желточной оболочки КЭ, против иммуноглобулинов человека, лошади, кролика собственного приготовления. Кроме того были использованы сыворотки людей с болезнью Бршшя-Цинссера, Астраханской пятнистой лихорадкой, коксиеллезом.

Эритроцитарные диагностикумы:В опытах по сравнительной оценке препаратов были использованы коммерческие жидкий эрит-роцитарный сыпнотифозный диагностикум, иммуноглобулиновый эритро-цитарный диагностикум, а также экспериментальные серии антигенных эритроцитарных диагностикумов, нагруженных разными белковыми сенси-тинами.

Профилактические препараты: При оценке экспериментальных серий комбинированной инактивированной сыпнотифозной вакцины в качестве препаратов сравнения использовали химическую сыпнотифозную сухую вакцину, производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и живую комбинированную сыпнотифозную вакцину Е, производства НПО "Биомед".

Методы

Методы культивирования: Риккетсии культивировали в развивающихся куриных эмбрионах по методу II.R Сох (1941), в органах и тканях белых мышей (П.Ф. Здродовский и Е.М. Голиневич, 1972).

Серологические методы:

Специфическую активность антигенов и антител оценивали в РСК (П.Ф. Здродовский и Е.М. Голиневич, 1972), в РНГА с ЖЭСД (P.A. Пше-ничнов и соавт., 1967), РНГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным диаг-ностикумом (П.С. Барбан, A.B. Мисенжников, 1979), реакцию нейтрализации антигена (РНАг) в модификации А. В. Мисенжникова и Н. А. Бривкальн (1974). прямом МФА (A. Coons, М. Kaplan, 1950; Р.Б. Гольдин и соавт.,

1972), непрямой МФА (Т. Weller, A. Coons, 1954; Р.Б. Гольдин и соавт., 1977). иммуноферментный анализ (Л.И. Райхер и соавт.. 1991). иммуноф-луорометрический анализ (К. Pettersson et al., 1983).

Физико-химические и и м му но х им иче с к ие методы. Определение белка в препаратах (О. Lowry, 1951) и спектров поглощения объектов исследования проводили при длине волны 260-280 нм на спектрофотометре СФ-26, на фотозлектроколориметре ФЭК-56 М при длине волны 560 нм.

Физико-химический состав антигенов изучали с использованием методов электрофореза в полиакриламидном геле по U. К. Laemmli (1970), гель-хроматографии в тонком слое сефадекса Г-200 ( К. Bergstrom, 1966; П. С. Барбан и Л. И. Сухорослова, 1973), иммуноблоттинга, поставленного в соответствии с рекомендациями фирмы Bio-Rad, колоночной гель хроматографии (P.C. Незлин, 1966).

Для определения аминокислотного состава изучаемых антигенов проводили их полный кислотный гидролиз по общепринятому методу (Moore S., Stein W.N., 1963) с последующим анализом с помощью прибора 835 Hitachi amino acid analyzer (Japan), используя систему мультихром для обработки данных.

Методы определения специфических свойств вакцины.

Антигенную активность разработанных препаратов определяли по динамике нарастания тигров антител в сыворотке крови морских свинок и кроликов в ответ на введение риккетсиальных антигенов или комбинированной инактивированной сыпнотифозной вакцины. Для оценки способности антигенных препаратов вызывать синтез антител разной специфичности были использованы РСК, нМФА, РНГА с эритроцитарными диагностикумами на основе сенситинов, разработанных специально для этих исследований. Для выявления групповых антител использовали диагностикум, полученный сенсибилизацией формалинизированных и танизированных эритроцитов (ФТЭ) барана поверхностным белковым антигеном риккетсий (А. Н. Пан-тюхина и соавт., 1992). Эритроцитарный диагностикум для выявления ви-доспецифических антител готовили путем сенсибилизации ФТЭ оригинальным антигеном риккетсий (патент №2062111).

Протективную активность исследуемой вакцины оценивали на модельной сыпнотифозной инфекции по степени выраженности инфекционного процесса у вакцинированных животных (морских свинок) после заражения вирулентной культурой R. prowazekii, штамм Breinl.

Интенсивность побочного влияния вакцины (острую и хроническую токсичность) на организм животных (белых мышей) изучали в соответствии с РД 42-28-8-89 "Доклинические испытания МИБП".

Полученные данные обрабатывали статистически. Достоверность показателей, степень различий между ними оценивали методами вариационной

статистики (И. П. Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962), а также используя программный пакет F.xcel 7.0 для Windows 95.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода выделения и очистки поверхностных белковых риккетсиальных антигенов

Одна из важнейших задач совершенствования качества выпускаемых и разработки новых диагностических и профилактических препаратов связана с получением антигенов риккетсий, сохраняющих в процессе очистки основные антигенные и протективные компоненты, присущие нативному возбудителю.

Известно, что применяемые в производстве риккетсиальных препаратов методы выделения риккетсий основаны на использовании эфирной обработки. Показано, что эфир вызывает не только серьезные морфологические повреждения микроорганизмов, но и способствует отторжению от клеточной стенки микрокапсулы, содержащей поверхностный серотипируемый антиген (Н.М. Бадаева и соавт., 1966), охарактеризованный рядом исследователей как протективный иммуноген (G.Dasch, 1981; Е. Weiss et al., 1987).

Эти данные явились предпосылкой для разработки новой бёзэфирной технологии получения риккетсиальных антигенов с сохраненной антигенной структурой.

Для выделения таких антигенов была предложена оригинальная технология, включающая инактивацию риккетсий, гомогенизацию взвеси , дифференциальное центрифугирование с последующей фильтрацией через отечественные мембраны 'Владипор' марки МФА-ОС.

В модельных опытах по изоляции корпускулярных антигенов из ово-культур R.prowazekii были отработаны основные условия инактивации риккетсий; определен дезинфектант, обеспечивающий фиксацию протектив-ного антигена на поверхности риккетсиальной клетки; установлены оптимальные параметры гомогенизации инактивированной взвеси риккетсий, дифференциального центрифугирования, разработаны условия проведения микрофильтрации.

Контроль каждого этапа очистки проводился по специфической активности (в РНГА и нМФА), степени очистки ( в нМФА) и выходу антигена (прямой подсчет количества риккетсий). Установлено, что наиболее эффективным фиксатором является формалин, обеспечивающий закрепление поверхностных антигенных структур на риккетсиальной клетке с сохранением их видоспецифической активности. Гомогенизация тканей при 5000 об/мин в течение 3 мин при сочетанном использовании высокоскоростного (10000 об/мин в течение 30 мин) и низкоскоростного (1500 об/мин в течение 5

мин) центрифугирований обеспечивала получение взвеси, пригодной для микрофильтрации.

В доступной научно-медицинской лшературе отсутствуют сведения о применении этого метода для очистки риккетсий, поэтому значительное внимание было уделено изучению различных условий, обеспечивающих достижение качественного разделения риккетсий от балластного материала с помощью микрофильтрации.

Основными критериями полноты разделения составляющих взвесь биореагентов было отсутствие в фильтрате, содержащем риккетсии, тканевых компонентов желточных оболочек. Контроль за качеством разделения осуществляли с помощью нМФА со специфической и противожелточной сыворотками. На модели R. prowazekii были апробированы разные типы мембран и фильтрационных установок, различные варианты фильтрующих растворов, объемов и концентраций риккетсиальной смеси, определен температурный режим и давление инертного газа.

В результате этих наблюдений были определены оптимальные параметры микрофильтрации, заключающиеся в использовании фильтрационной ячейки с перемешивающим устройством типа ФМО - 500 и мембран "Владипор" с размерами пор 3 мкм, фильтрующего 1 М раствора хлорида калия, 5%-ной концентрации риккетсиальной взвеси. Качественное разделе-гае смеси достигалось при давлении инертного газа в пределах 0,1-0,15 мПа при температуре 20°С. Растворимые желточные компоненты взвеси были элиминированы из фильтрата при последующем высокоскоростном центрифугировании.

Разработанный метод был апробирован при получении антигенов из овокультур R. typhi, R. sibirica. Показано, что выход антигена при использовании разработанного метода возрастает в 3-4 раза по сравнению с регламентированным методом. На способ получения риккетсий получен патент № 2062110 и положительное решение о выдаче патента № 94-020935/14 (020722).

При применении этой технологии для выделения С. burnetii, репродуцированных в ткани желточных мешков КЭ, возникли определенные трудности, связанные с извлечением коксиелл из "зафиксированной" ткани хозяина. Применение метода ферментативного гидролиза тканевого дебриса позволило повысить выход С. burnetii до 63% (рис.1).

Эти данные были подтверждены при масштабировании технологии в условиях экспериментального производства.

По разработанной технологии было получено 75 серий антигенов, включая 52 серии антигена R. prowazekii, 2 - R.typhi, 10 - R. sibirica, 1 -R.ASF, 12-С. burnetii.

Важными критериями, определяющими качество препарата, являются его активность, специфичность и стандартность. Нами была проведена де-

тальная оценка антигенной активности и специфичности полученных антигенов в различных серологических тестах: РСК. МФА. ИФА.

А

i

27%

Рис. 1. Выход препарата при очистке коксиеллезной взвеси по разным технологиям

А - очистка с применением дифференциального центрирования в сочетании с фильтрацией через мембраны.

Б - очистка методом, включающим дифференциальное центрифугирование, протеолиз трипсином и фильтрацию через мембрану.

1 - выход антигена коксиелл Бернета.

2 - технологические потери коксиелл.

Приготовленные по новой технологии корпускулярные антигены характеризовались в РСК специфической активностью (1:64-1:128 ) сопоставимой с растворимыми коммерческими антигенами, но отличались от них более высокой (4-5-кратной) межвидовой дифференциацией, что было зафиксировано с видовыми сыворотками R. prowazekii и R. typhi, R. sibirica и R.ASF. Показана высокая активность (1:2000 - 1:4000) антигенов в МФА и ИФА, что определило использование этих антигенов в указанных серологи-

ческих тестах. Следует отметить, что коммерческие препараты для этих реакций отсутствуют. ,

Диагностическая ценность полученных препаратов в плане выявления гомологичных антител была установлена при исследовании иммунных сывороток в различных серологических реакциях: РСК, РНАг, нМФА. В опытах с сыворотками людей с болезнью Брилля-Цинссера и диагностическими сыворотками эспериментально зараженных животных было установлено, что приготовленные антигены R. prowazekii и R. typhi позволяют обнаруживать специфические антитела во всех указанных серологических тестах. Было зафиксировано, что при 100% специфичности препаратов чувствительность их оказалась неравнозначной. Чувствительность препаратов в РСК составила 87%, в РНАг и нМФА - 100%.

Результаты этих наблюдений позволили рекомендовать экспериментальные антигены в качестве "единого" антигена для применения в таких серологических тестах, как РСК, РНАг, МФА.

Важной серологической характеристикой полученных антигенов группы сыпного тифа (R. prowazekii и R. typhi) явилась их межвидовая дифференцирующая активность. При параллельном титровании иммунных сывороток к R. typhi в РСК с антигеном R. prowazekii средняя геометрическая титра специфических антител составила 1:42,2, а с антигеном R. typhi -1:464,7. В аналогичных постановках с коммерческими антигенами достигался стандартный эффект дифференциации, поскольку указанные сыворотки взаимодействовали с коммерческим растворимым антигеном R. typhi в титре 1: 320, а с антигеном R. prowazekii - 1:160 (табл. 1)

При титрации антигенов R. prowazekii, R. typhi в РСК с 107-ю сыворотками (от больных марсельской лихорадкой, от животных, иммунизированных R. sibirica) и 135-ю сыворотками здоровых людей-до норов крови не было зарегистрировано перекрестно-реагирующих антител, что указывало на достоверную специфичность антигенов. Строгая специфичность была зафиксирована при исследовании антигенов R. sibirica, R ASF, С. burnetii с 148-ю сыворотками к риккетсиям группы сыпного тифа ( от больных и иммунных животных) при их высокой активности с гомологичными сыворотками (титр 1:320- 1: 1280).

Принципиально важными с точки зрения установления сохранности антигенных структур явились сравнительные исследования иммунохимическо-го и химического состава полученных антигенов и аналогичных коммерческих антигенов R. prowazekii, R. sibirica.

Таблица 1

Сравнительная оценка специфичности испытуемого антигена Кфитагекп в РСК с видовыми сыворотками к риккетсиям группы

сыпного тифа

Специфический титр в РКС

№ № Исследуемые с антигеном с коммерческим

сыворотки Я ргоиагекп антигеном

(экспериментальная серия) R typln

1. 160 80 640

?. 161 80 640

3. 162 20 320

4. 163 20 320

5. 164 20 640

6. 165 40 320

7. 166 40 320

8. 167 80 640

9. 168 40 320

10. 169 40 1280

11. 200 80 320

12. 201 80 320

13. 202 20 320

Средний геометрический титр сывороток 1:42,2 1:464,7

14. Сыворотка к риккетсиям Провачека для

РСК с. 79 №3079 годн. Х1-96 титр 1:320 1:320 1:160

15. Сыворотка к риккетсиям тифи для РКС

с.77 №2754 годн. 1Х-94 титр 1:320 1:40 1:320

При сопоставлении профилей элюции аминокислот указанных антигенов показано, что по составу аминокислот оба антигена аналогичны, хотя суммарное количество белка в коммерческом антигене в 1,24 раза выше, чем в изучаемом антигене. В обоих антигенах отмечено наличие большого количества нингидрин - положительных соединений кислого характера, поглощающих при длине волны 440 нм, что указывает на присутствие полисахаридов (рис. 2а, 26).

Большее суммарное количество белка аминокислот, определяемое в 1 аликвоте коммерческого антигена, позволяло ожидать выявление большего числа белковых компонентов при разделении его методом электрофореза в ПААГ. Однако, при анализе электрофореграмм сравниваемых антигенов нами было отмечено наличие в коммерческом антигене лишь одной полосы полипептидов в зоне маркера 94 кДа, в то время, как экспериментальные антигены содержали 6 основных полос полипептидов (рис. 3). Молекулярные массы этих полипептидов по отношению к стандартным белкам были

w ст\

X чз о S tu H

о

>3

S sa я о S 2 ci •o л a> о я о

■-I

о

аз

и

H

4

п> X к

70

—i о

5 р

N О PC

-MpbJJ'

о

Ï s

X

-Iiis 0.444

-Arj 0.218

20t 44

:

Рис. 3. Характеристика состава риккетсиальных антигенов при исследовании их методом электрофореза в полиакриламидном геле

Дорожки 1 и 2 мембранный антиген рнккетсий Провачека

3 и 4 корпускулярный антиген рнккетсий Провачека 5 и 6 риккетсии Провачека, штамм Брейнль 7 и 8 мембранный антиген риккетсий сибирика 9 и 10 корпускулярный антиген риккетсий сибирика 11 и 12 риккетсий сибирика. штамм К-1 13 маркеры молекулярных масс.

Нечетные номера - прогревание антигенов при 22°С в течение 2-х часов; четные номера - прогревание аетигенов при 95°С в течение 5 мин

идентифицированы как 94 кДа, 60 кДа, 31 кДа, 29кДа, 25кДа,17 кДа, что позволило отождествить их с основными полипептидами наружной оболочки риккетсиальной клетки (Емельянов В.В., 1992; Osterman J.V., Eisemann C.S. 1978; Smith D.K. Winkler H.H., 1979; Dasch G.A.et al., 1984).

Методом иммуноблоттинга обнаружено, что с сыворотками больных сыпным тифом реагируют главным образом полипептиды с молекулярной массой 94 и 31 кДа (рис. 4).

Рис. 4. Изучение специфичности полипептидов риккетсиальных антигенов методом иммуноблоттинга Дорожки: 1 и 2 мембранный антиген риккеггсий Провачека

3 и 4 корпускулярный антиген риккетсий Провачека 5 и 6 риккетсии Провачека, штамм Брейнль 7 и В мембранный антиген риккетсий сибиряка 9 и 10 корпускулярный антиген риккетсий сибиряка 11 и 12 риккетсии сибиряка, штамм К-1 А - сыворотка больного сыпным тифом;

Б - сыворотка клещевым риккетсиозом Северной Азии

Полученные результаты легли в основу разработки экспериментально-производственной технологии и оформления нормативно-технической документации на препарат "Диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный сухой для РСК, РНАг, МФА, одобренной Научно-Техническим Советом ПНИИВС, прошедшей экспертизу в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, ут-

вержденной МЗ РФ и реализованной в условиях производства НПО "Биомед".

В итоге представленные нами материалы определяют реальную возможность получения сухих, стабильных при хранении, полноценных по антигенной структуре корпускулярных антигенов риккетсий, пригодных для определения специфических антител в нескольких серологических реакциях : РСК, РНАг, МФА. Кроме этого, разработка качественных антигенов послужила методическим обеспечением дальнейших исследований по выделе-нгао поверхностных белковых антигенов риккетсиалыюй клетки.

При выделении поверхностных белковых антигенов из риккетсий за основу был принят принцип метода, предложенного J. B.C. Findlay ( 1990) для выделения периферических и интегральных белков животных клеток.

Основным объектом изучения были избраны указанные антигены R. prowazekii, а основным методом их выделения - солюбилизация с помощью неионного детергента - тритона Х-100.

На основании детального изучения динамики выделения поверхностных антигенов в зависимости от концентрации детергента, рН среды, температуры и продолжительности солюбилизации были определены оптимальные условия обработки риккетсий тритоном Х-100. Они включали солюбилиза-цию периферических белков 2% -ным раствором детергента при рН 7,4 в течение 1 часа.

При таких условиях обработки "единых" антигенов детергентом не наблюдалось разрушения клеток, что подтверждено было данными иммуноф-луоресцентного анализа. В то же время происходил интенсивный переход в раствор серологически активного поверхностного белка риккетсий (ПБР), активность которого через 1 час солюбилизации возрастала в 50,75 раз по сравнению с исходным антигеном.

Для извлечения мембранных (интегральных) белков риккетсий (МБР) осадок, полученный после обработки тритоном Х-100, подвергали щадящему экстрагированию физиологическим раствором. В процессе их извлечения наблюдалось разрушение целостности риккетсиальной клетки на мицеллы, наблюдаемые в иммунофлуоресцентном анализе. Полученные растворимые антигены, обладали в РНГА значительной серологической активностью, превышающей исходный антиген в 27,2 раза.

Сопоставимый анализ профилей кислотных гидролизатов 9 поверхностных и 9 мембранных белков и цельных антигенов зафиксировал количественные и качественные различия их аминокислотного состава (рис. 5а, 56). Показано, что в поверхностных белках отсутствует аминокислота гистидин, а суммарное количество аминокислот в 4,18 раз меньше, чем в цельном антигене. Напротив, мембранные белки по спектру аминокислот были сопоставимы с цельным антигеном, но по их суммарному количеству белка превышали последний в 3,52 раза.

Хг г.;.!з т .:г : -г- ; - 4 ^

5 10 1} 20 25 30 35. 40 45 50 55 61) 65 70 75 80 85 90 мин

Рис. 5а. Хроматограмма мембранных белков К.рго\уагекп

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 мин

Рис. 56. Хроматограмма поверхностных белков Я. рго\уагекн

Наличие белка в изучаемых фракциях было подтверждено и методом электрофореза в ПААГ. При определении полипеигилного состава изучаемых антигенных фракций были идентифицированы шесть основных полипептидов наружной мембраны II. ргои/агекп и Я. эШшса (рис. 3 и 4).

При серологическом анализе поверхностных и мембранных белков было установлено наличие в их составе как видоснецифических, так и групповых антигенов. Последние нередко обусловливали неспецифические реакции за счет наличия перекрестно-реагирующих антигенов. Для элиминации их из растворов солюбилизатов была применена исключающая иммуно-сорбция.

Для этого с целью повышения специфичности антигенов были проведены исследования по получению иммуносорбентов. Конструирование им-муносорбентов проводили на основе наиболее приемлемых в практике носителей: геля гидрокиси алюминия, полисорба. В качестве лиганда использовали гетерологичный групповой иммуноглобулин, который был иммобилизован на матрице с помощью глутарового альдегида.

В серии специальных экспериментов была выявлена высокая сорбци-онная способность у иммуносорбента на основе гидрокиси алюминия и отработаны условия его применения для истощающей сорбции. С помощью приготовленного иммуносорбента были получены антигены, обладающие абсолютной межвидовой дифференциацией и строгой специфичностью.

В результате этих наблюдений была экспериментально обоснована и апробирована на примере приготовления 79 серий методика получения поверхностных, мембранных белков риккетсий и видоспецифических антигенных комплексов риккетсий (ВАКР).

Предполагалось, что сконструированные на их основе антигенные эритроцитарные диагностикумы (АЭД) будут обладать более широкими диагностическими возможностями в плане иммунологического мониторинга в очагах инфекции, тестирования иммунологической перестройки у привитых химической сыпнотифозной вакциной и проведения внутригрупповой дифференциации риккетсиозов, чем коммерческий препарат ЖЭСД.

Изучение гемосенсибилизирующих и специфических свойств различных поверхностных белковых антигенов риккетсий

На основании детального изучения влияния ряда факторов, определяющих эффективность сенсибилизации (доза сенситина, температурный режим и продолжительность сенсибилизации) были установлены оптимальные условия приготовления АЭД. Оптимальный режим сорбции ПБР,МБР и ВАКР на формалинизированных и танизированпых эритроцитах происходил при концентрации белков 1,25 мг/мл, температуре 50°С и временной экспозиции 1 час.

Высокая гемосенсибшшзирующая активность приготовленных сенси-тинов дотекает предположение, что детергент дезагрегирует комплексы поверхностных структур риккетсиальной клетки и тем самым дезэкранирует участки комплементарные рецепторам эритроцитов.

Для объективной характеристики специфической активности и межвидовой дифференциации разных АЭД был разработан набор сывороток, включающий иммунные и реиммунные сыворотки к риккетсиям группы сыпного тифа, иммунные и реиммунные сыворотки к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки и сыворотку к Proteus ОХ 19.

В опытах, проведенных с разными АЭД было установлено, что их межвидовая дифференцирующая способность зависит от конструкционных характеристик сенситина. АЭД, приготовленные на основе полисахаридного антигена не обеспечивал дифференциации сывороток к R. prowazekii и R. typhi ,что постулировалось как непригодность РНГА для проведения межвидовой дифференциации

АЭД на основе ПБР и МБР обеспечивали относительную дифференциацию сывороток с индексом отношений гомологичной сыворотки к гете-рологичной 3,8 и 16 соответственно. И только использование АЭД на основе ВАКР позволило проводить абсолютную межвидовую дифференциацию сывороток одной таксономической группы.

Весьма важным для характеристики свойств приготовленных диагно-стикумов являются результаты оценки их диагностических возможностей. Препараты на основе "детергентных" сенситинов обладали высокой серологической активностью в отношении иммунных и реиммунных диагностических сывороток; сывороток больных в ранний период заболевания и в период реконвалесценции, а также лиц, вакцинированных ХСВ, что отличало их от коммерческого препарата ЖЭСД, обеспечивающего выявление специфических антител только у больных в ранней фазе сыпнотифозной инфекци-ии в иммунных диагностических сыворотках.

Результаты этих наблюдений позволили расширить рамки применения АЭД и рекомендовать разработанные препараты не только для выявления риккетсиозов у людей во все стадии инфекции, но и для изучения иммунологической структуры населения в очагах инфекции, оценки напряженности иммунитета у вакцинированных.

Завершающим этапом этих исследований явилась разработка экспериментально-производственной технологии изготовления сухого эритроцитар-ного антигенного сыпнотифозного диагностикума (СЭСД), что нашло отражение в соответствующей документации, одобренной Ученым Советом НИИВС, утвержденной МЗ РФ и реализованной в условиях производства.

По данной технологии были приготовлены лабораторные серии АЭД для выявления специфических антител при клещевом риккетсиозе, крысином сыпном тифе, лихорадке Ку, что указывало на универсальность данной технологии.

Конструирование тест-систем для выявления риккетсий и антител к ним.

Разработка иммунофтгуорометрической тест-системы

В современной иммунодиагностике наиболее важной задачей является разработка средств и методов выявления антигенов с целью раннего и экспрессного распознавания риккетсиозных болезней. Для решения поставленной задачи была разработана иммунофлуорометрическая тест-система (ИФМТС), основанная на детекции лантанидной метки и предназначенная для обнаружения риккетсиальных антигенов.

Для разработки ИФМТС предстояло решить неординарные вопросы повышения специфичности ингредиентов, входящих в ее состав: иммуноглобулинов, стандартных антигенов и конъюгатов.

Для получения специфических иммуноглобулиновых компонентов ИФМТС, предназначенных для сорбции на планшеты или приготовления конъюгатов, использовали сыворотки, полученные от разных видов животных: кроликов, лошадей, иммунизированных R. prowazekii или R. sibirica.

В качестве иммунореагента для сорбции на планшете было решено использовать Р(аЬ)2-фрагменты специфических антириккетсиозных иммуноглобулинов. Для этого кроликов иммунизировали R. prowazekii или R. sibirica.

В работе применяли сыворотки с содержанием специфических антител внМФА- 1:2560-1:5120, РИГА-1:8000 - 1:16000, РСК 1:640- 1:2560.

Из иммунных сывороток выделяли иммуноглобулины высаливанием сернокислым аммонием с последующим удалением нежелательных и перекрестно-реагирующих примесей с помощью истощающей сорбции.

Иммуносорбент готовили на основе геля гидрокиси алюминия. В качестве лиганда. использовали альбумин или желточный антиген, которые закрепляли на носителе с помощью поперечносшивающего реагента. На основе детального изучения методических приемов конструирования иммуносор-бентов были определены оптимальные условия их приготовления (соотношение носитель : лиганд равно 1:1, иммобилизация лиганда с помощью 0,25%-ного раствора глутарового альдегида при температуре 4-10°С). Приготовленные таким образом иммуносорбенты обеспечивали полную де-контаминацию иммуноглобулинов от побочных примесей. Контроль препаратов методами иммуноэлектрофореза, тонкослойной гель-хроматографии на сефадексе Г-200 и электрофореза в ПЛАТ свидетельствовал о их гомогенности и однородности.

В сравнительных экспериментах были оценены сорбционные и специфические свойства целых молекул иммуноглобулинов и их Fab - и F(ab)2-фрагментов. Анализ полученных данных позволил установить, что препаратом, обеспечивающим минимальный уровень неспецифических реакций являются Р(аЬ)2-фрагменты специфических иммуноглобулинов. Высокие ак-

тивность их, сопоставимая с целой молекулой иммуноглобулинов, обеспечивается сохранением в их структуре 2-х центров специфической активности.

Строгая специфичность препарата связана с отсутствием в его структуре Бс-фрагмента, присущего целой молекуле иммуноглобулина и обусловливающего неспецифические взаимодействия последнего. Сенсибилизированные на планшете РаЬ-фрагменты обладают низкой специфической активностью, что обусловлено с одной стороны наличием одного антигенсвязы-вающего центра, а с другой - пространственным взаимоотношением с поверхностью планшета, экранирующем свободный доступ к к антшельной детерминанте.

Препарат выбора использовали для сорбции на планшете в концентрации 1мг/мл.

Для получения конъюгата в сопоставимых опытах был определен оптимальный (иммуноглобулины, Р(аЬ)2- или РаЬ-фрагменты) иммунореагент. Исходя из данных проведенных исследований коньюгат, обеспечивающий минимальную неспецифическую и фоновую флуоресценцию, готовили из РаЬ-фрагментов специфических иммуноглобулинов лошади (способ защищен авторским свидетельством на изобретение) и последующей их маркировкой хлоридом европия. Для синтеза стабильных и активных антириккет-созных конъюгатов (к К ргошагекн или Я, эЛтса) были уточнены оптимальные количества флуорофора, хелатообразующего реагента, определены условия метки и удаления непрореагировавших ингредиентов.

Результаты этих наблюдений показали, что высококачественные конъ-югаты могут быть получены при соблюдении следующих условий: соотношение РаЬ-фрагмент : хелатирующий реагент : флуорофор 2:1:2, продолжительность конъюгации 15 мин при температуре 4-10°С, удалении непрореагировавших реагентов путем переосаждения нейтральными солями.

В итоге получали конъюгаты с достаточно близкими биохимическими и серологическими характеристиками: молярное соотношение белок : флуорофор 5,0 - 5,8 при содержании белка 0,45 - 0,5 мг/мл и активности в ИФМА 1:1000- 1:2000.

Испытание разных белковых антигенов с помощью разработанной тест-системы показало, что препаратом выбора являются мембранные белки рик-кетсий. Их высокая активность была обусловлена наличием видоспецифиче-ских и групповых антигенов, взаимодействующих с соответствующими специфическими антителами, иммобилизованными на твердофазном носителе. Применение антигена в высоких концентрациях обеспечивало строгую специфичность ИФМА. Учитывая результаты этих наблюдений, МБР были предложены в качестве положительного контроля в комплект тест-системы.

Применение такой конструкции ИФМТС позволило реализовать высокие качества иммунофлуорометрического анализа при выявлении корпускулярных и растворимых антигенов ( II. ргстагеки или II. эШтса). В сравнительных исследованиях было показано, что чувствительность этого ме-

хода превышает чувствительность РСК в 1000 раз. Контроль специфичности разработанной тест-системы проверяли путем оценки интенсивности флуоресценции на приборе ИФИ-01 на материалах из бактериальных антигенов и гетерологичных видов риккетсий, эмульсий из тканей и органов не-инфицированных и инфицированных животных.

Результаты опытов по индикации риккетсий и их антигенов (84 серии растворимых и корпускулярных антигенов и 1894 желточные оболочки .инфицированные R. prowazekii, R sibirica, С. burnetii ) позволили установить, что разработанная тест-система высокочувствительна, специфична и позволяет определять возбудитель в биоматериалах, взятых в практически неразведенном виде

На основании полученных материалов был разработан экспериментально-производственный регламент и оформлена соответствующая документация, которая рассмотрена и одобрена Ученым Советом НПО "Биомед".

Усовершенствование иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител

Повышение эффективности эпиднадзора за риккетсиозами предусматривает и совершенствование средств диагностики в плане быстрого определение уровня всех видов образующихся антител. Методом, отвечающим этому условию является иммуноферментный анализ.

В основу конструирования иммуноферментной тест-системы были заложены основные технологические принципы, разработанные в НПО "Биомед" профессором Л. И. Райхером и соавт. и д.м.н. Н. П. Ефимовой и соавт. Применительно к диагностике риккетсиозов для сорбции антигенов были использованы положительно зарекомендовавшие себя в ИФМА мембранные белки риккетсий, а в качестве конъюгата - аффинноочшценные Р(аЬ)2-фрагменты антител против Ig G человека.

В серии специальных экспериментов были детально изучены условия постановки ИФА, выявлены оптимальные концентрации используемых ингредиентов, В процессе отработки условий постановки ИФА при тестировании сывороток доноров крови и сотрудников цеха риккетсиозных препаратов были отобраны образцы положительных и отрицательных сывороток для использования их в качестве контрольных тест-сывороток. Данная тест-система включала оригинальные индикационные мембранные антигены R. prowazekii и R. sibirica и конъюгат, положительные и отрицательные контрольные сыворотки, наборы солей.

Предстояло оценить диагностическую значимость ИФА с применением данной комплексной тест-системы среди существующих серологических реакций: РСК, РИГА, нМФА (табл.2).

В этих исследованиях было показано явное преимущество ИФА по сравнению с традиционными тестами при 100% совпадении результатов по-

ложительных находок. При индикации сыпнотифозных антител величины титров, выявляемые в ИФА. в 19.8 - 37.2 раза превышали титры антител, определяемых общепринятыми реакциями.

Таблица 2

Результаты титрования сывороток в различных сероиммунологических тестах

Исследуемые Титры специфических антител (*)

сыворотки Кол-во РСК РИГА нМФА ИФА:СТ ИФТС к КПЛ

Сыворотки больных болезнью Бр илля-Цинссер а 10 1:2580,3± 1292,2 1:1485,3± 293,7 1:1599,9± 407,3 1:51200± 3386,5 0

Сыворотки лиц, привитых СХСТ-вакциной 10 1:21,7±3,3 0 1:45,9±4 1:8444,8± 1168,3 0

Сыворотки лиц, переболевших марсель-ской лихорадкой 42 1:5,8 - 1:11,7 0 1:1573± 142,4

Сыворотки больных с субфебрилитетом 52 0 0 0 0 0

Сыворотки здоровых людей 82 0 0 0 0 0

Примечание: (*) - средняя геометрическая титров и ее стандартная ошибка, (-) исследование не проводили, (0) - отрицательный результат.

Существенным достоинством ИФА является возможность выявления полного спектра антител, включая специфические антитела у лиц, привитых ХСВ. В отличие от РИГА с ЖЭСД, дающего отрицательные результаты с сыворотками привитых ХСВ, в ИФА закономерно обнаруживались антитела к Я. ргошагекп в титрах 1:8444,8.

Аналогичная закономерность была установлена при испытании другой составляющей комплексного препарата - тест-системы для обнаружения антител к риккетсиям группы КПЛ. При серологическом исследовании сывороток к риккетсиям этой группы с помощью РСК, нМФА, было зафиксировано значительное (134,4 - 271,2 раза) преимущество ИФА при выявлении антител.

На примере получения 12 серий была экспериментально доказана возможность приготовления комплексной тест-системы для выявления антител к риккетсиям группы сыпного тифа и группы клещевой пятнистой лихорадки.

На основании данных наблюдений была разработана технология . получены 3 экспериментально-производственные серии и оформлена документация, которая после одобрения Научно-Техническим Советом НПО "Биомед" и направлена на рассмотрение в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

АСПЕКТЫ ДАЛЬНЕЙШЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗРАБОТАНЫХ

КОРПУСКУЛЯРНЫХ И РАСТВОРИМЫХ РИККЕТСИАЛЬНЫХ

АНТИГЕНОВ

Характеристика функциональных свойств полученных антигенов представляется неполной без оценки их иммунобиологических свойств, в частности, протективных и иммуногенных свойств. В связи с этим были проведены исследования по изучению иммуногенных свойств с целью получения диагностических сывороток для комплектации препаратов и изучения комплекса антигенов в качестве модели комбинированной инактивированной сыпнотифозной вакцины. Изучения были проведены на модели Я. prowazekii

Исследования в области применения риккетсиальных антигенов для получения диагностических сывороток

Априори можно было предположить, что иммунизация животных антигенами, сохранившими антигенные структуры и очищенных от побочных примесей, позволит получить сыворотки, содержащие полный спектр антител и свободные от контаминирующих антител.

С этой целью были проведены исследования по иммунизации кроликов корпускулярным, растворимыми антигенами и комплексным антигеном в сравнении с овокультурой живых Я. ргошагекн по разработанной схеме иммунизации.

Оценку качества сывороток осуществляли в РСК, РНАг, РНГА с гомо-л0гичш.1м и перекрестно-реагирующими антигенами (рис. 6).

При сопоставлении результатов исследований было установлено, что более полный спектр антител (гемагглютининов, КФ-антител, нейтрализующих) определяется при иммунизации животных комплексным антигеном. Полученные сыворотки имели значительные титры специфических антител во всех трех серологических реакциях (титры 1:640 - 1:2560), сопоставимые с титрами антител, получаемыми в ответ на введение животным овокульту-ры живых риккетсий.

Отличия сравниваемого иммунологического сырья были выявлены лишь при обнаружении контаминирующих антител к компонентам желточного мешка куриного эмбриона в РНГА. Констатировано, что при введении животным препаратов антигенов уровень противожелточных антител не превышал 1:10, в то время как при иммунизации овокультурой живых риккетсий контаминирующие антитела определялись в титре 1:40 - 1:80.

5 ¡0 15 20 25 30 35 40 Дни

А

5 10 15 20 55 3D В 40 ДНИ

5 Го 15~ 20 25 30 35 40 Дни

0 " 5 10 15 20 25 30 35 40 Дни

Обозначения: •-• - гемагглютинины,

I-Г - КФантнтсла,

•-----. . нейтрализующие антитела

А - корпускулярный антиген, Б - растворимый антиген, В -комплексный, Г - овокультура живых рмккетсий.

Рис. 6. Динамика накопления антител у кроликов при иммунизации корпускуляторным, растворимым и смесью антигенов 11.рго\уагекн

Установленные особенности в проявлении антигенного действия испытуемых препаратов свидетельствовали о перспективности применения комплексного антигена для получения качественного иммунологического сырья, пригодного для комплектации диагностических препаратов (антигенов и АЭД).

Дальнейшей задачей наших исследований было выяснение биологической активности у комплексного антигена.

Использование риккетсиальных антигенов в качестве модели комбинированной инактивированной сыпнотифозной вакцины

Материалы, характеризующие иммунологическую активность риккетсиальных антигенов, определили необходимость испытания комплексного антигена в качестве вакцины для профилактики сыпного тифа. Эта проблема приобретает особенно важное значение в последнее время в связи с "возвращением" сыпного тифа.

В специальных экспериментах было изучено количественное соотношение корпускулярного и растворимого антигенов в вакцине, разработаны критерии ее стандартизации, степени очистки, определения специфической активности.

В результате предварительных исследований было определено, что оптимальное соотношение корпускулярного и растворимого компонентов вакцины составляет 1:1, стандартная удельная активность 480-502 ФЕ /мкг белка. Для контроля степени очистки вакцины следует использовать электрофорез в ПААГ. Исследование биологических свойств было проведено на 3-х лабораторных сериях вакцины. Препаратом сравнения при оценке биологических свойств вакцины избрана химическая сыпнотифозная вакцина (ХСВ).

При изучении иммуногенных свойств вакцины выявлена сероконвер-сия у всех (40) животных. При этом иммунный ответ на введение комбинированной инактивированной сыпнотифозной вакцины (КИСВ), регистрируемый в РНАг, РСК и нМФА был в 2-3 раза выше, чем при введении ХСВ. .

В следующей серии экспериментов, при изучении превентивных свойств КИСВ, установлено, что введение рабочей дозы вакцины стимулирует образование протективных антител, поскольку заражение животных вирулентной культурой Я. ргоиагекп в дозах 3 предохраняло их от заболевания сыпным тифом. Более того, введение инфекционного материала в дозе в 2 раза превышающую регламентированную (6,5 1§) также предохраняло животных от заболевания, в то время как в контрольной группе наблюдалась 100% гибель животных.

Высокий защитный эффект вакцины был продемонстрирован и на другой группе животных - белых мышах. Животные не заболевали при введении

им живой культуры возбудителя в дозе 1:4, которая приводила в 100% гибели животных в контрольной группе.

Морские свинки, вакцинированные ХСВ, были также устойчивы к заражению вирулентной культурой, но среди них наблюдались клинические проявления заболевания сыпнотифозной инфекцией (20% случаев).

В опытах на белых мышах нами была проведена сравнительная оценка токсического действия (острой и хронической токсичности) выбранной дозы вакцины из белковых антигенов. При однократном введении животным КИСВ и ХСВ в дозе эквивалентной человеку, а также физиологического раствора, не наблюдалось видимых реакций.

При изучении хронической токсичности на белых мышах, заключающейся в десятикратном ежедневном введении 3-х серий вакцины животным, не было отмечено негативных визуальных проявлений , кроме задержки в прибавлении веса в течение 7 дней. В последующем животные набирали массу и к завершению опыта прибавка в весе составила для серии 3 - 5,67%, для серии 5 - 5,58 %, для серии 7 - 5,48% (по Van Ramshorst).

Аналогичная реакция (прибавка в весе - 5,64%) наблюдалась при введении физиологического раствора, что может быть расценено, как стрессовая реакция на ежедневные инъекции.

При введении препарата сравнения наблюдалась более продолжительная задержка веса (показатель Van Ramshorst - 4,85%), что указывало на несколько большую токсичность препарата.

После завершения цикла инъекций животные быстро набирали в весе, что подтверждало предположение о стрессовом характере снижения в весе при проведении инъекций.

В сопоставимых опытах предстояло оценить аллергизирующие свойства КИСВ и препаратов сравнения. Препаратами сравнения были определены ХСВ, не обладающая сенсибилизирующими свойствами, и ЖКСВ-Е вызывающая анафилактические реакции.

В опытах на морских свинках установлено, что КИСВ, равно как и ХСВ обладают слабо выраженными (не превышающими 1+) анафилактическими реакциями, в отличие от ЖКСВ-Е, обеспечивающей тяжелое протекание анафилактических реакций (на 2+ и 3+). В параллельных опытах по разрешению сенсибилизированных вакцинами животных неинфицированной овокулыурой, было установлено, что причиной этих реакций является наличие побочных примесей среды культивирования в ЖКСВ-Е.

Результаты исследований по использованию КИСВ в качестве в вакцины, позволило выделить ряд моментов, которые имеют важное значение для дальнейших исследований.

В этих наблюдениях получены необходимые доказательства целесообразности конструирования комбинированной инактивированной сыпнотифозной вакцины, формирующей эффективный, стойкий антиинфекционный иммунитет. Решающее значение для создания полноценной вакцины имело

сочетанное использование корпускулярного компонента с сохраненной антигенной структурой и растворимого антигена. Используемые очищенные от белков среды культивирования антигены обеспечивали безвредность и низкую реактогенность вакцины. Кроме того указанные антигены можно было стандартизовать по количеству активного материала, контролировать по степени очистки. Следует отметить, что предлагаемая технология получения вакцины вписывается в технологический процесс производства профилактических риккетсиозных препаратов.

Заключая проведенные исследования, мы хотим подчеркнуть необходимость дальнейшего изучения КИСВ с целью обоснованного применения в эпидемиологической практике. Эти исследования представляют интерес не только для создания эффективных средств профилактики для сыпного тифа, но и других риккетсиозов.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально доказано, что использование дифферренциально-го центрифугирования и микрофильтрации позволяет получать корпускулярные антигены риккетсий максимально очищенные от компонентов среды культивирования и сохранившие поверхностные антигенные структуры на уровне нативной клетки. Эти данные подтверждены методом иммунохими-ческого анализа, зафиксировавшим 6 основных полипептидов наружной оболочки риккетсий и отсутствие белков, характерных для желточной оболочки КЭ. Получение по разработанной технологии корпускулярных антигенов других видов риккетсий (ЯЛурЫ, Я. БШшса, С.ЬигпеШ) позволяет заключить об универсальности оригинальной технологии, а повышение выхода в 4-8 раз - о ее рентабельности. Приготовленные антигены, использованы в качестве "единых" антигенов для РСК, РНАг, МФА, а также в качестве основы для получения поверхностных белковых антигенов.

2. Впервые теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность получения видоспецифических комплексов риккетсий (ВАКР) путем сочетанного использования солюбилизации неионным детергентом и исключающей иммунсорбции. Полученные препараты обладали высокой активностью (по удельной активности в 20-25 раз превышали исходный антиген) и строгой специфичностью в отношении видовой детерминанты возбудителя. Эти данные подтверждены методами иммунохимическо-го анализа (электрофорез в ПААГ и иммуноблотгинг).

3. Установлена высокая гемосенсибилизирующая активность ВАКР, определившая возможность их использования в качестве сенситина для конструирования видоспецифических АЭД, предназначенных для выявления антител к И-ргогуагеки, К.1урЫ, Я^Ыпса, К.АЗР. Впервые показано, что с помощью указанных диагностикумов можно проводить абсолютную межвидовую дифференциацию сывороток в РИГА.

4. Впервые определена возможность конструирования иммунофлуоро-метрической тест-системы на основе 'ПРР. специфических F(ab);-фрагментов иммуноглобулинов и индикашрных Fab- фрагментов иммуноглобулинов, меченных хлоридом европия, позволившая реализовать высокие диагностические качества (высокая чувствительность и разрешающая способность) нового метода - ИФМА. Полученные данные легли в основу разработки технологии получения иммунофлуорометрических тест-систем для выявления R. prowazekii и R.sibirica и составления соответствующей НТД.

5. Впервые обосновано и экспериментально доказано создание ИФТС для определения антириккетсиозных антител на основе оригинальных антигенов и индикаторных аффинно-очищенных Р(аЬ)2-фрагментов антител против Ig G человека, меченных пероксидазой хрена. Эти наблюдения нашли отражение в разработанной на препараты технологии и НТД.

6. Экспериментально доказана возможность получения полиспецифических сывороток к R. typhi на лошадях. Установлено, что сыворотки имеют высокую активность и могут быть использованы в качестве диагностических сывороток, для приготовления иммуноглобулиновых препаратов (ИЭД, флуоресцирующих Fab-фрагментов), а также для конструирования иммуно-сорбентов для исключающей иммунсорбции.

7. Получены антивидовые (против иммуноглобулинов кролика и человека) лошадиные сыворотки и показана возможность их использования для приготовления соответствующих F(ab)2 -фрагментов антител меченных изо-тиоцианатом флуоресцеина и хлоридом европия.

8. Впервые изготовлены иммуносорбенты на основе гидрокиси алюминия, на котором с помощью поперечно-сшивающих реагентов иммобилизованы различные иммуноглобулины (против желточного компонента КЭ, против белков крови лошади, кролика, человека) и установлена целесообразность их использования для исключающей иммунсорбции с целью очистки препаратов иммуноглобулинов или антигенов от контаминирующих биореагентов.

9. Впервые реализована возможность применения для оценки активности антивидовых сывороток (против иммуноглобулинов человека, кролика, лошади) "корпускуляризованных" тест-антигенов для нМФА. Конструирование таких препаратов проводилось на основе ФТЭ, сенсибилизированных растворимыми белковыми антигенами (иммуноглобулинами человека, кролика, лошади). Установлена высокая активность и специфичность тест-антигенов и пригодность их для оценки качества антивидовых сывороток.

10. Впервые экспериментально показано, что полученные корпускулярные антигены R. prowazekii в сочетании с поверхностным белковым антигеном риккетсий обладают выраженными протективными, иммуногенными свойствами и низкой реактогенностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Александрова Л.В., Пантюхина А.Н., Коробов В.П. Усовершенствование технологии получения риккетсиальных антигенов //Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: материалы научной конференции. - Томск, 1991.-С. 130-131.

2. Александрова Л.В., Пантюхина А.Н., Коробов В.П., Юркова H.A. Изучение возможности получения очищенного корпускулярного антигена рик-кетсий Провачека // Теоретические и прикладные исследования в иммунологии: Тез. Докл. научно-практ. конф. - Пермь, -1990. - С.23-24

3. Барбан П.С., Ковязина Р.Н. Пантюхина А.Н., Бердичевская Л.И.. Канина А.Г. К проблеме внутригрупповой дифференциации риккетсий группы сыпного тифа // Вопросы риккетсиологии: Материалы Всесоюзной конференции. - М., 1985. -С. 5-6.

4. Барбан П.С., Пантюхина А.Н. Р(аЬ)2-фрагменты антимикробных флуоресцирующих иммуноглобулинов: получение и характеристика // Тез.докл.итоговой научной конференции. - Пермь, 1984. -С. 13-15

5. Барбан П.С., Пантюхина А.Н. Иммунофлуоресцентный Fab-анализ: итоги и перспективы // Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов: Тез.докл. научной конф.-Пермь, 1988. -С. 139-141.

6. Барбан П.С., Пантюхина А.Н., Балкова О. Ю. Изучение возможности получения высокоочищенного корпускулярного антигена риккетсий сиби-рика//Вопросыриккетсиологии. -М, 1988. -С. 41-41

7. Барбан П.С., Пантюхина А.Н., Власова Л.В. К методике получения антивидовых иммунных сывороток многоцелевого назначения // Материалы научной конференции, посвященной 85-летию ПНИИВС. -Пермь, 1983. -С 20-22.

8. Барбан П.С., Пантюхина А.Н., Ковязина Р.Н. Мембранная технология разделения и концентрации сывороточных иммуноглобулиновых препаратов // Перспективы использования физико-химического анализа для разработки технологических процессов и методов аналитического контроля химического и фармацевтического производств: Тез. Докл. Республиканской научной конференции. -Пермь, 1985. -С 64-65.

9. Барбан П.С. Пшеничнов P.A. Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск: УрО АН СССР, 1988.- 175 С.

Ю.Ковалева Т.С., Пантюхина А.Н., В.Ф. Петров. Изучение возможности конструирования видоспецифического антигенного эритроцитарного ди-агностикума для выявления антител к R. prowazekii // Журн. микробиол.-1998.-№2.-С. 65 -68.

11. Ковязина Р.Н. Пантюхина А.Н. Экспресс-метод электрофореза и его применение для контроля чистоты препаратов моно- и бивалентных фраг-

ментов иммуноглобулинов // Перспективы использования физико-химического анализа для разработки технологических процессов и методов аналитического контроля химического и фармацевтического производств: Тез. докл. республиканской научной конференции. Пермь, 1985. С 62-63.

12. Кротов A.B., Панпохина А.Н., Петров В.Ф. Антигенные и иммуноглобу-линовые препараты для диагностики коксиеллеза в системе сопряженных однонаправленных серологических реакций // Журн. микробиол. -1998.-№2. - С. 68-72.

13. Мисенжников A.B., Панпохина А.Н., Лазаревт С.Н. Коляда Г.А., Кобе-лев С.Г. Тупицин A.B. Оптимизация методики лиофилыюго высушивания эритроцитарных диагностикумов // Экспериментальная и прикладная иммунология: Тез.докл. научной конф. -Пермь, 1991. - С.18-20.

14. Панпохина А.Н. Видоспецифические антигены риккетсий как основа создания диагностических препаратов // Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами. Тез. докл. международной конф. Иркутск, 1996. - С. 78-79.

15. Панпохина А.Н., Александрова Л.В., Тупицин A.B. ,Барахнина Е.В., Юркова H.A. Унификация технологии приготовления риккетсиальных препаратов // Экспериментальная и прикладная иммунология: Тез докл. на-учн. конф. - Пермь, 1991-С. 25-26.

16. Панпохина А.Н. Александрова Л.В. Петров, В.Ф. Изучение диагностической ценности межвидового эритроцитарного сыпнотифозного днагно-стикума // Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии. -Пермь, 1994. -С35-38.

17. Панпохина А.Н., Александрова Л.В., Воробьева М.С., Тарасевич И.В. Яблонская В.А., Еликоев К.А., Никитюк Н.М., Умнова Н.С. Сравнительная оценка серологических тестов, применяемых для диагностики рик-кетсиозов группы сыпного тифа //Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии. - Пермь, 1994. -С.32-35.

18. Панпохина А.Н., Александрова Л.В, Петров В.Ф. Тест-система имму-нофлуорометрическая для выявления антител к риккетсиям группы сыпного тифа и группы клещевой пятнистой лихорадки // Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тест-систем: материалы докл. Всеросс. научно-практ. конф. Махачкала, 1994. - С. 158.

19. Панпохина А.Н., Александрова Л.В., Райхер Л.И., Райхер И.И., Пагнуева Л.Ю. Применение ИФА для выявления антител к риккетсиям группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки // Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии. -Пермь, 1994.-С. 38-41.

20.Панпохина А.Н., Александрова Л. В., Петров В.Ф. Применение имму-нофлуорометрического анализа для внутригрупповой дифференциации риккетсиозов группы сыпного тифа // Роль иммунобиологических препа-

ратов в современной медицине: Тез.докл. Международного симпозиума. -Уфа. - 1995.-С. 192-194.

21.21.Пантюхина А.Н., Балкова О.Ю. Флуоресцирующие Fab-фрэгменты иммуноглобулинов и флуоресцирующие иммуноглобулины к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки: проникновение в живую клетку // Вопросы риккетсиологии: материалы Всесоюзной конф. - М., 1989. - С. 99-103.

22. Пантюхина А.Н., Барбан П.С. Экспрессный метод получения флуоресцирующих Fab-фрагментов антител // Естественные науки - здравоохранению: Тез. докл. научной конф. -Пермь,1987. - С.82-83.

23. Пантюхина А.Н. Барбан П.С. Изучение возможности применения бивалентных фрагментов антител в иммунофлуоресцентном анализе // Вопросы гигиены, эпидемиологии, микробиологии, вирусологии, инфекционной патологии: Тез. докл. научно-практической конф. - Пермь, 1982. -С. 52-54.

24. Пантюхина А.Н. Бердичевская Л.И. Канина А.Г. Сравнительная оценка антигендифференцирующей способности Fab-фрагментов антириккетси-озных антител в системе сопряженных серореакций // Вопросы риккетсиологии: материалы Всесоюзной конф. - М.,1985,- с.45-46.

25. Пантюхина А.Н., Ковалева Т.С., Петров В.Ф. Соснина О.Ю. Тарасевич И.В., Макарова В.А., Фетисова Н.Ф. Видоспецифические антигенные эритроцитарные диагностикумы // Тез. Докл. VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 1997. -С.482 -483.

26. Пантюхина А.Н. Ковалева Т.С., Соснина О.Ю., Петров В.Ф. Методы очистки живой комбинированной сыпнотифозной вакцины от контаминантов // Актуальные проблемы вакцинопрофилактики. Екатеринбург, 1996.- С. 46-47.

27. Пантюхина А. Н., Ковязина Р.Н. Физико-химический анализ риккетсиль-ных антигенов методом тонкослойной гель-хроматографии // Перспективы использования физико-химического анализа для разработки технологических процессов и методов аналитического контроля химического и фармацевтического производств: Тез. докл.'Республиканской конф.. -Пермь, 1985. С. 64.

28. Пантюхина. А. Н., Петров В.Ф., Александрова J1.B. Основные принципы конструирования риккетсиальных антигенных препаратов и перспективы их совершенствования // Журн. микробиол. - 1998,- № 2.- С. 51-54.

29. Пантюхина А.Н., Петров В.Ф., Соснина О.Ю. ,Ковалева Т.С. Метод ранней диагностики клещевого риккетсиоза // Вирусные, риккетсиозные, бактериальные инфекции, переносимые клещами: Тез.докл. Международной научной конф. Иркутск, 1996, - 1996. - С. 93-94.