Выявление, типирование и молекулярно-генетическая характеристика Coxiella burnetii

Фрейлихман, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление, типирование и молекулярно-генетическая характеристика Coxiella burnetii
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выявление, типирование и молекулярно-генетическая характеристика Coxiella burnetii"

На правах рукописи

ои«з<+ ----

Фрейлихман Ольга Александровна

2 О АВГ 2009

ВЫЯВЛЕНИЕ, ТИПИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОХ1ЕЫА BURNET1I

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003475379

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Токаревич Николай Константинович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Дмитриев Александр Валентинович доктор медицинских наук, профессор Тец Виктор Вениаминович

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской Академии медицинских наук

Защита диссертации состоится^/сентября 2009 года в ¿Г- на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН Автореферат разослан ^2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Бурова Л. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Ку-лихорадка - природно-очаговое инфекционное заболевание, представляющее важную медико-социальную проблему в связи с широким распространением возбудителя в различных климато-географических зонах мира, многообразием путей передачи инфекции (воздушно-пылевой, пищевой, трансмиссивный), профессиональным характером заражения лиц, занятых в животноводстве, значительными экономическими потерями, обусловленными инфицированием сельскохозяйственных животных.

Высокоустойчивый во внешней среде возбудитель Ку-лихорадки, Coxiella burnetii, является причиной спорадических заболеваний, эпидемических вспышек и может быть использован в качестве потенциального агента биотерроризма (Pappas G., Blanco J.R., 2007; Azad A.F., 2007; Tissot-Dupont H., Raoult D., 2008).

Сложившиеся в последнее десятилетие в России социально-экономические условия создают реальные предпосылки подъема заболеваемости населения Ку-лихорадкой. Так, частота обнаружения антител к С. burnetii у здоровых лиц увеличилась за последние годы в несколько раз и составила 16,0% и 11,0% в 2002 и 2003 г.г. против 1,1% и 1,8% в 1993 и 1994 г.г., соответственно (Беляев E.H. и др., 2001). Наблюдаемое при этом отсутствие корреляции между относительно высоким уровнем серопозитивности и низким уровнем официально регистрируемых случаев Ку-лихорадки обусловлено гиподиагностикой инфекции и типично не только для России, но и для ряда европейских стран. Это связано с многообразием клинических проявлений Ку-лихорадки, поздним появлением антител к коксиеллам, сложностью культивирования возбудителя, накопление которого в куриных эмбрионах или в культуре эукариотических клеток трудоемко и сопряжено с большими временными затратами. Иммунологические методы выявления С. burnetii с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА) недостаточно чувствительны и специфичны (Токаревич Н.К., 1997; Fournier P.E., Raoult D., 2003).

Существенная вариабельность беспозвоночных и позвоночных хозяев, вовлекаемых в эпизоотический процесс Ку-лихорадки (Raoult D., 1999), и способность возбудителя образовывать стойкие природные и хозяйственные очаги делают его выявление особенно актуальным. В настоящее время в России такие очаги практически лишены регулярного наблюдения, и одна из причин этой ситуации - отсутствие эффективных методов обнаружения С. burnetii в полевом материале.

Молекулярно-генетические методы выявления и типирования С. burnetii лишены упомянутых недостатков, и, кроме того, позволяют определить генетические маркеры, пригодные для дифференцирования штаммов возбудителя, что открывает перспективы совершенствования диагностики и эпидемиологического надзора за Ку-лихорадкой.

В последнее десятилетие разработан ряд модификаций метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК С. burnetii в культуре клеток и клинических образцах, в материале от животных и продукции животного происхождения (Willems Н., Thiele D., 1994; Tissot-Dupont Н. et al., 1999; Beaman M., Hung J., 1989; Rowbotham Т., 1999). В России проведено исследование по выявлению возбудителя Ку-лихорадки в полевом материале путем амплификации фрагмента гена белка теплового шока, dnaJ (Tokarevich N., Mossienko E., 2001). Однако метод ПЦР до настоящего времени не нашел широкого применения при мониторинге природных очагов Ку-лихорадки.

Таким образом, недостаток сведений о структуре природных популяций С. burnetii на территории России, несовершенство существующих методов их обнаружения в природных и хозяйственных очагах диктуют необходимость внедрения молекулярно-генетических методов быстрого выявления и типирования коксиелл в полевом материале.

Цель работы

Совершенствование методов выявления и типирования возбудителя Ку-лихорадки в биологическом материале и генотипическая характеристика штаммов С. burnetii различного географического происхождения.

Задачи исследования

1. Оптимизировать метод ПЦР для выявления С. burnetii в образцах биологического материала.

2. Оценить эффективность различных модификаций метода ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ) для выявления С. burnetii в образцах биологического материала.

3. Провести генотипирование штаммов мировой коллекции С. burnetii, в том числе штаммов, выделенных на территории России, с помощью метода анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции амплифицированного гена groEL и мультиспейсер-типирования хромосомной ДНК (анализ нуклеотидных последовательностей множественных межгенных участков - спейсеров).

4. Изучить генетические связи между штаммами С. burnetii, выделенными на различных территориях, на основе филогенетического анализа множественных спейсеров хромосомной ДНК.

Научная новизна

С использованием метода мультиспейсер-типирования и анализа длин фрагментов рестрикции гена groEL изучена генетическая структура популяции С. burnetii, представленной штаммами, выделенными из различных источников в ряде регионов России. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей множественных спейсеров установлено, что на территории Российской Федерации циркулируют штаммы С. burnetii - представители групп ST23 (85%) и ST7 (15%). Впервые для качественного и количественного определения С. burnetii в полевом материале из природных очагов Ку-лихорадки применен метод ПЦР-РВ на основе амплификации фрагмента гена icd.

Депонировано в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 90 нуклеотидных последовательностей спейсеров (протяженностью 383 - 674 п.н.) девяти штаммов С. burnetii (AY 864199 - AY

864288) и одна нуклеотидная последовательность фрагмента гена groEL штамма Ixodes-3-Луга, протяженностью 594 п.н. (EF627450).

Научно обоснована перспективность применения метода мультиспейсер-типирования для дифференциации штаммов С. burnetii различного географического происхождения. Практическая значимость

Разработан и апробирован метод ПЦР-РВ в модификации TaqMan с использованием праймеров icd и сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, для выявления и количественного определения фрагмента гена icd штаммов С. burnetii в биологическом материале из природных очагов Ку-лихорадки. Показано, что по показателям чувствительности и специфичности технология ПЦР-РВ TaqMan с использованием сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, превосходит технологию ПЦР-РВ SYBRGreen I с использованием интеркалирующего красителя. Разработаны методические основы оптимизации метода ПЦР-РВ TaqMan для выявления возбудителя у больных на ранних стадиях заболевания Ку-лихорадкой.

Установлена инфицированность С. burnetii диких мелких млекопитающих, свидетельствующая о наличии на территории Санкт-Петербурга в 2006-2007 г.г. активных природных очагов Ку-лихорадки. Положения, выносимые на защиту

1. ПЦР с сконструированными праймерами, ограничивающими фрагмент гена groEL, высоко эффективна для выявления С. burnetii в биологическом материале.

2. ПЦР-РВ с применением сконструированного зонда, меченного флуоресцеином (технология TaqMan), оптимальна для количественного определения С. burnetii в полевом материале.

3. Штаммы С. burnetii, выделенные на территории России, по результатам анализа полиморфизма межгенных участков хромосомной ДНК, принадлежат к генотипам ST23 и ST7.

4. Метод мультиспейсер-типирования эффективен для генотипической

характеристики штаммов С. burnetii различного географического

происхождения.

Апробация работы

Результаты работы доложены на Международной конференции по риккетсиям и риккетсиальным болезням (Любляна, Словения, 4-7 сентября 2002 г.), на заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (Санкт-Петербург, 15 мая 2007 г.), на Четвертой международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.).

Личный вклад диссертанта

Формулирование целей и задач, подбор методов исследования выполнены лично диссертантом. Автором лично проводился дизайн праймеров и зондов для ПЦР-РВ и оптимизация ПЦР-РВ, лабораторные исследования биологического материала методами ПЦР и ПЦР-РВ, амплификация и секвенирование межгенных промежутков штаммов российской коллекции С. burnetii при их анализе методом мультиспейсер-типирования, статистическая обработка данных. Соавторами осуществлялась консультативно-методическая помощь и предоставление технической базы для выполнения работы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы (13 отечественных и 131 зарубежных источников). Работа изложена на 117 страницах машинописного текста; содержит 14 таблиц, иллюстрирована 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Изучены 178 штаммов С. burnetii: вакцинный штамм М44, 27 штаммов-коллекции ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора и 150 штаммов коллекции Европейского референс-центра по изучению риккетсий, г. Марсель, Франция.

Присутствие С. burnetii определяли в образцах почек и селезенки 144 диких мелких млекопитающих, отловленных на территории садово-парковых зон Санкт-Петербурга в 2006-2007 гг, в органах (селезенка, почки) 25 лабораторных мышей линии C57BL, зараженных внутрибрюшинно живой вакциной «М-44», в крови больных с лихорадкой неясной этиологии. В качестве отрицательных образцов использовали ДНК Leptospira sp., Ureaplasma sp., Chlamydia sp. с содержанием геномов Ю,0/мл (ООО «Интерлабсервис», г. Москва), кровь здоровых доноров, кровь лабораторных интактных мышей и морских свинок.

Культивирование С. burnetii проводили в желточных мешках куриных эмбрионов общепринятым методом (Леннет Э., Шмидт Н., 1974), и в монослойной культуре клеток Vero (АТСС CRL 1587) с соблюдением правил работы с микроорганизмами 2 группы патогенности. Клетки С. burnetii очищали от тканевых примесей согласно Демкин В.В. и др. (1993). Для подсчета клеток С. burnetii в материале при помощи окулярной сетки использовали метод флуоресцирующих антител (Балаева Н.М., 1960). Методом последовательных разведений готовили растворы с концентрацией коксиелл 109- 101 клеток/мл. Геномным эквивалентом (ГЭ) считали ДНК одной клетки С. burnetii (Willems Н. et al., 1996).

Выделение тотальной ДНК из всех исследуемых образцов, включая культуры С. burnetii, проводили методом фенольной экстракции с использованием набора реагентов «Векто-ДНК-экстракция» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск).

Для амплификации ДНК С. burnetii методами ПЦР и ПЦР-РВ использовали ранее известные (Mossienko Е., Tokarevich N., 2003; Raoult D., 2005; Glazunova О. et al., 2005; Klee S. et al., 2006), и сконструированные праймеры. Праймеры и зонд разрабатывали с помощью программ Epimer,

Primer3, Vector NTI 8 на основе данных о нуклеотидной последовательности ДНК С. burnetii (NC 002971, NC 010117, NC 009726).

ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на приборе «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Москва), используя набор реактивов «Амплификация ДНК» НПО «Силекс М» (Москва). Продукты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом спектре.

ПЦР-РВ проводили в режиме автоматической амплификации на приборе ДТ-322 «ДНК-технология» (Москва), используя комплекты реагентов для ПЦР-РВ (ОАО «Синтол», Москва). Объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал: 2,5 мМ каждого дНТФ; 10х ПЦР буфер; 25 мМ MgCl2; праймеры, по 300 нМ каждого, 25 ед. Taq ДНК-полимеразы с игибирующими активность фермента антителами; деионизированную воду. Дополнительными компонентами служили: для ПЦР-РВ SYBRGreen I - интеркалирующий краситель SYBR Green 1 в концентрации 9,4 мкг/мкл; для ПЦР-РВ TaqMan -зонд, меченный флуоресцеином - 100 нМ.

Рестрикцию амплифицированных фрагментов ДНК, выделенных из геля с использованием набора «DNA Extraction Kit К0513» (MBI «Fermentas», Литва), проводили с помощью эндонуклеаз Hp all, Hin6i, Aínll (MBI «Fermentas», Литва) согласно инструкциям производителя.

Проведено секвенирование продуктов амплификации десяти межгенных промежутков: сох 2, сох 5, сох 18, сох 20, сох 22, сох 37, сох 51, сох 56, сох 57, сох 61 и фрагмента гена groEL с использованием «Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 2.0» (Ready Reactions, PE Biosystems, France) с 4 пкМ праймеров. Гель-элетрофорез проводили на автоматическом секвенаторе 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, USA). Продукты амплификации были предварительно очищены с помощью набора реагентов Multi Screen PCR (Millipore Corp., MA). Сиквенсы ДНК обрабатывали и компилировали с помощью программы AutoAssembler 2,0. Сравнение сиквенсов ДНК всех десяти межгенных участков выполняли с помощью программы CLUSTAL X (1.8).

Филогенетический анализ осуществляли методом UPGMA, основанным на вычислении коэффициента сходства Дайса (Dice L., 1945), с применением программы Mega, версия 2.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оптимизация метода ПЦР для выявления С. burnetii в полевом и клиническом материале.

Установлено, что использование праймеров dnaJ1 (Tokarevich N., Mossienko E., et al., 2001/ праймеров IS11112 (Raoult D., 2005), праймеров cox 56' (Glazunova O., et al., 2005) позволяет амплифицировать специфические фрагменты в образцах, содержащих ДНК С.burnetii (штамм Henzerling) (рис. 1, дорожки 2); в отрицательных образцах, содержащих ДНК микроорганизмов (Leptospira interrogans) (рис. 1, дорожки 3), продукты амплификации отсутствовали. Однако выявлено неспецифическое связывание праймеров IS 1111, сох56 и dnaJ с человеческой ДНК, выделенной из образца крови здорового донора (рис. 1, дорожки 1) и крови интактной морской свинки (на рис. 1 не показано).

Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов амплификации с наборами праймеров groEL, IS1111, сох56, dnaJ.

1 - суммарная ДНК. выделенная из образца крови здорового донора; 2 - ДНК С. burnetii (штамм Henzerling), 3 - ДНК Leptospira interrogans, М - маркер молекулярного веса (100- 1000 п.н. с шагом 100 п.н.)

Это обусловило необходимость разработки праймеров к гену groEL (1561 п.н.). Данный ген был выбран в качестве мишени для амплификации с учетом видовой специфичности, внутривидовой консервативности, антигенной активности кодируемого им белка-шаперонина Hsp60, ассоциированного с вирулентностью возбудителя (Lemos J.A. et al., 2007). ПЦР с использованием сконструированных праймеров, ограничивающих фрагмент хромосомной ДНК

1 амплифицируют фрагмент гена белка теплового шока dnaJ

2 амплифицируют фрагмент гена транспозазы, входящего в состав инсерционного домена высокой копийности IS////

1 амплифицируют 56-й межгенный участок хромосомной ДНК С. burnetii, расположенный между геном, кодирующим синтез OmpA-подобного трансмембранного протеина, и консервативным геном с неустановленной функцией

644 - 1257 п.н. протяженностью 594 п.н., обеспечивала появление соответствующего продукта амплификации участка гена groEL С. burnetii (рис. 1, дорожка 2). При этом в образцах, не содержащих ДНК С. burnetii, неспецифические продукты амплификации выявлены не были (рис. 1, дорожки 1, 3). Специфичность праймеров подтверждалась как контролями, содержащими ДНК человека, морской свинки и белой мыши, так и сравнением с нуклеотидными последовательностями других организмов (база данных BLAST): гомология последовательностей праймеров и амплифицируемого фрагмента с ДНК эукариотических организмов отсутствовала. Чувствительность метода ПЦР для выявления С. burnetii с различными наборами праймеров была сопоставима, и позволяла выявлять 100-1000 ГЭ в пробе.

Успешное применение праймеров groEL при амплификации контрольных образцов позволило провести исследование методом ПЦР 27б образцов органов (почки и селезенка) 144 диких мелких млекопитающих, отловленных в весенне-летний период 2006-2007 гг. на территории лесопарковых зон Санкт-Петербурга. ДНК С. burnetii была обнаружена у 11 (7,64%) особей - представителей двух видов: полевка рыжая (Clethrionomys glareolus) и бурозубка обыкновенная (Sorex araneus) (таблица 1).

Таблица 1. Частота выявления С. ЬигпеШ у особей различных видов диких мелких млекопитающих _

Вид Место отлова Число особей Наличие Д11К С. burnetii (%)

Полевка рыжая Северное кладбище, Удельный парк, Ржевский лесопарк, Ст. Морская 68 3 (4,4%)

Бурозубка обыкновенная Северное кладбище, Удельный парк, Ржевский лесопарк 35 8 (23%)

Бурозубка малая, средняя бурозубка, полевая мышь, малая лесная мышь, желтгорлая мышь, лесная мышь, обыкновенная полевка Северное кладбище, Удельный парк, Ржевский лесопарк, Павловский парк, ст. Морская, парк Александрино, Сестрорецкнй разлив, Стрельна 41 0

Итого 144 11 (7,6%)

Таким образом, для выявления С. burnetii, в том числе в полевом материале, по критериям чувствительности и специфичности наиболее эффективна ПЦР с праймерами groEL.

2. Сравнительная эффективность технологий ПЦР-РВ SYBRGreen I и ПЦР-РВ TaqMan для выявления и оценки количественного содержания С. burnetii в образцах биологического материала.

Для выявления С. burnetii в различных образцах с помощью ПЦР-РВ SYBRGreen I использовали наборы праймеров, позволяющие амплифицировать фрагменты генов IS Uli (Fenollar F. et al., 2004) и icd (Klee S. et al., 2006). Оптимизацию условий реакции осуществляли, используя в качестве положительного контроля ДНК вакцинного штамма С. burnetii М44 10-Ю10 ГЭ/мл, в качестве отрицательных образцов - ДНК различных микроорганизмов {Leptospira spp., Ureaplasma spp., Chlamidia spp.) 109 ГЭ/мл, а также тотальную ДНК, выделенную из образцов цельной крови доноров.

Сначала были подобраны условия проведения ПЦР, позволившие достигнуть максимальной чувствительности (96%) и специфичности (71,4%) амплификации с обоими наборами праймеров.

Как видно из таблицы 2, при указанных параметрах значения порогового цикла детекции флуоресценции различались при использовании различных концентраций ДНК вакцинного штамма С. burnetii М44 для амплификации с праймерами, ограничивающими участки гена icd и IS////.

При этом для каждого набора праймеров наблюдалась прямая зависимость между значением порогового цикла детекции флуоресценции и концентрацией ДНК С. burnetii. Однако репортерная флуоресценция была отмечена также в образцах, не содержащих ДНК С. burnetii М44.

Появление неспецифической репортерной флуоресценции могло быть обусловлено свойством интеркалирующего красителя SYBR Green I связываться с любой двухцепочечной ДНК (Zipper Н., Brunner Н., et al., 2004; Gudnason Н., Dufva М., et al., 2007), для подтверждения чего потребовались дополнительные исследования. Электрофорез амплифицированных фрагментов показал, что во всех положительных пробах независимо от

концентрации матрицы С. burnetii М44 образуется только один искомый специфический фрагмент: 195 или 76 п.н. для праймеров IS1111 или icd, соответственно. В отрицательных образцах указанные фрагменты обнаружены не были. Однако в случае Leptospira spp. при электрофорезе наблюдали неспецифический амплифицированный фрагмент ДНК (размером 100 п.н.). Кроме того, во всех пробах при электрофорезе выявляли фрагменты, характерные для димеров праймеров. Анализ кривой плавления продуктов амплификации подтвердил данные электрофореза: для специфического продукта амплификации характерно образование пика в диапазоне температур плавления 83° С - 85° С, тогда как для димеров праймеров - в диапазоне 80° С -82° С.

Таблица 2. Сравнительная оценка параметров ПЦР-РВ SYBRGreen I и TaqMan

ПЦР-РВ SYBRGreen I ПЦР-РВ TaqMan

Исследуемый образец 1S1111 праймеры* icd праймеры icd праймеры

Значение ГЭ С. burnetii Значение ГЭ С. burnetii Значение ГЭ С. burnetii

порогового цикла (Ci) порогового цикла(С 1) порогового цикла (Ct)

ДНК С. burnetii М44 12,7 3x10'' 15,6 2,2x109 18,3 3,4x10'

ДНК С burnetii 15,2 2,6x10' 18,8 4,8x10s 20,3 1,5x10'

ДНК С. burnetii М44 108 18,7 4,6x10" 20,8 1,2x107 25,1 2x10"

ДНК С. burnetii МЫ 107 22,8 6.2x107 26.2 8x106 26.4 4x107

ДНК С. ЬигпеШ М44 Ю" 28,2 3,5x106 30,4 7x103 28,3 4,5х106

ДНК С. burnetii Ш4 Ю3 32,6 4.5х104 31,6 1x10' 32,1 3x103

ДНК С. burnetii МАА 104 33,0 3,4x10' 32,8 1х104 33,2 1x10"

ДНК С. burnetii М44 103 34,2 2,4x10: 33,1 2,5xlOJ 33,8 1,6x103

ДНК С. burnetii М44 10: 36,7 840 34,9 900 34,1 600

ДНК С. burnetii М44 101 37,9 60 37,0 50 34,7 80

Н20 38,1 8 0,0 0 0 0

ДНК Ureaplasma sp. 10" 37,8 52 33,2 850 0 0

ДНК Chlamidia sp. 109 37,2 230 34,0 1 200 0 0

ДНК Leptospira sp.lO4 22,6 5,8x107 26,0 7,6x106 0 0

* 1 геномный эквивалент С. ЬигпеШ содержит 19-31 копию последовательности КПП; 5 содержание геномов С. ЬигпеШ/мл

Таким образом, появление неспецифического положительного сигнала в образце, не содержащем ДНК С. burnetii, при использовании обоих наборов праймеров явилось существенным недостатком метода ПЦР-РВ SYBRGreen I.

Для проведения ПЦР-РВ TaqMan использовали праймеры, амплифицирующие фрагмент гена icd С. burnetii (Klee S. et al., 2006). На основе анализа нуклеотидной последовательности гена icd (CP 001019), ограниченной

праймерами icd, был разработан специфический внутренний зонд, меченный флуоресцеином (FAM). Оптимизацию условий ПЦР-РВ TaqMan проводили с использованием тех же положительных и отрицательных контрольных образцов, что и в случае ПЦР-РВ SYBRGreen 1. Как и в случае с SYBRGreen I, наблюдалась прямая зависимость между значением порогового цикла детекции флуоресценции и концентрацией ДНК-матрицы (таблица 2). При этом во всех отрицательных контролях, не содержащих ДНК С. burnetii, репортерная флуоресценция отсутствовала. Чувствительность обоих методов ПЦР-РВ, SYBRGreen I и TaqMan, для выявления ДНК С. burnetii была сопоставима (таблица 2). При этом специфичность ПЦР-РВ TaqMan (97,2%) превышала достигнутую в ПЦР-РВ SYBRGreen I (74,1%).

Таблица 3. Результаты исследования образцов биологического материала на наличие ДНК С. ЬигпеШ методом ПЦР-РВ ТадМап___

Исследуемый образец Результат в ПЦР на наличие С. burnetii Значение порогового цикла(С,) гэ С. burnetii

Цельная кровь пациента с лихорадкой неустановленной этиологии отрицательный 0 0

Селезенка интактной лабораторной мыши отрицательный 0 0

Почка интактной лабораторной мыши отрицательный 0 0

Селезенка лабораторной мыши, зараженной С. burnetii 108кл/1 мкг ткани положительный 17,0 3x10"

Почка лабораторной мыши, зараженной С. burnetii 108кл/ 1 мкг ткани положительный 18,2 1,7x10'

Почка рыжей полевки -1, Северное кладбище положительный 32.3 2,3x104

Селезенка рыжей полевки -1, Северное кладбище положительный 32,0 2,8x104

Селезенка рыжей полевки -2, Северное кладбище положительный 31,8 2x103

Селезенка рыжей полевки -3, Северное кладбище положительный 33,6 1,8х104

Почка рыжей полевки -4, Северное кладбище положительный 34,2 1,5x104

Селезенка рыжей полевки -5, Северное кладбище положительный 32,2 4,4х104

Селезенка бурозубки обыкновенной, Северное кладбище положительный 31,2 6,7x104

Почка бурозубки обыкновенной, Северное кладбище положительный 31,2 5,2х104

Селезенка рыжей полевки-1, Ржевский лесопарк положительный 32,2 2,5х104

Селезенка рыжей полевки-2, Ржевский лесопарк положительный 33,7 1,1х104

Почка бурозубки обыкновенной, Ржевский лесопарк положительный 31,2 6,7x104

Селезенка бурозубки обыкновенной-1, ст. Морская положительный 33,5 1,4x104

Почка бурозубки обыкновенной-2, ст. Морская положительный 34,1 9x104

Метод ПЦР-РВ TaqMan с праймерами icd был апробирован на образцах органов диких мелких млекопитающих, положительных на наличие ДНК С. burnetii по результатам стандартной ПЦР с праймерами groEL. Во всех положительных пробах было обнаружено присутствие ДНК С. burnetii, ни в одной из заведомо отрицательных проб сигналов обнаружено не было (таблица 3).

Таким образом, метод ПЦР-РВ TaqMan, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью, может быть рекомендован для выявления генома С. burnetii в различных образцах, включая образцы биологического материала человека. Данная технология ПЦР-РВ позволяет избежать как стадии контроля результатов реакции с помощью электрофореза, так и необходимости анализа кривой плавления, что снижает продолжительность и трудоемкость исследования, а также исключает риск появления ложноположительных результатов вследствие контаминации продуктами ПЦР.

3. Молекулярно-генетнческая характеристика штаммов С. burnetii

С целью изучения генетической структуры популяции С. bunetii был проведен анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) гена groEL 14 штаммов возбудителя Ку-лихорадки, выделенных на территории Российской Федерации, республик бывшего СССР, Европы и Монголии.

Паттерны рестрикции ампликона groEL всех исследуемых штаммов были идентичны друг другу и совпадали с прогнозируемыми (CP 001019, CP 001020, АЕ 016828): для эндонуклеазы Hhal (Hin61) - фрагменты рестрикции 22 п.н., 122 п.н. и 450 п.н.; для эндонуклеазы Мп1\ - фрагменты 80 п.н. и 514 п.н.; для эндонуклеазы Нра\\ - отсутствие фрагментов рестрикции. Таким образом, установлена однородность по участку генома groEL штаммов С. burnetii, выделенных из различных источников на территориях бывшего СССР в период с 1954 по 1987 г.г., что согласуется с результатами предыдущих исследований тотальной хромосомной ДНК этих штаммов методом ПДФР (Демкин В.В., Токаревич Н.К., 1993).

Однородность гена groEL изученных штаммов С. burnetii при исследовании методом ПДФР послужила предпосылкой к секвенированию данного ампликона штамма Ixodes-3-JIyra. Полученная нуклеотидная последовательность депонирована в GenBank (EF627450); ее гомология с нуклеотидными последовательностями, представленными в GenBank, достигала 99%.

Установленный путем секвенирования полиморфизм множественных спейсеров хромосомной ДНК С. burnetii явился предпосылкой для разработки метода мультиспейсер-типирования штаммов на основе анализа различных комбинаций нуклеотидных последовательностей (аллелей) межгенных участков (спейсеров) (Glazunova О. et al., 2005). Из 68 изученных, успешно амплифицировались десять спейсеров: сох 2, сох 5, сох 18, сох 20, сох 22, сох 37, сох 51, сох 56, сох 57 и сох 61. Спейсеры сох18, сох 22, сох 51, сох 56, сох 57, сох61 обладали большей вариабельностью по сравнению с остальными. Спейсеры сох 2, сох 5, сох 20, сох 37, несмотря на относительную консервативность нуклеотидных последовательностей, оказались единственно пригодными для дифференциации некоторых штаммов.

Была проведена амплификация перечисленных десяти спейсеров 174 штаммов С. burnetii из 24 стран мира с последующим секвенированием каждого образца. Для каждого из спейсеров было выявлено от 7 (спейсер 5) до 13 (спейсер 56) вариантов сиквенса (табл. 4).

В результате компьютерной обработки результатов секвенирования для каждого из исследуемых штаммов было выявлено 30 вариантов сочетания нуклеотидных последовательностей спейсеров - «типов сиквенса» (ST) и построено филогенетическое дерево (табл. 4, рис. 2).

Таблица 4. Варианты нуклеотидных последовательностей десяти спенсеров (сох) С. burnetii

Тип Спейсср (сох)

сиквснса 2 5 18 20 22 37 51 56 57 61

(ST)

1 5 6 3 4 6 5 8 1 5 6

2 5 6 3 5 6 5 8 1 5 6

3 5 6 3 4 6 7 8 1 5 6

4 5 6 3 2 6 5 8 1 5 6

5 4 6 3 5 6 2 8 2 5 6

6 4 3 3 5 6 5 8 2 5 6

7 4 6 3 5 6 5 8 2 5 6

8 5 4 2 5 1 5 3 3 4 4

9 1 4 2 5 1 5 2 3 4 6

10 5 4 2 5 1 5 2 3 2 6

11 6 5 1 6 5 4 5 4 3 2

12 3 5 1 6 5 4 5 4 3 2

13 3 5 1 6 5 4 5 5 3 2

14 7 5 1 6 5 6 9 4 3 2

15 7 5 1 6 5 6 9 6 3 2

16 3 7 5 3 4 1 6 7 6 5

17 3 7 5 7 4 1 10 8 6 7

18 3 7 1 6 3 4 7 9 6 3

19 3 2 7 8 5 4 11 9 6 5

20 3 2 6 1 5 4 4 10 6 5

21 2 1 4 6 2 3 1 11 1 1

22 3 7 1 6 3 8 7 9 6 8

23 3 7 1 6 3 8 7 9 6 3

24 j 5 1 6 5 4 5 12 3 9

25 3 7 1 6 3 4 7 9 7 3

26 9 4 8 5 8 5 2 3 4 6

27 3 5 1 6 5 4 5 12 3 2

28 8 4 8 5 7 5 2 3 4 6

29 3 7 1 9 3 4 7 9 6 3

30 5 6 9 5 6 5 8 13 8 6

На дендрограмме (рис. 2) отмечены 3 монофилетические группы, которые объединяют штаммы С. burnetii, различного географического происхождения, представляющие различные ST.

MST монофилетические группы

ST1 (Франция) (19)* ST2 (Франция, Украина, Киргизия) (3) ST3 (Франция) (1) ST4 (Франция, Испания) (Б) STS (Франция) (2) ST6 (Франция) (1) ST7 (Франция, Россия) (3) ST30 (Намибия) (1) ЗТ26 (Узбекистан) (1) ST2S (Казахстан) (4) ST8 (Франция, Испания. США) (28) ST9 (Франция) (4) ST10 (Франция) (2) [-ST11 (Франция) |3)

ST12 (Франция, Швейцария. Германия) (13)

ST13 (Франция) (2) ST2T (Австрия) (1) ST24 (Германия) (1) ST1* (Франция, Германия) (5) ST15 (Франция) (1) rST18 (Франция, Румыния, Словакия, Греция, Италия, Германия) (10) J-ST25 (Казахстан) (3) rj^ST29 (Италия, Словакия) (1)

11-5723 (Словакия, Россия, Казахстан, Монголия, Узбекистан) (19)

1—ST22 (Словакия) (1)

ST16 (Франция, Румыния, Центральная Африка, США, Германия, Япония) (17) ST17 (Франция) (1) ST19 (Сенегал) (1) ST20 (Франция, Германия, США) (9) ST21 (Франция, Канада, США) (10)

Коэффициент подобия ST

I I I I I I I I I I I

1 0,9 0,8 0,70,6 0,5 0,4 0,3 0,20,1 0

* Количество изопятов, входящих в ST группу

Рисунок 2. Дендрограмма 174 штаммов С. burnetii, представляющих 30 типов сиквенса(ST)

Установлено, что большинство штаммов С. burnetii, выделенных в период с 1952 по 1987 год на территории различных регионов России из различных источников принадлежат к генотипу ST23 (монофилетическая группа II), к которому наиболее близки генотипы штаммов европейского происхождения -ST18, ST22, ST23, ST25 и ST29. Штаммы Ленинград-2 и Ленинград-4, выделенные в СССР от больных во время вспышек Ку-лихорадки в 50-х г.г. на

предприятиях по переработке сырья животного происхождения, обладают уникальным для российской популяции генотипом БТ7 (монофилетическая группа I).

Сравнительный анализ последовательностей спейсеров выявил значительную степень различий между генотипами, входящими в разные монофилетические группы (рис. 2, табл. 4). Так, различия между сиквенсами 8Т7 (монофилетическая группа Г) и БТ23 (монофилетическая группа II) российских штаммов наблюдались во всех десяти спейсерах, причем степень различий их объединенных последовательностей составляла 1,72% (суммарно 83 из 4826 нуклеотидов).

Межгенный промежуток 18 - "сох18"

Рисунок 3. Различия последовательности межгенного промежутка (сох) 18 у генотипов БТ7, 8Т22, 5Т23, 5Т24

Например, последовательности 18-го спейсера российских штаммов 8Т7 и БТ23 существенно различались между собой (5,23%). При этом последовательности данного спейсера были идентичны в пределах одной монофилетической группы (II), у 8Т22, 5Т23 и 8Т24 (штаммы выделены на территориях различных стран) (рис. 3).

Вместе с тем, генотипы БТ22 и БТ23 незначительно (1 нуклеотид - 0,02 %) различались, но лишь по одному из 10 межгенных участков - 61 (на рис. 3 не показано).

Отличие большинства российских штаммов С. burnetii, генотип ST23, от штаммов Ленинград-2 и Ленинград-4 (ST7), по-видимому, свидетельствует об импорте последних из географически отдаленного источника с зараженным сырьем.

В целом, для России характерна относительная генетическая однородность популяции С. burnetii (большинство штаммов принадлежат ST23) по сравнению с популяциями других стран. Так, у 11 штаммов из Германии выявлено 7 генотипов, у 4 штаммов из Словакии - 4 генотипа. Свойство относительной генетической однородности (присущее российским штаммам) проявляют только штаммы, выделенные на территории Канады (7 штаммов -генотип ST 21) и Японии (5 штаммов генотипа ST16). Генетическое разнообразие штаммов, выделенных на территориях Германии, Испании, Италии, Словакии, ограничивается пределами одной монофилетической группы. Штаммы, выделенные на территории Франции, США, распределяются по разным монофилетическим группам. Эти особенности, по-видимому, обусловлены миграциями людей, перемещениями зараженных сельскохозяйственных животных, сырья животного и растительного происхождения (хлопок) (Токаревич К.Н., Васильева Л.Д., 1958; Raoult D., 2003; Marmion В.Р. et al., 2004).

Дополнительные генотипические характеристики мировой коллекции штаммов С. burnetii были получены с помощью анализа последовательностей генов djlA и comí и плазмидного профиля. Сравнение последовательности генов djlA позволило выделить 4 группы штаммов. Группа I включала все ST-типы, включенные в монофилетическую группу 2 согласно мультиспейсер-типированию. Группа II включала ST1, ST2, ST3 и ST4. Группа III включала ST5, ST6, ST7, ST30, ST26, ST28, ST8, ST9 и ST10. Группа IV представлена ST21. Сравнение последовательности гена comí позволило выделить аналогичные группы, а также две дополнительных. Исследование плазмидного профиля позволило идентифицировать четыре типа плазмид: QpHl, QpRS, QpDV и QpDG, и выделить группу бесплазмидных изолятов. Распределение типов плазмид согласуется с распределением штаммов по монофилетическим

группам. Группа 2 включает штаммы, содержащие плазмиду QpHl. Группа 3 включает штаммы с типом плазмид QpHl и бесплазмидные. Группа 1 включает штаммы, для которых характерно наличие плазмид QpRS и QpDV.

Результаты этих исследований, таким образом, не противоречили результатам мультиспейсер-типирования и также позволяли сгруппировать штаммы. Однако анализ множественных межгенных участков оказался наиболее информативным для дифференциации штаммов различного географического происхождения.

Выводы

1. Сконструированный набор праймеров, позволяющий амплифицировать фрагмент гена groEL С. burnetii, эффективен для выявления методом ПЦР возбудителя Ку-лихорадки в биологическом материале.

2. Метод ПЦР-РВ в модификации TaqMan с использованием праймеров icd и сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, эффективен для выявления и количественного определения С. burnetii в биологическом материале и мониторинга природных очагов Ку-лихорадки.

3. Популяции С. burnetii на территории России свойственна относительная генетическая однородность. Подавляющее большинство штаммов (85%) С. burnetii, выделенных в различных регионах России, принадлежит к генотипу ST23 (монофилетическая группа II). К этой группе штаммов филогенетически наиболее близки штаммы европейского происхождения (генотипы ST18, ST22, ST25 и ST29). Штаммы Ленинград-2 и Ленинград-4 обладают уникальным для российской популяции генотипом ST7 (монофилетическая группа I).

4. Метод мультиспейсер-типирования позволяет дифференцировать штаммы С. burnetii различного географического происхождения в целях изучения глобальной эпидемиологии Ку-лихорадки. Однозначность интерпретации результатов секвенирования и их доступность в сети Интернет, позволяет сравнивать результаты генотипирования штаммов С. burnetii, полученные в различных лабораториях без обмена опасным биологическим материалом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Freylikhman О., Tokarevich N., Suvorov A., Vorobiova Е., Totolian А. Coxiella burnetii persistence in three generations of mice after application of live attenuated human M-44 vaccine against Q fever // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2003. - Vol. 990. - P. 496-500.

2. Glazunova O., Roux V., Freylikman O., Sekeyova Z., Tokarevich N., Fournous G., Tyczka J., Marrie T. J., Raoult D. Coxiella burnetii genotyping // Emerg. Infect. Dis.-2005.-Vol. 11, N8.-P. 1211-1217.

3. Tokarevich N., Freylikhman O., Titova N., Zheltakova I., Rybakova N., Vorobeychikov E.. Anthropogenic effects on changing of Q-fever epidemiology in Russia // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2006. - Vol. 1078. - P. 120123.

4. Фрейлихман O.A., Панфёрова Ю.А., Токаревич H.K. Результаты испытания новых праймеров для детекции Coxiella burnetii в организме диких мелких млекопитающих // 5-я межд. конф. "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями": Тез. докл. 2-4 июня 2008. - Санкт-Петербург. - 2008. -С. 104.

5. Фрейлихман О.А., Панфёрова Ю.А., Токаревич Н.К. Изучение гетерогенности штаммов Coxiella burnetii методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена groEL. - Бюлл. экспер. биол. и мед.-2008,-№9.-С. 56-59.

6. Фрейлихман О.А. Мультиспейсер-типирование (МСТ) - эффективный метод эпидемиологического надзора за Ку-лихорадкой // Материалы научно-практической конференции научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире». - Оболенск. - 2009. — С. 76-78.

Подписано в печать 08.07.2009. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 114.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии «Скифия-принт». 197110, Санкт-Петербург, ул. Б. Зеленина, 2/42. Тел./факс: (812)235-40-96.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фрейлихман, Ольга Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ТЕРМИНОВ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ .4 ВВЕДЕНИЕ.

1. Актуальность темы.

2. Цель работы.

3. Задачи исследования.

4. Научная новизна.

5. Практическая значимость.

6. Положения, выносимые на защиту.

7. Апробация работы.

8. Личный вклад диссертанта.

9. Структура и объем диссертации.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Биологические свойства С. burnetii.

2. Характеристика генома С. burnetii.

3. Методы идентификации и дифференциации коксиелл: биологические, серологические, иммунологические, молекулярно-биологичеекпе.

I. Методы идентификации.

Методы культивирования С. burnetii.

Биологические методы идентификации.

Серологические методы.

Молекулярно-генетические методы.

ПЦР в формате реального времени.

И. Методы дифференциации С. burnetii и оценка генетической однородности мировой популяции коксиелл.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

1.1. Штаммы С. burnetii.

1.2. Биологический материал.

1.3. ДНК микроорганизмов для контроля специфичности реакций ПЦР и ПЦР-РВ.

2. Методы.

2.1. Культивирование С. burnetii для накопления биомассы.

2.1.1. Культивирование на куриных эмбрионах.

2.1.2. Культивирование в культуре клеток.

2.2. Очистка от тканевых примесей.

2.3. Подсчет количества клеток С. burnetii в материале.

2.4. Выделение ДНК.

2.5. Дизайн праймеров.

2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.7. Электрофорез в агарозном геле.

2.8. ПЦР в формате реального времени.

2.9. Выделение ДНК из агарозного геля.

2.10. Рестрикция.

2.11. Секвенирование.

2.12. Статистическая и компьютерная обработка данных.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ С. BURNETII В

ПОЛЕВОМ И КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ.

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕХНОЛОГИЙ ПЦР-РВ SYBRGREEN IИ ПЦР-РВ TAQMAN ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОЦЕНКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ С. BURNETII В ОБРАЗЦАХ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.

1. ПЦР-РВ, технология SYBRGreen 1.

2. ПЦР-РВ, технология TaqMan.

ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ С. BURNETII.

1. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции.

2. Мультиспейсер-типирование.

3. Распределение штаммов по типу плазмид и типу сиквенса генов djIA и coml.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление, типирование и молекулярно-генетическая характеристика Coxiella burnetii"

1. Актуальность темы

Ку-лихорадка — природно-очаговое инфекционное заболевание, представляющее важную медико-социальную проблему в связи с широким распространением возбудителя в различных климато-географических зонах мира; многообразием путей передачи инфекции (воздушно-пылевой, пищевой, трансмиссивный); профессиональным характером заражения лиц, занятых в животноводстве; значительными экономическими потерями, обусловленными инфицированием сельскохозяйственных животных.

Высоко устойчивый во внешней среде возбудитель Ку-лихорадки, Coxiella burnetii, является причиной спорадических заболеваний, эпидемических вспышек и может быть использован в качестве потенциального агента биотерроризма (Pappas G., Blanco J.R., 2007; Azad A.F., 2007; Tissot-Dupont H, Raoult D., 2008).

Сложившиеся в последнее десятилетие в России социально-экономические условия создают реальные предпосылки подъема заболеваемости населения Ку-лихорадкой. Так, частота обнаружения антител к С. burnetii у здоровых лиц увеличилась за последние годы в несколько раз и составила 16,0% и 11,0% в 2002 и 2003 г.г. против 1,1% и 1,8% в 1993 и 1994 г.г., соответственно (Беляев Е.Н. и др., 2001). Наблюдаемое при этом отсутствие корреляции между относительно высокой частотой случаев обнаружения антител и низким уровнем официально регистрируемых случаев Ку-лихорадки обусловлено гиподиагностикой инфекции и типично не только для России, но и для ряда европейских стран. Это связано с многообразием клинических проявлений Ку-лихорадки, поздним появлением антител к коксиеллам, сложностью культивирования возбудителя, накопление которого в куриных эмбрионах или в культуре эукариотических г клеток трудоемко и сопряжено с большими временными затратами. Иммунологические методы выявления С. burnetii с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА) недостаточно чувствительны и специфичны.

2. Цель работы

Совершенствование амплификационных методов выявления и типирования возбудителя Ку-лихорадки в биологическом материале и генотипическая характеристика штаммов С. burnetii различного географического происхождения.

3. Задачи исследования

1. Оптимизировать метод ПЦР для выявления С. burnetii в образцах биологического материала.

4. Научная новизна

С использованием метода мультиспейсер-типирования и анализа длин фрагментов рестрикции гена groEL изучена генетическая структура популяции С. burnetii, представленной штаммами, выделенными из различных источников в ряде регионов России. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей множественных спейсеров установлено, что на территории Российской Федерации циркулируют штаммы С. burnetii - представители групп ST23 (85%) и ST7 (15%). Впервые для качественного и количественного определения фрагмента гена icd С. burnetii в полевом материале из природных очагов Ку-лихорадки применен метод ПЦР-РВ.

Депонировано в коллекцию Международного генетического банка

Национального центра биотехнологической информации http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 90 нуклеотидных последовательностей спейсеров (протяженностью 383 - 674 п.о.) девяти штаммов С. burnetii (АСС AY 864199 - AY 864288) и одна нуклеотидная последовательность фрагмента TQnagroEL штамма Ixodes-3-JIyra, протяженностью 594 п.н. (АСС EF627450).

Научно обоснована перспективность применения метода мультиспейсер-типирования для дифференциации штаммов С. burnetii различного географического происхождения.

5. Практическая значимость

6. Положения, выносимые на защиту

4. Метод мультиспейсер-типирования эффективен для генотипической характеристики штаммов С. burnetii различного географического происхождения.

7. Апробация работы

8. Личный вклад диссертанта

Формулирование целей и задач, подбор методов исследования выполнены лично диссертантом. Автором лично проводился дизайн праймеров и зондов для ПЦР-РВ и оптимизация ПЦР-РВ, лабораторные исследования биологического материала методами ПЦР и ПЦР-РВ, амплификация и секвенирование межгенных промежутков штаммов российской коллекции С.burnetii при их анализе методом мультиспейсер-типирования, статистическая обработка данных. Соавторами осуществлялась консультативно-методическая помощь и предоставление технической базы для выполнения работы.

9. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы (13 отечественных и 131 зарубежных источников).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Фрейлихман, Ольга Александровна

Выводы

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Freylikhman О., Tokarevich N., Suvorov A., Vorobiova Е., Totolian A. Coxiella burnetii persistence in three generations of mice after application of live attenuated human M-44 vaccine against Q fever.// Ann. N. Y. Acad. Sci. - -2003.- Vol. 990. - P.496-500

2. Glazunova O., Roux V., Freylikman O., Sekeyova Z., Tokarevich N., Fournous G., Tyczka J., Marrie T. J., Raoult D. Coxiella burnetii genotyping.// Emerging Infectious Diseases.-2005.-Vol. 11, N8.-P. 1211-1217.

3. Tokarevich N., Freylikhman O., Titova N., Zheltakova I., Rybakova N., Vorobeychikov E. Anthropogenic effects on changing of Q-fever epidemiology in Russia.// Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2006. - Vol. 1078. - P. 120-123

4. Фрейлихман O.A., Панфёрова Ю.А., Токаревич H.K. Результаты испытания новых праймеров для детекции Coxiella burnetii в организме диких мелких млекопитающих.// 5-я межд. конф. "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями": Тез. докл. 2-4 июня 2008. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 104

5. Фрейлихман О.А., Панфёрова Ю.А., Токаревич Н.К. Изучение гетерогенности штаммов Coxiella burnetii методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена groEL.ll Бюлл. экспер. биол. и мед. — 2008. - №9. - С. 56-59

6. Фрейлихман О. А. Мультиспейсер-типирование (МСТ) — эффективный метод эпидемиологического надзора за Ку-лихорадкой.// Мат-лы Научно-практической конференции научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире». - Оболенск, 2009. - С. 76-78

Заключение

Природные и хозяйственные очаги Ку-лихорадки широко распространены в России и во всем мире. При этом люди могут заражаться как непосредственно от животных (McQuiston J.H., Childs J.E., 2002), так и опосредованно (Tissot-Dupont Н., Raoult D., 2008), через объекты внешней среды (Tissot-Dupont Н., Torres S., 1999), продукцию животного происхождения (Kim S.G., Kim Е.Н., 2005) и т.д. В последнее время подтверждена способность коксиеллы длительно выживать в почвах (La Scola В. et al., 2001; Евстигнеева А.С., и др., 2005).

Однако методы выявления облигатного внутриклеточного паразита С. burnetii - возбудителя Ку-лихорадки, в очагах остаются неэффективными, что существенно затрудняет контроль за данной инфекцией. Разработанные сравнительно недавно и почти не используемые в России молекулярно-биологические методы направлены главным образом на детекцию коксиеллы в клиническом материале. Существуют единичные публикации, связанные с применением ПЦР для исследования полевого материала (Tokarevich N.K. et al., 2000), но данные по сравнению эффективности применения различных праймеров и адаптации РВ-ПЦР для выявления очагов Ку-лихорадки в литературе отсутствуют.

Хотя для детекции С. burnetii применяются различные праймеры (специфические к последовательностям генов icd, \S1111, coml, dnaJ, 16S rRNA), они малопригодны для целей мониторинга очагов Ку-лихорадки, основанного на ПЦР-анализе органов и тканей грызунов, поскольку не учитывают особенностей биологического материала. Это существенно осложняло выявление С. burnetii методом ПЦР в материале от диких мелких млекопитающих. Кроме того, гены С. burnetii, являющиеся мишенью для известных праймеров, в большинстве случаев уже были изучены на наличие полиморфизма, и оказались малоинформативными в этом отношении (Nguyen S., Hirai К., 1999; Sekeyova Z. et al., 1999; Denison A.M. et al., 2007). Выбор же гена groEL для последующего конструирования праймеров предусматривал последующее изучение его возможной внутривидовой вариабельности. Так, для многих бактериальных видов установлена связь гена groEL с вирулентностью штаммов,и с патогенезом заболевания (Lemos J.A. et al., 2007), кроме того, при анализе геномного сиквенса таких возбудителей, как Mycobacterium tuberculosis и Corynebacterium glutamicum выявлена дупликация гена groEL, или даже наличие множественных его копий (Goyal К., Qamra R., 2006). Многокопийность создает предпосылки для вариабельности данного гена. Таким образом, используя в качестве мишени для праймеров фрагмент гена groEL преследовалась двойная цель: использовать высокую видовую специфичность гена для -усовершенствования ГЩР-диагностики и, при наличии множественных его копий в геноме — изучить возможную гетерогенность штаммов.

Основной целью совершенствования молекулярно-генетической детекции коксиеллы в полевом материале являлось увеличение чувствительности и специфичности метода ПЦР и адаптация метода ПЦР-РВ для выявления С. burnetii в полевом материале. В ходе проведенной работы установлено, что разработанные праймеры groEL позволяют упростить и повысить надежность идентификации возбудителя лихорадки Ку методом ПЦР в биологических образцах. Оптимальные условия ПЦР (35 циклов при следующих параметрах: 95° С - 1 мин, 57° С - 1 мин, 72° С - 1 мин 30 сек) были выявлены с использованием ферментов и прибора для амплификации отечественного производства, что является важным обстоятельством, поскольку зарубежные наборы для ПЦР и приборы амплификации являются значительно более дорогостоящими.

Несмотря на достаточную чувствительность и специфичность оптимизированной стандартной ПЦР, ее недостатком является невозможность количественной оценки содержания ДНК возбудителя. Кроме того, ПЦР-РВ, позволяет существенно сократить продолжительность и трудоемкость исследований, снижает риск появления ложноположительных результатов, возникающих на стадии электрофореза. Более высокая чувствительность ИТ TP-PR по сравнению со стандартной ПЦР является важным преимуществом, особенно при работе с полевым материалом, где зачастую наблюдается незначительное накопление С. burnetii.

Применение метода ПЦР-РВ в нашей работе позволило установить его достаточную чувствительность и специфичность для прямого обнаружения С. burnetii в биологических образцах, но отмечено существенное колебание этих показателей в зависимости от технологии ПЦР-РВ. Сравнительный анализ ПЦР-РВ по технологиям SYBRGreen I и TaqMan показал, что наилучшие результаты по специфичности демонстрирует ПЦР-РВ по технологии TaqMan, где этот показатель достигает 100%. Чувствительность ПЦР-РВ в зависимости от технологии варьировала в менее широких пределах и была сопоставима для обеих технологий, но лучшие показатели были получены при использовании технологии TaqMan. Чувствительность этой реакции превышала чувствительность стандартной ПЦР в 10 раз в случае с праймерами icd, ив 10-100 раз в случае с праймерами IS1111.

Таким образом, метод ПЦР-РВ по технологии TaqMan может быть успешно использован в целях эпидемиологического мониторинга, как для определения наличия возбудителя у диких мелких млекопитающих, так и степени их инфицированности.

До настоящего времени генотипирование зарубежных штаммов С. burnetii было недостаточно эффективным, так как не позволяло дифференцировать штаммы по их географическому происхождению. Российские штаммы были охарактеризованы лишь в одном исследовании методом анализа ПДФР хромосомной ДНК С. burnetii (Демкин В.В., Токаревич Н.К., 1993).

На первом этапе с целью генетической характеристики штаммов был проведен рестрикционный анализ ампликонов гена groEL штаммов С. burnetii коллекции лаборатории зооантропонозных инфекций НИИЭМ имени Пастера, выделенных на территории бывшего СССР во второй половине XX века, различных по таким признакам, как географическое происхождение и источник выделения. При этом не было обнаружено значительной генетической гетерогенности. Отсутствие различий подтвердило данные предыдущего исследования этих штаммов методом анализа ПДФР, в ходе которого была выявлена генетическая однородность штаммов С. burnetii российской коллекции.

В связи с недостаточной информативностью анализа отдельных генов при изучении С. burnetii, дальнейшая работа служила изучению гетерогенности путем анализа множественных межгенных участков 174 штаммов С. burnetii из 24 стран всех частей света. Установленный полиморфизм этих спейсеров явился предпосылкой для разработки метода типирования штаммов С. burnetii на основе сиквенс-анализа полученных различных аллельных комбинаций межгенных участков. Сравнительный анализ последовательностей спейсеров выявил значительную степень различий между генотипами, входящими в разные монофилетические группы. В целом же для России характерна относительная генетическая однородность популяции С. burnetii (большинство штаммов принадлежат ST23) по сравнению с популяциями других стран. В результате впервые так полно были охарактеризованы филогенетические связи между штаммами мировой' популяции коксиелл и определено место в ней штаммов, выделенных на территории России и пограничных государств — республик бывшего СССР. На основе полученных результатов создана общая база данных, охватывающая типы сиквенсов штаммов со всех частей света, за исключением Австралии, позволяющая с большой степенью вероятности определять географическое происхождение типируемых штаммов и изолятов С. burnetii.

Проведенное с помощью метода МСТ исследование имело особое значение для штаммов, выделенных на территории России, так как позволило предположить с большой степенью вероятности географическое происхождение источников инфекции при вспышках 50-хх годов, связанных с завозом инфицированного сырья, а также генетически охарактеризовать штаммы, выделенные на территории России и республик бывшего СССР, оценить степень родства этих штаммов между собой, определить их связь с мировой популяцией коксиелл.

Преимущество метода МСТ связано с тем, что его дискриминационная способность превосходит этот показатель у MLST, поскольку МСТ основан на анализе не консервативных, а вариабельных участков генома. Это особенно важно для такого консервативного вида, как С. burnetii. Метод же MLVA, также позволяя типировать штаммы и изоляты, не дает филогенетических характеристик штаммов. Кроме того, перечисленные методы неприменимы при мониторинге госпитальных вспышек или вспышек в локальной популяции поскольку для этого необходимы методы с повышенной дискриминационной способностью. Напротив, метод МСТ применим для ретроспективного анализа вспышек, и для анализа распределения того или иного генотипа в пределах России, основных путей и закономерностей их распространения, что может существенно способствовать эффективности противоэпидемических мероприятий. Важно также, что, как показали исследования, МСТ применим при анализе любых образцов, содержащих ДНК возбудителя, что важно для быстрого молекулярного эпидемиологического анализа.

Такие методы как пульс-гель-электрофорез, RAPD, AP-PCR, AFLP, ERIC-PCR, IRS-PCR, сполиготипирование, риботипирование и изучение микросателлитов высокодискриминативны, но трудоемки, могут требовать больших количеств очищенной ДНК (например, PFGE), быть в некоторой степени субъективными (например, AP-PCR, риботипирование), и дают результаты, которые не всегда могут быть воспроизводимы или мобильны для других лабораторий. Методу МСТ, напротив, свойственна высокая воспроизводимость результатов даже после достаточно длительного пассирования штаммов, что существенно стандартизирует применение метода (Djelouadji Z., Arnold С., et al., 2008). МСТ является универсальным методом, благодаря однозначности интерпретации данных секвенирования и доступности базы данных по ним в сети Интернет. Это позволяет сравнивать результаты, полученные в различных лабораториях, без обмена штаммами. Кроме того, это разрешает вопросы, связанные со сложностью обмена изолятами вследствие опасности возбудителя и возможности его использования как потенциального агента биотерроризма. Преимущество МСТ состоит также в относительной дешевизне с минимальным расходом материалов, отсутствии необходимости в больших количествах ДНК и в ограничении риска контаминации лабораторных работников.

Кроме того, стоит заметить, что, хотя в настоящее время существуют различные методы типирования и генетической характеристики коксиеллы, для максимально объективной оценки генетических особенностей штаммов и филогенетических связей между ними необходимо применение комплекса методов.

Полученные результаты открывают перспективы дальнейших исследований, связанных с оптимизацией методов ПЦР и ПЦР-РВ для выявления С. burnetii в клиническом материале в целях усовершенствования диагностики Ку-лихорадки; с дальнейшими поисками генетических маркеров свойств вирулентности и других особенностей штаммов, определяющих тактику лечения и профилактики Ку-лихорадки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фрейлихман, Ольга Александровна, Санкт-Петербург

1. Амосенкова Н.И., Дайтер А.Б., Кленов К.Н. Исследование мелких млекопитающих в Лужском очаге Ку-лихорадки. Труды НИИЭМ имени Пастера. Том 20. Зооантропонозы. Л., 1959. С. 71-79

2. Балаева Н.М. Метод подсчета риккетсий, культивируемых в кишечнике платяных вшей // Материалы по обмену опытом (Управление институтов вакцин и сывороток СССР). М. - I960.- Вып. 2/57,- СЛ16-117

3. Беляев Е.Н., Подунова Л.Г., Ясинский А.А., Опочинский Е.Ф. Анализ деятельности Центров Госсанэпиднадзора по лабораторной диагностике риккетсиозов: Информационный сборник статистических и аналитических материалов. М., 2001, 28 с.

4. Васильева Л.Д. О вспышках лихорадки Ку профессионального характера в Ленинграде 1959 г. // Риккетсиозы. Болезни с природной очаговостью/ Труды Ленинградского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. 1961. - Т. XXIII. — С. 196

5. Демкин В.В., Токаревич Н.К., Рыдкина Е.Б. и др. Характеристика полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК штаммов Coxiella burnetii, выделенных на территории России // Молек. генетика, микробиол. и вирусология. 1993. - №6. — С. 13-16

6. Евстигнеева А.С., Комарова А.И, Фетисова Н.Ф. и др. Переживание коксиеллы в почве. // Журн. Эпидемиол., микробиол., иммунобиологии. 2005. - №6. - С. 57-59.

7. Коксиллез (Лихорадка Ку). Санитарные правила СП 3.1. 095—96. Ветеринарные правила ВП 13.3. 1221-96. — М.: Госкомсанэпиднадзор России, Минсельхозпрод России, 1996. 7 с.

8. Леннет Э., Шмидт Н. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. М.: Медицина, 1974. - 702 с.

9. Токаревич К.Н., Васильева Л.Д. Первые случаи Ку-лихорадки в Ленинграде. // Риккетсиозы. Сборник научных работ / Ленингр. Ин-тусоверш. врачей и Лен. Ин-т микробиол., эпидемиол. и гигиены им. Пастера.-Л., 1958. С.182

10. Токаревич К.Н., Васильева Л.Д. Первые случаи Ку-лихорадки в Ленинграде//Риккетсиозы. Л., 1958. — С. 182 191

11. Токаревич К.Н., Васильева Л.Д. Ку-лихорадка в Ленинграде// Зооантропонозы. Т. 20. Л., 1959. С. 7-19

12. Федорова Н.И. Эпидемиология и профилактика Ку-риккетсиоза. М., Медицина, 1968. -250 с.

13. Achtman М., Zurth К., Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 96, 1999. - P. 14043-14048

14. Afseth G., Mallavia L.P. Copy number of the 16S rRNA gene in Coxiella burnetii II Eur J. Epidemiol. Vol. 13(6), 1997. - P. 729-731

15. Azad A.F. Pathogenic rickettsiae as bioterrorism agents // Clin. Infect. Dis. — Vol. 15, 2007.-P. S52-55.

16. Baca O.G., Roman M.J., Glew R.H. et al. Acid phosphatase activity in Coxiella burnetii: a possible virulence factor // Infect. Immun. Vol. 61(10), 1993.-P. 4232-4239

17. Batrukova M.A., Betin V.L., Rubtsov A.M., Lopina O.D. Ankyrin: structure, properties, and functions // Biochemistry (Mosc.). — Vol. 65(4), 2000.-P. 395-408

18. Beaman M. H., Hung J. Pericarditis associated with tick-borne Q fever // Aust. N. Z. J. Med. Vol. 19, 2000. - P. 254-256

19. Bear P.A., Samuel J.E., Howe D. et al. Genetic diversity of the Q fever agent, Coxiella burnetii, assessed by microarray-based whole-genomecomparisons. // Journ. of Bacteriol. Vol.188, №7, 2006. - P. 2309-2324

20. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J. et al. GenBank: update // Nucleic Acids Res. Vol. 32, 2004. - P. D23-26.

21. Bes M., Slim L.S., Becharnia F. et al. Population diversity of Staphylococcus intermedius isolates from various host species: Typing by 16S-23S intergenic ribosomal DNA spacer polymorphism analysis // J. Clin. Microbiol. Vol. 40, 2002. - P. 2275-2277.

22. Boulos A., Rolain J.M., Raoult D. Measurement of the antibiotic susceptibility of Coxiella burnetii using real time PCR // Int. Journ. of Antimicrob. Agent. Vol. 23 (2), 2004. - P. 169-174

23. Brennan R.E., Samuel J.E. Evaluation of C. burnetii antibiotic susceptibilities by real-time PCR assay // J. Clin. Microbiol. Vol. 41, 2003. -P. 1869-1874

24. Cianciotto N.P. Type II secretion: a protein secretion system for all seasons // Trends Microbiol. Vol. 13 (12), 2005. - P. 581-588

25. Cirillo S. L., Lum J., Cirillo J. D. Identification of novel loci involved in entry by Legionella pneumophila II Microbiology. Vol. 146, 2000. — P. 1345-1359

26. Cole S.T., Eiglmeier K., Parkhill J. et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus // Nature. Vol. 409(6823), 2001. - P. 1007-1011.

27. Davies E.L., Bacelar M.M., Marshall MJ. et al. Heat shock proteins form part of a danger signal cascade in response to lipopolysaccharide and GroEL // Clin. Exp. Immuno. Vol. 145(1), 2006. - P. 183-189

28. Denison A.M., Thompson H.A., Massung R.F. IS1111 insertion sequences of Coxiella burnetii: characterization and use for repetitive element PCR-based differentiation of Coxiella burnetii isolates // BMC Microbiol. Vol. 7, 2007.-P. 91.

29. Fenollar F., Fournier P.E., Raoult D. Molecular detection of Coxiella burnetii in the sera of patients with Q fever endocarditis or vascular infection // J. Clin: Microbiol. Vol. 42(11), 2004. - P. 4919-4924

30. Fenollar F., Raoult D. Molecular genetic methods for the diagnosis of fastidious microorganisms // APMIS. Vol. 112(11-12), 2004. - P. 785-807

31. Fournier P.E., Marrie T.J., Raoult D. Diagnosis of Q fever // J. Clin. Microbiol.-Vol. 36(7), 1998.-P. 1823-1834

32. Fournier P.E., Raoult D. Predominant immunoglobulin A response to phase II antigen* of Coxiella burnetii in acute Q fever // Clin. Diagn. Lab. Immunol.-Vol. 6(2), 1999.-P. 173-177

33. Fournier P.E., Raoult D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever // J. Clin. Microbiol. Vol. 41(11), 2003. - P. 5094-5098

34. Fournier P.-E., Zhu Y., Ogata H., Raoult D. Use of highly variable intergenic spacer sequences for multispacer typing of Rickettsia conorii strains. // J. Clin. Microbiol. Vol: 42(12), 2004. - P. 5757-5766.

35. Frazier M.E., Mallavia L.P., Samuel4 J.E., Baca O.G. DNA probes for the identification of Coxiella burnetti strains // Ann. N. Y. Acad. Sci.— Vol. 590, 1990.-P.'445-458.

36. Freylikhman O., Tokarevich N., Suvorov A. et al. Coxiella burnetii persistence in three generations of mice after application of live attenuated human M-44 vaccine against Q fever // Ann. N. Y. Acad. Sci. Vol. 990, 2003. - P.496-500

37. Gauduchon V., Chalabreysse L., Etienne J. et al. Molecular diagnosis of infective endocarditis by PCR amplification and direct sequencing5 of DNA from valve tissue // J. Clin. Microbiol. Vol. 41, 2003. - P. 763-766

38. Giglio S., Monis P.T., Saint C.P. Demonstration of preferential'binding of

39. SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR // Nucleic Acids Res. Vol. 32, 2003. - P. 5.

40. Gimenez D. F. Staining rickettsiae in yolk sac cultures // Stain Technol. -Vol.30, 1964.-P. 135-137

41. GlazunovaO., Roux V., Freylikman O. et al. Coxiella burnetii genotyping // Emerg. Infect, diseases. Vol. 11, 2005.-P. 1211-1217

42. Goyal K., Qamra R., Mande S.C. Multiple gene duplication and rapid evolution in the groEL gene: functional implications. // J. Mol. Evol. -Vol.63 (6), 2006. - P. 781-787

43. Guatteo R., Beaudeau F., Joly A., Seegers H. Assessing the within-herd prevalence of Coxiella burnetii milk-shedder cows using a real-time PCR applied to bulk tank milk // Zoonoses Public Health. -Vol. 54(5), 2007. P. 191-194

44. Gudnason H., DufVa M., Bang D.D., Wolff A. Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature // Nucleic Acids Res. Vol. 35(19), 2007. - P. 127

45. Hacker J., Blum-Oehler G., Hochhut В., Dobrindt U. The molecular basis of infectious diseases: pathogenicity islands and other mobile genetic elements. A review // Acta Microbiol. Immunol. Hung. Vol. 50(4), 2003. P. 321-330

46. Hackstadt T. Antigenic variation in the phase I lipopolysaccharide of Coxiella burnetii isolates // Infect. Immun. Vol. 52, 1986. - P. 337-340.

47. Hackstadt Т., Peacock M., Hitchcock P., Cole R. Lipopolysaccharide variation in Coxiella burnetii: intrastrain heterogeneity in structure and antigenicity // J. Infect. Immun. Vol.48, 1985. - P.359-365

48. Harris R.J., Storm P.A., Lloyd A. et al. Long-term persistence of C. burnetii in the host after primary Q fever // Epidemiol. Infect. — Vol. 124, 2000. P. 543-549

49. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. Vol. 6, 1996. - P. 986-994

50. HeinzenR.A., Frazier M.E., Mallavia L.P. Nucleotide sequence of Coxiella burnetii superoxide dismutase // Nucleic Acids Res. Vol. 18(21), 1990. -P. 6437

51. Heinzen R.A., Frazier M.E., Mallavia L.P. Coxiella burnetii superoxide dismutase gene: cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli. Infect Immun. 1992 Sep;60(9):3814-23.

52. Heinzen R.A., Hackstadt Т., Samuel J.E. Developmental biology of Coxiella burnettii // Trends Microbiol. Vol. 7(4), 1999: - P. 149-154

53. Helbig K. J., Heatley S. L., Harris R. J. et al. Variation in immune response genes and chronic Q fever. Concepts: preliminary test with post-Q. fever fatigue syndrome // Genes Immun. Vol. 4, 2003. - P. 82-85

54. Hendrix L.R., Samuel J.E., Mallavia L.P. Differentiation of Coxiella burnetii isolates by analysis of restriction-endonuclease-digested DNA separated by SDS-PAGE. J Gen Microbiol. Vol. 137, 1991. - P. 269-276

55. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic Per analysis realtime monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. — Vol. 11, 1993.-P. 1026-1030

56. Holt J.G., Krieg N.R. The Coxiella // Bergey's manual of systematic bacteriology. Vol.1, 1984-1989. - P.687-704

57. Hoover Т., Culp D., Vodkin M. et al. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (Crazy), of the Coxiella burnetii Nine Mile strain // Infect Immun. Vol. 70 (12), 2002.-P. 6726-6733

58. Hoover T.A., Vodkin M.H., Williams J.C. A Coxiella burnetii repeated DNA element resembling a bacterial insertion sequence // Journ. of Bacteriol. — Vol. 174(1), 1992.-P. 5540-5548

59. Ibrahim A., Norlander L., Macellaro A., Sjostedt A. Specific detection of Coxiella burnetii through partial amplification of 23S rDNA // Eur. J. Epidemiol.-Vol. 13(3), 1992.-P. 329-334

60. Isacsson J., Cao H., Ohlsson L. et al. Rapid and specific detection of PCR products using light-up probes // Mol. Cell. Probes. Vol. 14, 2000. - P. 321-328

61. Jager C., Willems H., Thiele D., Baljer G. Molecular characterization of Coxiella burnetii isolates // Epidemiol. Infect. 1998;120:157-64.

62. Jolley K. A., Feil E. J., Chan M.-S. Sequence Type analysis and Recombination Tests (START) // Bioinformatics. Vol. 17, 2001. - P. 1230-1231

63. Juhas M., Crook D.W., Hood D.W. Type IV secretion systems: tools of bacterial horizontal gene transfer and virulence // Cell Microbiol. Vol. 10, 2008.-P. 315-319

64. Jung M., Muche J.M., Lukowsky A. et al. Dimethyl sulfoxide as additive in ready-to-use reaction mixtures for real-time polymerase chain reaction analysis with SYBR Green I dye // Anal. Biochem. Vol. 289, 2001. - P. 292-295

65. Karsai A., Muller S., Platz S., Hauser M.T. Evaluation of a homemade SYBR (R) Green I reaction mixture for real-time PCR quantification of gene expression // Biotechniques. Vol. 32, 2002. - P. 790-796

66. Kazar J., Brezina R., Schramek S. et al. Virulence, antigenic properties and physicochemical characteristic of Coxiella burnetii strains with different chick embryo yolk sac passage history // Acta Virol. Vol. 18, 1974. - P. 434-442

67. Kim S.G., Kim E.H., Lafferty C.J., Dubovi E. Coxiella burnetii in bulk tank milk samples, United States // Emerg. Inf. Dis. Vol. 11 (4), 2005. - P. 218224

68. Kishimoto R.A., Stockman R.W., Redmond C.L. Q fever diagnosis therepy and immunoprophylaxis // Milit.Med. Vol. 44, 1979. - P. 183-187

69. Klee S., Tyczka J., Ellebrok H. et al. Highly sensitive real-time PCR for specific detection and quantification of C. burnetii // BMC Microbiology. -Vol. 2,2006. -P. 338-345

70. La Scola B. Current laboratory diagnosis of Q fever // Semin. Pediatr. Infect. Dis. Vol. 13(4), 2002. - P. 257-262

71. La Scola В., Raoult D. Serological cross-reactions between Bartonella quintana, Bartonella henselae, and Coxiella burnetii II J. Clin. Microbiol. — Vol. 34(9), 1996. P. 2270-2274

72. La Scola В., Raoult D. Survival of Coxiella burnetii within free-living amoeba Acanthamoeba castellanii // Clin. Microbiol. Infect. — Vol. 7(2), 2001.-P. 75-79

73. Lautenschlager S., Willems H., Jager C., Baljer G. Sequencing of the cryptic plasmid QpRS from Coxiella burnetii II Plasmid. Vol. 44, 2000. - P. 85-88

74. Lemos J.A., Luzardo Y., Burne R.A. Physiologic effects of forced down-regulation of dnaK and groEL expression in Streptococcus mutans II J. Bacterid.-Vol. 189(5), 2007.-P. 1582-1588

75. Levett P.N., Morey R.E., Galloway R.L. et al. Detection of pathogenic leptospires by real-time quantitative PCR // J. Med. Microbiol. Vol. 54, 2005.-P. 45-49

76. Li W., Raoult D., Fournier P.-E. Genetic diversity of Bartonella henselae in human infection detected with multispacer typing. // Emerg. Infect, dis. -Vol. 13 (8), 2007.-P. 1178-1183

77. Lin Z., Mallavia L. Identification of partition region carried by the plasmid QpHl of Coxiella burnetii II Molec. Microbiol. -V. 13 (3), 1994.- P. 515523

78. Maiden M.C.J., Bygraves J.A., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 95, 1998. -P. 3140-3145

79. Mallavia, L.P. Genetics of Rickettsiae // Eur. Joum. of Epidemiol. — Vol. 73., 2001.-P. 213-221

80. Mallavia, L.P., Samuel, J.E., Frazier, M.E. The genetics of Coxiella burnetii: etiologic agent of Q fever and chronic endocarditis // Williams, J.C., Thompson, H.A. (Eds.), Q fever: The Biology of Coxiella burnetii. Boca Raton, FL, 1991. - P. 259-284

81. Marmion B.P., Storm P.A., Ayres J.G. et al. Long-term persistence of Coxiella burnetii after acute primary Q fever I I QJM. Vol. 98 (1), 2005. -P. 76-79

82. Masuzawa Т., Sawaki K., Nagaoka H. et al. Identification of rickettsiae isolated in Japan as Coxiella burnetii by 16S rRNA sequencing // Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 47(3), 1997. - P. 883-884

83. Maurin M., Raoult D. Q fever // Clin. Microbiol. Rev. Vol. 12(4), 1999. P. 518-553

84. McCaul Т., Williams J. Developmental cycle of Coxiella burnetii: structure and morphogenesis of vegetative and sporogenic differentiations // J. of Bacteriology. Vol. 147 (3), 1981.-P. 1063-1078.

85. McQuiston J.H., Childs J.E. Q fever in humans and animals in the United States // Vector Borne Zoonotic Dis. Vol. 2(3), 2002. - P. 179-191

86. Meconi S., Jacomo V., Boquet P. et al. Coxiella burnetii induces reorganization of the actin cytoskeleton in human monocytes // Infect. Immun. — Vol. 66(11), 1998.-P. 5527-5533

87. Mege J.L., Maurin M., Capo C., Raoult D. Coxiella burnetii: the 'query' fever bacterium. A model of immune subversion by a strictly intracellular microorganism // FEMS Microbiol Rev. -Vol.19, 1997. P. 209-217

88. Meghari S., Bechah Y., Capo C. et al. Persistent Coxiella burnetii infection in mice overexpressing IL-10: An efficient model for chronic Q fever pathogenesis // PLoS Pathog. Vol. 4(2), 2008. - P. e23

89. Minnick M.F., Heinzen R.A., Frazier M.E., Mallavia L.P. Characterization and expression of the cbbE1 gene of Coxiella burnetii II J. Gen. Microbiol. Vol. 136(6), 1990. P. 1099-1107/

90. Mossienko E., Tokarevich N., Suvorov A., Totolian A. Detection of Coxiella burnetii by PCR in Mice after Administration of Live M-44 Vaccine // J. Folia Microbiol. Vol. 48 (1), 2003. - P. 103-104

91. Murdoch D.R. Nucleic acid amplification tests for the diagnosis of pneumonia // Clin. Infect. Dis. Vol. 36, 2003'. - P. 1162-1170

92. Musser J. M. Molecular population genetic analysis of emerged bacterial pathogens: selected insights. // Emerg. Infect. Dis — Vol. 2, 1996. P. 1-17.

93. Nayak A.K., Rose J.B. Detection of Helicobacter pylori in sewage and water using a new quantitative PCR method with Sybr Green // J. Appl. Microbiol. -Vol. 103(5), 2007.-P. 1931-1941

94. Nguyen S., Hirai K. Differentiation of C. burnetii isolates by sequence determination and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of isocitrate dehydrogenase gene // FEMS Microbiol. Letters. Vol. 180, 1999:-P. 249-254

95. Ning Z., Shu-Rong Y., Guo Quan Y., Xue Z. Molecular characterization of cloned variants of Coxiella burnetii isolated in China // Acta virol. Vol. 35, 1991. -P. 173-183

96. Ogata H., Audic S., Renesto-Audiffren P. et al. Mechanisms of evolution in Rickettsia conorii and R. prowazekii II Science. — Vol. 293(5537), 2001. P. 2093-2098

97. Panning M., Kilwinski J., Greiner-Fischer S. et al. High throughput detection of Coxiella burnetii by real-time PCR with internal control system and automated DNA preparation // BMC Microbiol. Vol. 8, 2008. - P. 77

98. Pappas G., Blanco J.R., Oteo J.A. Q fever in Logrono: an attack scenario // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol. 25(3), 2007. - P. 199-203

99. Quevedo Diaz M., Lukacova M. Immunological consequences of Coxiella burnetii phase variation // Acta Virol. Vol. 42, 1999. - P. 181-185/

100. Raoult D., Levy P.Y., Harle J.R. et al. Chronic Q fever: diagnosis and follow-up // Ann. N. Y. Acad. Sci. Vol. 590, 1990. - P. 51-60

101. Raoult D., Marrie Т., Mege J. Natural history and pathophysiology of Q fever // Lancet Infect. Dis. Vol. 5(4), 2005. - P. 219-226

102. Rowbotham T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for fresh-water and soil amoebae // J. Clin. Pathol. -Vol. 33, 1980.-P. 1179-1183

103. Ruiz-Fons F., Rodriguez O., Torina A. et al. Prevalence of Coxiella burnetti infection in wild and farmed ungulates // Vet. Microbiol. — Vol. 126(1-3), 2008.-P. 282-286

104. Russell-Lodrigue К. E., Zhang G. Q., McMurray D. N., Samuel J. E. Clinical and pathologic changes in a guinea pig aerosol challenge model of acute Q fever // Infect. Immun. Vol. 74(11), 2006. - P. 6085 - 6091

105. Samuel J.E., Frazier M.E., Kahn M.L. et al. Isolation and characterization of a plasmid from phase I Coxiella burnetii II Infect. Immun. Vol.41, 1983. - P. 488-493

106. Samuel J., Frazier E., Mallavia L. Correlation of plasmid type and disease caused by Coxiella burnetii II Infect Immun. —Vol.49, 1985. — P.775-779

107. Savinelli E.A., Mallavia L.P. Comparison of Coxiella burnetii plasmids to homologous chromosomal sequences present in all plasmidless endocarditis-causing isolates // Ann. N. Y. Acad. Sci. Vol. 590, 1990. - P. 523-533

108. Scott G.H., Williams J.C., Stephenson E.H. Animal models in Q fever: pathological responses of inbred mice to phase 1 Coxiella burnetii II J. Gen. Microbiol. Vol. 133, 1987. - P. 691-700

109. Segal G., Shuman H.A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages // Infect. Immun. Vol. 67(5), 1999. - P. 2117-2124

110. Sekeyova Z., Roux V., Raoult D. Intraspecies diversity of Coxiella

111. Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H. et al. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematic // Appl. Environ. Microbiol. Vol. 51, 1986. - P. 873-884

112. Seshadri R., Paulsen I.T., Eisen J.A. et al. Complete genome sequence of the Q-fever pathogen Coxiella burnetii II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -Vol. 100, 2003. P. 5455-5460

113. Seshadri R., Samuel J. Genom analisys of Coxiella burnetii species: insights into pathogenesis and evolution and implications for biodefence // Ann. N.Y. Acad. Sci. Vol. 1063, 2005. - P. 171-175

114. Stephens R.S., Kalman S., Lammel C. et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis II Science. Vol. 282(5389), 1998. - P. 754-759

115. Stein A., Kruszewska D., Gouvernet J., Raoult D. Study of the 16S-23 S ribosomal DNA internal spacer of Coxiella burnetii II Eur. J. Epidemiol. -Vol. 13(4), 1997.-P. 471-5

116. Stein A., Louveau C., Lepidi H. et al. Q fever pneumonia: virulence of Coxiella burnetii pathovars in a murine model of aerosol infection // Infect. Immun. Vol. 73(4), 2005. - P. 2469-2477

117. Stein A., Raoult D. Detection of Coxiella burnetti by DNA amplification using polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. — Vol. 30(9), 1992.-P. 2462-2466

118. Thiele D., Willems H. Is plasmid based differentiation of Coxiella burnetii in 'acute' and 'chronic' isolates still valid? // Eur. J. Epidemiol. -Vol. 10, 1994. P. 427-434

119. Thiele D., Willems H., Kopf G., Krauss H. Polymorphism in DNA restriction patterns of Coxiella burnetii isolates investigated by pulsed field gel electrophoresis and image analysis // Eur. J. Epidemiol. Vol. 9, 1993. -P. 419-425

120. Thiele D., Willems H., Krauss H. The 16S/23S ribosomal spacer region of Coxiella burnetti II Eur. J. Epidemiol. Vol. 10(4), 1994. - P. 421426

121. Tissot-Dupont H., Raoult D. Q fever // Infect. Dis. Clin. North Am. -Vol. 22(3), 2008.-P. 505-514

122. Tissot- Dupont H., Torres S., Nezri M., Raoult D. A hyperendemic focus of Q fever related to sheep and wind // Amer. J. Epidemiol. Vol. 150, 1999.-P. 67-74

123. To H., Hotta A., Zhang G. Q. et al. Antigenic characteristics of polypeptides of Coxiella burnetii isolates // Microbiol. Immunol. — Vol. 42, 1998.-P. 81-85

124. Urwin R., Maiden CJ. Multi-locus sequence typing: a tool for global epidemiology // Trends Microbiol. Vol. 11, 2003. - P. 479-487

125. Valkova D., Kazar J. A new plasmid (QpDV) common to Coxiella burnetii isolates associated with acute and chronic Q fever // FEMS Microbiol. Letters.-Vol. 125, 1995.-P. 275-280

126. Vodkin M.H., Williams J.C. A heat shock operon in Coxiella burnetii produces a major antigen homologous to a protein to both mycobacteria and Escherichia coli II J. Bacteriol. Vol. 170, 1988. - P. 1227-1234

127. Weisburg W. G., Woese C.R., Dobson M.E., Weiss E. A common origin of rickettsiae and certain plant pathogens // Science. Vol. 230, 1985. -P. 556-558

128. Weiss E.; Moulder J.W. Genus III. Coxiella //N. R. Krieg, and J. G. Holt (ed.) / Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 1. The Williams & Wilkins Co. Baltimore, 1984. - P. 701-704

129. Willems H., Ritter M., Jager C., Thiele D. Plasmid-homologoussequences in the chromosome of plasmidless Coxiella burnetii Scurry Q217 // J. Bacteriol. Vol'. 179, 1997. - P. 329-337

130. Willems H., Thiele D., Krauss H. Plasmid.; differentiation and detection of Coxiella burnetii in clinical samples // Eur. J: Epidemiol: — Vol. 9, 1993.-P. 411-418

131. Wilson, K.H., Blitchington R., Shahs P. efr al. Probe directed, at a, segment of Rickettsia rickettsii rRNA amplified with polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. Vol. 27, 1989.,- P.! 2692-2696,

132. Woolley M.W., Gordon5 D.L., Wetherall B.L. Analysis of the first Australian-strains of Bartonella quintana reveals unique genotypes. // Journ. of clin. Microbiol., Vol. 45 (6), 2007 - P. 2040-2043

133. Zhang G.*, Hotta A., Mizutani Mi et al. Direct identification- of Coxiella burnetii plasmids in human sera by nested PCR // J. of Clin. Microbiol. -Vol. 36 (8), 1998. P. 2210-2213

Информация о работе

Фрейлихман, Ольга Александровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Выявление, типирование и молекулярно-генетическая характеристика Coxiella burnetii - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы