Разработка иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота

Филиппов, Сергей Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота"

На правах рукописи

Филиппов Сергей Юрьевич.

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО НАБОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ПАРАГРИППА - 3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА.

03.00.23 - биотехнология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Шелково - 2004 г.

На правахрукописи

Филиппов Сергей Юрьевич.

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Дмитрий Павлович Кузнецов

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Василий Иванович Белоусов.

кандидат биологических наук Иджат Фаисрахманович Муртазин

Ведущее учреждение—Всероссийский научно-исследовательский институт

экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.,

Защита состоится 26 марта 2004 года в 12 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г. Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан 25 февраля 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук КХД. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

В связи с сохранением в нашей стране животноводческих хозяйств, остается' актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации животных часто проявляются у молодняка. Парагрипп — 3 (ПГ-3) - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней телят при промышленном животноводстве. Изучение ПГ-3 крупного рогатого скота (КРС) в течение последнего времени показало актуальность данной проблемы.

Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы, как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако, ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов, метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа,

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченных пе-роксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов G, М и А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам животных, они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина, меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Быстрый и точный диагноз парагриппа-3 крупного рогатого скота является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора на основе аффинно-очищенных и концентрированных антигенов вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», для использования их в качестве компонента набора при серологической иммуноферментной диагностике ПГ-3 КРС посредством определения уровня антител в крови больных и переболевших животных.

Решались следующие задачи

1.2.1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного антигена вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80.

1.2.2. Выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС антисывротки на кроликах, выделить анти-IgG КРС антитела и синтезировать анти-IgG КРС иммунопе-роксидазный коньюгат.

1.2.3. Выделить поверхностные белки вируса ПГ-3, изучить их состав в электрофорезе и активность в иммуноблотинге, иммобилизовать их в качества ли* ганда на BrCN сефарозу.

1.2.4. На полученном сорбенте выделить специфические к антигенам ПГ-3 антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN сефарозу.

1.2.5. Разработать компоненты иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа — 3 крупного рогатого скота на основе аффинно-очищеных антигенов вируса ПГ-3.

1.2.6. Провести сравнительную оценку определения уровня анти-ПГ-3 антител в РН, РИГА и с помощью разработанного иммуноферментного Набора.

1.3, Научная новизна.

- В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения очищенных и концентрированных антигенов вируса ПГ-3 КРС, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ПГ-3 IgG Сефарозе.

- При изучении в электрофорезе белков вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, выявлено 8 структурных гликопротеинов с молекулярной массой от 14 до 180 кД.

- По результатам иммуноблотинга показано, что 8 белков вируса ПГ-3, которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, индуцируют выработку анти-ПГ-3 антител в организме восприичивых животных.

- разработана технология изготовления иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа — 3 крупного рогатого скота на основе аффинно очищеных антигенов вируса ПГ-3, штамм «ЗКСМ».

1.4. Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований позволили разработать инструкцию по изготовлению иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота и проект нормативной документации. Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-ПГ-3 антител в сыворотках крови КРС

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа-3 позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.

1.5. Апробацияработы.

Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2002 - 2004г.г.), на международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии Производства, биопрепаратов, Щелково (2002 г), на одинадцатом Московском международном ветеринарном конгрессе, г. Москва (2003 г.).

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

1.8. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалу и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список литературы, содержащий 72 отечественных и 151 зарубежный источников и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 22 рисунками и 1 схемой.

Автор выражает глубокую благодарность академику РАСХН, А.Я. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и исследований.

профессору проведении

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы Работа выполнена во ВНИТИБП в 2002 -2004 гг. в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской федерации на 2000 -2004г.

В работе использовали:

Вирус парагриппа-3 КРС, штамм «ЗКСМ», репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки теленка — ПТ-80, в первично-трипсинизированных культурах клеток легкого (ЛЭК) и трахеи (ТЭК) эмбриона коровы (на уровне 30-го субпассажа) и куриных эмбрионов (ККЭ) (1-й субпассаж).

Питательные среды: среда Игла, 199, ГЛАХ (институт полиомиелита, г.Москва); сыворотка КРС для культуральных работ (ООО Фуро), фетальная сыворотка коров (ООО Фуро).

Животные: белые мыши массой 18-20 г, крысы массой 250 - 400г, морские свинки, кролики массой 2,5 - 3,0 кг. Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.

Дезинтеграцию клеточной суспензии ПТ-80 осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование вируса ПГ-3 КРС проводили осаждением ПЭГ с различной молекулярной массой и в различных концентрациях, высаливанием сульфатом аммония в различных концентрациях, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием при различных скоростях и продолжительности.

В работе по предварительной очистке вируса ПГ-3 КРС от клеточных белков использовали ультрацентрифугирование в линейном градиенте сахарозы и

Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом ПГ-3 КРС клетки ПТ-80.

Титр инфекционности вируса определяли по ТЦД50/МЛ на культуре клеток ПТ-80 в 24-луночных микропланшетах для культуральных работ. Результаты оценивали по цитопатическому действию через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Ашмарина И.П.

Титр гемагглютинирующей активности определяли по методу Крюкова Н.Н. с оценкой реакции по общепринятой крестовой системе. За титр гемагглю-тинации принимали высшее разведение вируссодержащей суспензии, агглютинирующей эритроциты (на +). В качестве контроля использовали среду ГЛАХ.

Белки вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ» отщепляли путем обработки ви-рус-содержащей суспензии Тритоном Х-100.

Общий белок определяли по методу Лоури и на спектрофотометре СФ-26. Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

Вируснейтрализующую активность сывороток и анти-ПГ-3 антител определяли в реакции вируснейтрализации на 96-ти луночных микропланшетах по методу Florent G.

Электрофорез в ДСН - ПААГ проводили по методу Лаэмли.

Электроперенос белков после окончания электрофореза в ДСН - ПААГ осуществляли по методике Тоубина.

Иммуноиндикацию белков на нитроцеллюлозных мембранах проводили в непрямом методе ИФА.

Электронную микроскопию препаратов вируса ИРТ КРС проводили методом просвечивающей микроскопии с использованием электронного микроскопа JEM-100 В при ускоряющем напряжении 80КV И инструментальных увеличениях от 40 до 100 тысяч раз.

Гипериммунные антисыворотки к IgG КРС получали по методу разработанному в лаборатории иммунологии и утвержденному на методическом совете ВНИТИБП.

Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из цельной сыворотки КРС высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата 8

гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Трисакрил-М.

Очистку анти-IgG проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на BrCN-Сефарозу 4В очищенными иммуноглобулинами.

Контроль чистоты препаратов IgG осуществляли с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ).

Однородность и специфичность препаратов IgG проверяли с помощью им-муноэлектрофореза.

Для получения коньюгатов анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена использовали перийодатный метод Nakane P. При проверке активности коньюгатов использовали метод прямого твердофазного ИФА. Рабочее разведение коньюгата определяла согласно временной инструкции по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, утвержденной Главбио-промом Агропрома СССР в 1986г. Реакцию учитывали на автоматическом спектрофотометре.

В работе использовали стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микропланшетах по Engvall и др., а также метод конкурентного ИФА по Van Weemen и др. Результаты анализа учитывали визуально и фотометрически через 10-15 минут после внесения субстратного раствора.

Результаты исследований обрабатывали статистически по таблицам Фишера и Стьюдента.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Очистка и концентрирование вируса ПГ-3КРС.

Вирус парагриппа-3, штамм «ЗКСМ» репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка - ПТ-80, в первично-трипсинизированных культурах клеток легкого (ЛЭК) и трахеи (ТЭК) эмбриона коровы (на уровне 30-го субпассажа) и куриных эмбрионов (ККЭ) (1-й субпассаж).

Клетки выращивали на культуральной среде содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гентамицина на литр среды.

После образования монослоя клеток инокулировали вирус ПГ-3, штамм «ЗКСМ» в течение часа при 37 °С из расчета 1-2 ТЦЦ50 на клетку. Репродукцию вируса проводили в бессывороточной среде ГЛАХ, содержащей 40 единиц гентамицина на литр среды.

После проявления 80% ЦПД клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием и клеточный детрит осаждали центрифугированием.

Надосадочную вирус-содеожащую среду исследовали на инфекционную и гемагглютинирующую активность. Вирус, выращенный в перевиваемой культуре ПТ-80, проявлялся в реакции ГА в титрах 1:64 — 1:128, обладал инфекционностью на уровне 6,8 - 8,0 ^ ТЦ50/мл Во всех проведенных экспериментах он по всем показателям превосходил вирус, репродуцированный в монослое ЛЭК, ТЭК и ККЭ. Однако величины этих различий от опыта к опыту были не однозначными и варьировали в значительном диапазоне.

В образцах перевиваемой культуры клеток ПТ-80, инфицированных дозой 1—2 ТЦД50/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ПГ-3 КРС было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодер-жащих суспензий.

Для концентрирования вируса ПГ-3 КРС были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ). Был испытан ПЭГ с различным молекулярной массой: 3000, 6000 и 20 000 дальтон в концентрации 5.0, 7.5 и 10,0%.

При концентрировании вируса ПГ-3 КРС ПЭГ очистка вируса достигает 88,1 - 97,9%. Потеря вируса равна 36,9 - 84,2%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 дальтон.

Для концентрирования вируса ПГ-3 КРС также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат ам-10

мония. До 80% вируса ПГ-3 КРС осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 10 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 91,6%.

В вирусологических исследованиях для концентрирования вирусов все более широкое применение находит метод ультрафильтрации. Принцип метода основан на отделении вируса от культуральной жидкости с помощью полупроницаемых мембран с определенной степенью пористости.,

Концентрирование вируссодержащей суспензии проводили с использованием ядерных фильтров, изготовленных в лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна). О кратности концентрирования судили по накоплению фильтрата в мерном сосуде на выходе из ячейки.

В препаратах культурального вируса ПГ-3 КРС до и после концентрирования определяли титр инфекционной активности, общий белок и агглютинирующую активность. Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты вируса ПГ-3 КРС в 10 - 50 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на ядерных фильтрах является снижение в концентрате количества общего белка. При концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 -50 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса снижается на 85,0 - 87,4%. При концентрировании препарата в 10 раз потерь вируса не наблюдалось, с повышением кратности концентрирования до 50 раз потеря вируса составляла 20,4%.

Биологическая активность препарата вируса ПГ-3 КРС по мере концентрирования ультрафильтрацией достоверно увеличивается: В РГА с 1:64 в исходной суспензии при 50 - кратном концентрировании до 1:516.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования ядерных фильтров для концентрирования вируса ПГ-3 КРС и перспективности дальнейших исследований в этом направлении.

Наряду с концентрированием вируса ПГ-3 КРС вышеописанными методами испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали при 100 000g в течение 1, 2, 3, 4 и 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование позволяет практически полностью

без потерь осадить вирус ПГ-3 КРС из вируссодержащей суспензии. Очистка при этом достигает 97,5 - 98,6%.

Для изучения возможности очистки вируса ПГ-3 КРС осаждением в градиенте сахарозы концентрированный и частично очищенный вирус ПГ-3 КРС центрифугировали при l00000g в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1 мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр гемагглютинирующей активности и титр в ИФА. Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы с выходом до 63,08% вируса. Одновременно происходит очистка вируса ПГ-3 КРС на 97,1%.

Определение плавучей плотности вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на «подушке» сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. Вирус локализуется в интерфазе между 45% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты) через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 88,4% (3,2мг/мл белка в исходном препарате и 1,9мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 6 - 7раз. Выход вируса составил 55,4%.

Таким образом, ультрацентрифугирование вируса ПГ-3 КРС в градиенте плотности 15% - 55% и на «подушке» сахарозы позволяет получить высокоочи-щенный и концентрированный препарат вируса ПГ-3 КРС.

Была также определена плавучая плотность вируса ПГ-3 КРС в линейном 10 - 40% градиенте Фиколл - 400. Вирус ПГ-3 КРС концентрировался в двух зонах, соответствующих 19% и 29% Фиколла-400 с плотностью 1,065 и 1,098г/см3 соответственно, так как в этих зонах отмечены наивысшие титры инфекционности вируса, его гемагглютинирующей активности и активности в ИФА.

Фракции, содержащие вирус ПГ-3 КРС, объединяли. Степень очистки определяли по титру инфекционности вируса на количество общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен в 156 раз, потери составили 49%.

Таким образом, в линейном 10% - 40% градиенте плотности Фиколла-400 вирус ПГ-3 КРС штамм «ЗКСМ», располагался в двух зонах и имел плавучую плотность 1,065 и 1,098г/см3, соответственно.

Анализ результатов электронно-микроскопических исследований и сопоставление их с вирусологическими данными, показывает, что высокие и стабильные показатели биологической активности вируса, репродуцированного в перевиваемой культуре ПТ-80, обусловлены прохождением вирионами полного цикла морфогенеза и образованием ультраструктур (пепломеров), ответственных за ге-магглютинирующую, инфекционную и в значительной мере антителообразую-щую активности.

В образцах перевиваемой культуры ПТ-80, инфицированных дозой 1—2 ТЦД50/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования. По мере снижения заражающей дозы первые вирусные частицы обнаруживаются в пробах, полученных спустя 72 и даже 144 ч после инфицирования.

Следует отметить, что количество вирионов с пепломерами, являющимися морфологическими структурами, содержащими гемагтлютинин и нейраминидазу, возрастает по мере снижения дозы заражения и удлинения сроков культивирования.

Таким образом, получены препараты вируса ПГ-3, которые использовались для изучения белков вируса, отщепляющихся при обработке последнего Тритоном Х-100, обладающих антигенной активностью, с целью синтеза иммуносор-бента для аффинного выделения анти-ПГ-3 антител из сывороток естественно переболевших животных.

Биологические свойства вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота.

Были определены оптимальные условия постановки РГА для определения гемагглютинирующей активности вируса: реакция идет при использовании фор-малинизированных эритроцитов КРС в концентрации 0,5% в натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,3, при температуре +4°С в течение 2 - 4 ч.

При определении условий хранения вируса ПГ-3 КРС его помещали в условия температуры -50°, -20°, -7°, +4°, +20° и +37°С. Вирус хранится в условиях теМ-

пературы от +4° до -50°С практически без снижения титра инфекционности в течение 1 месяца. При дальнейшем хранении вируса происходит снижение титра инфекционности на 1 ^ ТЦДЮ/МЛ практически ежемесячно.

В течение первых суток титр инфекционности вируса ПГ-3 КРС снижается с 6,5 до 5,5 ^ в условиям температуры +20° и до 4,5 ^ - при +37°С. Далее при температуре +37°С титр инфекционности снижается до 0 через 5 суток и до 2,25 ^ при +20°С.

Тест-система иммуноферментного анализа для определения уровня антител к парагриппу-3 крупногорогатого скота

Для выявления специфических антител к вирусу ПГ-3 КРС в сыворотках животных нами получен коньюгат анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена.

Для получения коньюгата анти-IgG-KPC с пероксидазой из хрена необходимо наличие чистых препаратов IgG КРС.

Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из цельной сыворотки КРС высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Трисакрил-М.

Контроль чистоты препаратов IgG проводили с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ) в слабощелочной среде. О чистоте препарата свидетельствовало наличие одной полосы, располагающейся ближе к катодной части столбика.

Однородность и специфичность препаратов IgG проверяли в иммуноэлек-трофорезе. На специфичность препарата указывало наличие одной дуги преципитации, характерной для IgG.

Гипериммунную анти-IgG- КРС сыворотку крови получали от кроликов массой 2,5 - 3,0 кг, приобретенных из благополучного по инфекционным болезням хозяйства и прошедших 12-дневный карантин. В качестве антигена использовали IgG - из сыворотки крови КРС.

Преципитирующую активность антисыворотки определяли по Оухтерлони. За титр преципитирующей активности препарата принимали последнее разведе-14

ние, дающее видимую полосу преципитации в геле. Полученный нами препарат давал полосу преципитации в разведении 1:64 - 1:128 и выше.

Специфическую активность полученной антисыворотки определяли в им-муноэлектрофорезе.

Очистку анти-IgG проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на BгCN-Сефарозу очищенными иммуноглобулинами КРС.

Для получения коньюгатов анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена использовали модифицированный периодатный метод Nakane.

Рабочее разведение полученного конъюгата определяли в прямом твердофазном ИФА титрованием с гомологичным (IgG КРС) и гетерологичным (IgG кролика) иммуноглобулинами, адсорбированными в лунках полистерольных микроплат.

В рабочем разведении величина ОП450 в реакции с гомологичным иммуноглобулином составила 1,5, с гетерологичным - 0,02 оптические единицы.

После определения рабочего разведения коньюгата его лиофильно высушивали со стабилизатором (Декстран Т-70) в 10мл флаконах из расчета последующего разведения до рабочей концентрации в 10мл.

Антиген для иммуноферментного определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота

Кроме очищенного и концентрированного вируса из вируссодержащей суспензии, имеющей в ИФА титр от 1:640 до 1:2560, антиген выделяли из инфицированной вирусом ПГ-3 КРС культуры клеток ПТ-80. Вируссодержащую суспензию из 50 флаконов Ру (200 мл) центрифугировали при 2,5 - 3,0 тыс. g в течение 10 -15 минут для сбора инфицированных вирусом клеток. Затем клетки ресуспенди-ровали в 1/100 первоначального объема, т.е. в 100 мл буферного физиологического раствора, рН 7,3 - 7,4 и обрабатывали ультразвуком на частоте 22 кГц при плотности 2-3 ватт/мл импульсивно 6 раз по 10 сек. Далее обработанную ультразвуком вирусную суспензию центрифугировали при 10 тыс. g в течение 10-15

минут, осадок отбрасывали, надосадок использовали в качестве вируссодержащей суспензии.

Выделение антигенов вируса ПГ-3 из вируссодержащих суспензий.

Для изучения поверхностных: гликопротеинов вируса, ПГ-3 очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию обрабатывали 1% Тритоном X-100 и инкубировали при +20°С в течение 60 минут на шейкере. Затем нуклеокап-сид и неразрушенные вирусные частицы осаждали центрифугированием при 100 тыс. g в течение четырех часов, а белки из надосадка концентрировали ультрафильтрацией на мембране пределом исключения 3 кД до концентрации 500 мгк/мл. Далее белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ. Тритоном Х-Ю0 отщеплялись 8 белков с молекулярной массой (ММ) 180, 89, 83, 66, 55, 43, 39 и 14 кД).

Вирусные белки, индуцирующие выработку анти-ПГ-3 антител у восприимчивых к ИРТ КРС животных, определялись посредством иммуноблотинга с индикацией белков 1 непрямым методом ИФА, В качестве анти-ПГ-3 антисыворотки использовали сыворотку от переболевших животных в разведении 1:50 (титр в непрямом ИФА 1:25600). Иммуноглобулины КРС выявляли антивидовым иммуно-пероксидазным коньюгатом. У переболевших животныхвырабатываются антитела к 8 (ММ 180, 89, 83, 66, 55, 43, 39 и 14 кД) белкам.

Таким образом, в составе вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», выявлено 8 белков, отщепляющихся при обработке Тритоном Х-Ю0 с ММ от 14 до 180 кД. Восемь белков индуцировали выработку анти-ПГ-3 антител у восприимчивых к 1111-3 животных.

Концентрированные ультрафильтрацией белки вируса ПГ-3, отщепленные Тритоном Х-100 были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения анти-ПГ-3 антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки анти-ПГ-3 сразу переводили с помощью гель-

хроматографии на Сефадексе в-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000g в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные анти-ПГ-3 пришивали к активированной БгСК-Сефарозе 4В в количестве 6мг белка на 1мл геля, согласно инструкции производителя.

После заполнения "колонки анти-ПГ-3 иммуносорбентом его трижды промывали 0,1М глицин-НС1 и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вирус-содержащую суспензию, обработанную 1% Тритоном Х-100, в режиме замкнутого реактора в течение ночи при +4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-305, и пятью объемами ЗФР'элюи-ровали вирусные белки 0,Ш глицин. НС1, рН 2,0. Элюат немедленно нейтрализовали 1М №ОН. Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5 - 50мкл из собираемой фракции для количественного анализа по Лаэмли. Фракции содержащие белок объединяли и концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения ЗкД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удалось выделить 8 гликопротеинов вируса ПГ-3 КРС с ММ от 14 до 180 кД практически без примесей.

Специфичность аффинно очищенных гликопротеинов определяли в имму-ноблотинге с анти-ПГ-3 сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ. Все 8 гликопротеинов (ММ от 14 до 180 кД) сохранили свою антигенную активность после аффинной очистки на иммуносорбентах с анти-ПГ-3 ^в.

Таким образом была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса парагриппа-3 КРС из вирус-содержащих суспензий, использование ко-

торой позволило практически без потерь выделять поверхностные белки вируса ПГ-3.

Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота

С целью оптимизации процесса постановки реакции, для увеличения точности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, необходимо подобрать концентрации используемых реагентов. Для определения оптимальной концентрации аффинно очищенного антигена при постановке ИФА его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1:100.

Постановку непрямого ИФА проводили по следующей схеме. Двукратные разведения антигена, начиная с концентрации 50 мкг/мл в объеме ЮОмкл, адсорбировали в лунках полистирольных микропланшет в течение 18 ч при +4°С, после чего микропланшеты пятикратно промывали ФБР, содержащем 0,1% Тритона X-305, рН 7,2 - 7,4, и вносили по ЮОмкл положительной и отрицательной сыворотки в разведении 1:100. Микропланшеты помещали в термостат на 1 ч при +37°С и промывали, как описано выше. На следующей стадии микропланшеты обрабатывали антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом в объеме ЮОмкл на лунку. Затем микропланшеты промывали. Реакцию проявляли субстратным раствором о-фенилендиамина 10 минут и учитывали после остановки 1М серной кислотой по показаниям ОП490 на считывающем устройстве "Sigma".

Оптимальное разведение антигена составило 1 мкг/мл, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности (ОП490 равен 1,8 - 1,6) и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками.

Для определения пороговой чувствительности ИФА исследовали зависимость величины ОП490 продукта реакции от разведения сыворотки. Опыт проводили при оптимальной концентрации сорбированного антигена вируса. Двукратные разведения положительной сыворотки начинали с разведения 1:50. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 (более чем в 2 раза) наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:100. При разведении

ниже 1:50 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции.

Таким образом, была определена концентрация антигена вируса ПГ-3 и положительной сыворотки, которые могут быть использованы для иммунофермент-ного определения уровня антител к вирусу парагриппа— 3 крупного рогатого скота.

Определение уровня анти-ПГ-3 антител в сыворотке КРС методом иммуноферментного анализа.

Методом ИФА было исследовано 767 сывороток КРС, полученных из различных хозяйств, и определены благополучные и неблагополучные хозяйства.

Из всех исследованных сывороток произвольно взяли 107 с установленным титром в ИФА и исследовали в реакции вируснейтрализации и непрямой гемагг лютинации.

Сравнительные исследования 107 сывороток КРС в ИФА и в РН показали; что 93 образца, которые имели в реакции нейтрализации титр антител 1:4 и выше, давали в ИФА значение ОГЦ490 (при разведении сывороток 1:100) выше 0,4. Кроме того, 14 отрицательных в реакции вируснейтрализации сывороток имели в ИФА небольшие положительные значения (ОП490 0,32-0,3 8).

Исследование дисперсии результатов титрования сывороток двумя методами показывает выраженную корреляцию между титрами, полученными в ИФА и РН. Коэффициент корреляции между методами высок: г = 0.94 + 0,06, Р< 0,01.

Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РИГА. 28 сывороток отрицательных в РНГА (т.е. 26,2%) были положительны в ИФА. Коэффициент корреляции равен: г = 0,86, Р< 0,01. Обе методики ставятся без использования культуры клеток, быстры и позволяют исследовать большое количество сывороток. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность, чем РНГА и возможность инструментального учета результатов. Титры, полученные в ИФА в 10 - 20 раз выше, чем в РНГА.

Таким образом, при сравнительной оценке уровня анти-ПГ-3 антител, полученных различными методами (РИГА, РН и ИФА), установлено, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокий коэффициент корреляции (г = 0,94) с результатами РН, чувствителен, быстр в исполнениии и может быть использован при определении уровня анти ПГ-3 антител при обследовании большого количества животных.

Иммуноферментный, набор для определения уровня антител к вирусу парагриппа — 3 крупного рогатого скота.

В результате проведенных исследований были получены компоненты для проведения ИФА, при определении уровня антител к вирусу парагриппа— 3 крупного рогатого скота, определены условия постановки реакции. Проведенная работа позволила создать набор для серологической диагностики этого заболевания.

Набор предназначен для иммуноферментного определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота путем постановки твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и для массового серологического обследования поголовья крупного рогатого скота на наличие антител к вирусу ПГ-3.

Сущность иммуноферментной реакции заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина меченного ферментом, способным вызвать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Набор представляет собой комплект биологических и химических компонентов, использующихся при постановке реакции, и полистироловой 96-луночной микропанели, сенсибилизированной аффинно очищенным антигеном вируса ПГ-3, положительной и отрицательной контрольными сыворотками.

Биологические компоненты: № 1. Микропланшеты для постановки ИФА, сенсибилизированные антигеном вируса ПГ-3, положительной (лунки С1, Б1) и отрицательной (лунки А1, Б1) анти-ПГ-3 контрольными сыворотками КРС, 2 шт.

№2. Иммунопероксидазный анти-^О КРС коньюгат, объем I см3 2 амп. (флакон)

Химические компоненты: №3.20 кратный концентрат инкубационного буфера, объем 20 см3,2фл. №4.5 кратный концентрат субстратного буфера, объем 5 см3, 1 фл. №5. Ортофенилендиамин (ОФД), 2фл. №6. Гидроперит (Н2О2), 2 табл.

На основании проведенной работы была разработана и утверждена «Временная инструкция по изготовлению иммуноферментнного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота.

Назначение разработки - создание технологии изготовления наборов.

Отзывы о Наборе положительные. Поступили просьбы о необходимости промышленного производства наборов и обеспечение ими потребностей ветеринарных служб.

"Иммуноферментный набор для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота" предназначен для серологической диагностики указанного заболевания и эпизоотологического обследования поголовья в племенных и пользовательных хозяйствах при организации оздоровительных в отношении ПГ-3 КРС мероприятий в ветеринарных лабораториях республиканского и областного масштаба, на пунктах пограничного ветеринарного контроля для проведения проверки импортируемых животных Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания. Набор может быть предложен для экспорта в страны со стационарным неблагополучием скота по ПГ-3 крупного рогатого скота.

Внедрение в практику набора для иммуноферментной диагностики этого заболевания и эпизоотологического обследования поголовья в племенных и поль-зовательных хозяйствах позволит повысить эффективность диагностики и в комплексе мер, будет способствовать оздоровлению хозяйств от парагриппа-3 круп-

ного рогатого скота, обеспечению эпизоотологического благополучия, улучшению качества продукции.

Экономический эффект от применения наборов для диагностики парагрип-па-3 крупного рогатого скота составит 120 тыс. рублей на тысячу исследований (в ценах 2004г).

Выводы.

1. Разработан метод очистки и концентрирования вируса ПГ-3 КРС, штамм

«ЗКСМ», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, позволяющий получить препараты с титром инфекционности вируса выше, чем в исходной суспензии на 2,0 - 2,5 ^ ТЦД50/ил

2. При изучении состава белков вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», полученных при обработке вирус-содержащей суспензии Тритоном Х-100 выявлено 8 структурных белков с ММ от 14 до 180 кД. По результатам иммунобло-тинга все восемь белков индуцируют выработку анти-ПГ-3 антител в организме восприимчивых к ПГ-3 животных.

3. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов вируса ПГ-3 КРС из вирус-содержащих суспензий с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ПГ-3 ^О Сефарозе 4В.

4. На основе очищенных и концентрированных препаратов разработаны компоненты диагностикума для определения уровня анти-ПГ-3 антител в сыворотках больных, переболевших и вакцинированных животных в иммуно-ферментном анализе.

5. При сравнительной оценке различных методов определения уровня анти-ПГ-3 антител установлено, что в ИФА и РНГА, коэффициент корреляции равен 0,86, в ИФА и РН - 0.94. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность и возможность инструментального учета результатов. Метод ИФА может применяться при исследовании большого количества сывороток.

6. Разработана технология изготовления иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота

на основе аффинно очищенного антигена вируса ПГ-3 КРС, штамм

«ЗКСМ».

7. Практические предложения.

На основе проведенной работы представлена нормативная документация:

«Временная инструкция по изготовлению и контролю иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота на основе аффинно очищеных антигенов вируса ПГ-3, штамм «ЗКСМ»» утверждена директором ВНИТИБП.

Проект технических условий на «иммуноферментный набор для определения уровня антител к вирусу парагриппа — 3 крупного рогатого скота»,

Проект «Временного наставления по применению иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота»,

Списокработ, опубликованных по теме диссертации

1. Филиппов С.Ю., Матвеева И.Н., Еремина И.О., Кузнецов Д.П. // Репродукция вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в первичных культурах клеток почки теленка и куриных эмбрионов // Материалы одинадцатого Московского международного ветеринарного конгресса, 2003, с.с. 248-249.

2. Филиппов СЮ:, Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П. // Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 крупного рогатого скота. // Матариалы международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства биопрепаратов», Щелково, 2002, с.с. 39-41.

3. Филиппов С.Ю., Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П. // Изучение репродукции вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в первично-трипсинизированной культуре клеток почки теленка // Матариалы международной. конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства биопрепаратов», Щелково, 2002, с.с. 36-38.

Отпечатано в ООО "Мещера" г Щелково, Московской обл Пролетарский проспект, 11 Зак №011, тир 100 экз

t *m ч3 9 6 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филиппов, Сергей Юрьевич

1. Введение

2. Обзор литературы.

2.1. Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота

2.1.1. Общаа характеристика парамиксовирусов

2.1.2. Парагрипп-3 крупного рогатого скота

2.2. Антигенная вариабельность вируса ПГ-3 КРС

2.3. Иммунный ответ на заражение вирусом ПГ-3 КРС

2.4. Морфология вируса парагриппа

2.5. Химический состав вируса ПГ-3 КРС

2.6. Антигенное родство парамиксовирусов и идентичность аминокислотных сиквенсов

2.7. Антигенное родство парамиксовирусов и идентичность нуклеотидных сиквенсов

2.8. Биологические свойства штаммов вируса ПГ-3 КРС и влияние на них физических и химических факторов

2.8.1. Инфекциопность и гемагглютинирующая активность

2.9. Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 КРС и его структурных компонентов 28 <- ~<

2.10. Лабораторная диагностика ПГ-3-3 КРС

2.11. Профилактика парагриппа-3 и перспективы лечения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота"

1.1. Актуальность темы.

Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

В связи с сохранением в нашей стране животноводческих хозяйств, остается актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации животных часто проявляются у молодняка. Парагрипп — 3 (ПГ-3) - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней телят при промышленном животноводстве. Изучение ПГ-3 крупного рогатого скота (КРС) в течение последнего времени показало актуальность данной проблемы.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов, метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пероксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов в, М и А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам животных они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

1.2. Цели и задачи исследования.

Решались следующие задачи'.

1.2.2. Выделить КРС, получить анти-^С КРС антисывротки на кроликах, выделить анти-^О КРС антитела и синтезировать анти-^в КРС иммунопероксидазный коньюгат.

1.2.3. Выделить поверхностные белки вируса ПГ-3, изучить их состав в электрофорезе и активность в иммуноблотинге, иммобилизовать их в качестве лиганда на ВгСЫ сефарозу.

1.2.4. На полученном сорбенте выделить специфические к антигенам ПГ-3 антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на ВгСЫ сефарозу.

1.2.5. Разработать компоненты иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота на основе аффинно-очищеных антигенов вируса ПГ-3.

1.3. Научная новизна.

1.4. Практическая значимость работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Филиппов, Сергей Юрьевич

6. Выводы.

6.1. Разработан метод очистки и концентрирования вируса ПГ-3 КРС, % штамм «ЗКСМ», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, позволяющий получить препараты с титром инфекциоппости вируса выше, чем в исходной суспензии на 2,0 - 2,5 lg ТЩ^о/мл

6.2. При изучении состава белков вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», полученных при обработке вирус-содержащей суспензии Тритоном X-100 выявлено 8 структурных белков с ММ от 14 до 180 кД. По

• результатам иммуноблотинга все восемь белков индуцируют выработку анти-ПГ-3 антител в организме восприимчивых к ПГ-3 животных.

6.3. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов вируса ПГ-3 КРС из вирус-содержащих суспензий с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ПГ-3 IgG Сефарозе 4В.

6.4. На основе очищенных и концентрированных препаратов разработаны компоненты диагностикума для определения уровня анти-ПГ-3 антител в сыворотках больных, переболевших и вакцинированных животных в иммуноферментном анализе.

6.5. При сравнительной оценке различных методов определения уровня анти-ПГ-3 антител установлено, что в ИФА и РНГА, коэффициент корреляции равен 0,86, в ИФА и РН - 0.94. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность и возможность инструментального учета результатов. Метод ИФА может применяться при исследовании большого количества сывороток.

6.6. Разработана технология изготовления иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота на основе аффинно очищенного антигена вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ».

7. Практические предложения.

На основе проведенной работы представлена нормативная документация:

Временная инструкция по изготовлению и контролю иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота на основе аффинно очищеных антигенов вируса ПГ-3, штамм «ЗКСМ»» утверждена директором ВНИТИБП.

Проект технических условий на «иммуноферментный набор для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота»,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филиппов, Сергей Юрьевич, Щёлково

1. Авилов B.C., Мникова JI.A., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. // Иммуноферментный анализ // Ветеринария, 1981, 8, 33-35.

2. Авророва Р.И. // Усовершенствование и применение реакции пассивной гемагглютинации в практике лабораторных исследований при гриппе.// Авторефератдис. канд. мед. наук. М. 1967.

3. Амирбеков М., Юров К.П., Караваев Ю.Д., Степанова С.И., Махмадшоев А. // Опыт профилактики парагриппа-3 и хламидиоза ягнят. // Ветеринария 1992. - №1 - С.34-36.

4. Бейлли Н. // Статистические методы в вирусологии. // М.: Медицина -1962-С.29-31.

5. Белоусова Р.В., Литвинов О.Б., Колесникова Л.М., Резова Т.И. // Эффективность двух инактивированных вакцин против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. // Проблемы ветеринарной биологии (Сборник научных трудов) М. 1984 - С.20-23.

6. Березин В.Э., Воркунова Г.К., Мацевич Г.Р., Зайдес В.М., Маренникова С.С., Букуринская А.Г. // Применением метода имууного («вестерн») блотинга для изучения вирусных антигенов и выявления антител к вирусным белкам. // Вопр.вирусол., 1987, 3, 317-323.

7. Бродянский Ю.М. Реакция связывания комплемента. // В кн.: Иммунологическая диагностика вирусных инфекций (под ред. Перадзе Т.В., Халонена П.) М.: Медицина - 1985 - С.77-97.

8. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная биология парамиксовирусов.//М. Медицина- 1978.

9. Бурцева И.А. // Идентификация вирусов по гемагглютинирующим свойствам. // Сельское хозяйство Республики Саха (Якутия), Новосибирск. 1993 (1994) - С. 136-138.

10. Васильев A.B., Акбкева Л.М. // Использование реакции непрямой гемагглютинации в вирусологических исследованиях. // Проблемы ветеринарной биологии (Сборник научных трудов) М. 1984 - С.33-36.

11. Васильева Г.А., Зотин В.В. // Усовершенствованная микромодификация реакции торможения гемагглютинации при эпидермическом паротите. //В. кн.: Острые вирусные инфекции у детей.-Л. 1981-С. 119-123.

12. Вечеров А.Е., Лисицын В.В., Прохватилова Л.Б., Аянот П.К. // Сравнительный анализ вариабельной области гена HN различных штаммов и изолятов вируса парагриппа-3 КРС. // Достижения молодых ученых в ветеринарную практику, Владимир. - 2001. - С.91-97.

13. Гайданович С.Я., Клисенко Г.А., Шаноян Н.К., Обухов В.Р., Мельникова Е.Э. // Реакция непрямой гемагглютинации с вирусами группы КГЛ Конго. // Вопросы вирусологии. - 1974 - №6 - С.705-708.

14. Гладченко Н.Р. // Экспериментальное изучение биологических свойств вакцинного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота. // Автореферат дис. канд. вет. наук. 1985.

15. Гомбосурэн Г. // Цитопатогенное действие вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальног о вируса в культурах клеток из различных органов и тканей ягненка и плода овцы. // Бюллетень ВИЭВ. 1991. -Вып. 75-76.-С. 124-127.

16. Грязин В.Н. // Диагностика некоторых вирусных инфекций крупного рогатого скота в Новосибирской области. // Лекция. Новосибирский аграрный университет. Новосибирск. 1992. - С. 29-36.

17. Гуненков В.В., Сюрин В.Н. // Биологические свойства вируса парагриппа крупного рогатого скота. // Сельское хозяйство за рубежом. 1968. -ЖЗ-С.33-36

18. Гуненков В.В., Сюрин В.Н. // Малоизвестные вирусные инфекции крупного рогатого скота. // Лекция 7. Парагрипп крупного рогатого скота. МВА. Москва. 1972.

19. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. // Вирусные и хламидиозные респираторные и кишечные инфекции крупного рогатого скота. // Итоги науки и техники (Животноводство и ветеринария). -1975-Т.8-С.8-121.

20. Дьяконов Л.П. и Ситьков.В.И. // Животная клетка в культуре. // М.: Компания Спутник 2000.

21. Елисеев А.К. // Инфекционная активность вируса парагриппа-3 в процессе хранения при различных температурах. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии (тезисы докладов научно-практической конференции молодых ученых). Владимир. 1990. -С.41-42.

22. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. // Лабораторные животные: разведение, содержание, использование в эксперименте. // Киев: Вища школа 1983 - С.223-243.

23. Зеленый И.В. // Аллергическая диагностика при парагриппе-3 телят. // Автореферат дисс. канд. вет. наук. -М.: 1992.

24. Зелютков Ю.Г., Красочко П. А. // Получение эритроцитарного диагностикума вирусной диареи крупного рогатого скота. // Изв. АН БССР. Сер. с.-х. наук 1990 - Т.1 - С. 113-116.

25. Зелютков Ю.Г., Севрюк И.З. // Использование РИГА в диагностике рота и коронавирусной инфекции телят. // Сб. науч. тр. Витеб. вет. инта -1992-Т.29-С.26-31.

26. Зудилина З.Ф. // Изучение биологических свойств парамиксовируса и вируса Herpes крупного рогатого скота. // Автореферат дис. канд. биол. наук.-М.: 1970.

27. Игудин Л.И., Маркман Г.А., Лобань С.А., Позина И.М., Мигунова В.И. // // Полиэтиленгликоли и их использование в биологии и медицине. // ЖМЭИ, 1984, 4, 17-21.

28. Кис В.И. // Серопрофилактика вирусных пневмоэнтеритов телят в промышленных хозяйствах. // Автореферат дис. канд. биол. наук- 1980 -С. 16

29. Кицак В.Я. // Твердофазный иммуноферментный анализ в вирусологии. Обзор литературы. // МРЖ, 1988, разд.М., I, 20-23.

30. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных. // Под ред. Луговцева В.Ю., Васильева Д.А. «Семейство парамиксовирусов». -Ульяновск 2002 С. 121-129.

31. Коникова P.E., Носков Ф.С., Баяр Г.А. // Разработка эритроцитарных препаратов для выявления антигенов и антител в РИГА. // В кн.: Реакция непрямой гемагглютииации. Л., 1981 - С. 13-31.

32. Красочко П.А., Помирко Т.И. // Анализ степени инфицированности крупного рогатого скота и овец вирусами парагриппа-3 и диареи. И Современные аспекты профилактики инфекционных болезней молодняка, Кишинев 1989. - С. 52-55.

33. Красочко П.А., Помирко Т.И. // Выявление антител к респираторным вирусам у крупного рогатого скота. // Ветеринария 1988 - №4 - С.63

34. Крюков H.H., Зудилина З.Ф., Вечеркин A.C. // Иммуногенность ассоциированной вакцины против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. // Проблемы вет. Иммунологии (труды ВИЭВ) 1983 - Т.57 - С.23-25.

35. Крюков H.H., Зудилина З.Ф., Ярных Е.В., Вечеркин A.C. // Иммунопрофилактика парагриппозной инфекции у телят. // Бюлл. ВИЭВ 1980 - Вып.38 - С.7-10.

36. Кэрстак Э. // Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретации результатов. // Семинар ВОЗ по проблеме получения вирусных реагентов, М., СССР, 11-24/ХИ, 1983.

37. Лабораторные исследования в ветеринарии (Справочник). // Под ред. Антонова Б.И. // М.: Агропромиздат 1987.

38. Лисицын В.В., Мищенко В.А., Вечеров А.Е. // Эпизоотологический мониторинг парагриппа-3 крупного рогатого скота. Владимир. // Достижения молодых ученых в ветеринарную практику. - 2000. -С.78-82

39. Литвинов О.Б., Фролов B.C. // Об антигенной активности инактивированной вакцины против аденовирусной инфекции крупного скота. // Проблемы ветеринарной биологии (Сборник научных трудов) -M. 1984-С.28-31.

40. Мартынов Ю.В. // Гуморальный ответ на вакцину «Парвак» у телят с различным предвакцинальным уровнем специфических антител к парагриппу-3. // Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных (Сборник научных трудов) Новосибирск - 1984 - С. 106110.

41. Мартынов Ю.В., Иванов П.А., Цунская Н.И., Погулясва Л.В. // Вакцинопрофилактика парагриппа-3 крупного рогатого скота. // Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных (Сборник научных трудов) Новосибирск - 1984 - С. 100-102.

42. Музычин С.И., Летецкий В.А. // Выделение и изучение некоторых свойств вируса парагриппа крупного рогатого скота. // Ветеринарная наука — производству. — 1988. — Т. 26. — С. 3-7.

43. Музычип С.И., Шипко С.И., Ковалев H.A., Севастьянова // Иммунныйответ у телят при аэрозольной вакцинации против парагриппа-3. // В кн.: Инфекционные болезни крупного рогатого скота и меры борьбы с ними.-Минск 1982 - С.77-81.

44. Муравьев В.Н., Аносов Л.И., Сюрин В.Н. // Серопрофилактика острых респираторных заболеваний телят в откормочном комплексе совхоза им. 60-летия Союза ССР. // Проблемы ветеринарной биологии (Сборник научных трудов) М. 19 84-С.15-17.

45. Мчедлишвили Б.В., Кондратьева Н.Л., Аксенвоа Т.А. // Опыт использования мембран типа «Владипор» для концентрирования культурального вируса бешенства. // В сб.: «Вопр.мед.вирус.». Теэ. конф., 1975, 500-501.

46. Науменков В.И. // Изучение взаимодействия вируса парагриппа-З с бактериями. // Современные аспекты профилактики инфекционных болезней молодняка, Кишинев. 1989. - С.46-48.

47. Николаев В.П. // Сравнительная оценка методов обнаружения вируса омской геморрагической лихорадки. // Вопросы вирусологии 1989 -№3-С.366-368.

48. Никулина Р.Т., Мальцев Н.Н. // Получение эритроцитарного диагностикума для выявления противогерпетических антител в реакции гемагглютинации. // Вопросы вирусологии. 1976 - №2 -С.238-240.

49. Ницмане А.К., Жильинский А.Д., Бригманес А.Ю. // Проблемы энзоотических болезней в индустриальном животноводстве. Профилактика и лечение болезней сельскохозяйственных животных. // тр. ЛСХА, Тарту 1979 - Вып. 177 - С.68-72.

50. Носков Ф.С. Реакция непрямой гемагглютинации. // В кн.: Иммунологическая диагностика вирусиых инфекций (под ред. Перадзе Т.В., Халонена П.) М. Медицина - 1985 - С.98-120.

51. Носков Ф.С., Коникова Р.Е., Баяр Г.А. // Лиофилизированные эритроцитарные диагностикумы для реакции непрямой гемагглютинации. // Военно-медицинский журнал 1973 - №5 - С.52-58.

52. Носков Ф.С., Лернер О.М., Эртте А.П. // Применение РНГА для обнаружения вируса осповакцины. // Вопросы вирусологии 1970 - №5 -С.614-618.

53. Носков Ф.С., Эртте А.П, // Применение РНГА для диагностики натуральной оспы // Вопросы вирусологии 1972 - №3 - С.3-47.

54. Осидзе Н.Г., Гладченко Н.Р. // Изучение биологических свойств аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота. // Проблемы молекулярной биологии и патологии (сборникнаучных трудов MB А). Т. 106 - С.89-90.

55. Русак О.В., Хлюстов C.B., Рытик П.К., Баринский И.Ф., Мороз А.Г., Прялкина С.М. // Использование эритроцитов индюков в реакции непрямой гемагглютинации для выявления антител к вирусу герпеса. // Вопросы вирусологии- 1989 №1 -С. 113-115.

56. Семенихин A.JI. // Изучение биологических свойств ИРТ и усовершенствование реакции непрямой гемагглютинации при ИРТ крупного рогатого скота. // Автореферат дисс. канд. вет. паук. ВИЭВ -1972.

57. Семенихин А.Л., Крюков H.H., Белкина JI.M., Бодон J1. // Повышение чувствительности РНГА при ИРТ крупного рогатого скота. // Бюлл. ВИЭВ. 1972 -Вып. 14 - С.16-18.

58. Смертин В.П., Пфеффер Г.И. // Получение иммунных сывороток крови против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. // Диагностика и профилактика инфекционных болезней животных. 1989. - С. 58-64.

59. Смородинцев A.A. Реакция торможения гемагглютинации // В кн.: Иммунологическая диагностика вирусных инфекций (под ред. Перадзе Т.В., Халонена П.) М.: Медицина - 1985 - С.49-76.

60. Соковых Л.И., Горбунова A.C., Исаченко В.А. // Реакция пассивной гемагглютинации при вирусных инфекциях. // Вопросы вирусологии -1966-№3-С.254-258.

61. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. // Диагностика вирусных болезней животных (справочник) // М.: Агропромиздат 1991.

62. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. // Вирусные болезни животных. // М.: ВНИТИБП 1998 - С.213-293.

63. Сюрин. В.Н., Фомина Н.В. // Частная вереринарная вирусология. М., «Колос», 61-67

64. Третьякова И.В., Лобова Т.П., Белоусова Р.В., Нургазиев Р.З. и др. // Получение гипериммунных сывороток к некоторым гексопам аденовирусов крупного рогатого скота. // Достижения науки и техники АПК. 1989 - №1 - С:45-47.

65. Троценко Н.И. // Реакция нейтрализации и ее использование в вирусологии. II В кн: Практикум по ветеринарной вирусологии. (Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А.) М.: Колос -2000-С. 126-131.

66. Усманова Г.В., Муравьев В.Н., Блехерман Б.Е. // Выделение и идентификация полевых изолятов аденовируса при респираторно-кишечных заболеваниях телят. // Проблемы ветеринарной биологии (Сборник научных трудов) М. 1984 - С. 17-19.

67. Фролов B.C. // Изучение распространения аденовирусной инфекции крупного рогатого скота с помощью РИГА. // Проблемы ветеринарной биологии (Сборник научных трудов) М. 1984 - С.31-33.

68. Хамадеев Р.Х. // Разработка и испытание набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в РИГА. // Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов. Щелково -2000-С. 199-200.

69. Adair В.М, Bradford H.E.L, McNuIty M.S., Foster J.C. // Cytotoxic interactions between bovine alveolar macrophages. // Vet. Immunology and Immunopath. 1999. - V.67 - P.285-294.

70. Adair B.M. // Immuno fluorescence in the serological diagnosis of parainfluenza type 3 and respiratory syncytial virus infection in calves. // Res. Vet. Sci. 1986. - V. 41 - P. 414-416.

71. Adair B.M., Bradford H.E.L., Bryson D.G., Foster J.C., Mcnulty M.S. // Effect of parainfluenza-3 virus challenge on cell-mediated immune function in parainfluenza-3 vaccinated and non-vaccinated calves. // Res. Vet. Sci. — 2000.-V. 68.-P. 197-199.

72. Albrecht P, Klutch M. // Sensitive hemagglutination inhibition test for mumps antibody. //J. Clin. Microbiol. 1981 - V. 13 -N.5 -P.870-876.

73. Arski Z.I., Wisniewski J. // Poziom przeciwcial HI dla wirusa parainfluenzy-3 w surowicach bydla w woj olsztynskim, gdanskim i bydgoskim. // Med. Wet. 1972. - V.28 - N.8 - P.456-455.

74. Assaf R., Montpetit C., Marsolais G. // Serology of bovine parainfluenza virus type 3 comparison of the enzyme linked immunosorbent assay andhemagglutination inhibition. // Can. J. coTp. Med. 1983 - V.47 - P. 140142.

75. Avrameas S. Ternynek T. // Peroxidase labeled antibody and Fab conjugates with enchanced intracellular penetration. // Immunochemistry. 1971, 8, 1175-1179.

76. Bachmayer I I., Liehl E., Schidt G. // Isolation and cell culture propagation of rotaviruses from turkeys and chickens.// Post-grad. Med. J.— 1976.— Vol. 52.—P. 360—367.

77. Bamford A.I., Adair B.M., Foster J.C. // Primary cytotoxic response of bovine peripheral blood leukocytes to parainfluenza type 3 virus infection. // Vet. Immunology and Immunopath. 1995. - V.45 - P.85-95.

78. Becht II., // Properties erythrocytes stabilized sulfosalicylic acid and their use in indirect hemagglutination test with influenza virus RNA-antigen // J. Immunol. 1968 - V. 101 - P. 18-22.

79. Bing D.H., Weyand J.G. // Stavitsky hemagglutination with aldehyde fixed erythrocytes for assay of antigens and antibodies // Proc. Soc. Exp. Biol. -1967-V.214-P. 11 -66.

80. Blomberg J., Klasse Per J. // Quantification of immunoglobulin on electrophoretic immunoblot strips as a tool for human immunodeficiency virus serodiagnosis. //J.Clin.Microbiol., 1988,26. 1, 111-115.

81. Bradford H.E.L., Adair B.M., Me Nutlty M.S., Foster J.C. // Cytotoxicity of bovine leukocytes for parainfluenza type-3 virus infected cells. // Vet. Immunol. Immunopathol. 1992 - V.31 - P.I 15-127.

82. Brand C. M. Skehel J. J. // Reactivation of a bovine herpesvirus aftar corticosteroid treatment. // Nature. — New BioL— 1972.— Vol. 238.—P. 145— 147.

83. Bryson D.G., McNulty M.S., Ball H.J., Neill S.D., Connor T.J., Cush P.P. // The experimental production of pneumonia in calves by intranasal inoculation of parainfluenza type III virus. //The Vet. Rec. 1979. - V.I 05 -N.22/29-P.566-573.

84. Bultikofer P. // Grossed immunoblottings identification of proteins after crossed immunoelectrophoresis and electrotransfer to nitrocellulose membranes.//J.Imunol.Meth., 1984, 1-2, 65-71.

85. Chinchar V.A., Former A. // Functions of Sendai virus nucleocapsid polypeptides: enzymatic activities in nucleocapsids following cleavage of polypeptide P by Staphylococcus aureus protease V8. // Virol. 1981 -V.109-P.59-71.

86. Choppin P.W., Compans R.W., Scheid A., McSharry J.J., Lazarowitz S.G. // Structure and assembly of viral membranes. // In "Membrane Research" (Fox C.F. ed), Academic Press, New York 1972 - P. 163-179.

87. Choppin P.W., Klenk H.-D., Compans R.W., Caliguiri L.A. // The parainfluenza virus SV5 and its relationship to the cell membrane. // Perapect. Virol.- 1971 V.7-P.127-158.

88. Coates S., Madsen R., Rippe D. // New passive hemagglutination assay kit that uses hemagglutinin-sensitized erythrocytes for detection of rubella antibodies. //J. Clin. Microbiol. 1982 - V. 16 - P. 1117-1122.

89. Compans R.W., Choppin P.W. // The structure and assembly of influenza and parainfluenza viruses. // In "Comparative Virology" (Maramorosch K., Kurstak F. eds), Academic Press, New York 1971 - P.407-432.

90. Coronel E.G., Takimoto T., Murti K.G., VaruchN., Portner A. // Nucleocapsid incorporation into parainfluenza virus is regulated by specific interaction with matrix protein. // J. Virol. 2001 - V.75 -N.3 - P.I 1171123.

91. Cox J. H., Dietzschold B., Schneider L. G. // Characterization of virulent and aviruient strains of Pseudorabies virus for thymidine kinaae activity, viruience and restriction paiterns. // Infect, and Immun.—1977.—Vol. 16. — p. 754—759.

92. Cutlip R.C., Lehmkuhl H.D. // Experimental-induced parainfluenza type 3 infection in young lambs: pathologic response. // Am. J. Vet. Res. 1982 -V.43-P.2101

93. Davies D.H. // Isolation of parainfluenza virus type 3 from pneumonic lambs. // N.Z. Vet. J. 1977 - V.25 - P.263-269.

94. DeMeio J.L., Walker D.L. // Demonstration of antigenic relationship between mumps virus and hemagglutinating virus of Japan. // J. Immun. -1957 V.78-N.4-P.465-471.

95. Ditchfield W.J.B., Macpherson L.W., Zbitnew A. // Association of myxovirus parainfluenza-3 (RES 5) with upper respiratory infection of horses. //Can. Vet. J.- 1963-V.4-P. 175-180.

96. Ebner D., Heider G. // Fortschritte in der serodiagnostik von virusinfektionen. // Mh. Vet.-Med. 1986. - V.41 - P.I 1-14.

97. Faber R., Hartwig N., Busby D., BreDahl R. // The costs and predictive factors of bovine respiratory disease in stendardized steer tests. // Ac publ. / Iowa State Univ. Coop. Extens. Serv. Ames (Iowa) 1999 - N.641 - P.90-100

98. Fechheimer M., Daiss J.L., Cebra J.J. // Interaction of immunoglobulin with actin. // Mol. Immun. 1979 - V. 16 - P.881-888.

99. Feteanu A., Coman I. // Identification of the parainfluenza-3 cattle virus on cell cultures with fluorescent antibodies. //Arch. Veter. 1972. - V.81. N.( 1 )2-P. 151-158.

100. Flammini C.F., Bottarelli E., Allegri G. // Indagine sicro-epidemologica sulla diffusione del virus parainfluenza 3 fra bovine da latte. // Riv. Zoot. Vet. -1981.-V.9-N.2-P. 87-90.

101. Frank G.H., Marshall R.G. // Parainfluenza-3 virus infection of cattle. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1973 -V. 163 - 858-860.

102. Galinski M.S., Mink M.A., Lambert D.M., Wechsler S.L., Pons M.W. // Molecular cloning and sequence analysis of the human parainfluenza 3 virus mRNA encoding the P and C proteins. // Virol. 1986 - V.I55 - P.46-60.

103. Galinski M.S., Mink M.A., Lambert D.M., Wechsler S.L., Pons M.W. // Sequence homology of nucleocapsid proteins within the paramyxovirus family. // In "The biology of negative strand viruses" (Mahy & Kolakofsky,eds) 1987. - P.227-235.

104. Garabedian G.A., Matossian R.M., Djanian A.Y. // An indirect hemagglutination test for hydatid disease. // J. Immun. 1957 - V.78 - N.4 -P.269-272.

105. Gilka F., Thomson R.G., Savan M. // The effect of oedema, hydrocortisone acetate, concurrent viral infection and immunization on the clearance of Pasteurella hamolytica from the bovine lung. // Can. J. CoTp. Med. 1974 -V.38-P.251-259.

106. Glezen P.W., Frank A.L., Taber L.H., Kasel J.A. // Parainfluenza virus type 3: seasonality and risk of infection and reinfection in young children. // J. Infect. Dis. 1984 - V. 150 - P.851-857.

107. Gösset F., Gale C., Gregory R., Matuoka T. // Serologic response to a formalized and adjuvant parainfluenza-3 antigen in calves. // J. Am. Vet. Med. Ass. 1970-V. 157-P.I 14-177.

108. Gossler R., Paulsen J. // Virologische Untersuchungen bei besamungsbullen in hessen. 2. Mitteilung: Untersuchungen auf antikorper gegen BVD- und PI-3-Virus. // Berliner und Mimchener Tierarztliche Wochenschrift. 1975.-V. 88.-P.241-242.

109. Goswami K.K.A., Russell W.C. // A comparison of paramyxoviruses by immunoprecipitation. // J. Gen. Virol. 1982 - V.60 - P. 177-183.

110. Graham D.A., Mawhirmey K.A., German A., Foster J.C., Adair B.M.,

111. Guskey L.E., Bergtrom G. // High yield growth and purification of human parainfluenza type 3 virus and initial analysis of viral structural proteins.//J. Gen. Virol.- 1981 V.54-P.115-123.

112. Haralambiev H., Mitov B., Jarmin P., Bostandjieva R., Simeonov S. // Examination for virusis of lung lavages from calves with bronchopneumonia: preliminary results. // Acta Vet. Hung. 1987. - V.35 -N.4-P.475-477.

113. Hazrati A., Roustai M., Khalili Kh., Dayhim F. // Serological survey for antibodies against infectious bovine rhinotracheitis and parainfluenza 3 virus among cattle in Iran. // Arch. Inst. Razi 1976. - V.28 - P.45-49.

114. Helenius A., von Bonsdorff C. // Characterization of an antigenic determinant of the glycopro-tcin that correlates with pathogenicity of rabies virus. // Ibid. — 1976. — Vol. 436. — P. 895—899.

115. Henessy A. M., Davenport F. M. // Genetic dimorphism in influenza viruses: Characterization of stably associated hemagglutinin mutants differing in antigenicity and biologi-cal properties // Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.). — 1974.—Vol. 146.—P. 200—204.

116. Hore D.E., Stevenson R.G. // Experimental virus pneumonia in lambs. // Vet. Res. 1967 - V.80 -P.26-27.

117. Hussain A., Mohanty S.B. // Antibody and complement-mediated cytotoxicity for bovine parainfluenza virus-infected cells. // Am. J. Vet. Res. . 1984.-V.45-N.6-P. 1219-1221.

118. Ibu J., Obi T.U., Aba-Adulugba. // Parainfluenza type 3 (PI-3) virus infection of sheep in northern Nigeria. // Bull. Anim. Health Product. In Africa- 1993. V.41-N.3-P.169-171.

119. Inaba Y., Omori T., Kono M., Matumoto M. // Parainfluenza 3 virus isolated from Japanese cattle. I. Isolation identification. // Jpn. J. Exp. Med. -1963-V.33-P.313-329.

120. Inaba Y., Tanaka Y., Sato K., Ito H., Omori T., Matumoto M. // Nomi vims, a virus isolated from an apparently new epizootic respiratory disease of cattle. //Jap. J. Microbiol. 1970 - V. 14 - P.246-248.138,139,140,141,142,143,144,145,146147148149150151

121. Jambou R.C., Elango N., Venkatcsan S. // Proteins associated with human parainfluenza virus type 3. //J. Virol. 1985 - V.56 - N.I - 298-302.

122. Jennings R., Brand C. M., McLaren C. et al. // Hemagglutinin variants ofreovirus type 3 have altered central nervous system tropism. // Med. Microbiol. Immunol. — 1974. — Vol. 160.—P. 295—309.

123. Jerico K.W.F., Darcel C. le Q., Langford E.V. // Respiratory disease calves produced parainfluenza-3 virus and Pasteurella haemolytica. // Can. J. CoTp. Med. 1982. - V.46-P.239-301.

124. Jim O.K., Booker C.W., Ribble C.S., Guichon P.T., Thorlakson B.E. // A field investigation of the economic impact of respiratory disease in feedlot calves. // Can. Vet. J. 1989 - V.34 - P.668-672.

125. Jolken R.H., Leister F.I. // Staphylococcal protein A-enzyme immunoglobulin conjugates: verstile tools for ensyme immunoassaya. // J.Immunol.Health, 1981, 33, 2, 209-218.

126. Kahn D.E., Kita J., Gillaspie J.H. // An electron microscopic comparison of three strains of bovine parainfluenza-3 virus. // Rep. Cornell Vet. 1969. -V.LIX-N.3-P.431-438.

127. Kelly B.J. // Paramyxovirus type 3 (PMV-3) in California: serologic study of PMV-3 antibody with an enzyme-linked immunosorbent assay. // Avian Dis.- 1985 V.29 - P.364-368.

128. Key D.W., Derbyshire J.B. // Serological studies of parainfluenza type 3 virus, bovine adenovirus type 3 and bovine respiratory syncytial virus infection in beef calves. 'II Vet. Microbiol. 1984. - V.9 - P.587-592.

129. Kingsbury D.W. Paramyxoviridae. // In Molecular biology of animal viruses (D.B. Nayak), Marcel Dekker, Inc., New York. 1977 - P.367-398.

130. Kingsbury D.W. // Paramyxoviridae: the viruses and their replication. // In "Virology" 2ht Ed (Fields B.N., Knipe D.M., Eds.), NY: Raven Press -1990

131. Kita J., Balasuriya U.B.R., Osburn B.I. // Comparison of the proteins of bovine and ovine parainfiuenza-3 viruses. // Arch. Vet. Polonicum 1994. -V.34-N.3-4-P. 195-204.

132. Klippmark E., Rydbeck R., Shibuta H., Norrby E. // Antigenic variation of human and bovine parainfluenza virus type 3 strains. // J. Gen. Virol. -1990.-V.71-P. 1577-1580.

133. Koves B., Belak S., Rusvai M. // Comparative studies on haemagglutinating activity and immunogenicity of bovine parainfiuenza-3 virus strains. // Acta

134. Vet. Acad. Sci. Hung. 1982 - V.30 -N.l-3 -P.45-50.

135. Koves В., Belak S., Rusvai M., Glavits R. // Immunization experiments with an inactivated parainfluenza-3 virus. // Acta Vet. Acad. Sci. Hung. -1982-V.30-N.1-3-P.51-58.

136. Krasota A., Belousova R., Larionova N. // In vitro inhibition of bovine herpes virus 1 reproduction with native and microencapsulated proteinase inhibitor aprotinin. //J. Contr. Rel. 2002 - V.85 - P.I 17-124.

137. Kurstak E. // Application of the immunoperoxidase technique in virology and cancer virology light and electron microscopy. // Virol.immunol., N.J., Acad.Press, 1974,3-30.

138. Lamb R.A. // "Aspects of the structure and replication of Sendai Virus", Dissertation for the degree of Doctor of Philosophy. The University of Cambridge, London 1974.

139. Lamb R.A. // The phosphorylation of Sendai virus proteins by a virus particle-associated protein kinase. // J. Gen. Virol. 1975 - V. 26 - P.249-263.

140. Lamb R.A., Choppin P.W. // Determination by peptide mapping of the unique polypeptides in Sendai virus and infected cells. // Virol. 1978 -V.84-P.469-478.

141. Lamb R.A., Mahy B.W.J., Choppin P.W. // The synthesis of Sendai virus polypeptides in infected cells. //Virol. 1976. - V.69 -P. 116-131.

142. Lazarides E., Weber K. // Actin antibody: the specific visualization of actin filaments in non-muscle cells. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1974 -V.71-P.2268-2272.

143. Leaflet A.S. // The costs and predictive factors of bovine respiratory disease in standardized steer tests. // 1999 Beef Research Report Iowa State University. - 1999. -P.90-100.

144. Lehmkuhl H.D., Cutlip R.C. // Experimental parainfluenza type 3 infection in young lambs: clinical, microbiological, and serological response. // Vet. Microbiol. 1983. - V. 8 (1083) - P. 437-442.

145. Lopez A., Thomson R.G., Savan M. // The pulmonary clearance of Pasteurella haemolytica in caves infected with bovine parainfluenza 3 virus. //Can. J. Сотр. Med. 1979 - V.40 - P.385-391.

146. Lrhmkuhl H.D., Cutlip R.C. // Characterization of parainfluenza type 3 virus from the lung of a lamb with pneumonia. // Am. J. Vet. Res. 1982 -V.43-P.626

147. Lugovic B. // Primgena indirektne hemaglutinacije u titraeiziserum skin protutjela zarazneg rinotraheitisa goveda. // Veterinarski arhiv, 1981, 51, 1, 43-50.

148. Lyn D., Gill D.S., Scroggs R.A., Portner A. // The nucleoproteins of human parainfluenza virus type 1 and Sendai virus share amino acid sequences and antigenic and structural determinants. // J. Virol. 1991 -V.72-P.983-987.

149. Majewska H., Baczynski Z. // Virological and serological characteristics of field strains of parainfluenza-3 virus isolated from cattle in Poland. // Bull. Vet. Inst. Pulawy 1975. - V. 19 - N.3-4 - P.79-86.

150. Marshall R.G. // Antibody response of calves after intranasal inoculation with parainfluenza-3 virus and resistance of inoculated calves to experimental homologous viral infection. // Am. J. Vet. Res. 1981 - V.42 -N.6-P.907-911.

151. Mc Sharry J., Benzinger R. // Concentration and purification of VSV by polyethylene glycol "precipitaion". // Virology, 1970, 40, 745-746.

152. McCullough J.S., Adair B.M., McKillop E.R. // A survey of serum antibodies to respiratory viruses in cattle in Northern Ireland. // Irish Vet. J. -1987-V.41 -P.342-344.

153. McKercher D.G., Saito J.K., Frauti C.E., Wada E.M. // Response of calves to parainfluenza-3 vaccines administered nasally or parenterally. // Am. J. Vet. Res. 1972 - V.33 - P.721-730.

154. McSharry J.J., Compans R.W., Choppin P.W. // Proteins of vesicular stomatitis virus (VSV) and of phenotypically-mixed VSV-SV5 virions. // J. Virol. 1971 - V.3 - P.722-729.

155. Merz D.C., Scheid A., Choppin P.W. // Immunological studies of functions of paramyxovirus glycoproteins. // Virol. — 1981. — V.I09 — P.94-105.

156. Merz D.C., Scheid A., Choppin P.W. // Importance of antibodies to the fusion glycoprotein of paramyxoviruses in the prevention of spread of infection. //J. Exp. Med. 1980 - V. 151 -P.275-288.

157. Morein B., Sharp M., Sundquist B., Simons K. //Protein subunit vaccines of parainfluenza type 3 virus: immunogenic effect in lambs and mice. //J. Gen. Virol. 1983 - V.64-P. 1557-1569.

158. Mountcastle W.E., Compans R.W., Choppin P.W. // Proteins and glycoproteins of paramyxoviruses: A comparison of simian virus 5, Newcastle disease virus, and Sendai virus. //J. Virol. 1971 - V.7 - P.47-52.

159. Mozaffari-Nezhad H., Kita J. // Antibody appearance of parainfluenza-3 virus in cattle population in West Azarbaijan Province. // Polskie Arch. Weter. 1980. - V.21 - N.4 - P.472-476.

160. Nakane P.K., Kawaoi A. // Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation. // J.Histochem,Cytochem., 1974, 22, 12, 1084-1091.

161. Naletoski A. // Parainfluenza-3 kod goveda i Ovaca. // Vet. Glasnik -1985. -V.39 -N.8 P.879-883.

162. Panigrahi P., Mohanty S.B., Maheshwari R.K., Friedman R.M. // Structural proteins of bovine parainfluenza-3 virus. // Vet. Microbiol. -1987.-V.13-P.205-210.

163. Pasternak C.A. // Viruses as toxins with special reference to paramyxoviruses. // Arch. Virol. 1987 - V.93 - P. 169-184.

164. Phillips J.I.H., Darbysshire J.I I. // Respiratory virus of cattle. // Adv. Vet. Sci.- 1971 V.15 -P. 159-199.

165. Pollard T.D., Weihing R.R. // Actin and myosin and cell movement. // C.R.C. Grit. Rev. Biochem. 1974 - V.2 - P. 1-65

166. Ramachandran S., Scott G.R. // Paramyxovirus relationships: (2) cross-reactions between Sendai, Yucaipa, Mumps and Parainfluenza-3 (bovine) viruses. // Indian Vet. J. 1988. - P. 855-860.

167. Ray R., Compans R.W. // Monoclonal antibodies reveal extensive antigenic differences between the hemagglutinin neuraminidase glycoproteins of human and bovine parainfluenza 3 viruses. // Virol. - 1986 -V.148-P.232-236.

168. Ray R., Glaze B.J., Compans R.W. // Role of individual glycoproteins of human PIV type 3 in the induction of a protective immune response. // J. Virol. 1988a - V.62 - P.783-787.

169. Reinhardt G., Polette M., Cano M. // Prospeccion serdogica del parainfluenza-3 en bovines de la Provincia de Valdiva. // Zbl. Vet., Med. -1980. -V.27-P.149-153.

170. Rosenquist B.D. // Rhinoviruses: isolation from cattle with acute respiratory disease. // Am. J. Vet. Res. 1971 - V.32 - P.685-688.

171. Rosenquist B.D., Dobson A.W. // Multiple viral infection in calves with acute bovine respiratory tract disease. // Am. J. Vet. Res. 1974 - V.35 -N.3-P.363-365.

172. Rulka J. // Diagnostyka serologiczna parainfluenzy bydla przy uzyciu mikrotestu zahamowania hemaglutynacji z krwinkami gejsi. // Med. Weter. -1988. R. 44 -N. 9 - P. 542-544.

173. Rulka J. // Diagnostyka zakazen wimsem parainfluenzy bydla przy uzyciu odczynu immunodyfuzji (ID). // Med. Wet. 1990. - V.46 - N.4 -P.88-89.

174. Rulka J. // Zastosowanie erytrocytow ptasich do testu hemaglutynacji z wirusem parainfluenzy PI3. // Med. Wet. 1986 - V.42 -N.6 - P.342-345.

175. Rydbeek R., Love A., Orvell C., Norrby E. // Antigenic analysis of human and bovine parainfluenza virus type 3 strains with monoclonal antibodies. // J. Gen. Virol. 1987 - V.68 - P.2153-2160.

176. Rydbeek R., Orvell C., Love A., Norrby E. // Characterization of four parainfluenza virus type 3 proteins by use of monoclonal antibodies. // J. Gen. Virol. 1986. - V.67 -P.1531-1542.

177. Sanchez A., Banerjee A.K // Cloning and gene assignment of mRNAs of human parainfluenza virus 3. // Virol. 1985 - V. 147 - P. 177-186.

178. Sanchez A., Banerjee A.K. // Studies on human parainfluenza virus 3: characterization of the structural proteins and in vitro synthesized proteins coded by mRNAs isolated from infected cells. // Virol. 1985 - V.I43 -P.45-54.

179. Shibuta H., Kanda T., Adachi A., Yogo Y. // Characterization of bovine parainfluenza virus type 3. // Microbiol. Immunol. 1979 - V.23 - P.617-628.

180. Shibuta H., Kanda T., Hazama A., Adachi A., Matumoto M. // Parainfluenza 3 virus: plaque-type variants lacking neuraminidase activity. // Infect. Immun. 1981. ~ V. 34 - N. 1. - P. 262-267.

181. Shibuta H., Suzu S., Shioda T. // Differences in bovine parainfluenza 3 virus variants studied by monoclonal Antibodies against viral glycoproteins. // Virol. 1986. - V.155 - P.688-696.

182. Storey D.G., Dinock K., Kang C.Y. // Stuctural characterization of virion proteins and genomic RNA of human parainfluenza virus 3. // J. Virol. -1984,-V.52-N.3-P.761-766.

183. Thorsen J., Henderson J.P. // Surver for antibody to infectious bovine rhinotracheitis (IBR), bovinevirus diarrhea (BVD) and parainfluenza 3 (PI3) in moose sera. //J. Wildlife Deseases 1971 - V.7 - P.93-95.

184. Tint I I., Dobkin M. B., Rubin B. A. // Arrangement of the glycoproteins in the envelope of pseudorabies virus // Symp. Ser. Immunobiol. Stand. —1974. —Vol.21.—P. 132—144.

185. Towbin I I., Staehelin T., Gordon Y. // Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1979, 76, 4350-4354.

186. Trybala E. // Attempts at the detection of antibodies against Newcastle disease virus by haemofusion-inhibition test. // Acta Virol. 1988 - V.32 -P.435-442.

187. Trybala E., Larski Z., Wisniewski J. // The effect of some physical and serological treatments on haemofusing activity of bovine parainfluenza virus type 3. // Acta Microbiol. Polonica 1991. - V.40 - N. 1/2 - P.59-64.

188. Trybala E., Wisniewski J., Larski Z. // An evaluation of four serological tests for the detection of antibodies to bovine parainfluenza virus type 3. // Acta Vet. Hung. 1989. - V.37 - N.4 - P.365-372.

189. Tyrrell D.L.J., Taechaudomtavorn W., Lund G.A., Tovell D.R. // The mechanism by which paramyxoviruses break tolerance to cellular actin. // In "The biology of negative strand viruses" (Mahy & Kolakofsky,eds) 1987. -P.304-308.

190. Vengris V.E., Mare CJ. // A mico-passive hemagglutination test for rapid detection of antibodies to infection bovine rhinotracheitis virus. // Can. J. CoTp. Med. 1971 - V.35 -N.4 -P.289-293.

191. Waterson A.P. Almeida J.D. // Taxonomic implication of myxovirus. // Nature-V.210-P.I 138-1140.

192. Wechsler S.L., Lambert D.M., Galinski M.S., Heineke B.E., Pons M.W. // Human parainfluenza virus 3: purification and characterization of subviral components, viral proteins and viral RNA. // Virus Res. 1985a -V.3-P.339-351.

193. Wechsler S.L., Lambert D.M., Galinski M.S., Pons M.W. // Intracellular synthesis of human parainfluenza type 3 virus-specified polypeptides. // J. Virol. 1985b - V.54 - P.661-664.

194. Wenzel R.P., McCormick D.P., Beam W.E. // Parainfluenza pneumonia in adults. //J. Am. Vet. Ass. 1972 - V.221 - P.294-295.

195. Wezel A.L. // Large-scale concentration and purification of virus suspension from microcarrier culture for the preparation of intractivated virus vaccines. // Devclop.biol.Stand., 1979, 42, 65-69.

196. Whitman J.E., Hetrick F.M. // An indirect hemagglutination test for detecting antibody to infectious bovine rhinotracheitis virus. // Cornell vet. -1965-V.55-P.613-622.

197. Wilson M.B., Nakome P.K. // In: Knapp W.P. Immunofluorescence and related staining techniques. // Amsterdam, Elsevier/North Holland, 1978,215.224.

198. Wisniewski J., Larski Z. // Odpowiedz scrologiczna bydta na wirus parainfluenzy-3 adaptowany do komorck jamy omoczniowej zarodka kurzego. // Med. Weter. 1983. - R. 39 - N. 4 - P. 223-224.

199. Wojciechowski K.J., Kubinski T. // Immunofluorescencyjna ocean zakazenia cielat wirusami PI3 i IBR/IPV. // Med. Wet. 1975 - V.31 - N.6 -P.330-332.

200. Zarnke R.L., Erickson G.A. // Serum antibody prevalence of parainfluenza 3 virus in a free-ranging bison (Bison bison) herd from Alaska. // J. Wildlife Diseases 1990. - V.26 -N.3 - P. 416-419.

201. Zhirnov O.P. // Replication of influenza B virus in chicken embryos is suppressed by exogenous aprotinin. // Arch. Virol. 1994 - V.I35 - P.209-216.

Информация о работе

Филиппов, Сергей Юрьевич
кандидата биологических наук
Щёлково, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы