Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и совершенствование средств диагностики, профилактики и терапии при чуме плотоядных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колышкин, Владимир Михайлович, Москва

Министерство сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации

Департамент ветеринарии

Всероссийский Государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ)

На правах рукописи Колышкин Владимир Михайлович

Разработка и совершенствование средств диагностики, профилактики и терапии при чуме плотоядных.

03.00.06 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук Груздев К.Н.

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение............................................................................................................................................................................................................................................................3

1. Обзор литературы........................................................................................................................................................................................................6

1.1. Характеристика возбудителя..............................................................................7

1.2. Эпизоотология..........................................................................................................................................................................................................15

1.3. Клинические признаки, стадии и формы течения болезни............................................................17

1.4. Патогенез........................................................................................................................................................................................................................19

1.5. Иммунитет......................................................................................................................................................................................................................23

2. Собственные исследования....................................................................................................................................................................27

2.1. Разработка технологии изготовления и контроля набора диагности-

кумов для быстрого выявления антител к вирусу чумы плотоядных..........................27

2.1.1. Литературная справка............................................................................................................................................................27

2.1.2. Материалы и методы.................................................................................................33

2.1.3. Результаты и обсуждение............................................................................................................................34

2.2. Совершенствование технологии изготовления и контроля вакцины

против чумы плотоядных из штамма «ЭПМ».............................................................................45

2.1.1. Литературная справка...........................................................................................................45

2.1.2. Материалы и методы..............................................................................................................................................................56

2.1.3. Результаты и обсуждение................................................................................................................................57

2.3. Разработка технологии изготовления и контроля специфического иммуноглобулина для лечения и профилактики парвовирусного

энтерита, аденовирусных инфекций и чумы собак «Поликаниглоб»......................70

2.1.1. Литературная справка............................................................................................................................................................70

2.1.2. Материалы и методы....................................................................................73

2.1.3. Результаты и обсуждение................................................................................................................................................75

3. Заключение................................................................................................................................................................................................................................87

4. Выводы............................................................................................................................................................................................................................................851

5. Благодарности....................................................................................................................................................................................................................90

6. Список литературы....................................................................................................................................................................................................91

? -к

Введение

Чума плотоядных (ЧП) - одна из наиболее опасных, преимущественно остро протекающая, высококонтагиозная болезнь животных отряда хищных вирусной этиологии (Appel M.J.G., J.H.Gillespie, 1972), (Appel M.J.G., 1987). Она проявляется лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек, поражениями кожи, центральной нервной системы или сочетанием этих признаков (Appel M.J.H., 1969). ЧП регистрируется повсеместно и наносит значительный ущерб звероводству и собаководству. Борьба с ЧП ведется преимущественно по следующим направлениям: разработка средств и методов диагностики; разработка средств специфической профилактики и лечения; разработка и совершенствование ветеринарно-санитарных мероприятий, направленных на локализацию и предотвращение распространения возбудителя.

Наиболее узким местом в системе мер борьбы с ЧП является диагностика заболевания (Груздев К.Н., А.В.Селиванов, 1985; Логунова Л.Б. и др., 1994; Хомов В.В. и др., 1997; Сазонкин В.Н., В.И. Уласов 1995; Zaghawa А. et al, 1990). До последнего времени прижизненная диагностика ЧП основывалась исключительно на учете клинических признаков; при посмертной диагностике предусматривались патолого-гистологические и патоло-гоанатомические исследования (Appel M.J.H., 1987). Крупные звероводческие хозяйства могли использовать для этих целей биопробу на чувствительных животных (Груздев К.Н., A.B. Селиванов, 1987). Лабораторные исследования, направленные на выделение возбудителя, его идентификацию или на выявление антигенов и антител практически не проводились из-за отсутствия доступных коммерческих тест-систем. Только в последние годы (Логунова Л.Б.и др., 1994; Хомов В.В.и др., 1997; Сазонкин В.Н. и др., 1994) были предложены коммерческие диагностические наборы для выявления антигена ВЧП в пробах материала, взятых от больных животных. Выявление антител для целей диагностики в нашей стране не проводили, так как отсутствовали доступные коммерческие наборы.

Для профилактики ЧП используют живые аттенуированные вакцины (Appel M.J.H., 1987; Груздев К.Н., А.В.Селиванов, 1985, 1987; Chappius G., 1995). Однако особенности патогенеза ЧП, наличие восприимчивых животных в дикой фауне, нарушение календаря прививок среди собак, находящихся в индивидуальном пользовании, возможность латентного течения инфекции не позволяют предотвратить вспышки ЧП (Patronek G.J. et al., 1995; Johnson R. et al., 1995). Особенно опасна ЧП для пушного звероводства. Это обусловлено тем, что на ограниченных производственных площадях сосредоточено большое

количество восприимчивых животных, и занос инфекции в такие хозяйства является катастрофой. Поэтому разработка средств лабораторной диагностики, направленной на выявление антигенов и антител, совершенствование существующих средств профилактики ЧП остаются важными и актуальными проблемами.

Неотложного решения требуют так же вопросы, связанные с разработкой и производством поликомпонентных иммуноглобулинов для лечения и профилактики чумы, пар-вовирусного энтерита и аденовирусных инфекций плотоядных. Это обусловлено тем, что применяемые в настоящее время гипериммунные сыворотки недостаточно активны и характеризуются высокой аллергенной активностью.

Поэтому исследования, направленные на изыскание новых средств и методов диагностики, профилактики и лечения ЧП имеют для ветеринарной практики бесспорную актуальность.

Крупный вклад в решение вышеуказанных проблем внесли отечественные (A.B. Селиванов, В.И. Уласов, К.Н. Груздев, В.П. Чичканов, A.A. Сулимов и др.) и зарубежные (M.J.G. Appel, B.K. Rima, G.J. Patronek, E. Norrby, J.A. Baker, S. Krakowka et. all.) исследователи, труды которых, во многом, определили направление и перспективы дальнейшего научного поиска. Многие вопросы данного направления не решены и нуждаются в теоретическом обосновании, дальнейшей разработке и внедрении в практику.

Цели и задачи исследований. Целью работы являлась разработка и совершенствование средств специфической диагностики, профилактики и терапии ЧП. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- разработать технологию изготовления набора диагностикумов для быстрого выявления и количественной оценки антител к вирусу ЧП;

-чселекционировать штамм "ЭПМ" вируса чумы плотоядных и усовершенствовать технологию изготовления вакцины против чумы плотоядных;

- разработать технологию изготовления и методы контроля иммуноглобулина для лечения и профилактики парвовирусного энтерита, аденовирусных инфекций и чумы собак.

Научная новизна. Впервые получены научно-обоснованные данные, положенные в основу разработки технологии изготовления «Набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в РИГА».

За счет селекции штамма «ЭПМ», усовершенствования режимов замораживания и лиофильного высушивания, снижения количества балластных белков, получена стандартная по иммунобиологическим свойствам вакцина против чумы плотоядных.

Разработаны оптимальные условия технологии получения нового иммуноглобулина для лечения и профилактики парвовирусного энтерита, аденовирусных инфекций и чумы собак. Определена оптимальная схема применения препарата.

Научная новизна препаратов подтверждена тремя патентами РФ на изобретения, выданными Федеральным институтом промышленной собственности.

Практическая значимость работы. Разработана и внедрена новая промышленная технология изготовления тест-системы «Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в РИГА».

Разработана технология и организовано серийное производство лечебно-профилактического иммуноглобулина «Поликаниглоб».

Усовершенствована технология изготовления вакцины против чумы плотоядных из штамма «ЭПМ».

На «Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в РНГА» и лечебно-профилактический иммуноглобулин «Поликаниглоб» разработана и утверждена нормативная документация.

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на:

- Семинаре ветеринарных работников по болезням собак, проведенном на базе биологического научно-практического центра «ЧИН», г. Санкт-Петербург, 1995 г.;

- 1-ой Региональной конференции по болезням мелких домашних животных, г. Новосибирск, 1996 г;

, - Семинаре ветврачей звероводческих хозяйств России, павильон кролиководство ш пушное звероводство ВВЦ, г. Москва, 1998 г.;

- П-ой Международном симпозиуме «Физиологические основы повышения продуктивности хищных пушных зверей, г. Петрозаводстк, 1998 г.

- заседаниях Ученого совета ВГНКИ (1996-1998).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

1. Результаты разработки технологии изготовления и контроля набора эритроцитар* ных диагностикумов для выявления антител к ВЧП.

2. Результаты исследований по усовершенствованию технологии производства вакцины против ЧП из штамма «ЭПМ».

3. Результаты разработки технологии изготовления и контроля специфического иммуноглобулина для лечения парвовирусного энтерита, аденовирусных инфекций и чумы собак.

' Основные материалы диссертации изложены в 10 печатных работах.

Объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, список литературы (105 отечественных и 143 зарубежных источников литературы). В приложении представлена нормативно-техническая документация на внедренные иммунобиологические препараты. Работа содержит 11 таблиц, 2 рисунка, 2 диаграммы и 4 фотографии.

Основные разделы работы выполнены автором самостоятельно. При выполнении отдельных этапов работы принимали участие: Васильев A.B., Сазонкин В.Н., Нагиева Ф.Г., Лотте В.Д., Чесалов С.А., Корицкая М.А., Елаков А.Л.

1. Обзор литературы.

Чума плотоядных - Pestis carnivorum - преимущественно остро протекающая болезнь животных отряда хищных, вызываемая РНК-содержащим вирусом сем. Paramyxoviridae. Она проявляется лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек, поражениями кожи, центральной нервной системы или сочетанием этих признаков.

Историческая справка. Согласно сообщениям Kirk Н., 1922, Geiger W., 1939, ЧП впервые появилась из европейских стран - в Испании в 1761 г. Предполагают, что она

была занесена из Азии или Перу. В течение нескольких веков болезнь распространилась %

по всей Европе. Впервые болезнь описана Дженером в 1809 году. В 1905 г. Carre Н. сообщает о вирусной природе ЧП, после чего заболевание стали часто называть болезнью Kappe. Сообщение Carre Н. было подтверждено Ligneres в 1906 г., однако, многие ученые: McCowan (1911), Ferry (1912), Torrey and Rahe (1913); настаивали на бактериальной этиологии данного заболевания, приписывая его возбудителю "Bordetella bronhiseptica" (Bacillus bronchicanis). Ученые предполагали, что при фильтровании суспензии возбудителя инфекции, им удается выделить бактерии, обладающий защитным действием при ЧП. Спор в пользу вирусной этиологии ЧП был разрешен после исследований Dunkin G.W.,

and P.P.Laidlow (1926), впервые использовавших специально полученных и выращенных животных для изучения моно инфекции ЧП, не осложненной посторонней микрофлорой. Представляют интерес и исследования Puntoni V. (1923), которые практически остались незамеченными большинством ученых мира. Он провел серию перезаражений хорьков ин-трацеребральным введением инфицированной возбудителем ЧП мозговой ткани хорьков, а также одним из первых получил инактивированную формалином тканевую вакцину. С 1928 по 1948 гг. было сделано лишь несколько сообщений (Watson Е.А.1939; Green R.G.,1939; Green R.G. and F.S.Swale 1939; Cordy D.R. 1942; Hurst E.W. et al., 1943} об изменениях вируса чумы плотоядных (ВЧП) при пассировании на хорьках, использовании живой тканевой вакцины, гистологических изменениях в мозге восприимчивых собак при поражении ВЧП. В 1948 г. впервые было установлено родство вируса кори человека и ЧП. Это дало толчок к развитию серологических методов диагностики заболевания, разработке эмбриональных, а в последующем культуральных вакцин против ЧП. В нашей стране большой вклад в изучение чумы плотоядных внесли Ф.М. Орлов (1922), А.Н.Макаревский (1931), И.И. Миролюбов (1932), В.С.Котов (1939), В.К.Новиков (1948), Т.Я.Ванновский (1940), Т.А.Спиров (1952).

1.1. Характеристика возбудителя. ВЧП отнесен в состав семейства Paramyxoviridae, основными таксономическими признаками которого являются: одно-цепочечный монолитный РНК-геном отрицательной полярности, трубчатый (спиральный) тип симметрии нуклеокапсида, наличие плейоморфной липопротеиновой оболочки. Ви-рионы округлой формы диаметром 150-300 нм, с крупными поверхностными выступами (Филдс Б. и др. 1989). По современной классификации (Макаров В.В. и др., 1995) вирусы, входящие в это семейство разделены на 2 подсемейства Paramyxoviridae и Pneumoviridae. ВЧП входит в род Morbillivirus подсемейства Paramyxoviridae, куда включены вирус кори, вирус чумы крупного рогатого скота и вирус чумы мелкого рогатого скота (Kingsbury D.,1991).

За последние годы этот род пополнился новыми представителями. С 1988 года началось изучение возбудителя, вызвавшего заболевание и гибель около 17000 тюленей в Северном и Балтийском морях.

Этиологическим агентом оказался вирус по морфологии и типу нуклеиновой кислоты близкий к Морбилливирусам (Greenfell В.Т. et al., 1992, Rima B.K. et al., 1992). Вскоре бы-

ло выявлено серологическое родство между вирусом, вызвавшим гибель тюленей и ВЧП, ' что подтвердило правильность включения этого возбудителя в состав рода Морбилливи-русы.

Этот вирус получил название - вирус чумы тюленей (PDV от phocine distemper virus). С помощью моноклональных антител были выявлены значительные различия между вирусами чумы плотоядных и чумы тюленей (Rima В.К. et. al., 1992). Этот вирус стал 5 членом рода Морбилливирусов.

В этот же период (1987-1988 годы) среди байкальских тюленей (Phoca sibirica) вспыхнуло заболевание, по клинической картине сходное с тем, что протекало на Северном и Балтийском морях у тюленей (Phoca vitulina). (Grachev М.А. et al., 1989; Никишин И.В. и др. 1990; Osterhaus A.D.M.E. et al., 1989; Титенко А.М.и др., 1990).

Первоначально было установлено, что возбудитель, вызвавший гибель байкальских тюленей, относится также к роду морбилливирусы, и, естественно было предположить, что он является вирусом чумы тюленей. Поскольку он отличался от последнего, то ему присвоили название - вирус чумы тюленей 2 типа (PDV-2), а ранее выделенный вирус чумы тюленей назвали, соответственно, вирус чумы тюленей 1 серотипа (PDV-1).

Однако дальнейшие исследования, проведенные Mamaev L.V. et al., (1995, 1996); Barret Т. et al., (1995), показали, что вирус чумы PDV-2 является ВЧП.

Таким образом, было установлено, что ВЧП способен инфицировать не только сухопутных, но и морских млекопитающих, в частности, ластоногих. В 1990 г., вспыхнула эпизоотия среди полосатых дельфинов (Stenella caeruloalba) в Средиземном море. Выделенные изоляты от больных и погибших дельфинов также были отнесены к роду морбилливирусов (DomingoM. et al., 1990) Для этой группы изолятов было предложено название «Морбилливирус полосатых дельфинов» (Dolphin morbillivirus, DMV). Выделенные в эту эпизоотию изоляты от бурых дельфинов (harbour porpoise) оказались сходными с морбил-ливирусами, но отличались как от вируса чумы тюленей, так и от морбилливирусов полосатых дельфинов. Таким образом, в род морбилливирусы входят семь представителей, родственных между собой, но и значительно различающихся по биохимическим, вирусологическим и молекулярно-биологическим характеристикам: - вирус кори, вирус чумы плотоядных, вирус чумы крупного рогатого скота, вирус чумы мелкого ро