Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии производства антигена Coxiella burnetii для реакции связывания комплемента, метода флуоресцирующих антител и иммунофлуориметрического анализа

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соснина, Оксана Юрьевна, Пермь

^/'''1 ......

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Пермский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток Научно-производственное объединение «Биомед»

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА АНТИГЕНА Coxiella burnetii ДЛЯ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, МЕТОДА ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ И ИММУНОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

На правах рукописи

Соснина Оксана Юрьевна

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидита биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор ПЕТРОВ В.Ф. доктор медицинских наук ПАНТЮХИНА А.Н.

Пермь - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ. 4

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ Coxiella

burnetii И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ 12

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31

2.1. Материалы исследования 31

2.1.1. Микроорганизмы 31

2.1.2. Антигены • 31

2.1.3. Сыворотки . 32

2.2. Методы исследования 33

2.2.1. Реакция связывания комплемента 33

2.2.2. Реакция угнетения связывания комплемента 34

2.2.3. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) 35

2.2.4. Реакция нейтрализации антигена (РНАг) 36

2.2.5. Метод флуоресцирующих антител (МФА) 37

2.2.6. Иммунофлуориметрический анализ (ИФМА) 38

2.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле 39

2.2.8. Колоночная гель хроматография антигена 40

2.2.9. Люминесцентная микроскопия 40

2.2.10. Электронная микроскопия 41

2.2.11. Определение белка 41

2.2.12. Стандартизация C.burnetii 41

2.2.13. Расчет необходимой площади поверхности мембран 42

2.2.14. Статистическая обработка 42

Глава 3. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНОГО АНТИГЕНА Coxiella burnetii ШТАММА «М-44», ПРИГОДНОГО ДЛЯ

РАЗЛИЧНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ (РСК, нМФА) 43

3.1. Апробация различных способов препаративного выделения

корпускулярного антигена C.burnetii и выбор оптимального метода 44

3.1.1. Получение антигена методом эфирной обработки по М.Ю.Морозовой и его оценка в различных серологических тестах 44

3.1.2. Выделение антигена по способу В.АЛблонской и его серологическая характеристика 47

3.1.3. Очистка C.burnetii методом дифференциального центрифугирования и оценка пригодности полученного антигена для РСК, нМФА 51

3.1.4. Сравнительная оценка апробированных способов очистки

54

3.2. Разработка способа очистки C.burnetii с использованием дифференциального центрифугирования, ферментолиза и микрофильтрации

3.2.1. Стабилизация основных антигенных структур на C.burnetii, штамма «М-44». 59

3.2.2. Максимальная изоляция C.burnetii из клеток желточной оболочки: гомогенизация и протеолиз трипсином 61

3.2.3. Изучение возможности использования микрофильтрации для очистки антигена. Выбор мембран 69

3.2.4. Отработка оптимальных параметров микрофильтрации субстрата C.burnetii 75

3.2.5. Определение характеристик препарата с помощью метода электронной микроскопии и колоночной гель-хроматографии 84

3.2.6. Получение антигенов C.burnetii и изучение специфической активности приготовленных антигенов С. burnetii в нескольких серологических реакциях и их стандартизация 88

3.2.7. Стабилизация антигенов C.burnetii 95

Глава 4. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДАЛЬНЕЙШЕГО ПРИМЕНЕНИЯ РАЗРАБОТАННОГО АНТИГЕНА С burnetii 100

4.1. Исследования в области применения антигена C.burnetii для получения диагностических сывороток 100

4.2. Изучение возможности использования антигенов C.burnetii для выявления антител в ИФМА 101

4.2.1.Приготовление для оценки антигенов Eu-конъюгатов для прямого и непрямого вариантов ИФМА 103

4.2.2. Изучение сорбционной способности антигенов на твердофазном носителе 109

4.2.3. Выявление специфических антител в непрямом ИФМА 116

57

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

119

ВЫВОДЫ

131

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

АЕ - антигенные единицы

«ЖМ-JIyra» - штамм "Желтогорлая Мышь-Луга"

ЗФР - забуференный физиологический раствор

ИФРМА - иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФМА - иммунофлуориметрический анализ

нИФМА - непрямой иммунофлуориметрический анализ

ИФМ - иммунофлуоресцентный метод

ИЭД - иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум

КАП - кожная аллергическая проба

КЭ - куриные эмбрионы

ЛАТ - люминесцирующие антитела

ЛПС - липополисахарид

ЖС - нормальная кроличья сыворотка

нМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител

пМФА - прямой метод флуоресцирующих антител

ПААГ - полиакриламидный гель

РА - реакция агглютинации

РМА - реакция микроагглютинации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РНАг - реакция нейтрализации антигена

РСК - реакция связывания комплемента

РУСК - реакция угнетения связывания комплемента

ФИТЦ - флуоресцина нзотиоцианат

ЧАЭД - человеческий антигенный эритроцитарный диагностикум

Ig G - иммуноглобулины класса G

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема зооантропонозных заболеваний, особенно вирусной и риккетсиозной этиологии, постоянно находится в центре внимания российского здравоохранения. Одним из таких заболеваний является коксиеллез (лихорадка Ку) - факультативно-трансмиссивный зооантропоноз с природной очаговостью, повсеместно распространенный на земном шаре, встречающийся в виде спорадической заболеваемости и эпидемических вспышек.

В Российской Федерации коксиеллез регистрируется в 37 регионах из 89 административных территорий, при этом отмечается выраженная неравномерность территориального распределения инфекции. Наибольшее число случаев коксиеллеза по данным Н.В.Рудакова [111] приходится на Поволжский регион (38,8%), Астраханскую область (32,4%) и Западную Сибирь (30,6%>). Анализ эпидемиологических закономерностей распространения данной инфекции в современных условиях позволил установить антропическую трансформацию очагов коксиеллеза, выраженность которой зависит не только от напряженности очага, но и от уровня диагностики заболевания [110]. При эпидобследовании ряда очагов коксиеллеза в России и на Украине было установлено, что реальный уровень заболеваемости превышает данные официальной статистики в десятки раз, что связано с полиморфной картиной клинических проявлений, подострым и бессимптомном течением инфекционного процесса [126, 111, 124,], а также отсутствием диагностикумов для выявления специфических антител к определенным фазовым вариациям возбудителя, появляющихся на разных стадиях инфекционного процесса. В последнее десятилетие отмечен значительный рост числа хронических заболеваний коксиеллезом [120], что

указывает на отсутствие своевременной диагностики и лечения этой инфекции.

Важную роль в повышении эффективности эпиднадзора и совершенствовании предупредительных мероприятий в отношении

коксиеллезной инфекции играет уровень клинической и эпидемиологической диагностики, при этом первостепенная роль отводится лабораторным методам исследования. Достоверность результатов серологического анализа зависит в значительной мере от качества диагностических препаратов, их возможности регистрировать разные фазовые вариации возбудителя или антитела к ним. Создание высокоэффективных и высокочувствительных препаратов, использование единых диагностикумов для нескольких серологических реакций следует рассматривать как одну из ведущих и интенсивно разрабатываемых проблем, определяющих своевременность всего комплекса мероприятий по предупреждению распространения этой природно-очаговой инфекции.

Для проведения полной и достоверной диагностики коксиеллеза должны быть учтены биологические особенности возбудителя, в частности его способность существовать в 2-х фазовых вариациях, что нашло отражение и в образовании специфических антител. При заболевании человека коксиеллезом в остром периоде заболевания образуются антитела к II фазовой вариации возбудителя, при хронизации процесса в сыворотке крови человека превалируют антитела к I фазе Coxiella burnetii. Поэтому ранняя диагностика должна основываться на поиске в крови больных антител ко II фазе инфекции, с последующим определением антител к I фазовой вариации возбудителя.

Для ранней диагностики использовался корпускулярный антиген С.burnetii II фазы, выпускаемый Ташкентским НИИВС, очищенный традиционным методом по J. Cragie [162], основанном на применении эфирной обработки. Следует подчеркнуть, что использование диэтилового эфира в технологическом процессе производства коксиеллезных диагностикумов I и II фазовых вариаций дает неравнозначные результаты. Регламентированный метод обеспечивает стандартность в получении очищенных суспензий С. burnetii лишь I фазы. По данным С.Шрамека с сотр. [220] и М.Ю.Морозовой [83], очистка возбудителя, находящегося в фазе II, дает низкий выход, требует

длительного времени, а полученные суспензии содержат тканевые примеси и обладают недостаточной активностью и специфичностью. Мнения исследователей о качестве диагностических препаратов неоднозначны. П.Ф.Здродовский и Е.М.Голиневич [37] считают, что наличие примесей в корпускулярных антигенах I и II фаз не отражается на достоверности результатов в РСК и РА. Напротив, В.А.Яблонская, И.В.Тарасевич и В.А.Макарова [135] полагают, что наличие тканевых компонентов среды культивирования в диагностических антигенных коксиеллезных препаратах часто ведет к ложноположительным результатам. Использование же этих антигенов в ИФРМА оказалось малоэффективным из-за наличия спонтанных агглютинатов и тканевых компонентов, обусловливающих неспецифические реакции [4, 7, 75]. Наиболее остро проблема очистки коксиеллезных антигенов возникла при использовании их в таких высокочувствительных тестах, как ИФА и ИФМА, что потребовало разработки методических приемов дополнительной очистки коммерческих антигенов [122, 25, 113]. Предложенные исследователями способы очистки при самостоятельном использовании либо не гарантируют полной очистки С.burnetii от тканевых компонентов среды культивирования, либо трудоемки в исполнении и поэтому не вышли за рамки экспериментальных исследований. Отсутствие коммерческих, стандартизованных, высокоочшценных антигенов С.burnetii затрудняет внедрение новых серологических методов в практику здравоохранения.

Изложенное свидетельствует, что до настоящего времени проблема очистки С.burnetii II фазы, максимально очищенного от компонентов среды культивирования и сохраняющего антигенную структуру на уровне нативной клетки еще не решена, что определяет актуальность изысканий в этой области.

Цель работы. Разработка технологии изготовления антигена С.burnetii II фазы штамма «М-44» для создания коксиеллезного диагностикума, пригодного для РСК, нМФА и ИФМА.

Основные задачи исследования.

¡.Разработать метод получения корпускулярного антигена C.burnetii II фазы штамма «М-44», изучить степень его очистки и специфические свойства.

2. Определить диагностическую значимость полученного антигена в РСК и нМФА.

3. Изучить возможность получения высокоэффективной сыворотки к С. burnetii для комплектации препарата.

4. Изучить возможность применения полученного антигена C.burnetii в нИФМА для выявления специфических антител.

5. Оптимизировать технологию к условиям производства.

Научная новизна работы. Разработана технология, позволяющая получать корпускулярный антиген C.burnetii II фазы вакцинного штамма «М-44» без применения эфирной обработки. Использование дифференциального центрифугирования в сочетании с ферментолизом и мембранной микрофильтрацией дает возможность получить высокоочищенный препарат, максимально сохраняющий специфические характеристики, свойственные нативному возбудителю. Изучение специфических и иммуногенных свойств препарата позволило охарактеризовать его как полноценный антиген, пригодный для обнаружения антител к C.burnetii в РСК и нМФА.

Отработана оригинальная схема иммунизации животных для получения диагностической высокоактивной и специфической сыворотки к С. burnetii.

Впервые установлена возможность использования выделенного антигена в новом методе иммуноанализа - ИФМА.

Сконструированы лантанидные конъюгаты для индикации C.burnetii в прямом варианте ИФМА и для нИФМА на основе Fab-фрагментов антивидовых антител против иммуноглобулинов человека.

Разработан оригинальный иммуносорбент на основе геля гидрокиси алюминия и белковых лигандов, иммобилизованных на носителе с помощью

поперечно-сшивающих реагентов для удаления неспецифических примесей из иммуноглобулиновых препаратов.

Изучена сорбционная способность корпускулярных и растворимых антигенов С. burnetii к поверхности полистироловых планшетов, оценена их пригодность для индикации антител в сыворотках больных и лиц, привитых вакциной против лихорадки Ку в нИФМА.

Теоретическое и практическое значение работы. В теоретическом плане проведенное исследование расширяет существующие представления о возможности создания нового типа препарата для лабораторной диагностики коксиеллеза. Полученный фактический материал может быть использован при изучении возможности приготовления единых диагностикумов многоцелевого назначения из риккетсий других таксономических групп. Определен аспект дальнейшего применения разработанного оригинального антигена при конструировании препаратов для нового метода иммуноанализа - нИФМА.

На основании проведенных исследований разработана экспериментально-производственная технология получения корпускулярного антигена С.burnetii штамма «М-44», позволяющая проводить раннюю диагностику коксиеллеза в РСК, нМФА и ИФМА. Разработанная технология способствует увеличению удельной активности препарата в 4-8 раз по сравнению с регламентированной технологией, исключает токсическое воздействие паров эфира на персонал и повышает безопасность работы, что способствует созданию благоприятных санитарно-гигиенических условий в производственных помещениях.

По предложенной оригинальной схеме получена диагностическая сыворотка к С.burnetii, прилагаемая в качестве положительной контрольной сыворотки для комплектации препарата.

На препарат составлена и направлена для утверждения в ГИСК им. Л.А.Тарасевича нормативно-техническая документация в виде экспериментально-производственного регламента, Временной Фармакопейной

статьи и Инструкции по применению на «Диагностикум коксиеллезный Бернета сухой для РСК и МФА».

При непосредственном участии автора проведено освоение препарата в производстве НПО «Биомед».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделение C.burnetii II фазы, штамма «М-44» по безэфирной технологии, сочетающей дифференциальное центрифугирование, ферментолиз трипсином и мембранную микрофильтрацию, обеспечивает получение корпускулярного антигена с сохраненной антигенной структурой, высокой степени очистки и гомогенности, что зафиксировано методом электронной микроскопии и иммунохимического анализа.

2. Разработанный антиген обладает достаточными диагностическими возможностями, позволяя проводить индикацию специфических антител в РСК и нМФА, а также в сыворотках экспериментальных животных к разным штаммам C.burnetii I и II фазы: «Грита», «М-44» и «ЖМ-JIyra». Это явилось основанием для рекомендации полученного антигена для ранней серодиагностики и эпидемиологического надзора за коксиеллезом.

3. Целесообразность использования приготовленного антигена для выявления специфических антител в высокочувствительном тесте - нИФМА. Сконструированная на основе оригинального антигена и индикаторных Fab-фрагментов антител против иммуноглобулинов человека, меченных хлоридом европия, ИФМТС продемонстировала более высокую чувствительность при выявлении специфических антител к С. burnetii по сравнению с РСК и нМФА.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на конкурсе молодых специалистов НПО "Биомед" (апрель 1998г.), на пленарном заседании общества микробиологов и эпидемиологов (19 января 1999г.)

Диссертационная работа прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета Пермского НПО

"Биомед" (24 декабря 1998), на расширенном совместном заседании лаборатории экологической генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, кафедры микробиологии Пермской Медакадемии (4 марта 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками и 17 таблицами, вставленными в текст по месту цитирования; состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, заключения, выводов и приложения. Список цитируемой литературы включает 251 источник, в том числе 137 отечественных и 114 зарубежных авторов.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермского НПО «Биомед» (№ гос. регистрации 01.9.50 005347).

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ Coxiella burnetii И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

Среди патогенных для человека риккетсий возбудитель коксиеллеза