Разработка метода контроля антигенной активности вакцин против чумы плотоядных

Елаков, Александр Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка метода контроля антигенной активности вакцин против чумы плотоядных
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода контроля антигенной активности вакцин против чумы плотоядных"

На правах рукописи

Елаков Александр Леонидович

Разработка метода контроля антигенной активности чумы плотоядных.

03.00.06. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000 г.

Р Г Б ОД

1 4 ФЕЗ 2000

вакцин против

Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Научный руководитель:

Доктор ветеринарных наук В.И. Уласов

Официальные оппоненты:

- Заслуженный деятель науки РФ

Доктор биологических наук, профессор В.А. Сергеев (НПО "Нарвак")

- Доктор биологических наук H.A. Власов (ВНИИВВиМ)

Ведущая организация:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится

на заседании Диссертационного совета Д 120.85.01. при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат разослан ßг

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Актуальность темы.

В ряду инфекционных болезней собак и пушных зверей особое место занимает чума плотоядных ( ЧП ). ГГатогенность вируса чумы плотоядных для разных видов животных колеблется в широких пределах - от бессимптомного переболевания до 100 % летальности. Для звероводческих хозяйств чума плотоядных представляет большую опасность: падеж среди невакцинированного молодняка может доходить до 70 - 90 %, среди взрослых зверей - до 40- 70 %. Единственным надежным методом профилактики является иммунизация пушных зверей с помощью моно- и ассоциированных вакцин. Высокое качество препаратов, применяемых в системе иммунопрофилактики, является одним из важнейших условий успешной борьбы с инфекционными болезнями.

В этой связи большое внимание уделяется контролю за качеством вакцин против чумы плотоядных. Выпускаемые вакцины должны быть свободны от контаминантов, безвредны, биологически активны в соответствующей культуре клеток. Для отечественных препаратов предусмотрен также контроль иммуногенности каждой четвертой- пятой серии вакцины на тхорзофретках, что является весьма дорогостоящим и продолжительным по времени мероприятием. Для аналогичных импортных препаратов предусмотрен контроль антигенной активности.

Устранение существующих расхождений в методах контроля вакцин отечественного и импортного производства позволит существенно улучшить ситуацию на российском рынке вакцин.

В настоящее время контроль активности специфических лечебно-профилактических препаратов против чумы плотоядных ( сывороток и иммуноглобулинов ) осуществляется с помощью реакции нейтрализации. Эта реакция требует наличия культур клеток, живого вируса, сложна в постановке, длительная и дорогостоящая, поэтому все производители данных препаратов заинтересованы в разработке более простого и доступного метода контроля.

Цель работы.

Разработать серологический метод контроля антигенной активности вакцин против чумы плотоядных и метод оценки активности лечебно- профилактических препаратов на основе РНГА.

Задачи исследования.

- изучить активность, специфичность, стандартность и сроки хранения эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации;

- исследовать динамику титров антител у пушных зверей после иммунизации коммерческими вакцинами против чумы

плотоядных в реакциях нейтрализации и непрямой гемагглютинации;

- сопоставить титры антител в PETA у тхорзофреток с результатами экспериментального заражения вирулентным штаммом и определить защитный титр;

-определить корреляцию между реакцией нейтрализации и непрямой гемагглютинации.

Научная новизна.

Изучена динамика титров поствакцинатьных антител к ВЧП у пушных зверей в реакции нейтрализации и реакции непрямой гемагглютинации. Определен защитный титр поствакцинальных антител к ВЧП у тхорзофреток в реакции непрямой гемагглютинации и реакции нейтрализации. Выявлена корреляция между РИГА и РН и определен коэффициент корреляции. Показана возможность использования РИГА для контроля лечебно-профилактических препаратов против чумы плотоядных.

Практическая значимость.

Разработанный и испытанный на большом фактическом материале "Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)" может быть использован для:

- контроля антигенной активности вируса чумы плотоядных в составе моно - и ассоциированных вакцин для собак и пушных зверей,

- определения напряженности иммунитета у собак и пушных зверей к чуме плотоядных.

Разработанный метод вошел в качестве дополнений и изменений в пункт 4.8.2. ТУ 9382-005-11472788-97 ( сыворотка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная ) и пункт 4.9.2. ТУ 9382-008-11472788-96 ( гамма -глобулин ( иммуноглобулин ) против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных ) для контроля препаратов изготавливаемых ЗАО "Ветзвероцентр". Апробация работы. Материалы исследований доложены на:

- 1-ой Региональной конференции по болезням мелких домашних животных, г. Новосибирск, 1996 г.

- И-ом Международном симпозиуме "Физиологические основы повышения продуктивности хищных пушных зверей", г. Петрозаводск, 1998 г.

- заседаниях Ученого совета и проблемной научно- методической комиссии ВГНКИ (1996-1999 ).

Публикации.

По результатам исследований опубликовано 6 печатных работ. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

РНГА является высоко чувствительным, специфичным и практичным методом, позволяющим быстро и надежно проводить контроль антигенной активности вакцин против чумы плотоядных, а также активности лечебно-профилактических препаратов против чумы плотоядных. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы ( 147 источников, из них 32 отечественных и 115 зарубежных ), приложения. Работа содержит 19 таблиц и 7 рисунков.

В процессе выполнения диссертационной работы принимали участие следующие сотрудники:

Колышкин В.М. и Васильев A.B. ТОО "Биоцентр" предоставили наборы эритроцитарных диагностикумов для исследований, и участвовали в контроле активности и специфичности.

Журавлева H.H. и Нефедов B.C. ТОО "Биоцентр" участвовали в проведении опытов на тхорзофретках и постановке РН.

Домский И.А. и Бельтюкова З.Н. ВНИИОЗ им. Б.М. Житкова помогали в исследовании динамики титров антител у пушных зверей.

Дубков Ю.А. ( в/ч № 2625 ) и Бояринов A.C. ( в/ч № 32516 ) помогли в сравнительном изучении антигенной активности вакцин на собаках.

Собственные исследования. Материалы и методы.

Экспериментальная часть исследований выполнялась в период с 1995 по 1998 г. в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ. Эпизоотический анализ, клинические наблюдения за состоянием вакцинированных против чумы плотоядных зверей и собак проводили в ряде зверосовхозов, питомниках служебного собаководства, ОПХ «Манихино», ТОО «Биоцентр».

В работе использовали производственные штаммы вируса чумы плотоядных: вакцинный штамм ЭПМ, который поддерживали путем пассажей в культуре клеток фибробластов перепелиных эмбрионов, и вирулентный штамм Snyder Hill, который поддерживали заражением серонегативных тхорзофреток. Штаммы хранили в лиофилизированном состоянии при - 40° С.

Для вакцинации животных использовали коммерческие моно-и ассоциированные вакцины отечественного и импортного производства, содержащие в своем составе аттенуированные штаммы вируса чумы собак: вакцина против чумы плотоядных культуральная сухая из штамма «ЭПМ» ( ТОО "Биоцентр" ), вакцина ассоциированная против чумы, вирусного энтерита, ботулизма и псевдомоноза норок - "Бионор DPAB" ( ТОО "Биоцентр" ), "Биовак DPAL" ( ТОО "Биоцентр" ), "Biocom DP" ( "United", США ), "Гексадог" и "Тетрадог" ( "Rhone Merieux", Франция ), "Вангард - 5" и "Вангард - 7" ("Pfizer", США ).

В процессе исследований использовали щенков собак в возрасте 3-4 месяца, тхорзофреток в возрасте 2-4 месяца, красных и серебристо - черных лисиц в возрасте 2 месяца, песцов в возрасте 2 месяца, енотовидных собак в возрасте 2 месяца, норсх з возрасте 2 месяца.

При проведении исследований использовали следующее оборудование:

- С02 инкубатор IG 150 фирмы Jouan,

- настольный ламинарный бокс BSB 48 фкрмы ICN Biomedikals Ltd.,

- инвертированный микроскоп

- микроскоп Р7У4.2 производства «Ломо»,

- планшеты для иммунологических реакций однократного применения производства «Медполимер»,

- 96 луночные микропанели фирмы «Nunc»,

- моноканальные микропипетки производства «Gitson»,

- восьмиканальную пипетку производства «Finnpipette»,

- камеру Горяева,

- центрифугу MPW - 310,

- центрифугу Т 23.

Биологическую активность вакцины против чумы плотоядных из штамма "ЭПМ" определяли титрованием в культуре клеток фибробластов эмбрионов японского перепела согласно ТУ10.19.87-89. Учет результатов проводили на шестые сутки по цитопатическому действию вируса, выражавшемуся в округлении клеток, образованию мегакариоцитов. Биологическая активность

лиофилизированного препарата находилась в пределах 2,5-3,5 lg ТЦД50/МЛ.

Иммуногенность вакцины оценивали на тхорзофретках. Животных вакцинировали внутримышечно в дозе 10 - 560 ТЦД50 и через 21 сутки заражали вирулентным штаммом вируса чумы собак Snyder Hill в дозе 1000 ЛД50. Вакцину считали иммуногенной, если она предохраняла от заболевания всех привитых животных, при условии гибели всех контрольных животных.

Оценку антигенных свойств вакцины против чумы плотоядных из штамма "ЭПМ" проводили по приросту титров антител, исследуя парные сыворотки крови тхорзофреток, полученные перед вакцинацией и через 21 день после вакцинации. Сыворотки исследовали параллельно в РНГА и РН.

Реакция нейтрализации микрометодом проводилась в микропанелях фирмы Nunc на субкультуре клеток фибробластов эмбрионов японского перепела против 100 ТЦД5о/0,1 мл вакцинного штамма ЭПМ вируса чумы плотоядных.

Реакция нейтрализации макрометодом проводилась в пробирках в первичнотрипсинизированной культуре клеток фибробластов эмбрионов японского перепела против 1000 ТЦД50 /0,5 мл ВЧП штамма ЭПМ.

В работе также использовали опытно- промышленные серии «Наборов эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации РНГА» ( ТУ 9384- 001- 00008064- 96 ), разработанного Васильевым A.B., Колышкиным В.М. и Уласовым В.И.

Постановку и учет результатов РНГА проводили в соответствии с Временным наставлением, утвержденным Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 11.01.96 N13- 72/504.

Результаты исследования сывороток крови пушных зверей и собак в РН и РНГА обрабатывали методами математической статистики с помощью программы Microsoft Exel и сопоставляли с результатами контрольного заражения. Устанавливали динамику нарастания и убывания антител к вирусу чумы собак у пушных зверей, привитых вакциной из штамма ЭПМ.

Результаты исследований. Анализ некоторых данных выпуска вакцин против чумы плотоядных.

В нашей стране для профилактики чумы плотоядных у пушных зверей и собак наиболее часто используются вакцина культуральная сухая из штамма "ЭПМ" производства ТОО

"Биоцентр" и вирусвакцина сухая культуральная против чумы плотоядных "Вакчум" производства Института полиомиелита и вирусного энцефалита АМН РФ, являющиеся отечественными аналогами зарубежных вакцин из всемирно известных штаммов Onderstepoort и Rockborn.

В последние годы к этим биопрепаратам прибавились вакцины против чумы плотоядных, полученные из аналогичных штаммов, адаптированных к различным перевиваемым культурам клеток ("Владавак", "Мультикан", "ВННИИВВиМ - 88"). .

Биологическую активность каждой вакцины контролируют в гомологичной культуре клеток, используемой для размножения вируса: "ЭПМ" - в культуре фибробластов эмбрионов японских перепелов, "Вакчум" - в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647, "ВНИИВВиМ-88" - в культуре клеток CV-1, "Владивак" и "Мультикан" - в культуре клеток Vero. При этом прививочные дозы различных вакцин весьма существенно различаются, так в одной дозе "Вакчум" содержится 500 - 20000 БОЕ, а в одной дозе "ЭПМ" содержится 125 - 3160 ТЦД50.

Существенно различаются отечественные вакцины против чумы плотоядных и по реактогенности. Наиболее четко это выявилось при испытании вакцин на тхорзофретках. Вакцина "Вакчум", приготовленная из вируса, размноженного в культуре эпителиоподобных клеток, вызывала заболевание, а иногда и гибель привитых животных, в то время, как вакцины, приготовленные из вируса, размноженного в культуре фибробластоподобных клеток перепелиных или куриных эмбрионов, были безвредны для тхорзофреток.

Изучение безвредности и иммуногенных свойств коммерческих серий вакцин против чумы плотоядных из штаммов "ЭПМ" и "Вакчум" проводили на 24 тхорзофретках в возрасте 2,5 месяца. Животные были разбиты на три равные группы по 8 голов. Животных первой группы привили вакциной из штамма ЭПМ в дозе 500 ТЦДзо, животных второй группы привили вакциной из штамма "Вакчум" в дозе 1000 БОЕ, третья группа оставалась не привитой в качестве контроля. Через 21 день после иммунизации у животных всех трех групп взяли пробы крови. Полученные по общепринятой методике сыворотки были исследованы в реакции нейтрализации против 1000 ТЦД50 вируса чумы плотоядных из штамма "ЭПМ". По четыре тхорзофретки из каждой группы были заражены вирулентным вирусом чумы плотоядных штамма Snyder Hill в дозе 1000 ЛД50 через 21 день и через год после вакциниции. За зараженными животными наблюдали в течение четырех недель.

Результаты клинического наблюдения за состоянием иммунизированных тхорзофреток показали, что по характеру поведения, приему корма и температурной реакции животные привитые вакциной из штамма "ЭПМ" и "Вакчум" в первые дни после иммунизации существенно отличались между собой. Так у зверей, иммунизированных вакциной из штамма "ЭПМ", как и у тхорзофреток контрольной группы, не наблюдали никаких отклонений от физиологической нормы. У животных, привитых вакциной «Вакчум», на третий день после введения вакцины наблюдали повышение температуры тела на 1,5° С выше нормы, в течение 5 суток они плохо поедали корм, были малоподвижны.

Все тхорзофретки в обеих опытных группах перенесли контрольное заражение, проведенное через 21 сутки после вакцинации, а 4 зверя в контрольной группе заболели на 8 - 9 день после заражения и пали в течение пяти суток с характерными клиническими и патологоанатомическими признаками чумы плотоядных. Перед контрольным заражением среднегеометрические значения титров антител в реакции нейтрализации составляли 4,8 + 0,3 log2 у зверей, привитых вакциной из штамма "ЭПМ" и 5,3 + 0,3 log2 у зверей, привитых вакциной из штамма "Вакчум". В сыворотках крови тхорзофреток контрольной группы нейтрализующих антител не обнаружили.

Заражение, проведенное через двенадцать месяцев после иммунизации, показало, что все привитые звери сохраняли устойчивость к заболеванию, тогда как в контрольной группе все животные заболели и погибли с характерными клиническими и патологоанатомическими признаками чумы плотоядных.

При исследовании сывороток крови, полученных от тхорзофреток через год после иммунизации, а также от контрольных не привитых зверей, антител к вирусу чумы плотоядных в реакции нейтрализации не удалось выявить ни у привитых животных, ни у контрольной группы.

Контроль вакцин на тхорзофретках с применением живого вирулентного штамма позволяет обеспечить выпуск высококачественных препаратов, однако этот метод является очень дорогим и продолжительным ( около полутора месяцев ). Кроме того, работа с живым вирулентным штаммом требует повышенных мер безопасности, которые не всегда могут быть обеспечены. Увеличивающийся из года в год поток отечественных и импортных моно- и ассоциированных биопрепаратов, содержащих в своем составе вирус чумы плотоядных, выявил необходимость разработки

нового чувствительного, специфичного и доступного метода контроля антигенной активности вакцин.

Поэтому нами был продолжен поиск альтернативной реакции. Было решено остановиться на реакции непрямой гемагглютинации. РИГА является быстрым, простым и весьма чувствительным методом. По мнению Каральника Б.В. и др. ( 1990 ), а также Жуматова К.Х. и др. ( 1994 ), РИГА является наиболее удобным тестом для диагностики вирусных инфекций.

Постановка и испытание РИГА.

Опытный вариант набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации в 1995 году разработан сотрудниками ТОО "Биоцентр" и ВГНКИ ( лаборатория контроля и стандартизации препаратов, применяемых в звероводстве ). Перед нами была поставлена цель изучить возможность применения этого набора для оценки антигенной активности выпускаемых моно- и ассоциированных вакцин, содержащих в своем составе вирус чумы плотоядных.

В состав набора входят:

- специфический вируса чумы плотоядных эритроцитарный диагностикум,

- контрольный эритроцитарный диагностикум,

- сыворотка специфическая к вирусу чумы плотоядных,

- сыворотка отрицательная,

- разбавитель для реакции.

Технология изготовления компонентов «Набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации ( РИГА )» защищена патентом РФ N 2119671 ( авторы Васильев A.B., Колышкин В.М., Уласов В.И. ).

Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками оценивали по титрам со специфическим эритроцитарным диагностикумом с учетом титров с контрольным эритроцитарным диагностикумом. Положительными считали сыворотки, имевшие со специфическим эритроцитарным диагностикумом титр не ниже 1:16, при условии, что титр с контрольным эритроцитарным диагностикумом не превышал 1:4.

Нами были изучены активность, специфичность, стандартность и сроки хранения эритроцитарных диагностикумов.

Изучение активности специфического вируса чумы плотоядных эритроцитарного диагностикума.

Активность специфического вируса чумы плотоядных эритроцитарного диагностикума исследовали с заведомо положительными в отношении вируса чумы плотоядных сыворотками крови, предварительно исследованными в реакции нейтрализации.

Все сыворотки положительные в реакции нейтрализации оказались также положительными и в реакции непрямой гемагглютинации. Это свидетельствует о высокой совпадаемости результатов РН и РНГА. Титры в реакции непрямой гемагглютинации на 4-5 выше аналогичных титров в реакции нейтрализации, что свидетельствует о высокой активности специфического эритроцитарного диагностикума.

Изучение специфичности эритроцитарных

диагностикумов.

Специфичность одна из важнейших характеристик эритроцитарных диагностикумов. Она заключается в отсутствии агглютинации сенсибилизированных эритроцитов растворами и сыворотками, заведомо не содержащими антител к вирусу чумы плотоядных, в том числе имеющими антитела к другим возбудителям инфекционных болезней собак. В то же время сыворотки, содержащие антитела к антигенно родственным ВЧП вирусам: вирусу кори и вирусу чумы крупного рогатого скота, должны вызывать агглютинацию специфического эритроцитарного диагностикума.

Специфический эритроцитарный диагностикум не реагирует с нормальной сывороткой крови кролика, фосфатным буфером, фетальной сывороткой крови крупного рогатого скота. Реакция также отрицательная с сыворотками крови кроликов, иммунизированных, соответственно, коронавирусом собак, вирусом панлейкопении кошек, лептоспирами, а также с сывороткой крови крупного рогатого скота и сывороткой крови собаки, отрицательной к ВЧП по данным реакции нейтрализации. Титр до 1: 16 может быть обусловлен неспецифической агглютинацией и не свидетельствует о положительной реакции. С учетом этого, все биологические жидкости, заведомо не содержащие антител к вирусу чумы плотоядных, являются отрицательными при титровании со специфическим эритроцитарным диагностикумом.

В то же время наблюдается положительная реакция с иммунной коревой сывороткой и сывороткой к чуме крупного рогатого скота, титры соответственно 1: 256 и 1: 512. Это согласуется с данными о высокой степени антигенного родства между этими морбилливирусами.

Те же сыворотки с контрольным эритроцитарным диагностикумом во всех случаях были не активны или активны в титре не выше 1: 2, что свидетельствует об отсутствии неспецифической агглютинации эритроцитов.

Полученные данные позволяют сделать заключение о высокой специфичности эритроцитарных диагностикумов.

Изучение стандартности эритроцитарных диагностикумов.

При использовании коммерческих наборов эритроцитарных диагностикумов важно чтобы титры, полученные с различными сериями наборов, могли сравниваться между собой, то есть реакция должна быть стандартной.

В целях изучения стандартности пять серий приготовленных нами специфических эритроцитарных диагностикумов исследовали в реакции непрямой гемагглютинации с шестью сыворотками, три из которых были заведомо положительными к вирусу чумы плотоядных, а три других заведомо отрицательными.

Все пять серий специфического эритроцитарного диагностикума обнаружили практически одинаковые титры с положительными сыворотками. Колебания титра в пределах одного разведения не превышали ошибки метода, обусловленной визуальным определением титра, и составляющей +0,5 log2. При этом все пять серий диагностикума не агглютинировали с отрицательными по отношению к вирусу чумы плотоядных сыворотками крови в разведениии выше, чем 1: 8, то есть во всех случаях реакция была отрицательной. Таким образом, можно считать, что специфический эритроцитарный диагностикум обладает высокой стандартностью.

Изучение сроков хранения эритроцитарных диагностикумов.

Через 1 месяц хранения при 37°С эритроцитарные диагностикумы начинают спонтанно агглютинировать. В случае хранения при комнатной температуре спонтанная агглютинация специфического эритроцитарного диагностикума появляется через два месяца. В условиях бытового холодильника эритроцитарные диагностикумы могут храниться в течение десяти месяцев ( срок

Все контрольные животные погибли с проявлением характерных клинических признаков чумы плотоядных. На 9 - 10 день у этих зверей начинался конъюнктивит, отмечалось снижение двигательной активности. На 11- 12 день признаки усиливались, у животных наблюдали гнойный коньюнктивит, они полностью отказывались от корма, снижалась реакция на внешние раздражители. На 12 - 13 сутки все контрольные звери погибли. При вскрытии отмечалось общее истощение, поражение желудочно-кишечного тракта, кровоизлияния в легких, увеличение размеров селезенки, сморщенность и утолщение стенок мочевого пузыря.

В группе № 6 титры нейтрализующих антител в сыворотках двух животных были ниже 1: 8, при этом сыворотки имели в РНГА титр 1:16. Обе тхорзофретки погибли после заражения в одни сроки со зверями контрольной группы с проявлением характерной клинической картины чумы плотоядных. Животные, имевшие титр в РНГА 1: 32 ив PH 1 : 8, выжили, хотя у них наблюдались незначительное снижение аппетита и слабый серозный конъюнктивит на 10 -11 сутки после заражения.

В группах 1-5 все животные имели через три недели после вакцинации титры в PH 1: 16 и выше, а в РНГА 1: 64 и выше. После заражения ни одно из иммунизированных животных не проявляло каких-либо клинических признаков заболевания чумой плотоядных, и все оставались здоровыми в течение срока наблюдения (28 дней).

Таким образом, все животные, имевшие титры в РНГА 1 : 64 и выше, а в PH 1 : 16 и выше, были полностью защищены от экспериментального заражения 1000 ЛД50 вирулентного штамма Snyder Hill вируса чумы плотоядных.

Изучение динамики поствакцинальных титров антител к вирусу чумы плотоядных у пушных зверей.

Б зверохозяйстпах и питомниках служебного собаководства наряду с общими ветеринарно-санитарными мероприятиями ежегодно проводят профилактическую вакцинацию всего взрослого поголовья, а молодняк пушных зверей и собак обязательно прививают в двухмесячном возрасте. Применение для этих целей отечественных биопрепаратов обеспечивает при правильном применении стабильное благополучие зверосовхозов, звероферм и ведомственных питомников служебного собаководства в отношении заболеваемости чумой плотоядных. В целях сохранения в дальнейшем данной благополучной ситуации важно изучить динамику нарастания и убывания поствакцинальных титров антител в сыворотках крови животных, определить корреляцию между

титрами антител в реакциях непрямой гемагглютинации и нейтрализации. С этой целью в одном из зверосовхозов страны в период плановой иммунизации молодняка коммерческой вакциной против чумы плотоядных культуральной сухой из штамма "ЭПМ" были привиты двухмесячные щенки пушных зверей: норок, тхорзофреток, песцов, енотовидных собак, красных и серебристо-черных лисиц. Перед введением вакцины, затем еженедельно в течение месяца, а также через три месяца после иммунизации у зверей отбирали пробы крови, полученные сыворотки параллельно исследовали на наличие антител к вирусу чумы плотоядных в РН и РИГА. РН ставили в культуре фибробластов японского перепела в двух модификациях макрометодом против 1000 ТЦД50 вируса чумы плотоядных штамма ЭПМ и микрометодом против 100 ТЦД5о того же вируса.

Параллельно в двух модификациях РН было исследовано 138 сывороток пушных зверей.

Титры в РН микрометодом колебались в пределах от 4,3 до 7,0, средние значения составили 5,7 + 0,8 log2.

Титры в РН макрометодом колебались в пределах от 3,0 до 5,0, средние значения составили 4,3 ± 0,5 1о&.

Коэффициент корреляции г = 0,98. Совпадаемость реакций составила 100 %. Проведение РН микрометодом позволяет исследовать малые объемы сыворотки, которых может не хватить на проведение РН макрометодом. В дальнейшей работе мы приводим данные микрометода РН.

Динамика титров антител у пушных зверей: норок, песцов, тхорзофреток, серебристо- черных и красных лисиц, енотовидных собак, привитых против чумы плотоядных вакциной из штамма "ЭПМ" представлена в таблице № 2.

Проведенные исследования показали, что в РНГА титры антител начинают заметно возрастать уже через 7 дней после вакцинации у всех шести видов обследованных нами пушных зверей. В то же время, в РН прироста тшров на 7 день после вакцинации не наблюдали. Наиболее выраженный прирост титров антител в РНГА к 7 дню после вакцинации наблюдался у норок ( 8,3 + 0,7 log2 ), а наименьший - у енотовидных собак ( 1,0 ± 0,8 log2). У тхорзофреток и песцов прирост титров антител в РНГА к 7 дню после вакцинации составил, соответственно, 4,6 + 0,6 log2 и 4,5 + 0,8 log2, а у серебристо- черных и красных лисиц, соответственно, 2,5 + 1,3 log2 и 2,8 + 0,6 log2. При этом наибольшие значения титров антител в РНГА на 7 день после вакцинации наблюдали у норок 11,8 + 0,3 log2, а наименьшие - у серебристо-

черных лисиц ( 8,5 + 0,6 log2 ) и у енотовидных собак ( 8,8 + 0,5 log2).

Таблица №2.

Динамика титров антител у пушных зверей, привитых против чумы плотоядных.

Вид животного Реакция Титры антител к ВЧП по дням, logs

0 7 14 21 28 90

Норки РН — — 5,5±0,3 6,3+0,3 6,0±0,4 4,8±0,6

РНГА 3,5 ± 0,4 11,8 ±0,3 12,8 ±0,5 13,6 ±0,3 13,6 ±0,3 8,8± 0,5

Хорьки РН — — 7,0±0,5 5,0±0,5 4,3±0,3 5,7±0,8

РНГА 5,7 ± 0,3 10,3 ±0,3 14,0 ±0,3 11,0 ± 1,0 11,0 ± 1,0 6,3 ± 0,8

Серебристо-черные лисицы РН — — 4,8+0,5 5,0±0,7 4,8±0,9 6,3±1,1

РНГА 6,0 ± 0,7 8,5 ± 0,6 10,8 + 0,6 10,3 ± 0,8 10,6 ± 1,1 8,8 ± 0,9

Красные лисицы РН — — 4,8+0,6 5,8+0,5 6,0+0,4 6,8+0,8

РНГА 7,0 ± 0 9,8 ±0,6 10,6 ± 1,1 11,8 ±0,6 12,1 ±0,5 10,3 ±0,3

Енотовидные собаки РН — — 5,3+0,3 5,8+0,5 7,0±0,4 6,5±0,6

РНГА 7,8 ± 0,3 8,8 ± 0,5 10,1 ±0,3 11,6 ±0,5 13,6 ±0,3 10,3 ± 0,5

Песцы РН — 6,5±0,3 5,8+0,3 5,5±0,3 5,3+0,3

РНГА 6,8 ±0,3 11,3 ±0,5 12,3 ±0,4 10,3 ± 0,6 10,1 ±0,5 9,0 ± 0,4

п = 4

К 14 дню после вакцинации наибольший прирост титров антител в РНГА по сравнению с 7 днем после вакцинации наблюдался у тхорзофреток ( 3,7 + 0,6 log2), а наименьший у норок (1,0 + 0,8 log2), песцов (1,0 ± 0,9 log2) и енотовидных собак ( 1,3 + 0,8 log2 ). В эти сроки ( 14 день после вакцинации ) наибольшие титры антител в РНГА наблюдаются у тхорзофреток ( 14,0 + 0,3 log2 ), а наименьшие у енотовидных собак ( 10,1 + 0,3 log2). К 14 дню после вакцинации в сыворотках пушных зверей были выявлены антитела в РН. Наибольшие титры антител в РН были у тхорзофреток ( 7,0 ± 0,5 log2 ), а наименьшие у серебристо-черных (4,8 ± 0,5 log2) и красных лисиц (4,8 ± 0,6 log2).

К 14 дню после вакцинации у тхорзофреток и песцов титры антител достигали максимума как в РН ( 7,0 ± 0,5 loga и 6,5 ± 0,3 log2 ), так и в РИГА ( 14,0 ±_0,3 log2 и 12,3 ± 0,4 log2 ), а у серебристо- черных лисиц титры антител достигали максимальных значений только в РНГА (10,8 + 0,6 log2).

К 21 дню после вакцинации у тхорзофреток и песцов было замечено некоторое снижение титров антител по сравнению с 14 днем после иммунизации как в РНГА ( 3,0 +1,3 log2 и 2,0 ±1,4 log2) так и в РН ( 2,0 ±.1,0 log2 и 0,7 ± 0,6 log2 ). У серебристо- черных лисиц титры антител к 21 и 28 дням после вакцинации существенно не изменялись по сравнению в 14 днем после вакцинации и составили соответственно, в РНГА 10,3 + 0,8 log2 и 10,6 ± 1,1 log2, а в РН 5,0 + 0,7 log2 и 4,8 ± 0,9 log2. Наибольшие значения титров антител к 21 дню после вакцинации были отмечены у норок в РНГА 13,6 ± 0,3 log2, а в РН 6,3 ± 0,3 log2.

Только у красных лисиц и енотовидных собак титры антител продолжали расти до 28 дня после иммунизации. К этому сроку они составили 12,1 ± 0,5 log2 и 13,6 ± 0,3 log2 в РНГА и 6,0 + 0,4 log2 и 7,0 + 0,4 log2 в РН, соответственно. Наивысшие титры антител в РНГА на 28 день после иммунизации были отмечены у енотовтдных собак и норок ( 13,6 ± 0,3 log2 ), а наименьшие у песцов ( 10,1 ± 0,5 log2). В то же время, в РН наименьшие титры были отмечены у тхорзофреток (4,3 ± 0,3 log2).

К третьему месяцу после иммунизации все группы пушных зверей сохраняли высокие титры антител: в РНГА выше 6,0 log2, а в РН выше 4,0 log2. При этом наиболее высокие титры антител как в РНГА, так и в РН сохранялись у красных лисиц ( 10,3 ± 0,3 log2 и 6,8 + 0,8 log2) и енотовидных собак ( 10,3 +.0,5 log2 и 6,5 ± 0,6 log2). Наиболее низкие титры антител в РНГА были отмечены у тхорзофреток ( 6,3 ± 0,8 iog2 ), а в РН у норок ( 4,8 ± 0,6 log2 ) и песцов (5,3 + 0,3 log2).

Таким образом, можно отметить, что животные, у которых титры антител нарастали медленно ( красные лисицы и енотовидные собаки ), дольше сохранили высокий уровень титров антител, чем животные, у которых был отмечен резкий подъем титров антител в первые две недели ( тхорзофретки и песцы ). В то же время, остаточный уровень антител к третьему месяцу после иммунизации превышал защитные титры как в РНГА, так и в РН, а значит все виды пушных зверей были защищены от заражения чумой плотоядных.

Сравнив титры антител в 138 сыворотках пушных зверей в РНГА и в РН мы обнаружили тесную корреляцию между результатами двух реакций ( г = 0,75 ). Совпадаемость реакций

Рисунок № 1.

Результаты исследования антигенной активности чумного компонента в ассоциированных вакцинах для собак.

БиовакйРАЬ Гексадог Тетрадог Вангард-5 Вакгард-7

ПТитр до вакцинации В! игр после вакцинации

Как видно на рисунке № 1, исходный иммунный фон у собак был высокий, что вероятно связано с персистированием в популяции животных полевых штаммов вируса чумы плотоядных, циркулирующих в данном питомнике или с колостральным иммунитетом.

Наиболее выраженный иммунный ответ наблюдался у щенков, привитых вакциной "Биовак 1)РЛЬ", прирост титров антител в РНГА составил 5,3 1о§2. Причем сероконверсия после введения вакцины наблюдалась у всех трех щенков.

После иммунизации вакцинами "Гексадог" и "Тетрадог" наблюдали положительную сероконверсию ( четырехкратный прирост титров антител) у одного и двух животных, соответственно. По одному щенку в каждой группе не ответило на введение вакцины приростом титров антител. Один щенок, привитый вакциной "Гексадог", ответил двукратным увеличением титров антител. В

среднем прирост титров антител после иммунизации вакцинами "Гексадог" и "Тетрадог" составил, соответственно, 1,0 log2 и 1,6 log2. Однако наличие высоких превакцинальных титров антител не позволяет с полной достоверностью судить об антигенной активности данных вакцин.

После иммунизации вакцинами "Вангард - 5" и "Вангард - 7" все щенки отвечали приростом титров антител, причем по два щенка в каждой группе имели четырехкратный и более прирост титров антител. По одному животному в каждой из групп ответили двукратным приростом титров антител. В среднем после иммунизации вакцинами "ВанГард - 5" и "Вангард - 7" отмечался прирост титров антител на 2,0 1о& и 2,3 log:, соответственно, что свидетельствует о высокой антигенной активности данных вакцин.

Таким образом, в реакции непрямой гемагглютинации нами была изучена антигенная активность пяти коммерческих ассоциированных вакцин. Было показано, что вакцины "Биовак DPAL", "Вангард - 5", "Вангард - 7" имели высокую антигенную активность. Несколько меньшей активностью обладали вакцины "Гексадог" и "Тетрадог".

В настоящее время в лаборатории контроля и стандартизации препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ контроль качества чумного компонента в составе моно- и ассоциированных вакцин для собак и пушных зверей проводится только по результатам изучения антигенной активности препаратов в РНГА. Для практического применения допускаются препараты, которые через две недели после введения вызывают образование в сыворотках крови собак антител к вирусу чумы плотоядных в титре не ниже 1: 256.

Сравнительное исследование антигеннной активности и иммуногенности вакцины против чумы плотоядных из штамма "ЭПМ".

В период с 1998 по 1999 год нами было исследовано 6 коммерческих серий вакцины против чумы плотоядных из штамма "ЭПМ", выпускаемых ТОО "Биоцентр". Для исследования было взято четыре серии моновакцины для норок с титром 2,5 lg ТЦД50/МЛ ( серии № 2, 12, 25,51 ), одна серия ассоциированной вакцины для собак ( № 43 ) с титром 3,5 lg ТЦД50/МЛ и одна серия ассоциированной вакцины для норок с титром 3,25 lg ТЦД50/МЛ. Шесть групп тхорзофреток в возрасте 2-4 месяца ( по четыре головы в каждой ) были привиты соответственно разными сериями вакцины. Еще одну группу из четырех голов не прививали и оставили в качестве контроля. С целью исследования антигенной

активности вакцин у животных до иммунизации и через три недели после иммунизации отбирали пробы крови для исследования полученных сывороток в РНГА и PH. Контроль иммуногенности проводили путем заражения привитых тхорзофреток 1000 ЛД50 вирулентного штамма ВЧП Snyder Hill на 21 день после иммунизации. За животными наблюдали в течение 28 дней после заражения.

Все вакцинированные животные выжили после заражения вирулентным штаммом Snyder Hill ВЧП и не проявляли никаких отклонений от нормы в течение срока наблюдения ( 28 дней ). При этом все контрольные животные заболели и погибли. В сыворотках крови животных до иммунизации антител не было. Через 21 день после иммунизации все животные имели защитные титры антител как в РНГА ( 1: 64 и выше ), так и в РН (выше 1: 16 ).

Таким образом, все исследованные серии вакцины из штамма "ЭПМ" были иммуногенны. Исследование антигенной активности вакцины против чумы плотоядных из штамма "ЭПМ" подтвердило высокое качество данного препарата и показало возможность перехода от контроля иммуногенности вакцин против чумы плотоядных к контролю их антигенной активности.

Сравнительное исследование качества лечебно-профилактических препаратов, применяющихся при чуме плотоядных.

В последние годы для серотерапии и профилактики наиболее часто встречающихся инфекционных болезней собак широкое распространение получили моно- и поливалентные сыворотки и иммуноглобулины. Препараты отличаются видом донора, схемами иммунизации, способом получения и формой выпуска конечного продукта. Абсолютное большинство, как отечественных, так и зарубежных лечебно- профилактических препаратов содержит з своем составе антитела к вирусу чумы собак. Для индикации антител используются различные методы. Общепринятым методом контроля данных препаратов является реакция нейтрализации, в то же время, ряд существенных недостатков данной реакции не всегда позволяют должным образом провести контроль. Использование «Набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в РНГА» позволит исправить ситуацию. В предварительных опытах нами была показана возможность использования данного набора для оценки уровня антител к вирусу чумы плотоядных в серийно выпускаемых лечебно-профилактических препаратах. Метод оказался простым в

исполнении, быстрым в получении результатов, надежным и стандартным.

В соответствии с распоряжением Департамента ветеринарии МСХиП РФ № 13-4-19/410 от 2.07.96 г были проведены сравнительные комиссионные испытания качества 15 лечебно-профилактических препаратов для плотоядных, изготовленных различными предприятиями страны.

Все исследованные лечебно- профилактические сыворотки и иммуноглобулины содержали различное количество антител к вирусу чумы собак. Активность их варьировала в широких пределах от 1: 64 до 1: 2048 в РИГА и от 1: 2 до 1: 32 в РН. Наибольшую активность проявляли:

- Иммуноглобулин специфический против парвовирусного энтерита, гепатита и чумы плотоядных. Производства ВНИИЗЖ, серия 2, контроль 25. В РИГА 1: 2048, в РН 1: 32.

- Сыворотка поливалентная против чумы, парвовирусных инфекций и вирусного гепатита плотоядных. Производства Покровского завода биопрепаратов, серия 89, контроль 89. В РНГА 1: 1024, в РН 1: 16.

- Сыворотка поливалентная против чумы, парвовирусных инфекций и вирусного гепатита плотоядных. Производства Покровского завода биопрепаратов, серия 90, контроль 90. В РНГА 1: 1024, в РН 1: 16.

- Глобулин против чумы, энтерита и гепатита плотоядных. Производства ВНИИВВиМ, серия 14, контроль 14. В РНГА 1: 2048, в РН 1: 16.

- Иммуноглобулин против энтерита, гепатита, чумы собак. Производства МПБП ТОО «Биоцентр», серия 6, контроль 6. В РНГА 1: 1024, еРН1: 16.

- Сыворотка поливалентная против чумы, парвовирусных инфекций и гепатита плотоядных. Производства ТОО «Бионит», серия 1, контроль 1. В РНГА 1:1024, в РН 1: 16.

- Иммуноглобулин против энтерита, гепатита, чумы собак. ТОО «Биоцентр», г. Москва, серия 14, контроль 14. В РНГА 1: 2048, вРН 1: 16.

- Сыворотка поливалентная против энтерита, гепатита, чумы собак. Производства ТОО «Биоцентр», серия 22, контроль 22. В РНГА 1: 1024, в РН 1: 8.

Полученные результаты были подтверждены данными применения этих препаратов в ветеринарной практике. Препараты, имеющие низкие титры антител к вирусу чумы плотоядных, оказались малоэффективными.

В настоящее время выпускается 8 наименований лечебно -профилактических препаратов. При проведении выборочного контроля и сертификационных испытаний титры антител к вирусу чумы плотоядных оцениваются с помощью РИГА и должны быть не ниже 1 :256.

Также разработаны, согласованы и внесены соответствующие изменения и дополнения в пункт 4.9 ТУ 9382-008-11472788-96 « гамма - глобулин против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных »ив пункт 4.8.2. ТУ 9382-005-11472788-97 «сыворотка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная», выпускаемых ЗАО Ветзвероцентр (г. Москва).

Выводы.

1. Оптимизирован и прошел широкие производственные испытания "Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации ( РНГА )" с целью оценки антигенной активности вакцин, качества лечебно - профилактических препаратов, напряженности иммунитета, определения иммунного статуса у переболевших и вакцинированных пушных зверей и собак.

2. Установлены защитные титры антител к ВЧП в сыворотках крови плотоядных животных (тхорзофреток): в РНГА >1:64 и в РН >1:16.

3. В результате модификации постановки реакции нейтрализации при чуме плотоядных повышена ее чувствительность, и упрощены постановка и учет реакции.

4. Изучена динамика титров антител в сыворотках крови пушных зверей, иммунизированных вакциной из штамма ЭПМ. Титры антител в РНГА начинают возрастать на 7 сутки после вакцинации, достигая максимальных значений у разных видов пушных зверей через 2-3 недели.

5. Разработанная методика позволила установить, что наиболее высокой антигенной активностью чумного компонента в ряде изученных вакцин обладали коммерческие вакцины, изготовленные ТОО "Биоцентр" ( Россия ), фирмами Rhone Merieux ( Франция) и Pfizer (США).

6. Результаты проведенных исследований нашли отражение в соответствующих разделах Инструкции о мероприятиях по

предупреждению и ликвидации чумы плотоядных, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 25.04.97 г.

Практические предложения.

"Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации ( РНГА )" рекомендован для использования в следующих целях:

- контроль антигенной активности чумного компонента в составе моно - и ассоциированных вакцин для собак и пушных зверей,

определение напряженности колострального и поствакцинального иммунитета у собак и пушных зверей к чуме плотоядных,

- контроль лечебно - профилактических препаратов, содержащих антитела к вирусу чумы плотоядных ( сыворотки и иммуноглобулины).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Контроль за вакцинацией собак против чумы плотоядных. Сборник научных трудов МГАВМиБ. Проблемы ветеринарной биологии. М, 1997, с. 66-69. Соавторы: Васильев A.B., Уласов В.И., Колышкин В.М.

2. РНГА для выявления антител к вирусу чумы плотоядных. Ветеринария. 1996, № 11, с. 20-23. Соавторы: Васильев A.B., Колышкин В.М.

3. Разработка набора эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в РНГА. Тезисы докладов I региональной конференции по болезням мелких домашних животных. Новосибирск. 1996, с. 33-34. Соавторы: Васильев A.B., Уласов В.И., Груздев К.Н., Колышкин В.М.

4. Динамика титров антител у пушных зверей, вакцинированных против чумы плотоядных. Сборник научных трудов ВГНКИ. 1996, том 59, с. 41-44. Соавторы: Уласов В.И., Колышкин В.М., Васильев A.B., Домский И.А., Бельтюкова З.Н.

5. Контроль вакцинации пушных зверей против чумы плотоядных. Материалы II международного симпозиума "Физиологические основы повышения продуктивности хищных пушных зверей". Петрозаводск. 1998, с. 38-39. Соавторы: Уласов В.И., Васильев A.B., Колышкин В.М.

6. Иммунный ответ у зверей при вакцинации против чумы плотоядных. Кролиководство и звероводство. 1998, № 2, с. 24. Соавторы: Уласов В.И., Колышкин В.М., Васильев A.B., Домский И.А., Бельтюкова З.Н.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Елаков, Александр Леонидович

Список используемых сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Вакцины против чумы плотоядных.

1.2. Методы контроля вакцин против чумы плотоядных.

1.3. Факторы, влияющие на эффективность вакцинации.

1.4. Методы выявления антител к вирусу чумы плотоядных.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Анализ некоторых данных выпуска вакцин против чумы плотоядных.

2.2.2. Постановка и испытание РИГА.

2.2.3. Изучение активности специфического вируса чумы плотоядных эритроцитарного диагностику ма.

2.2.4. Изучение специфичности эритроцитарных диагностикумов.

2.2.5. Изучение стандартности эритроцитарных диагностикумов.

2.2.6. Изучение сроков хранения эритроцитарных диагностикумов.

2.2.7. Определение иммунизирующей дозы и защитного титра на тхорзофретках.

2.2.8. Изучение динамики поствакцинальных титров антител к вирусу чумы плотоядных у пушных зверей.

2.2.9. Сравнительное исследование антигенности чумного компонента в ассоциированных вакцинах для норок.

2.2.10. Сравнительное изучение антигенности чумного компонента в ассоциированных вакцинах для собак.

2.2.11. Сравнительное исследование антигеннной активности и иммуногенности вакцины против чумы плотоядных из штамма "ЭПМ".

2.2.12. Сравнительное исследование качества лечебно - профилактических препаратов, применяющихся при чуме плотоядных.

2.3. Обсуждение результатов.

Выводы.

Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка метода контроля антигенной активности вакцин против чумы плотоядных"

В ряду инфекционных болезней собак и пушных зверей особое место занимает чума плотоядных (ЧП ). Это обусловлено чрезвычайно широким спектром хозяев вируса чумы плотоядных, относящегося к семейству Paramixoviridae, роду Morbillivirus. К вирусу чумы плотоядных восприимчивы многие виды отряда Carnivora, подотряда Fissepeda. Имеются сообщения о восприимчивости к ЧП животных семейств: Ailuridae, Canidae, Hyaenidae, Mustelidae, Ursidae, Procyanydae, Viverridae и Felidae. Патогенность вируса для разных видов животных колеблется в широких пределах - от бессимптомного переболевания до 100 % летальности. Для звероводческих хозяйств чума плотоядных представляет большую опасность: падеж среди не вакцинированного молодняка может доходить до 70 - 90 %, среди взрослых зверей - до 40- 70 %. Единственным надежным методом профилактики является иммунизация пушных зверей с помощью моно- и ассоциированных вакцин. Вакцинация среди животных в промышленном звероводстве является строго обязательной. Высокое качество препаратов, применяемых в системе иммунопрофилактики, является одним из важнейших условий успешной борьбы с инфекционными болезнями.

В этой связи большое внимание уделяется контролю за качеством вакцин против чумы плотоядных. Живые аттенуированные вакцины должны быть стерильны, безвредны, активны в соответствующей культуре клеток. Для отечественных препаратов предусмотрен также контроль иммуногенности каждой четвертой- пятой серии вакцины на тхорзофретках, что является весьма дорогим и продолжительным по времени мероприятием. Для аналогичных импортных препаратов предусмотрен только контроль антигенной активности по приросту нейтрализующих антител в парных сыворотках.

В настоящее время контроль активности специфических лечебных препаратов против чумы плотоядных ( сывороток и иммуноглобулинов ) осуществляется с помощью реакции нейтрализации. Эта реакция требует наличия культур клеток, живого вируса, сложна в постановке, длительная и дорогостоящая, поэтому не все производители имеют возможность для ее проведения. Ветеринарная практика нуждается в разработке доступного, простого, надежного и быстрого метода, позволяющего провести анализ качества сывороток и иммуноглобулинов.

В 1995 году ТОО «Биоцентр» совместно с лабораторией звероводства ВГНКИ был разработан «Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)». Однако для широкого внедрения РИГА в практику требовалось провести детальное изучение набора и возможностей его использования.

Цель работы.

Разработать серологический метод контроля антигенной активности вакцин против чумы плотоядных и метод оценки активности лечебно- профилактических препаратов на основе РИГА.

Задачи исследования.

- исследовать динамику титров антител у пушных зверей после иммунизации коммерческими вакцинами против чумы плотоядных в реакциях нейтрализации и непрямой гемагглютинации;

- сопоставить титры антител в РИГА у тхорзофреток с результатами экспериментального заражения вирулентным штаммом и определить защитный титр;

-определить корреляцию между реакцией нейтрализации и непрямой гемагглютинации.

Научная новизна.

Изучена динамика титров поствакцинальных антител к ВЧП у пушных зверей в реакции нейтрализации и реакции непрямой гемагглютинации. Определен защитный титр поствакцинальных антител к ВЧП у тхорзофреток в реакции непрямой гемагглютинации и реакции нейтрализации. Выявлена корреляция между РИГА и РН и определен коэффициент корреляции. Показана возможность использования РИГА для контроля активности лечебно- профилактических препаратов против чумы плотоядных.

Практическая значимость.

Разработанный и испытанный на большом фактическом материале "Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации ( РИГА )" может быть использован для:

- контроля антигенной активности вируса чумы плотоядных в составе моно -и ассоциированных вакцин для собак и пушных зверей,

- определения напряженности иммунитета у собак и пушных зверей к чуме плотоядных.

Разработанный метод вошел в качестве дополнений и изменений в пункт 4.8.2. ТУ 9382-005-11472788-97 ( сыворотка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная) и пункт 4.9.2. ТУ 9382-008-11472788-96 (гамма - глобулин ( иммуноглобулин ) против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных) для контроля препаратов изготавливаемых ЗАО "Ветзвероцентр".

В проведении исследований оказывали помощь сотрудники лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ, ТОО «Биоцентр», ВНИИОЗ им. Б.М. Житкова, питомников служебного собаководства. Особо хотелось бы поблагодарить за практическую помощь Нефедова B.C., Журавлеву H.H., Домского И.А., Бельтюкову З.Н., Сорокину А.М:, Дубкова Ю.А., Бояринова A.C., а также авторов набора Васильева A.B., Колышкина В.М., Уласова В.И.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Елаков, Александр Леонидович

ВЫВОДЫ.

1. Оптимизирован и прошел широкие производственные испытания "Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации ( РИГА )" с целью оценки антигенной активности вакцин, качества лечебно - профилактических препаратов, напряженности иммунитета, определения иммунного статуса у переболевших и вакцинированных пушных зверей и собак.

2. Установлены защитные титры антител к ВЧП в сыворотках крови плотоядных животных (тхорзофреток) в РИГА >1:64 и в РН >1:16.

4. Изучена динамика титров антител в сыворотках крови пушных зверей, иммунизированных вакциной из штамма ЭПМ. Титры антител в РИГА начинают возрастать на 7 сутки после вакцинации, достигая максимальных значений у разных видов пушных зверей через 2 - 3 недели.

5. Разработанная методика позволила установить, что наиболее высокой антигенной активностью чумного компонента в ряде изученных вакцин обладали коммерческие вакцины, изготовленные ТОО "Биоцентр" ( Россия), фирмами Rhone Merieux (Франция) и Pfizer (США).

6. Результаты проведенных исследований нашли отражение в соответствующих разделах Инструкции о мероприятиях по предупреждению и ликвидации чумы плотоядных, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 25.04.97 г.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Набор эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации ( РИГА )" рекомендован для использования в следующих целях:

- определение напряженности колострального и поствакцинального иммунитета у собак и пушных зверей к чуме плотоядных,

- контроль лечебно - профилактических препаратов, содержащих антитела к вирусу чумы плотоядных (сыворотки и иммуноглобулины).

Разработанный метод вошел в качестве дополнений и изменений в пункт 4.8.2. ТУ 9382-005-11472788-97 ( сыворотка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная ) и пункт 4.9.2. ТУ 9382-008-11472788-96 ( гамма-глобулин ( иммуноглобулин ) против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных) для контроля препаратов изготавливаемых ЗАО "Ветзвероцентр".

Заключение.

В настоящее время для профилактики чумы плотоядных у собак и пушных зверей разработаны и используются различные типы вакцин как отечественного, так и зарубежного производства. Они обязательно контролируются на стерильность и безвредность. Для живых аттенуированных вакцин одним из основных показателей является вирусная активность.

Эффективность вакцины против чумы плотоядных может быть оценена как по иммуногенным, так и по антигенным свойствам. При контроле иммуногенности и антигенности могут быть использованы только здоровые животные, не имеющие

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

Экспериментальная часть исследований выполнялась в период с 1995 по 1998 г. в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ. Эпизоотический анализ, клинические наблюдения проводили на базе центральной научно- производственной лаборатории, в ряде зверосовхозов, питомниках служебного собаководства, ОПХ «Манихино», ТОО «Биоцентр».

В работе использовали производственные штаммы вируса чумы собак ЭПМ и Snyder Hill, которые, поддерживали путем пассажа на культуре клеток фибробластов перепелиных эмбрионов и интактных тхорзофретках, соответственно. Штаммы хранили в лиофилизированном состоянии при - 40° С.

Для вакцинации животных использовали коммерческие моно- и ассоциированные вакцины отечественного и импортного производства, содержащие в своем составе антиген вируса чумы собак: вакцина против чумы плотоядных культуральная сухая из штамма «ЭПМ» ( ТОО "Биоцентр" ), вакцина ассоциированная против чумы, вирусного энтерита, ботулизма и псевдомоноза норок - "Бионор DPAB" ( ТОО "Биоцентр" ), "Биовак DPAL" ( ТОО "Биоцентр" ), "Biocom DP" ("United", США), "Гексадог" и "Тетрадог" ("Rhone Merieux", Франция), "Вангард - 5" и "Вангард - 7" ("Pfizer", США).

В процессе исследований использовались животные: 15 щенков собак в возрасте 3 - 4 месяца, 76 тхорзофреток в возрасте 2 - 4 месяца, по 8 красных и серебристо - черных лисиц в возрасте 2 месяца, 8 песцов в возрасте 2 месяца, 8 енотовидных собак в возрасте 2 месяца, 16 норок в возрасте 2 месяца.

- Определение антигенной и иммуногенной активности вакцин на восприимчивых животных.

Восприимчивые к вирусу чумы собак животные: тхорзофретки, енотовидные собаки, черные и рыжие лисы, песцы, норки, собаки были иммунизированы вакциной против чумы плотоядных культуральной сухой из штамма ЭПМ в соответствии с наставлением по применению. Тхорзофреткам, норкам и песцам было введено по одной дозе вакцины ( 900 ТЦД50), а собакам, черным и красным лисам, енотовидным собакам по две дозы (1800 ТЦД50). Такое же количество не вакцинированных зверей каждого вида служили в качестве контроля. Пробы крови от исследуемых и контрольных групп каждого вида отбирали на 7, 14, 21, 28 и 90 день после вакцинации. У норок и тхорзофреток кровь отбирали из хвостовой артерии. У остальных видов кровь брали из вены сафена. Пробы крови 1 час выдерживали при температуре 37° С в термостате, а затем два часа при 4° С в бытовом холодильнике, после чего центрифугировали при 2000 об/мин 10 минут. Сыворотки крови отбирали в стерильные эпендорфы и прогревали при 56°С, после чего определяли титры антител к вирусу чумы собак в РН и РИГА.

Всего было исследовано 144 сыворотки крови пушных зверей.

При проведении исследований использовали следующее оборудование и реактивы:

- СО2 инкубатор IG 150 фирмы Jouan,

- настольный ламинарный бокс BSB 48 фирмы ICN Biomedikals Ltd.,

- инвертированный микроскоп

- микроскоп Р7У4.2 производства «Ломо»,

- планшеты для иммунологических реакций однократного применения производства «Медполимер»,

- 96 луночные микропанели фирмы «Nunc»,

- моноканальные микропипетки производства «Gilson»,

- восьмиканальную пипетку производства «Finnpipette»,

- камеру Горяева,

-центрифугу MPW-310,

- центрифугу Т 23.

Перечень используемых растворов, питательных сред и реактивов представлен в соответствующих разделах диссертации.

Биологическую активность вакцины против чумы плотоядных из штамма "ЭПМ" определяли титрованием в культуре клеток фибробластов эмбрионов японского перепела согласно ТУ10.19.87- 89. Учет результатов проводили на шестые сутки по цитопатическому действию вируса, выражавшемуся в округлении клеток, образованию мегакариоцитов. Биологическая активность лиофилизированного препарата находилась в пределах 2,5- 3,5 Ig ТЦД50.

- Постановка реакции нейтрализации микрометодом.

Реакция нейтрализации микрометодом проводилась в микропанелях фирмы Nunc на субкультуре клеток фибробластов эмбрионов японского перепела против 100 ТЦД50 вакцинного штамма ЭПМ вируса чумы собак.

Для получения субкультуры в трехлитровые роллерные бутыли вносили 250 млн клеток в 600 см3 среды 199 с 7 % сыворотки крови крупного рогатого скота, и инкубировали двое суток для получения полного монослоя. На второй день удаляли ростовую среду, дважды промывали монослой раствором версена 0,02 % и снимали клетки 0,25 % раствором трипсина. Подсчет клеток вели в камере Горяева. В лунки микропанели вносили по 0,2 см3 суспензии, содержащей 100000 клеток/см3 в среде 199 с 7 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Панель инкубировали сутки в атмосфере 5 % СО2 в СОг инкубаторе. На следующий день ставили реакцию нейтрализации.

Сначала определяли титр вируса. В четыре пробирки вносили по 1,8 см3 среды 199 с 2 % сыворотки крови крупного рогатого скота. В первую пробирку пипеткой вносили 0,2 см3 вируссодержащей жидкости, пипетировали, затем новой пипеткой отбирали 0,2 см3 жидкости и переносили во вторую, и так далее, получая таким образом разведения вируса от 1: 10 до 1: 10000. Из панели с однодневным редким монослоем субкультуры фибробластов эмбрионов перепела удаляли среду, затем из каждой пробирки вносили по 0,2 см3 разведения вируса в четыре лунки микропанели. В четыре лунки панели вносили среду 199 с 2 % сыворотки крупного рогатого скота, они служили в качестве контроля. Затем панель закрывали крышкой и помещали в СО2 инкубатор. На 2- 3 день после внесения вируса в панели проводили смену среды на поддерживающую ( среда 199 без сыворотки крови). Конечную точку титрования определяли на шестой день микроскопически при помощи инвертированного микроскопа по наличию специфического ЦПД, выражавшегося в округлении клеток, слиянии клеток с образованием гигантских многоядерных клеток (симпластов). За положительный результат принимали лунки в которых наблюдали четкое специфическое ЦПД. При этом в контрольных лунках был ровный не пораженный монослой. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.

Для определения титра антител в сыворотках крови в восемь пробирок вносили по 0,2 см3 среды 199, затем в первую добавляли 0,2 см3 испытуемой сыворотки крови, перемешивали и переносили 0,2 см3 во вторую пробирку, и так далее до восьмой, из последней пробирки 0,2 см3 смеси удаляли. Таким образом получали разведения от 1: 2 до 1: 256. В каждую пробирку с разведениями испытуемой сыворотки добавляли 0,2 см3 вирусной суспензии, приготовленной на среде 199 , и содержащей 400 ТЦД50. Затем смесь вируса с сывороткой крови инкубировали 1,5 часа при 20- 25°С. Из планшет с предварительно полученным однодневным монослоем удаляли по 0,1 см3 среды, после чего из каждой пробирки вносили по 0,1 см3 смеси вирус - сыворотка в четыре лунки микропанели. Параллельно с титрованием сывороток проводили контрольное титрование вируса. Панели закрывали крышкой и инкубировали при 37°С, 5 % СО2 три дня, затем проводили смену среды на поддерживающую и оставляли в СО2 инкубаторе до учета результатов. Учет результатов проводили на шестой день с помощью инвертированного микроскопа. Титром сыворотки считали ее предельное разведение, сдерживающее развитие ЦПД в 50 % зараженных культур клеток. При этом в контроле титр вируса был 2,0 - 2,25 1д ТЦД50. Титр сыворотки выражали в 1од2 и обрабатывали статистически. Параллельно с титрованием ставили контроль токсичности сыворотки. Для чего в четыре лунки микропанели вносили по 0,1 см3 не разведенной сыворотки и 0,1 см3 среды 199. Панели инкубировали при условиях идентичных титрованию. На шестой день не должно было наблюдаться неспецифической дегенерации в культуре клеток.

- Постановка реакции нейтрализации макрометодом.

Реакция нейтрализации макрометодом проводилась в пробирках с первичнотрипсинизированной культурой клеток фибробластов эмбрионов японского перепела. Культуру клеток фибробластов эмбрионов японского перепела получали общепринятым методом.

В пробирки вносили суспензию фибробластов в объеме 0,5 см3, содержащую 400000 клеток в среде 199 с 7 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Пробирки инкубировали в термальной комнате при температуре 37°С в наклонном положении в течение суток. На следующий день ставили реакцию нейтрализации. Для этого в семь стерильных пробирок вносили по 1,0 см3 среды 199, в первую добавляли 1,0 см3 исследуемой сыворотки крови, пипетировали и переносили в следующую пробирку 1,0 см3, и так далее до седьмой. Из последней пробирки 1,0 см3 удаляли. Таким образом получали разведения от 1: 2 до 1:128. Затем во все пробирки вносили по 1,0 см3 вирусной суспензии, содержащей

4000 ТЦДбо вируса чумы собак штамма ЭПМ. Инкубировали смесь вируса с разведениями сыворотки 1,5 часа. После инкубации из каждой пробирки вносили по 0,5 см3 смеси в четыре пробирки с культурой клеток. Параллельно проводили контроль биологической активности вируса. Для чего в три пробирки вносили по 4,5 см3 среды 199, в первую добавляли 0,5 см3 рабочего разведения вируса, пипетировали и переносили во вторую, снова пипетировали и переносили в третью. Разведения вируса инкубировали также как и смесь вируса с сывороткой 1,5 часа при комнатной температуре. Затем из каждой пробирки вносили по 0,5 см3 в четыре пробирки с культурой клеток. Также проводили контроль токсичности сывороток крови, для чего в четыре пробирки вносили 0,5 см3 не разведенной сыворотки крови. Пробирки оставляли в термальной комнате при температуре 37°С на двое суток. На третьи сутки проводили смену среды на поддерживающую ( среда 199 ) и помещали в термальную комнату до учета результатов. Учет результатов проводили на шестые сутки с помощью лабораторного микроскопа. Вначале определяли титр вируса в контроле, который должен быть равен 3,0 Ig ТЦД50. Затем учитывали титры сывороток. За титр сыворотки принимали предельное разведение, сдерживающее развитие ЦПД в 50 % зараженных культур клеток. Титр сыворотки расчитывали по Риду и Менчу и выражали в log2.

В работе также использовали опытно- промышленные серии «Наборов эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации РИГА» (ТУ 9384- 001- 0000806496), разработанного Васильевым A.B., Колышкиным В.М. и Уласовым В.И.

Постановку и учет результатов РИГА проводили в соответствии с Временным наставлением, утвержденным Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 11.01.96 N13- 7- 2/504.

Перед использованием наборов проводили изучение активности, специфичности, стандартности и срока годности эритроцитарных диагностикумов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елаков, Александр Леонидович, Москва

1. Борисович Ю.Ф., В.А. Чижов, В.И. Мурашкин. Реакция диффузионной преципитации в агаровом геле при чуме плотоядных. Труды ВГНКИ ветпрепаратов, 1972, т. 18, с. 65-68.

2. Грачев В.П., А.В.Курбатов, Л.Л.Миронова и др. Создание экспериментальной культуральной вакцины против чумы плотоядных с использованием клеток линии 4647. Вопросы вирусологии, 1990, № 1, с. 56-57.

3. Груздев К.Н., А.В.Селиванов, Чума плотоядных. М., Агропромиздат, 1985

4. Дибиров Ш.С. Автореферат кандидатской диссертации. Покров. 1997.

5. Дорофеев В.М., Э.Г.Бирюкова, О.Г.Анджапаридзе и др. Способ получения живой культуральной вакцины против чумы плотоядных. Авторское свидетельство СССР № 2395515/30-15 от 04.08.1976.

6. Жуматов К.Х., С.С.Багашева, Т.В.Кирющенко и др. Способ приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов для индикации вирусов. Вопросы вирусологии, 1994, № 5, с. 235-238.

7. Зорин В.Л., Зорина А.И. Новое в вакцинации собак против чумы плотоядных. Ветеринария. 1995, № 10, с. 50-51.

8. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. М., Медицина, 1976.

9. Каральник Б.В., Т.Д.Укбаева, И.Х.Шуратов. Сравнительная оценка некоторых серологических методов диагностики респираторно-синцитиальной инфекции. Вопросы вирусологии, 1990, № 6, с. 518-520.

10. Колышкин В.М. Разработка и совершенствование средств диагностики, профилактики и терапии при чуме плотоядных. Автореферат. Москва. 1999.

11. Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология. М., Агропромиздат, 1986.

12. Митин Н.И. Вирус чумы плотоядных. В книге «Руководство по ветеринарной вирусологии» под редакцией В.Н.Сюрина. М., «Колос», 1966, с. 563-570.

13. Мурашкин В.И. Опыт получения активных антисывороток на исходный и очищенный вирус чумы плотоядных. Труды ВГНКИ. 1978. Т. 26., с. 7780.

14. Нибиеридзе В.П. Изучение биологических свойств вируса чумы плотоядных и разработка методов диагностики болезни. Автореферат кандидатской диссертации. Владимир, 1977.

15. Нибиеридзе В.П., О.И.Шарабрин. Метод иммуноосмофореза для определения активности антисывороток к вирусу чумы плотоядных. Труды ВГНКИ ветпрепаратов, 1977, т. 23, с. 28-31.

16. Панков В.А. О восприимчивости кроликов к вирусу чумы плотоядных. Кролиководство и звероводство. 1950, № 4, с. 63-65.

17. Панков В.А. Чума плотоядных у кроликов. Каракулеводство и звероводство. 1950, № 3, с. 67-68.

18. Прохорова Э.М., В.П.Нибиеридзе. Выявление специфических антител к вирусу чумы плотоядных с помощью РИГА. Госинти, 1977, № 3, с. 67-77.

19. Радзивиловский Г.Л., 1936. Цитировано по Колякову Я.Е., 1986.

20. Сафонов Г.А. и др., Цитировано по Сулимову A.A., К.Н.Груздеву «Чума плотоядных» в книге «Ветеринарные препараты», справочник, М., Колос, 1981, с. 119-125.

21. Селиванов A.B., Груздев К.Н., Сулимов A.A. Чума плотоядных и меры борьбы с ней. Ветеринария. 1984. № 7, с. 36-39.

22. Селиванов A.B., Сулимов A.A., Груздев К.Н. Сравнительное изучение иммуногенности вакцин против чумы плотоядных. Тезисы докладоввсесоюзной научной конференции "Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов". 1981, М., с. 111.

23. Селиванов A.B., Хасанов Ч.Г. Групповая профилактика инфекционных болезней животных. 1983. М. "Колос"., с. 243-255.

24. Скаршевская Е.И. Изучение готового эритроцитарного диагностикума в реакции непрямой гемагглютинации. В сборнике «Материалы научной конференции по вопросам ветеринарии», часть I. М., 1971, с. 79-80.

25. Сюрин В.Н., Р.В.Белоусова, Н.В.Фомина, Диагностика вирусных болезней животных. Справочник. М., В.О.Агропромиздат, 1991.

26. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология. М. 1990.

27. Фомин К.Ю., Мусиенко М.И., Дудников Л.А. Сравнение эффективности культивирования вакцинных штаммов вируса чумы плотоядных в различных культуральных системах. Вирусные болезни с.-х. животных. Владимир. 1995, с. 109.

28. Черкасский Е.С. Опыт иммуно-биологической профилактики и лечения чумы плотоядных. Каракулеводство и звероводство. 1950, № 1, с. 7778.

29. Черкасский Е.С. Результаты применения поливалентной эмбриовакцины и опыт изготовления сухой вакцины чумы плотоядных. Труды Всесоюзного научно-исследовательского института охотничьего промысла. 1956, Вып. 16, с. 188-189.

30. Черкасский Е.С. Чума и чумоподобные болезни плотоядных. М. 1971.

31. Adelus-Neveu F., A.L. Saint-Gerand, G.Fayet et al. Canine distemper -conclusions from an outbreac in France. Practicche-Tierarzt, 1991, vol. 72, № 10, p. 866-871.

32. Anon., Off. Journal of the European Communities., 1992, № L 97-1/23.

33. Appel M.J.G. Reversion to virulence of attenuated canine distemper virus in vivo and in vitro. J. Gen. Virol., 1978, vol. 41, p. 385-393.

34. Appel M.J.G. Immune response to vaccinia virus and recombinant virus products in dogs. Am. J. Vet. Res., 1988, vol. 49, p. 1932-1934.

35. Appel M.J.G., Jones O.R. Use of alveolar macrophages for cultivation of canine distemper virus. Proc. Soc. Exp. Biol. 1967,vol. 126, p. 571-574.

36. Appel M.J.G. Canine Distemper Virus In Virus infections of carnivores. Ed. M. Appel. Amsterdam-Oxford-New-York, 1987, p. 133-160.

37. Appel M.J.G., J.H.Gillespie. Canine Distemper virus. Virology monographs, vol. 11, 1972.

38. Appel M.J.G., Reggiardo C., Summers B.A. et al. Canine distemper virus infection and encephalitis in javelinas (collared peccaries). Arch. Virol., 1991, vol. 119, p. 147-152.

39. Appel M.J.G., D.S.Robson. A microneutralisation test for canine distemper virus. Am. J. Vet. Res., 1973, vol. 34, № 11, p. 1459-1463.

40. Appel M.J.G., W.R.Shek, H.Shesberadaran et al. Measles virus induce incomplete immunity to canine distemper. Archive Virol., 1984, vol. 82, p. 73-82.

41. Appel M.J.G., W.R.Shek, B.A.Summers. Lymphocyte-mediated immune cytotoxicity in dogs infected with virulent canine distemper virus. Infect. Immunity, 1982, vol. 37, p. 592-600.

42. Appel M.J.G., B.A.Summers. Pathogenicity of morbilliviruses for terrestrial carnivores. Veterinary Microbiology, 1995, vol. 44, p. 187-191.

43. Appel M.J.G., Yates R.A., Foley G.L. Canine distemper epizootic in lions, tiges, and leopards in Noth America. J. Vet. Diagn. Invest., 1994, vol. 6, p. 277-288.

44. Baker J.A. Measles vaccine for protection of dogs against canine distemper. J. Am. Vet. Med. Assoc., vol. 156, p. 1743-1746.

45. Baker J.A., Gorham J.R., Leader R.W. Stadies on an in ovo neutralisation test for distemper. Am. J. Vet. Res., 1954, vol. 15, p. 102-107.

46. Baker J.A., D.S.Robson, J.H.Gillespie et al. A nomograph that predicts the age to vaccinate puppies against distemper. Cornell. Vet., 1959, vol. 49, p. 158-167.

47. Barrett T., D.K.Crarke, S.A.Evans et al. The nucleotide sequence of the gene encodiny the F protein of canine distemper virus: a comparison of the deduced amino acid sequence with other paramyxoviruses. Virus Researct, 1987, vol. 8, p. 373-386.

48. Baumgartner W. Virale Infektionskrankheiten bei Welpen und Junghunden unter besonderer Berücksichtigung der Staupevirusinfektion. Prakt. Tierarzt., 1993, vol. 1, p. 26-33.

49. Bittle J.Z., York C.J., Newberne J.W. Adaptation and modification of a strain of canine distemper viris in tissue culture. Cornell. Vet. 1961, vol. 51, p 369.

50. Blixenkrone-Moller M., J.Bohm, E.Lund. Outbreak of distemper among sled dogs in North Greenland. Dansk-Veterinaertidaakrift, 1989, vol. 72, p. 488497.

51. Blixencrone-Moller M., V.Svansson, P.Have et al. Studies of manifestation of canine distemper virus infection in an urban dog populations. Veterinary Microbiology, 1993, vol. 37, № 1-2, p. 163-173.

52. Bodin S. Nagra erfarenheter av ympning mot valpsjuka med simultanympamne enlight Laidlaw-Dankin och ympamne enlight Green. Skand. Vet., 1947, vol. 37, p. 696-715.

53. Brooks R. Adverse reactions canine and feline vaccines. Australian Vet. J., 1991, vol. 68, p. 342-344.

54. Brueckner A.H. et al. Conclusions and recommendations of the symposium on canine distemper immunisation. J. Am. Vet. Med. Ass., 1966, vol. 148, p. 1400-1403.

55. Bush M., R.J.Montali, D.Brownstein et al. Vaccine-induced canine distemper in a lesser pands. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1976, vol. 169, p. 959-960.

56. Bussel R.H., Karson D.T. Canine distemper virus in ferret, dog, and bovine kidney cell cultures. Arch, ges Virusforsch., 1965, vol. 15, p. 183-202.

57. Cabasso V.J., Burckhardt R.L. Learning J.D. The use of an egg-adapted modified canine distemper virus vaccine under experimental conditions and in the field. Vet. Med., 1951, vol. 46, p.167-175.

58. Cabasso V.J., Cox H.R. Propagation of canine distemper virus on chorioalantoic membrane of embryonated hen eggs. . Proc. Soc. Exp. Biol.,1949, vol. 71, p. 246-250.

59. Cabasso V.J., J.E.Avampato, K.H.Kiser et al. Further evidence of immunologic dissimilarity of distemper (CD) and measles (M) viruses. Proc. Soc. Exp. Biol., 1960, vol. 104, p. 526-529.

60. Cabasso V.J., K.Kisser, M.R.Stebbins. Distemper and measles viruses. Lack of immunogenic crossing in dogs and chickens. Proc. Soc. Exp. Biol., 1959, vol. 101, p. 227-230.

61. Campbell J.J., S.L.Cosby, J.K.Scott et al. A comparison of measles and canine distemper virus polypeptides. J. Gener. Virology, 1980, vol. 48, p. 149-159.

62. Carmichael L.E., J.M.OIin. Immunization strategies in puppies. Why failure? Comp. Cont. Ed., 1966, vol. 5, № 12, p. 1043-1052.

63. Carpenter J.W., M.J.G.Appel, R.C.Ericson et al. Fatal vaccina-indused canine distemper virus infection in black-footed forrets. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1976, vol.169, p. 961-964.

64. Chalmers W.S.K., W.Baxendale. A comparison of canine distemper vaccine and measles vaccine for the prevention of canine distemper in young puppies. Vet. Res., 1994, vol. 135, № 8, p. 349-353.

65. Chappius G. Control of canine distemper. Veterinary Microbiology, 1995, vol.44, p. 351-358.

66. Chappius G., Terre J. Immunisation contre la Maladie de Carre et la Malladie de Rubarth. I La Serovaccination. Rec. Vet. Med., 1973, vol. 149, p. 91-94.

67. Chappius G., Terre J. Immunisation contre la Maladie de Carre et la Malladie de Rubarth. Il Installation Precoce de l'immunité. Rec. Vet. Med., 1973, vol. 149, p. 177-186.

68. Chappius G., Terre J. Immunisation contre la Maladie de Carre et la Malladie de Rubarth. IV Calendrier de vaccination. Rec. Vet. Med., 1974, vol. 150, p. 515-525.

69. Cornwell H.J.C., H.Thompson, I.Q.P.Mc Candish et al. Encephalitis in dogs associated with a bath of canine distemper vaccine. Vet. Res., 1988, vol. 122, № 3, p. 54-59.

70. Carre H. Sur la maladie des jeunes chiens. C. R. Acad. Sci., 1905, vol. 140, 689-690.

71. De Vries P., G.C.M.Fong, B.Uytdehaag et al. Canine distemper virus (CDV) immune-stimulating complexces (ISCOMS), but not measles virus iscomsprotect dogs against CDV infections. J.Gen. Virol., 1988, vol. 69, p. 20712083.

72. Dunkin G.W., P.P.Laidlow. Studies in dog distemper I. Dog distemper in the ferret. J.comp. Pat., 1926, vol. 39, p. 201-212.

73. Durchfeld B., Baumgartner W., Hebst W. et al. Vaccine associated canine distemper infection in a litter of African hanting dogs ( Lycaon pictus ). J. Vet. Med., 1990, vol.37, p. 203-212.

74. Ferry N.S. Bacillus bronchisepticus ( bronchicanis ); the cause of distemper in dogs and similar disease in other animals. Vet. J., 1912, vol. 68, p. 376391.

75. Gillespie J.H. The significance of passive immunity and the biological tests used in the study of distemper. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1966, vol. 149, p. 623-632.

76. Gillespie J.H., J.A.Baker, J.Burgher et al. The immune response of dogs to distemper virus. Cornell Vet., 1958, vol. 48. p. 103-126.

77. Glardon O., Stockli R. Staupeepidemie in der Schweiz: Epidemiologie und Impfanamnese. Schweiz. Arch. Tierheilkd., 1985, vol. 127, p. 707-716.

78. Gorham J.R. A simple technique for the inoculation of the chorioalantoic membrane of chicken embryos. Am. J. Vet. Res., 1957, vol. 18, p. 691-692.

79. Green R.G. Modification of the distemper vims. J. Amer. Vet. Med. Ass., 1939, vol. 95, p. 465-466.

80. Green R.G., F.S.Swale. Vaccination of dogs with modified distemper virus. J. Amer. Vet. Med. Assoc., 1939, vol. 95, p. 469-470.

81. Gutieres J.C., Gorham J.R. The adaptation of distemper virus to suckling mise and hamsters. Am. J. Vet. Res., 1955, vol. 16, p. 325-330.

82. Haig D.A. Canine distemper immunization with avianised virus Ondorstepoort. J.Vet. Res., 1956, vol. 27, p. 19-53.

83. Halbrooks R.D., L.J.Swango, P.R.Schnurrenberger et al. Response of gray foxes to modified live canine dictemper vaccine. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1981, vol. 179, p. 1170-1174.

84. Hansen M., Jacobsen P., Lund E. Comparative distemper vaccive titration in ferrets and minks. Nord. Vet. Med., 1973, vol. 25, p. 1-7.

85. Hansen M., Lund E. Profilactic, postinfectious and neonatal vaccination against canine distemper in mink. Nord. Vet. Med., 1976, vol. 28, p. 585591.

86. Harder T.C., M.Kenter, H.Vos et al. Canine distemper virus from diseased large felinds: biological properties and phylogenetic relationships. J. Gen. Virol., 1996, vol. 77, Part 3, p. 397-405.

87. Hathaway L.J., Partidos C.D., Vohra P. et al. Induction of systemic immune responses to measles virus syntetic peptides administered intranasally. Vaccine., 1995, vol. 13, 1495-1500.

88. Hewicker M., Damsch S., Trautwein G. Detection of canine distemper viral antigen in formalin-fixed and parafin-embedded tissue of a fitch (Mustelaputorius), using an immunoperoxidase technique. Dtsch. Tierarztl. Wschr., 1990, vol. 97, p. 85-87.

89. Johnson R. V., York C.J., Robinson V.B. et al. Immunology of canine distemper. Vet. Med. 1959, vol. 54, p. 405-412.

90. Johnson R. V., L.T.GIickman, T.J.Emerick et al. Canine distemper infection in pet dogs: 1. Surveillance in Indiana during a suspected outbreak. J. Amer. Animal Hosp. Association, 1995, vol. 31, p. 223-229.

91. Kazacos K.R., H.L.Thacker, H.L.Shivaprasad. Vaccination-induced distemper in kinkajous. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1981, vol. 179, p. 11661169.

92. Keep J.M. Immunisation against canine distemper by the modified virus method. Aust. Vet. J., 1959, vol. 35, № 4, p. 200-202.

93. Kesel M.L., Neil D.H. Combined MLV canine parvovirus vaccine: immunosupression with infective shedding. Vet. Med. Small Anim. Clin., 1983, vol.78, p. 687-691.

94. Krakowka S., R.J.Higgins, A.Koestner. Canine distemper virus: review of structural and functional modulation in lymphoid tissues. Am. J. Vet. Res., 1980, vol. 41, p. 284-292.

95. Krakowka S., Koestner A. Age-related susceptibility to infection with canine distemper virus in gnotobiotic dogs. J. Inf. Dis., 1976, vol. 134, № 6, p. 629-632.

96. Krakowka S., R.A.Mador, A.Koesten. Canine distemper virus-associated encephalitis: modifications by passive antibody administration. Acta Neuropathol., 1978, vol. 43, p. 235-241.

97. Krakowka S., Olsen R., Axthelm M.K. et al. Canine parvovirus infection potenciates canine distemper encefalitis attributable to modifed live virus vaccine. J. Am Vet. Med. Assoc., 1982, vol. 180, p. 137-139.

98. Krakowka S., R.OIsen, A.Confer et al. Serologic response to canine distemper viral antigens in gnotobiotic dogs, infected with canine distemper virus. J. Infect. Dis., 1975, vol. 132, p. 384-392.

99. Krakowka S., S.S.Ringler, M.Lewis et al. Immuno suppression by canine distemper virus: modulation of in vitro immunoglobulin synthesis, interleukin release and prostaglandin E2 production. Vet. Immunol., Immunopathol., 1987, vol. 15, p. 181-201.

100. Lavender J.F., Bewsey B.J. Immunogenicity of canine distemper virus vaccine produced in a contineous cell line ( LLC-MK2 cells). Am. J. Vet. Res., 1973, vol.34, № 9, p. 1189-1194.

101. Lo J.P., Dickson W.M., Gorham J.R. Errors in distemper virus titrations peformed in embrionated hen eggs. Arch, ges Virusforsch., 1965, vol. 15, p. 74-90.

102. Mc Cormick A.E. Canine distemper in African cape hanting dogs ( Lycaon pictus ) possibly vaccine induced. J. Zoo. Anim. Med., 1983, vol. 14, p. 66-71.

103. Mc Gowan J.P. Some observations on a laboratory epidemic, principally among dogs and cats in which the animals affected presented the symptoms of the disease called "distemper". J. Path. Bact., 1911, vol. 15, p. 372-426.

104. Mc Innes E.F., Burroughs R.E., Duncan N.M. Possible vaccine-induced distemper in a South American bush dog ( Speothos venaticus ). J. Wildlife Dis., 1992, vol.28, p. 614-617.

105. Merz D.C., Scheid A., Choppin P.W. The importance of antibodies to the fusion (F) of paramixoviruses in the prevention of spread of infection. J. Vet. Med., 1980, vol. 151, p. 275-285.

106. Montali R.J., Bartz C.R., Teare J.A. et al. Clinical trial with canine distemper vaccines in exotic animals. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1983, vol. 183, p. 1163-1167.

107. Noon K.F., M.RoquI , L.N.Binn et al. Enzyme-linker immunosorbent assay for evaluation of antibody to canine distemper virus. American Journal veterinary research, 1980, vol. 41, № 4, p. 605-609.

108. Norrby E., M.J.G.Appel, J.A.Baker. Humoral immunity to canine distemper after immunization of dogs with inactivated and live measles virus. Arch. Virol., 1980, vol. 66, p. 169-177.

109. Norrby E., G.Ueter, C.Orvell et al. Protection against canine distemper virus in dogs after immunization with isolated fusion protein. J. Virol., 1986, vol. 58, p. 536-541.

110. Orwell C., H.Sheshberadaran, E.Norrby. Preparation and characterization of monoclonal antibodies directed against four structural components of canine distemper virus. J. Gener. Virol., 1985, part 3, vol. 66, p. 443-456.

111. Ott R.L., Gorham J.R., Farrell R.F. The effect of dillution on egg-adapted distemper virus on the immune response in ferrets and dogs. Nord Am. Vet., 1957, vol. 38, №7, p. 219-222.

112. Palmer D., Ossent P., Waldvogel A., et al. Staupe-Encephalitis beim Steinmarder (Martes foina, Erxleben, 1777) in der Schweiz. Schweiz. Arch. Tierheilkd., 1983, vol. 125, p. 529-536.

113. Patronek G.J., L.T.GIickman, R.Johnson etal. Canine distemper infection in pet dogs: a case-control study of risk factors during a suspected outbreak in Indiana. J. Am. Anim. Hosp. Assoc., 1995, vol. 31, p. 230-235.

114. Phillips T.R., J.L.Jensen, M.J.Rubino et al. Effects of vaccines on the canine immune system. Can. J. Vet. Res., 1989, vol. 53, p. 154-160.

115. Piersy S.E., Sellers R.F. Antibody response to a combined living attenuated distemper-hepatitis vaccine. Res. Vet. Sci., 1960, vol. 1, p. 84.

116. Povey R.C. Distemper vaccination of dogs: factors which could cause vaccine failure. Can. Vet. J., 1986, vol. 27, p. 321-323.

117. Puntoni V. Saggio di vaccinazione anticimurosa preventiva esequita per mezzo del virus specifico. Ann. Igiene, 1923, vol. 33, p. 553.

118. Rockborn G. Viraemia and neutralizing antibodies in experimental distemper in dogs. Arch, gen Virusforsch. 1957, vol. 7, p. 168-182.

119. Rockborn G. Canine distemper virus in tissue culture. Arch, ges Virusforsch., 1958, vol. 8, p. 485-492.

120. Rockborn G. An attenuated strain of canine distemper virus in tissue culture. Nature, 1959, vol. 184, p. 822.

121. Roelke-Parker M.E., Munson L., Parker C. et al. Canine distemper virus epidemic in Serengeti lions ( Pantera Leo ). Nature., 1996, vol. 379, p. 441-445.

122. Schroeder J.P., Bordt D.E. Influence of amount of test virus on quantitative in ovo canine distemper virus neutralization test. Proc. Soc. Exp. Biol., 1962, vol. 109, p. 979-982.

123. Sheshberadaran H., E.Norrby, K.C.Mc Cullough et al. The antigenic relationship between measles, canine distemper and rinderpest viruses studied with monoclonal antibodies. J. Gener. Virol., 1986, vol. 67, p. 1381-1392.

124. Slater E.A. Metod of protection dogs at birth against canine distemper. Patent № 480.483. 1965.

125. Slater E.A. The response to measles and distemper virus in immunosupressed and normal dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1970, vol. 156, p. 1762-1766.

126. Standard Reqirements. Part 113. 1995.

127. Straw B. Decrease in platelet count after vaccination with distemper-hepatitis ( DH ) vaccine. Vet. Med., 1978, vol. 73, p. 725-726.

128. Taylor J., Pincus S., Tartaglia J. et al. Vaccinia virus recombinants expressing either the measles virus fusion or hemagglutinin glicoprotein protect dogs against canine distemper virus challenge. J. Virol., 1991, vol. 65, p. 4263-4274.

129. Terre J., Chappuis G., Precausta P. Calendrier de vaccination du chien. Rec. Vet. Med., 1978, vol, 154, p. 551-557.

130. Thomas E.D., Baker J.A., Ferrebee J.W. The effect of methotrexate on the prodaction of antibodies against attenuated distemper virus in the dog. J. Immunol. 1963, vol. 90, p. 324-328.

131. Thomas-Baker B. Vaccination-induced distemper in maned wolves, vaccination-induced corneal opacity in a maned wolf. Proc. Am. Assoc. Zoo Veterinarians, Ann. Rep., Scotsdale, Aris., 1985, p. 53.

132. Tizard I. Risks associated with use of live vaccines. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1990, vol. 196, p. 1851-1858.

133. Van Heerden J., Bainbridge N., Burroughs R.I.J, et al. Distemper-like disease and encephalitozoonosis in wild dogs ( Lycaon pictus ). J. Wildlife Dis„ 1989, vol. 25, p. 70-75.

134. Van Moll P., Alldinger S., Baumgartner W. et al. Distemper in wild carnivores: An epidemiological, histological and immunocytochemical study. Veterinary Microbiology, 1995, vol. 44, p. 193-199.

135. Varsanyi T.M., Utter G., Norrby E. Purification, morfology and antigenic characterization of measles virus envelope components. J. Gen. Virol., 1984, vol.65, p. 355-366.

136. Waner T., Naveh A., Ben Meir N.S. et al. Assessment of immunization response to canyne distemper virus vaccination in puppies using a clinic-based ensime-linked immunosorbant assay. Vet. J., 1998, vol. 155, № 2, p. 171-175.

137. Watson E.A. The use and possible effects of live virus vaccine as a means of preventing distemper on fox and mink farms. Canada. Dept. Ayr. Pull, 1939.1. СОГЛАСОВАНО:

138. УТВЕРЖДАЮ: Генеральный директор ЗАО "Научно-производственный ветеринарный и звероводческий центр" (ВЕТЗВЕРОЦЕНТР)

139. Директор Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля ./стандартизациии

140. Извещение N1 об изменении ТУ 9382-ОСг.1. В.С.Слугин9сыворотка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная)

141. Пункт 4.8.2. изложить в новой редакции: Определение титра антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).48.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы.

142. Ампулы с эритроцитарными диагностикумами осторожно встряхивают до получения однородной взвеси.

143. Вскрытые и не до конца использованные ампулы с эритроцитарными диагностикумами хранят закрытыми лейкопластырем при температуре 4-8° С в течение двух недель.

144. Ампулы, содержащие растворитель для сухих сывороток и ампулы с сухими сыворотками вскрывают, затем растворитель для сухих сывороток переносят в ампулы, содержащие сухие сыворотки.48.2.3. Проведение испытания.

145. РНГА ставят в микропанелях с и-образными лунками для микротитрования типа "Такачи", "Титратек" или изготовленных заводом "Медполимер".

146. Во все лунки микропанели вносят по 0,05 куб. см. разбавителя.

147. В первые лунки специальной петлей от наборов для микротитрования или с помощью автоматической пипетки вносят исследуемые сыворотки в количестве1. СОГЛАСОВАНО:

148. Директор Всероссийского государственного-научно-исследовательского .стандартизации ветеринарныхпрепафатовд1. А.Н.Панин 1998 г.

149. УТВЕРЖДАЮ: Генеральный директораучно-производствен-жнарный и зверо-водческ^^ентр"1ЕНТР)1. В.С.Слугин1998 г.

150. Извещение № 2 об изменении ТУ 9382-008-11472788-96гамма-глобулин (иммуноглобулин) против парвовирусного энтеритаи чумы плотоядных

151. Пункт 4.9.2. изложить в новой редакции: Определение титра антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).49.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы.

152. Из отобранных коробок по п.3.1. берут по одному флакону (ампуле) гамма-глобулина.

153. Ампулы с эритроцитарными диагностикумами осторожно встряхивают до получения однородной взвеси.

154. Вскрытые и не до конца использованные ампулы с эритроцитарными диагностикумами хранят закрытыми лейкопластырем при температуре 4-8° С в течение двух недель.

155. Ампулы, содержащие растворитель для сухих сывороток и ампулы с сухими сыворотками вскрывают, затем растворитель для сухих сывороток переносят в ампулы, содержащие сухие сыворотки.49.2.3. Проведение испытания.

156. РНГА ставят в микропанелях с и-образными лунками для микротитрования типа "Такачи", "Титратек" или изготовленных заводом "Медполимер".

157. Во все лунки микропанели вносят по 0,05 куб. см. разбавителя.

158. Затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 куб.см. взвеси специфического вируса чумы плотоядных эритроцитарного диагностикума, а во второй ряд по

Информация о работе

Елаков, Александр Леонидович
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.06

Диссертация

Разработка метода контроля антигенной активности вакцин против чумы плотоядных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы