Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка экспресс-метода диагностики чумы плотоядных и индикации возбудителя болезни - вируса чумы собак

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ногина, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Чума плотоядных, краткая характеристика болезни

2.2. Биологические свойства ВЧС

2.3. Лабораторная диагностика чумы плотоядных

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка экспресс-метода диагностики чумы плотоядных и индикации возбудителя болезни - вируса чумы собак"

Обоснование темы диссертации

Чума плотоядных - высококонтагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, гнойным ринитом, конъюнктивитом, пневмонией, гастроэнтеритом, поражением ЦНС, протекающая в острой и подострой форме с высоким уровнем смертности среди собак и других плотоядных во всем мире. Возбудитель болезни - вирус чумы собак (ВЧС)-вместе с вирусами кори, чумы КРС, чумы мелких жвачных, чумы тюленей, чумы дельфинов относится к роду Morbillivirus семейства Paramyxoviridae [23].

Для лабораторной диагностики чумы плотоядных разработаны методы флуоресцирующих антител, полимеразной цепной реакции, латекс агглютинации, реакции диффузионной преципитации, связывания комплемента, нейтрализации, иммуноферментного анализа, реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) на основе антигенного эритроцитарного диагностикума [34].

Очевидно, что задачи лабораторной диагностики нельзя успешно решать без использования всего арсенала иммунодиагностических методов. Практика показывает, что использование методов, требующих культур клеток (МФА, РН), значительно осложняет возможности их применения. Перспективность широкого внедрения сложных, предполагающих специальную подготовку персонала и применения дорогостоящих реактивов, оборудования (ИФА, ПЦР) представляется проблематичной.

В этой связи целесообразно проанализировать возможности и перспективы применения эритроцитарных препаратов, которые по чувствительности и удобству для массовых исследований могут конкурировать с иммуноферментными. Представляется актуальным разработать простой, экспрессный, дешевый, высокоспецифичный микрометод выявления антигенов ВЧС и антител к ним. Одним из возможных решений вопроса может стать применение РПГА и задержки РПГА на основе акролеинизированных, танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных высокоактивными и специфичными к антигенам ВЧС антителами. Данный метод может найти широкое применение как в клинических лабораториях, так и в научных исследованиях при изучении биологических и иммунологических свойств ВЧС.

Клиницисты заинтересованы в возможности быстро обнаруживать антигены вирусов в секретах и экскретах инфицированных животных до или одновременно с проявлением первых клинических признаков, а также определять наличие колостральных и поствакцинальных антител в сыворотках крови плотоядных.

В научных исследованиях метод может оказаться полезным для обоснования тактики противоэпизоотических мероприятий, профилактики и лечения чумы собак, которые требуют информации о вирусемии и вирусовыделении в процессе развития болезни, мониторинга напряженности специфического иммунитета в больших популяциях и обширных территориях. Опубликованные данные по вирусовыделению зачастую получены не в ходе специальных экспериментов, а в результате наблюдений за эпизоотиями или исследования образцов из клинических лабораторий от предположительно больных чумой собак, и потому носят отрывочный несистемный характер. Необходимо восполнить имеющийся пробел и изучить наличие ВЧС в слюне и конъюнктивальных смывах у экспериментально инфицированных и вакцинированных собак. Цель и задачи работы

Цель диссертационной работы заключалась в разработке экспресс-метода диагностики чумы плотоядных и индикации возбудителя болезни - вируса чумы собак в РЗПГА и РИГА на основе антительного эритроцитарного диагностикума и определение эффективности его применения в клинических и экспериментальных исследованиях. В задачи исследований входило:

•разработать технологию изготовления диагностического набора для экспресс-диагностики чумы плотоядных методами РПГА и РЗПГА;

• изучить динамику накопления антигенов ВЧС в плазме крови и секретах экспериментально инфицированных животных с помощью изготовленного диагностического набора;

•определить титры специфических антигенов вируса чумы плотоядных в плазме крови, слюне, конъюнктивальных смывах собак, привитых различными вакцинами;

•оценить пригодность разработанного набора для лабораторных клинических и иммунологических исследований.

Научная новизна

В результате проведенных исследований:

1. Разработан чувствительный, специфичный, экспрессный метод индикации антигенов ВЧС и лабораторной диагностики чумы плотоядных на основе использования антительного эритроцитарного диагностикума;

2. С помощью изготовленного «Набора препаратов для лабораторной диагностики чумы плотоядных с использованием антительного эритроцитарного диагностикума»:

• изучена динамика накопления ВЧС-антигенов в секретах и плазме крови в процессе переболевания чумой плотоядных, а также после прививки различными вакцинами против чумы плотоядных;

• определены показатели вирусспецифического гуморального иммунитета у ВЧС-инфицированных всеядных: человека и свиньи;

• проведен иммунологический мониторинг сывороток собак из различных по экологическим условиям регионов России.

Практическая значимость

Разработана технология изготовления "Набора препаратов для лабораторной диагностики чумы плотоядных с использованием антительного эритроцитарного диагностикума".

Практическое использование проведенных исследований определено следующей нормативно-технической документацией:

• Временная инструкция по изготовлению и контролю "Набора препаратов для лабораторной диагностики чумы плотоядных с использованием антительного эритроцитарного диагностикума", утверждена директором ВНИИВВиМ 28 мая 1999 г.

• Технические условия на опытную партию "Набор препаратов для лабораторной диагностики чумы плотоядных с использованием антительного эритроцитарного диагностикума", ТУ - 9388 - 023 -00495549 - 99, утверждены Департаментом ветеринарии 25 ноября 1999 г.

• Временное наставление по применению "Набора препаратов для лабораторной диагностики чумы плотоядных с использованием антительного эритроцитарного диагностикума" (в порядке широких производственных испытаний 1999-2001 гг.), утверждено Департаментом ветеринарии 25 ноября 1999 г.

Методика постановки РПГА и РЗПГА при чуме плотоядных вошла в "Методические рекомендации по определению иммунного статуса у собак", утвержденные директором ВНИИВВиМ 22.11. 1999 г.

Апробация работы

Результаты исследования были доложены на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (1999-2000 г.г.), научных конференциях во ВНИИВВиМ (г. Покров) в декабре 1998 г. и августе 2000 г.; Покровском заводе биопрепаратов, май 1999 г.; Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии, июнь 1999 г.; ВНИТП, г. Щелково, июнь 2000 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Результаты экспериментальных исследований по разработке экспресс-метода диагностики чумы плотоядных и индикации антигенов ВЧС с использованием антительного эритроцитарного диагностикума.

2. Результаты экспериментов по определению чувствительности, специфичности, сроков хранения «Набора препаратов для лабораторной диагностики чумы плотоядных с использованием антительного эритроцитарного диагностикума».

3. Результаты исследований по определению антигенов ВЧС в секретах и плазме крови в ходе переболевания чумой плотоядных или вакцинального процесса.

4. Результаты применения «Набора .» для изучения ВЧС-инфекции у всеядных и мониторинга иммунного статуса собак в различных регионах Российской Федерации.

Отдельные этапы экспериментальных работ выполнены совместно с сотрудниками лаборатории "Биохимии", "Диагностики", «Конструирования биопрепаратов» за что автор выражает им глубокую признательность: К.Е. Гаврилову, Л.Г. Фугиной, B.C. Кропотову, Карпову Г.М., Е.М. Хрипунову, В.Я. Савуковой.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Ногина, Ирина Викторовна

Результаты исследования активности интерферона в сыворотке крови собак позволяют предположить, что высокий процент положительных проб был получен в пунктах с высокой плотностью популяции собак в группах (питомники, служебные в воинских частях и УВД). Это указывает на циркуляцию в данных популяциях различных инфекционных агентов -индукторов интерферона.

Можно констатировать, что в регионах, затронутых воздействием Чернобыльской аварии (Брянская и Смоленская область), не отмечено статистических отличий исследованных иммунологических показателей с таковыми из относительно благополучных территорий (Владимирская область).

Следует обратить внимание на аномально низкие показатели иммунного статуса в популяциях собак №№ 1-28 из Семеновского района

От 50 до 70 % исследованных проб сывороток собак в г. Москве, Смоленской, Брянской, Владимирской областях не имеют определяемых в РЗПГА антител. Выборочный анализ сывороток в реакции нейтрализации подтвердил этот результат. При этом большинство из обследованных животных, по данным хозяев, были вакцинированы. Причем, это касается и тех животных, которым вводили вакцину незадолго до взятия крови на исследование. Это обстоятельство свидетельствует либо о недостатках качества вакцин, либо об их применении на сенсибилизированных ВЧС животных. Учитывая, что защитный титр антител при ВЧС для индивидуумов составляет около 1:4-1:8 можно предположить, что практически во всех исследованных регионах имеет место опасность распространения чумы плотоядных. В то же время, на популяционном уровне титры антител в РЗПГА 1:2-1:4, вероятно, достаточны для обеспечения сохранения устойчивости собак к ВЧС.

Нами была предпринята попытка исследовать пробы органов диких животных, добытых в различных районах Новгородской области с ноября 1999 по январь 2000 гг. В исследованиях использовали 10 %-ные суспензии проб печени, легкого, крови, селезенки, сердца, почки, мышц диких животных: куница, хорь черный, норка, енот, лиса, медведь.

После центрифугирования при 500 g в течение 10 минут надосадки использовали в качестве антигенов в РПГА в разведениях от цельного до

1:4096. Реакцию ставили в 96-луночных микропланшетах при температуре 37 °С и читали через 1.5-2 часа. Относительную концентрацию антигенов вируса выражали в величинах, обратных полученным значениям титров в РПГА (таблица 23).

Значимые титры антигенов ВЧС обнаружены у енотов, норок, куниц.

Заключение"

1. Комп/"тд1Гт'т т нп^ря активны, специфичны и могут быть использованы в разведениях, указанных на этикетках.

2.Набор позволяет выявлять антигены ВЧС в органах павших от чумы плотоядных, слюне и смывах со слизистой оболочки носа больных чумой плотоядных, в вируссодержащих культуральных жидкостях. 7

3.Специфичность набора подтверждена исследованиями гетерологичных антигенов и сывороток.

4. Набор позволяет определять антитела к ВЧС в сыворотках вакцинированных и переболевших плотоядных. Титры антител в РЗПГА сопоставимы с титрами антител в

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ногина, Ирина Викторовна, Покров

1. Правительство Москвы *

2. Объединение ветеринарии г.Москвы

3. МОСКОВСКАЯ ГОРОДСКАЯ ВЕТЕРИНАРНАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

4. Директору ВНИИВВиМ профессору Вишнякову И.Ф.1. Инд.г.Москва,ул. Юннатов, 16-А1. Тел.212-10-232804.99 № 31на №

5. Л-ч'Х! ' ; Директор vBH И ИВ Ви VI1. Коттгярову В. V!

6. Семеновская межрайонная ветеринарная лаборатория провела испытание "Набора препаратор, для лабораторной диагностики чумы плотоядных с использованием антителъного эритродитарного диагностикума" ( ВНИИВиМ г. Покров, ТУ-9388-023-00495549-99).

7. В качестве испьпуемого материала в РЗГТГА использовали сьгворотку крови.

8. Всего за период с 4.09.00 по 28 09.00 года было происследовано 12 собак частного сектора г Семенов Нижегородской области.

9. В результате исследований получены еле дующие данные-—,---------——-—.-----1

10. При исследовании сыворотки крови собак методом РЗПГА четко прослеживаются титры антител к вирусу чумы плотоядных. Испытанный набор рекомендуется применять в ветеринарных

11. Общество с ограниченной ответственностью "Друг"1. Ветеринарная клиникац1. Шф^ 2001 г.

12. В качестве исследуемых материалов в РПГА использовали смывы со слизистой рта, носа и конъюнктивы собак подозреваемых в болезни.

13. Всего с использованием "Набора препаратов ." было исследовано 15 проб материалов от 10 собак частного сектора г. Орла за период с 6 по 30 марта 2001 года.

14. При проведении исследований материалов от собак на чуму плотоядных методом РПГА с использованием "Набора препаратов ." были получены следующие данные:п/п экспертизы (смывы со слизистых) Результат; РПГА

15. P7CL- /гсЛ^Ш^й^Г1^^ /7^ / у //:/й1. Г > / 2. 'trc< / 7 У: ЗЛ3. .4. 'рта- / о /О.5. 7/'Itctс/ И*': яН: $6. ' fctrCL /7. fbTCL J8. <рТ^ // зх9.. ' i^tl10.'' р(ГсЬ

16. Испытанный "Набор препаратов ." позволяет проводить диагностические исследования на чуму плотоядных в практических ветеринарных лабораториях с минимальным лабораторным оснащением и в короткие сроки. х^енно<г1. Заведующий ветеринар1. Тутаев И.Н.