Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства и диагностика коронавирусного энтерита собак

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства и диагностика коронавирусного энтерита собак"

? МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

УДК 619:578.834.1.636.7

ОЛЬШАНСКАЯ Алиса Алексеевна

Биологические свойства и диагностика коронавирусного энтерита собак

03.00.06 г вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Научный руководитель:

Доктор ветеринарных наук В. И. Уласов

Официальные оппоненты:

- заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук,

профессор? в. А. Сергеев

- кандидат ветеринарных наук,

доцент В. А. Есепеиок (МВД)

Ведущая организация - Всероссийский научно-исслея вательский институт охотничьего хозяйства и зверовс им. проф.Б.М.Жидкова (601601 Г.Киров, ул.Энгельса, 1

Защита диссертации состоится " " ип^я 1997 г. в 1&"часов на заседании Специализированного совета Д 1Z(T85.01.

при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

Просим принять участие в работе совета или выслать Ваш отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ВГНКИ.

Автореферат разослан

ыая 19S>7 г.

Ученый секретарь специализированного совета.

кандидат ветеринарных наук

¡оэырев

3

I

Актуальность темы.

В общей патологии заболеваний соСак энтеровирус-ные инфекции щенков продолжают занимать ведущее место. В России из-за сложности дифференциальной диагностики такие заболевания чаще объединяют под названием "парвовирусный энтерит". Вместе с тем распространенная практика профилактической обработки против парвовирусного энтерита с использованием отечественных й импортных биопрепаратов дает основание полагать, что в этиологии массовых диарей щенков собак имеются различия.

Симптомы проявления инфекционных болезней на практике часто имеют "стертый" характер, что затрудняет их правильную дифференциацию. Поэтому возрастает роль лабораторных' методов диагностики инфекционных болезней.

За рубежом широкое распространение у собак имеет коронавирусный энтерит, возбудитель был впервые выделен в США в 1971 году из кала взрослой немецкой овчарки. Заболевание наступает через 3-7 дней после инфицирования. Волезнь характеризуется профузным-поносом, дегидратацией, общей интбксикацией, приводящих к гибели животных.

Вирус вьщеляетсй с калом в течение 15-16 дней, наиболее интенсивно - на 5-7-й день болезни. У выживших щенят развивается иммунитет, в крови появляются антитела ( Binn L.N. :et.al.,1974; Keeman et.al.,1976).

\ В нашей стране коронавирусная инфекция собак пока еще ни кем не изучена,-хотя массовые диареи у щенков в первые месяцы жизни имеют место, как в ведомствен-

ных питомниках, так и среди собак находящихся в личном владении граждан.

Таким образом, несмотря на широкое распространение болезни, она остается не изученной, чем и вызвана необходимость исследования биологических свойств коронавируса собак, поиска оптимального метода идентификации возбудителя и создания диагностического набора.

По настоянию руководителей ветелужОы ряда ведомств в плановую тематику научно-исследовательской работы ВГНКИ была включена тема по изучению биологических свойств коронавируса собак.

Цель работы. Получить штаммы коронавируса собак и изучить основные свойства вируса, особенности клинического проявления болезни, разработать средства лабораторной диагностики.

Задачи исследования:

1. Изучить клинику и паталогоанатомические изменения при коронавирусной инфекции собак, выяснить некоторые эпизоотические данные.

2. Изучить некоторые биологические й физико-химические свойства полученных изолятов коронавируса.

3. Испытать диагностику коронавируса собак методом иммунофлуоресцентного анализа для практического применения.

Научная новизна. Впервые в отечественной практике от собак выделен и характеризован штамм "Карат" коронавируса собак.

Предложен режим лиофилиэациии и хранения штамма. Разработан способ получения активных и специфических диагностических сывороток к возбудителю коронавирус-иого энтерита собак.

Изучена возможность применения для диагностики инфекции люминесцентного метода, электронной и имму-ноэлэктронной микроскопии, реакции нейтрализации в культуре клеток.

Подана заявка на авторское свидетельство на штамм "Карат" коронавируса собак. Государственный регистрационный номер 96108623/13 от 29.04.1996 г.

Практическая цогшость. На основании проведенной работы выделен и депонирован в коллекцию микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского, института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов штамм мКарат" возбудителя коронавирусного энтерита собак. Справка о депонировании датирована на 7.07.1994 г. № 29 ДЕП.

Разработаны рекомендации по люминесцентной диагностике коронавирусной" инфекции собак. НТД одобрена 29.04.1996 научно-методической комиссией по вирусным инфекциям ВГНКИ ветпрепаратов и утверждена директором института 6.06.1996.

Апробация работы.

Материалы исследований доложены и обсуждены: 1.На методических комиссиях ВГНКИ по препаратам, применяемым в вирусологии в 1995 и 1996 годах.

2.Конференция «Актуальные проблемы болезней мелких домашних животных» г. Ленинград 1995 г..

3. Конференция « Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней с.х. животных и птиц», посвященная 50-летию Краснодарской НИВС 1996 г.

Публикации.

По результатам исследований опубликовано 4 статьи.

Получено положительное решение на выдачу патента РФ.

ОО-тьем и структура работы.

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы содержит 107 источников, из них 17 отечественных и 90 зарубежных авторов. Работа содержит 10 таблиц и 9 рисунков. ' '■ .

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И ШТОДЫ.

Исследования выполнены в период 1992-1997 г.г в лаборатории контроля и стандартизации препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ. Клинические наблюдения и анализ заболеваемости собак проведен в условиях ветстанций и ветеринарной лаборатории г. Москвы, а также в ряде ведомственных питомниках для собак.

При исследованиях использовали:

- штамм «Карат» возбудителя коронавирусного энтерита собак ( изолированного А. А. Ольшанской, В. И. Ула-совым и Е. Д. Захаровой в 1993 году из тонкого отдела кишечника щенка собаки, породы немецкая овчарка, в возрасте 4-х месяцев). Штамм «прошел» 15 пассажей в культуре клеток CRFK;

- коммерческий набор для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней;

- положительную сыворотку к возбудителю коронавирусного перитонита кошек, полученную от доктора J.Chappius (Франция).

По данным ветеринарных отчетов из года в год в городе снижается количество и степень проявления чумы плотоядных и инфекционного гепатита, но возрастают болезни, протекающие с явлениями поражения кишечного тракта - свыше.54% от общего количества зарегистрированных случаев заболеваний, которые из-за сложности дифференциальной диагностики часто определяют под термином "парвоаирусный энтерит".

Благодаря разработкам, выполненным в ВГНКИ, ВНИИ-ИВВиМ'и НПО "Нарвак", в последние годы для профилактики болезней собак практически повсеместно применяются моно- и ассоциированные вакцины, содержащие в своем составе парвовирусный компонент.

Чувствительность штамма вируса изучали в экспериментах с использованием культур клеток: почки щенка собаки (ШЦ), почки эмбриона свиньи (ПЭС) и их субкультуры, клеток куриных эмбрионов (ККЭ), клетки эмбриона перепела (КЭП), тестикул бычка (ТВ), перевиваемой линии клеток почки собаки (МДСК), перевиваемой -линии клеток почки кошки(CRFK), перевиваемой ли-

нии клеток подкожной опухоли собаки А-72,перевиваемой линии клеток подкожной опухоли собаки СС-81, перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки "Vero".

Чувствительность культуры клеток к вирусу определяли по цитопатическому эффекту. Инфекционную активность вируса устанавливали методом титрования на культуре клеток CRFK. Плашки с инфицированной культурой помещали при 37°С, в условиях СОг инкубатора. Титр инфекционности рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в ТЦДзо/ыл.

Устойчивость вируса к хлороформу определяли по методу Мауг и Bogel (1981), pH - среды по методу Мауг (1977).

В процессе исследований использовали .собаки разных пород в возрасте от 3 до 6 месяцев, кроликов породы шиншилла массой 1,5-2,5 кг; морских свинок массой 250-300 г; белых мышей массой 10-12 г. Исследовали патологического материала от павших собак с клиникой вирусного энтерита. Исследовано 153 сыворотки крови собак. .

Гемагглютинирущую активность выделенного штамма возбудителя коронавирусного энтерита собак изучали в РГА при различных значениях pH и температуры с 1% эритроцитами морской свинки, крысы, кролика и свиньи.

Патогенность штамма определяли в опытах на белых мышах, морских свинках, -кроликах и сойаках разного возраста и иммунного статуса.

Элактродлел микроскопия проведена совместно с ведук.им научном сотрудником'лаборатории инструмен-

тальных'методов контроля и лиофилизацйи ВГНКИ Ю.И. Могильным. Вируссодержащую суспензию подвергали исследованию на электронном микроскопе JEM 100 СХ методом негативного контрастирования.

Гипериммунную сыворотку к коронавирусу собак получали на кроликах массой 2,5-3,0 кг по отработанной схеме, путем гипериммунйзации концентрированным ко-ронавирусом собак;.штаммом «Карат». Сыворотку крови получали методом.отстоя, через 2 недели после завершения цикла гипериммуниэации. Для определения титра вируснейтрализующих антител к коронавирусу собак а сыворотке крови использовали реакцию нейтрализации в культуре клеток CRFK.

Опыты по■йзученйю антигенного родстпа возбудителя коронавируса собак с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней осуществляли с помощью коммерческого набора для диагностики ТГЭ в реакции непрямой гем-маглютинации совместно со старшим научным сотрудником, к.в.н. .И.П.Скворцовой.

Для изготовления люминесцентной диагностической сыворотки использовали полученную нами кроличью сыворотку, обладающую специфической активностью с -титром 1:64-1:128. . •

Приготовление люминесцентной сыворотки к коронавирусу собак проводили в лаборатории К.Л.Шиханиной Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН РСФСР по существующей там технологии.

Полученные люминесцентные сыворотки имели еле-

I

дующие показатели: белок 15 мг/мл, метка 3 мг/мл.

При анализе и обобщении результатов исследований делали статистическую обработку по общепринятым в биологии методам. В качестве доверительного интервала был выбран уровень вероятности Р-0,95 (уровень значимости р- 0,05) . Учет совпадений результатов, чувствительности и специфичности .диагностических методов проводили по методу ГеасЫ1с1 (1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ некоторых эпизоотических данных

По данным ветеринарной отчетов из года в год в Москве снижается количество и степень проявления чумы плотоядных и инфекционного гепатита, но возрастают болезни, протекающие с явлениями поражения кишечного тракта - свыше 54% от общего количества зарегистрированных случаев заболеваний, которые из-за сложности дифференциальной диагностики, часто определяют термином "парвовирусный энтерит".

Наибольшее количество заболеваний приходится на щенков в возрасте до года.

Для уточнения истинных причин возникновения диарей нами, при активном участии ряда практических ветеринарных специалистов города, была собрана 71 проба клинического и паталогоанатомического материала от собак (тонкий и толстый отдел кишечника, лимфатические узлы брыжейки кишечника, содержимое кишечника) . По анамнестическим данным, наблюдаемые собаки были ранее иммунизированы отечественными и импортными вакцинами против парвовируса собак и содержали в сыворотке крови специфические тормозящие гемагглютинацию антитела в титре не ниже 1:64,

Полученные результаты дают основания полагать, что этиология инфекционных энтеритов у собак более многообразна и одной из причин острых диарей может являеться коронавирус.

Выделение и идентификация коронавируса собак.

. Штамм «Карат» возбудителя коронавирусного энтерита собак был выделен из ткани тонкого отдела кишечника 4-х месячного щенка собаки, имеющей следующие клинические признаки: рвота, угнетенное состояние, диарея, дегидратация. С этой целью гомогенат кишечника, после специальной обработки, вносили на сформированный монослой культуры клеток СЯГК. Цитопати-ческое действие в этой культуре проявлялось на 3 сутки и характеризовалось округлением и увеличением эпителиоподобных клеток, а фибробластоподобные клетки удлинялись и образовывали своеобразные тяжи. Монослой принимал вид узорчатого кружева. На пятые сутки после заражения клетки полностью отделялись от стекла. . ,

Совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории инструментальных методов исследования Ю.А. Могильным, методом негативного контрастирования, проводили электронно-микроскопические исследования культуральной вируссодержащей жидкости на уровне 5 пассажа, полученной на культуре клеток СКИС.

В результате электронно-микроскопического исследования были обнаружены частицы, схожие по морфологическим признакам .с коронавйрусом. Частицы имели сферическую форму, диаметр их колебался от 90 до 120 нм. Поверхность частиц была покрыта выступами.

\г

образующими подобие солнечной короны, длина их составляла 15-20 нм.

Проведенные опыты показали, что выделенный нами изолят коронавируса соОак не обладает гемагглютини-рукадими свойствами.

Изолятом, прошедшим,5 пассажей в культуре клеток СйПС, заразили 7 беспородных шенков собак в, возрасте до 5 месяцев (алиментарным путем в объеме 3 см3, активность вируса составляла б, 5 1д ТЦДао/мл) • Два контрольных щенка получили таким же методом по 3 см3 незараженной клеточной суспензии. На третьи сутки у щенков первой группы отмечали угнетенное состояние, учащенную дефекацию, фекалии были жидкой консистенции. При исследовании морфологического состава крови животных, не наблюдали существенных изменений количества форменных элементов крови (эритроциты 6,5-7,3 млн./мл, лейкоцита 9,0-10,5 тыс./мл). Температура тела оставалась в пределах нормы (38,6-39,7°С). На 6-7-е сутки три щенка пали с признаками диареи, При вскрытии у них отмечали обезвоживание организма, слизистая оболочка тонкого отдела кишечника была утолщена, гиперемирована, с. точечными кровоизлияниями и участками некроза, селезенка увеличена.

Гомогенат, полученный из тонкого отдела кишечника, был внесен в моноелойную культуру клеток СИЕК, и в течение 3 пассажей наблюдали ЦПД в виде округления элителиоподобных клеток, и удлинения фибробластопо-добных.

Щенки контрольный группы в течение 14 дней оставались клинически здоровыми.

Полученные данные свидетельствуют о том, что выделенный возбудитель патогенен для щенков собак и вызывает заболевание, по клиническим, паталогоана-томическим признакам и характеру размножения в культуре клеток сходен с возбудителем коронавирусного энтерита.

Культуральныа свойства. При выборе чувствительной клеточной системы исследовали 10 видов первичных и перевиваемых культур клеток.

На сформированный клеточный монослой вносили вирус с активностью 1д 6,5 ТЦЦ 50/мп в дозе 0,1 ТЦД5о/ш! на клетку и после одного часа контакта при 37° С добавляли поддерживающую среду. Культивирование продолжали при•температуре 37-37,5" С в течение 7 суток и зараженную культуру ежедневно просматривали под микроскопом. Размножение коронавируса собак в культуре клеток ПЩ, .МДСК, СЯГК, А-72 и СС-81 сопровождалось характерным цитопатическим эффектом.

Накопление вируса в чувствительных тест-культурах клеток после пятого пассажа составляло от 5,5 1д ТЦЦ 50/мл до 6,5 1д ТЦЦ'50/мл.

Данные этих опытов свидетельствуют, что выделенный возбудитель размножается в первичной культуре клетрк почки щенка, перевиваемых линиях клеток МДСК и СИГК и не размножается в культуре клеток почки эмбриона свиньи, что характерно для коронавируса собак. Наиболее высокое накопление вируса ( 6,5 1д ТЦЦ 50/мл) отмечали в перевиваемой культуре клеток

Размножение коронавируса совах в клеточных культурах

ТаОл.№ 1.

N п/п Наименование :Срок появ-! культуры клеток: ления ЦПЭ : (сутки) : Степень выраженности ЦПЭ : Титр инфекционной активности : (19)

1. CRFK 3 +++ 6,5 + 0,25 ТЦД50/МЛ

2. А-72 5 +++ 6,0 + 0,5 ТЩЬо,т

3. МДСК 4 +++ 6,5 + 0,25 ТЦЦ;,о/ип

4. ПЩ(первичная культура) 7 +++ 5,75 + 0,5 ТЦД5о/«

5. ГОД(суй. Культура) 7 +++ 5,5 + 0,25 ТЦЦ5о/-л

6. ПЭС — — »

7. ККЭ ___

8. КПЗ ___ •

9. ТВ ___

10. Vero — —— —

n=4 х+т

Возможность лиофилиэации вируса была проверена с наиболее распространенными защитными средами: средой ВГНКИ № 3, обезжиренным молоком и сорОит-желатозной средой. Среды готовили на фосфатном буфере с рН •* 7,0. Стабилизирующие среды смешивали с вируссодержа-щей суспензией в соотношении 1:1.

Из изученых нами сред лучшей защитной средой для лиофилизации и хранения коронавируса собак является среда высушивания ВГНКИ № 3. Инфекционная активность после сушки с этой средой снижалась только на 1 1д и в течение 12 месяцев хранения активность вируса ос-' тавалась стабильной.

Сушка со средами № 2 и о приводила к снижению активности вируса на 1,75-1,51д, а хранение в течение 12 месяцев снижало активность еще на 2-2,51д.

Хранение культуральной вирусной суспензии при температуре -40°С является оптимальной и вирус сохраняет свойства 12 месяцев.

Изучение действия физико-химических факторов. При изучении влияния химических средств инактивации в вирусную суспензию коронавируса собак с исходной активностью 6,5 1д Т1Щ50/ил вносили 1%-й формалин. Флаконы с вируссодержащей суспензией выдерживали при 37°С 2, 4, 24 и 48 ч. В пробах с вирусом спустя 2 часа инфекционная активность снижалась на 2,5-3 1д, а через 4 часа происходила полная инактивация вируса.

В результате проведенных исследований установлено, что при воздействии формалином на штамм «Карат», последний : теряет способность вызывать цитопатиче-ское действие в культуре клеток.

Коронавирус.собак является кислотоустойчивым вирусом' и. сохраняет свою инфекционную активность в среде с рН 7,0-5,0. Активность вируса значительно снижалась при рН 3,0-3,5. После 24 часов хранения вируса в среде срН 3,0 при 4°С потеря вирусной ин-фекционности составила 3 1д ТЦД5ол»п<

Инфекционная активность вируса при 56°С снижалась на 2 1д ТЦД5о/кя через 30 минут. Через 60 минут вирус полностью инактивировался.

При 37° С инфекционная активность полностью исчезала на 12 сутки, а при 4°С вирус сохранялся в течение 4 месяцев.

Инфекционная активность культурального вируса при низких температурах сохранялась значительно дольше. Так, при -4°С она сохранялась в течение 9 месяцев, а вирус хранившийся при -40°С, вызывал специфические изменения в культуре клеток спустя 2 года (срок наблюдения),

Антигенное родство.

Из литературных источников известно об антигенном родстве коронавируса человека, коронавируса собак, вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и инфекционного перитонита кошек, вызываемым коронавиру-сом.

Полученные нами иммунные сыворотки крови от лабораторных животных на выделенный штамм "Карат" изучали в РИГА с помощью коммерческого "Набора для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней" в перекрестной реакции.

Близкое антигенное родство.коронавируса собак и вируса трансмиссивного энтерита свиней дает возможность определять уровень титров специфических антител в сыворотках крови экспериментально зараженных коронавирусом собак лабораторных животных в РИГА с диагностикумом на ТГЭ. Контролем этой оценки служила реакция нейтрализации, проведенная с этими сыворотками в культуре клеток СВГК. Результаты этих исследований представлены в таблице № 2. Результаты проведенного опыта позволяют сделать вывод, что коронавирус собак и вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней антигеннородственны.

Результаты РИГА и РН а сыворотками крови лабораторных животных

Таблица № 2.

Сыворотка РИГА РН

кроликов 1:2-1:4 1:32-1:128 1:2 1:32-1:64

нормальная гипериммунная

морских свинок 1:2-1:4 1:8-1:128 1:2 1:32-1:64

нормальная гипериммунная

белых мышей 0 о •

щенков собак 1:2-1:32 1:512-1:2048 1:2-1:16 1:256-1:512

нормальная гипериммунная

При постановке реакции нейтрализации исследуемого штамма коронавируса собак с гипериммунными сыворотками к возбудителю чумы плотоядных, инфекционного гепатита плотоядных и парвовирусного энтерита пло-' тоядных получен отрицательный результат.

Патогенные и антигенные свойства коронавируса собак, штамма «Карат» изучали при экспериментальном заражении различными методами белых мышей, морских свинок и кроликов.

С этой целью применяли культуральный коронавирус собак в титре 6,5 1д ТЦД 50/мл.

За инфицированными животными наблюдения проводились в течение 24 дней.

Кровь для исследования у животных брали до введения, а также на 7, 14, и 21 день. Присутствие в сыворотках крови специфических антител определяли в

и

реакции нейтрализации и в РИГА с коммерческим диаг-ностикумом к ТГЭ свиней.

У зараженных кроликов в ответ на введение штамма вируса не отмечено изменений в физиологическом состоянии. Наиболее высокие титры (до 1:32-1:64) специфических антител в сыворотках крови кроликов после заражения коронавирусом собак обнаружены на 21 сутки при внутривенном и внутрибрюшинном введении вируса.

■ При исследовании сывороток крови морских свинок на 14 и 21 сутки обнаружены антитела в пределах 1:16-1:32 в реакции нейтрализации и в РИГА.

Белые мыши при различных способах введения вируса оказались нечувствительными к возбудителю КВС. Введение вируса не вызывало у них образования антител в крови.

Таким образом, введение коронавируса собак не вызвало клинического проявления заболевания у использованных в опытах кроликов и мышей. У морских свинок после;внутрибрюшинной иньекции возбудителя отмечали угнетенное состояние и гибель части животных.

С целью воспроизведения болезни и изучения патогенных свойств коронавируса собак для естественно восприимчивых животных использовали 12 беспородных щенков собак в возрасте 2-3 месяцев. Животные были разделены на 3 равнозначные группы и заражены вирусом внутрибрюшинно в объеме 3 см3 . Щенков первой группы заражали вирусом с инфекционной активностью . 10"6'5 ТЦД50/ЫЛ, второй 10"5'5 ТЦДэо/ил и третьей: 10"*'5 ТЦДзо/ыл. • Двум контрольным щенкам аналогичного возраста тем же способом и в том же Объеме вводили сре-

ду Игла, не содержащую вирус. Наблюдение за щенками проводили в течение 3 недель. На третьи сутки после заражения у щенков 1 и 2 группы наблюдалось угнетенное состояние, учащенная дефекация, фекалии жидкой консистенции. На 7 сутки пали три щенка ( два щенка из группы, получившей вирус 10е'5 ТЩЬоли, и один щенок, зараженный вирусом 105'5 ТЩЬо/ид ), с признаками тяжелой формы диареи. При вскрытии у павших животных отмечено обезвоживание, воспалительные изменения тонкого отдела кишечника. Слизистая оболочка кишечника утолщена, гиперемирована, с точечными кровоизлияниями и участками некроза. У оставшихся в живых щенков в каждой опытной группе к 12 суткам исчезли клинические признаки болезни.

Щенки контрольной группы оставались клинически здоровыми весь период наблюдения.

Антитела к 'коронавирусу собак в сыворотке крови, определенные в РИГА, появились уже на третьи сутки после экспериментального заражения в титре 1:321:64. Максимальный титр антител наблюдали у собак "на 21 день после заражения - 1:1024 в РИГА и 1:2561:2048 в реакции нейтрализации. Полученные данные свидетельствуют о высоком уровне накопления антител к коронавирусу сабак у экспериментально зараженных животных.

Факт заболевания и гибели животных от коронави-русного энтерита был подтвержден результатами исследований :клинического материала {кал, содержимое кишечника, фрагменты тонкого и толстого отделов кишечника) с помощью электронного микроскопа , а также

методом выделения вируса в культуре клеток почки собаки и СЯГК.

Для изучения циркуляции специфических антител к возбудителю коронавирусного энтерита Гтроведено исследование в реакции нейтрализации сывороток крови 52 собак; при этом 20 проб были взяты от собак частных владельцев, вторую группу составили сыворотки крови от собак, отловленных в городе. Специфические айтитела были обнаружены у 5 из 20 собак первой группы и ' у 14 из 32 у второй группы. Титры антител колебались от 1:4 до 1:512.

Лабораторная диагностика коронааируоа собак.

Получение гилериммуннкх сывороток.

Гипериммунную сыворотку к штамму «Карат» получали от кроликов, используя комбинированный способ введения антигена. Сыворотки с• активностью 1:128 в РН получены при трехкратном введении концентрированного вируса с равным количеством полного адыбванта Фрейн-да при первом введении.

При испытании на специфичность эти сыворотки не были активными со штаммами вируса чумы плотоядных в РН, с аденовирусами - в, РДП,: с парвовирусами - в РТГА. ' '

Следующим этапом работы было изучение сроков сохранения активности полученной сыворотки. Их консервировали 5% раствором карболовой кислоты,, внося ее в соотношении 1:10, а также лиофмлиэировали. Хранили при температуре + 4"С и - 20°С.

Установили, что образцы сыворотки, консервированные карболовой кислотой, в течение 12 месяцев хранения при 4°С снизили свою активность на 2 1д, а титр

а

образцов лиофилиэированной сыворотки оставался без изменения.

Приготовление люминесцентной диагностической сыворотки , ,

Этот этап работы был проведен совместно с сотрудниками лаборатории, возглавляемой профессором К.П.Шиханиной, Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалея АМН РФ.

В работе использовали краситель изоци'нат флюоресци-на. Соединение красителя с иммунными белками осуществляли в смеси следующего состава: 2% глобулинов, 15$ 0,5 М свежеприготовленного раствора бикарбоната натрия рН 8,8 и 2,5% красителя к общему количеству белка.

По окончанию коныогации часть флюорохрома оставалась не связанным с белками. Избыток красителя приводил к снижению специфичности свечения готовых препаратов. Очистку коньюгатов от свободного красителя производили с помощью сефадекса и ионнообменных смол.

Полученную таким образом флюоресцирующую сыворотку разливали в стерильные флаконы и хранили в холодильнике при - 20° С.-При разработке условий получения специфического свечения антигена, обработанного лю-минесцируадей сывороткой, было проведено специальное исследование по выбору методики фиксации препаратов.

Из веществ применяемых для фиксации препаратов ( смесь абсолютного этилового спирта с ледяной уксусной кислотой в соотношении. 9:1 ,, ацетоном, метиловым спиртом и фиксация нагреванием ) наилучшие результа-

>

ты Сьши получены с метанолом и охлажденным до -20° ацетоном при экспозиции 15 минут.

Окрашивающий титр флюоресцирующих коньюгатов был равен 1:2-1:4. • Чтобы установить специфичность свечения антигена коронавируса собак, обработанного люминесцирующей сывороткой были проведены контроли, которые мы считаем весьма показательными, а именно: обработка препаратов с парвовирусом собак, с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), коронавирусом телят, вирусом чумы плотоядных, вирусом болезни Ауе-ски, аденовирусом плотоядных, а также мазков-отпечатков тканей органов от здоровых животных люми-несцирующими антителами к коронавирусу собак.

Данные этого опыта представлены в таблице № 3, При окрашивании коныогагом препаратов с коронавирусом собак в поле зрения наблюдали"изумрудно-зеленое свечение, окрашивание препарата с коронавирусом собак флюоресцирующей нормальной сывороткой свечения не дало. Обработка препаратов с вирусом чумы плотоядных, парвовирусом собак, вирусом болезни Ауески и аденовирусом плотоядных не приводила к свечению.антигенов этих вирусов. . >,

Препараты с вирусом ТГЭ и коронавирусом телят, просматриваемые под люминесцентным микроскопом, имели свечение, но болеа слабое по срааягм^е со свечением препаратов, содержащих коронавирус собак. Эти два вируса антигенно родственны коронавирусу собак и люминесцентное свечение препаратов подтверждает это.

»

Интенсивность свсчеяи» ютягемп, обработжныт люминеецнрумхчей сывороткой ккоромааарусу собак

Таблица Л 9

Исследуемис вкруси Количество исследуемых препарат* Интенсивность саеченм Отсутствие свечеяя* пр обработке нормальной флюоресцирующей сыаоротеой

++++ 1 ++ 1 .

Короижвирзп собак штамм "Карат" 12 9 3 0 12

X Парвовирус собак штамм "Чин* 4 - 4 4

3. Вирус ТГЭС 4 4 0 4

4. Корошкирус телят ппамм "КП-83" 4 а > 4

5. Вирус чумы плотоялшл штамм "Береговое'* 4 4 4

6. Вирус болезни Ауе-ска пггамм "Арский" 4 4 4

7. Аяеповврус шгатоад-т штамм "Ада* 4 - - 4 4

8. Препараты от здоровых животных 10 10 10

Опыты показали, что полученная люминесцирущая сыворотка к коронавирусу собак явилась специфической и не содержала свободного красителя.

Метод флюоресцирующих антител к коронавирусу собак был применен для: ;

- изучения локализации вирусного антигена в клетке на уровне световой микроскопии;

- изучения динамики накопления коронавируса собак в зараженной клетке.

Для приготовления препарата использовали суб.культуру клеток почки щенка собаки(ПЩ), трипси-низированную по общепринятой методике.

Было установлено, что через 24 часа после инфицирования в культуре клеток наблюдали округлые, отрос-чатые, хорошо.распластанные на стекле клетки с се-

ровато-зеленоватой цитоплазмой и ядром со слабо светящимися ядрышками. В пораженных клетках отмечали яркое свечение отдельных мелких гранул в цитоплазме вблизи ядра. Клетки Сыпи распластаны на стекле, ци-топатический эффект отсутствовал, а спустя 48 часов после заражения клетки становились веретеновидными и в цитоплазме -вокруг ядра йаблюдали более интенсивное свечение. Клеточное ядро хорошо просматривалось, но не флуоресцировало. Через 12 часа после заражения, при 50% поражении клеточного монослоя, клетки становились сильно вытянутыми, отделялись от стекла и имели яркую флюоресценцию всей клеточной цитоплазмы. В контрольной культуре клеток ПЩ Ш. наблюдали слабое зеленоватое свечение всей клетки, с более интенсивным свечением ядрышек.

Люминесцентный метод исследования зараженных клеток позволил установить, что репродукция вируса происходит в цитоплазме клетки, а это характерно для РНК-содержащйх вирусов, к которым относится корона-вирус собак.

Установлено, что ухе через 24 часа послё заражения коронавирус усиленно репродуцируемся в цитоплазме зараженной клетки и может быть визуально обнаружен при помощи флуоресцентного метода диагностики.

В процессе исследования биологических свойств ко-ронавируса собак, были использованы такие методы его идентификации, как электронная микроскопия, выделение в чувствительных культурах клеток и метод флуоресцирующих антител.

Методами электронной микроскопии, выделения вируса в культурах клеток почки щенка, перевиваемой

линии клеток СЯГК и методом флуоресцирующих антител бьши исследованы 40 образцов патматериала, полученные от собак с клиникой коронавирусного энтерита и давшие отрицательный результат при исследовании на

г

наличие парвовируса. Патматериал от больных.щенков, проявивших выраженные клинические признаки болезни после заражения их штаммом "Карат", служил контрольным.

Наряду с иммунофлуоресцентным методом выявления вируса проводилась работа по изучению- возможности выделения вируса в культуре клеток.

С помощью флюоресцирующих антител нами было диагностировано 11 случаев заболевания коронавирусом собак в питомнике служебного собаководства "Красная звезда" и собак частных владельцев.

Все электронномикроскопические исследования патматериала от с'обак проводили совместно с Ю.И.Могильным, применяя метод негативного контрастирования. Коронавирусные частицы были обнаружены только в 4 пробах.

Попытки выделения коронавируса собак в культурах клеток из патматериала не всегда были успешны, так как данный вирус очень трудно адаптируется к культуре клеток. . ■ '

Таким образом, применение меченых сывороток является более быстрым и точным методом индикации антигена коронавируса собак в тканевой культуре и в исследуемом материале. Иммунофлуоресцентным метод, по нашему мнению, можно использовать для изучения патогенеза коронавируса собак, так как он ппляется

достаточно точным и по эффективности превосходит вирусологический. '

ВЫВОДЫ

1. Впервые в нашей стране у щенков соОак установлено заболевание с клиническими признаками диареи, вызываемое.коронавирусом.

2. От больного щенка в перевиваемой культуре клеток СЕШ< выделен штамм «Карат» возбудителя коронави-русного- энтерита собак, который под электронным микроскопом имеет вид сферической частицы диаметром 90-120 нм.

3. Штамм «Карат» коронавируса собак« размножается в чувствительных эпителиальных культурах клеток кошачьего и собачьего происхождения, с проявлением ци-топатического эффекта. Вирус не вызывает агглютинацию эритроцитов свиньи, барана, морской свинки и крысы.

4. Штамм «Карат» коронавируса собак имеет антигенное родство с вирусами трансмиссивного гастроэнтерита свиней и коронавирусом телят.

5. Штамм коронавируса собак сохраняет 'инфекционную активность при температуре -20'с в течение двух лет, при 4°С - в течение 4 месяцев, при 37°с - в течение 12 суток. Оптимальной защитной средой для лиофилиза-ции коронавируса собак является среда ВГИКИ № 3.

6. Экспериментальное воспроизведение болезни у щенков собак возможно при внутрибрюшинном и оральном способе заражения интактных щенков коронавирусом собак.

7. Кролики, морские свинки и белые мыши не чувствительны к коронавирусу собак. В сыворотке крови кроликов и морских свинок после введения вируса на 21 ■ сутки образуются специфические антитела в титре 1:16-1:128.

8. Трехкратная иммунизация кроликов концентрированным вирусом в сочетании с равным объемом полного адъюванта Фрейнда позволяет получить специфические и активные диагностические сыворотки к возбудителю ко-ронавирусного энтерита собак.

9. Разработан метод получения флуоресцирующих имму-

• ноглобулинов, включающий получение концентрированного коронавируса, трехкратную иммунизацию кроликов с применением адъюванта Фрейнда, выделение глобулиновой фракции из сыворотки и ее метки изо-цианом флуоресцина.

10. Метод флуоресцирующих антител'выявляет антиген коронавируса в цитоплазме зараженных клеток первичной культуры почки щенка, а также в клетках слизистой оболочки кишечника.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Дана биологическая характеристика штамма «Карат» . коронавируса собак,' депонированного в коллекцию микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов МСХ и ПРФ. Справка о депонировании датирована от 7.07.1994 г. № 29 ДЕП.

2. Материалы проведенных исследований оформлены в ?1'де заявки на получение патента Российской Федора-

цйи «Штамм Coronavirus canine, используемый для контроля иммуно'генной активности вакцин и получения сывороток для лечения и диагностики коронавирусной

решение - государственный регистрационный номер 96108623/13 от 29.04.1996 г.

3. Разработаны рассмотрены и одобрены методической комиссией по препаратам против вирусных инфекций ВГНКИ 29.04.1996 г. ^Методические рекомендации для люминесцентного метода диагностики коронавирусной инфекции собак» и утверждены директором института 6.06.1996 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ольшанская A.A., Уласов В.И., Могильный Ю.И., Захарова Е.Д.- «Изучение .коронавируса собак».

Ж. «Ветеринария», К» 6, 1995, С.57-59.

2. Ольшанская A.A., Уласов В.И., Могильный Ю.И., Захарова Е.Д:., Посабцева Я.А. «Культуральные " свойства коронавируса собак». Сборник научных трудов ВГНКИ, т. 57, 1995, С.20-28. "

3. Ольшанская А,А.Уласов В.И., Захарова Е.Д. Изучение коронавирусного энтерита собак. Материалы конференции «Актуальные проблемы болезней мелких домашних животных» г.Санкт-Петербург 1995 г. С.32-36.

4. Ольшанская A.A., Уласов В.И., Захарова Е.Д. Коронавирусный энтерит собак. Материалы конференции «Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению'болезней с.х. животных и птиц» посвященная 50-летию Краснодарской

инфекции собак». Из ВНИИГПЭ получено -положительное

НИВС 1996 г. С.27.