Серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

Сивков, Георгий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа"

На правах рукописи

СИВКОВ ГЕОРГИЙ ВИКТОРОВИЧ

Серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.01.06 - биотехнология (в том числебионанотехнологии) 06.02.02 - ветеринарная микробиология,вирусология, эпизоотология,микология с микотоксикологией и иммунология

/ А ПО ¿Uli

Щелково-2011 г.

4843495

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН)

Научный руководитель доктор биологических наук

Матвеева Ирина Николаевна

Научный консультант доктор биологических наук

Сургучева Лилия Михайловна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Клюкина Валентина Ивановна доктор ветеринарных наук.профессрр Мищенко Владимир Александрович

Ведущая организация ГНУ « Всероссийский научно-исследовательский институтэкспериментальной ветеринарии им. Я.Р Коваленко» РАСХН

Защита состоится "28 января" 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ « Всероссийский научно -исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская облает^ Щелковский район,п/о Кашинцево,пос.Биокомбината, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ « Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН

Автореферат разослан"27"декабря 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, .

кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Успешное ведение селекционно-племенной работы и получение высоких показателей продуктивности, невозможно без поддержания соответствующего ветеринарпо-санитарпого благополучия хозяйства. Иными словами, здоровье животных, является тем стержнем, опираясь на который можно внедрять современные достижения технологии производства, использовать генетический потенциал и другие составляющие рентабельного сельскохозяйственного производства в полном объеме.

Интенсивное ведение животноводства способствует распространению заболеваний, поражающих дыхательные пути. В этиологической структуре этих заболеваний значительная роль принадлежит вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВ) инфекций. (В.В.Гуненков, 1975; В.Н.Сюрин1978; Н.Н.Кргоков 1984; Р.В.Белоусова,1989; C.B.Кузнецова,1991; П.А.Красочко,1997; В.А.Мищенко, 2001; А.Г.Глотов, 2001; Т.И.Глотова, 2006; К.П.Юров, 2001,2003; Д.П.Кузнецов, 2002; О.Г.Петрова, 2002; О.Г.Новиков, 2002; A.L.E. Lindberg, 2003; Н.И. Кот, 2003; А.Я.Самуйленко, 1998 и др.).

Однако в настоящее время ветеринарная практика располагает наборами моно-диагностических тест-систем в основном зарубежного производства. Поэтому увеличение номенклатуры, совершенствование качества и стандартизация отечественных диагностических тест-систем для серологического мониторинга респираторных заболеваний крупного рогатого скота является актуальной задачей.

Современное развитие биотехнологии предполагает создание экспресс-методов диагностики на основе иммунофермептных тест-систем (ИФА).

При этом необходимо использование в данных системах высокоэффективных и специфических реагентов, полученных на основе

современных технологий в области выделения и очистки вирусных белков, получения специфических сывороток.

В этой связи актуальным является разработка технологии изготовления комплексных диагностических тест-систем и совершенствование методов серологического мониторинга вирусных инфекций.

Цели и задачи исследований. Цель исследований - серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

-провести анализ эпизоотической ситуации по респираторным болезням крупного рогатого скота в хозяйствах РФ;

-определить этиологическую структуру респираторных вирусов в возникновении патологий крупного рогатого скота;

- усовершенствовать тест-систему ИФА для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3,РС, ВД-БС и АВ инфекции в сыворотках крови и молозиве крупного рогатого скота при тестировании в одном разведении и установить критерии оценки результатов;

-провести серологический мониторинг поголовья крупного рогатого скота на наличие вирусных респираторных болезней и проанализировать полученные результаты.

Научная новизна.

1. Проведен анализ эпизоотической ситуации по респираторным болезням крупного рогатого скота в хозяйствах РФ и определена этиологическая структура респираторных вирусов в возникновении патологий.

2. Усовершенствована технология получения компонентов иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител в сыворотках крови к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ инфекций (Патент РФ «Комплексная тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота» №2371726, 2009 г.

3. Получены специфические компоненты, контрольные референс-сыворотки, оптимизированы условия постановки, критерии оценки результатов иммуноферментной тест-системы (Патенты РФ: «Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем» №2392331, 2009 г.; «Способ выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям крупного рогатого скота» №2008126759, 2010 г.).

4. Проведен анализ результатов серологического мониторинга поголовья крупного рогатого скота с использованием разработанной тест-системы.

Практическая значимость работы.

Результаты исследований использованы при составлении:

- "Методических рекомендаций по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальиой инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1;

методических рекомендаций «Мероприятия по профилактике респираторных заболеваний и болезней органов размножения крупного рогатого скота», утвержденные 25 мая 2009 г. директором ГНУ ВНИТИБП.

Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность по использованию тест-системы ИФА не только для серологического мониторинга вирусных заболеваний, но и для оптимизации противоэпизоотических мероприятии с целыо установления этиологической структуры респираторных вирусов в возникновении патологий крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ГНУ ВНИТИБП (2005-201 Огг), в виде ежегодных отчетов по темам

заданий Российской НТП, а также на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» 2007 г.; на заседаниях секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарной медицины РАСХН, Щелково, 20072008 гг.

Публикации научных работ. По теме диссертации опубликовано J» научных работ, из них 1 работа - в издании, рекомендованном ВАК. Получены Патент РФ «Способ выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям крупного рогатого скота» №2008126759, 2010 г. и Патент РФ «Комплексная тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота» №2371726, 2009 г.

Основные положения диссертационной работы, выносимые па защиту. Анализ эпизоотической ситуации по респираторным болезням крупного рогатого скота в хозяйствах РФ.

Определение этиологической структуры респираторных вирусов в возникновении патологий крупного рогатого скота.

Усовершенствование тест-системы ИФА для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3,РС, ВД-БС и АВ инфекции в сыворотках крови и молозиве крупного рогатого скота.

Результаты серологического мониторинга поголовья крупного рогатого скота на наличие вирусных респираторных болезней.

Личный вклад. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились совместно с сотрудниками отдела молекулярной биологии ГНУ ВНИТИБП Д.П. Кузнецовым, C.B. Кузнецовой, И.И. Кочиш, Т.Ю. Кочиш, С.Ю.Филипповым, патентоведом института С.И. Бехтеревым. Автор выражает признательность академику РАСХН А.Я. Самуйленко и всем исполнителям и участникам за помощь в выполнении диссертационной работы.

Объем ii структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, приложения. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 16 рисунками, 1 схемой. Список литературы включает 265 источников, в том числе 103 отечественных и 162 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 2005-2010 гг. в отделе молекулярной биологии ГНУ ВНИТИБП в соответствии с планами НИР и ОКР ГНУ ВНИТИБП на 2005-2008 гг , задание 08.06.01 «Разработать новые диагностические тест-системы и комплексные лечебно-профилактические препараты экономически значимых инфекционных заболеваний животных», в хозяйствах Московской, Владимирской, Рязанской, Кировской, Пензенской областей.

2.1. Материалы и методы

В работе использовали комплекс вирусологических и биотехнологических методов. Вирусологические исследования проводили согласно стандарту МЭБ (QIE Manual, Manual of Standarts// Chapter 2.3.5..2000).

Вирусы. В исследованиях использовали следующие штаммы: штамм "ТК -А (ВИЭВ) В2" вируса ИРТ; штамм "Oregon C24V" вируса диареи-болезни слизистых оболочек; штамм "ЗКСМ" (ВГНКИ) вируса парагриппа-З; штамм "Randall" (ВГНКИ) PC-вирус; вакцина инактивированная против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Bovine-10 серотип 1 ТУ 1009.09-89.

Культуры клеток. В работе использовали перевиваемые линии клеток МДВК, Тауэр; ПТ-80, Taurus-1 (Т-1), первично-трипсинизированные культуры клеток почкн (ПЭК), лёгкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца эмбриона коровы (СЭК). В качестве ростовых и поддерживающих сред применяли среды 199, ГЛАХ (г. Москва). Инфекционную активность вирусов определяли в чувствительных культурах клеток, выражая титр вируса в lg ТЦЦ 50/смз, по общепринятым методам.

Методы определения антител. Специфические антитела к антигенам вирусов ИРТ, PC и ПГ-3 выявляли в реакции нейтрализации (РН). Антитела к вирусу респираторно-синцитиальной инфекции определяли в РН и в РНГА, к вирусу ПГ-3 с использованием «Набора диагностикумов ПГ-3 крупного рогатого скота в РТГА», ТУ 46-21-480-78. Антитела к вирусу аденовирусной инфекции определяли, используя «Набор сухих диагностикумов аденовирусной инфекции крупного рогатого скота», ТУ 46-21-939-79, к ВД-БС КРС используя «Набор диагностикумов против ВД крупного рогатого скота» ТУ 46-21-529-79, «Набор для диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота методом ИФА»,ТУ 1007078-92.

Антигены для ИФА.

Антигены вирусов получали обработкой вирусных препаратов ультразвуком при 22кГц импульсивно в течение 10 секунд на установке УЗДН-2Т или 1-2% тритоном Х-100 .Предварительно вирусы ИРТ, ПГ-3, и PC очищали и концентрировали из вируссодержащих суспензий осаждением ПЭГ, сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах. Фракционный состав и молекулярную массу антигенов вирусов устанавливали методом электрофореза по системе U. К. Laemmli (1970 г.) в блоке SDS-PAGE(«Pharmacia»,Швеция) с использованием маркеров молекулярной массы и методом иммуноблотинга на нитроцеллголозных мембранах (США,0,54мкм).

Сыворотки для ИФА. Специфические антитела из антивирусных сывороток выделяли методом аффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В («Pharmacia» .Швеция) с иммобилизованными вирусными антигенами. Препараты антигенов и антител концентрировали методом ультрафильтрации на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа ФМО 2-200 (СКБ АП АН, Ленинград) с мембранами "Владипор" УАМ-150.

скота боенского происхождения (п=64). В качестве гетерологичных сывороток использовали коммерческие диагностические сыворотки к сальмонеллам, пастереллам и хламидиям (п=30).

Анти-lgG нероксидазныи копыогат. Получение коныогата включало выделение IgG из нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота методом аффинной хроматографии на сорбенте BrCN ссфароза 4В с протеином A (Sigma). Метку антивидовых антител ферментом пероксидазы из хрена проводили перйодатным методом по P. Nakane и A. Kawaoi (1974).

Определение белка. Общий белок определяли по методу Лоури (1958) и спектрофотометрически на СФ-26 при длине волны 280нм.

Непрямой нммупофермептпый анализ. Определение антител проводили в твердофазном варианте непрямого ИФА по Engvall и др.( 1976), оптимальные условия которого определяли экспериментально. Лунки микроплат адсорбировали антигенами респираторных вирусов, инкубировали 18 час при 4°С, избыток удаляли пятикратной промывкой ФСБТ и блокировали свободные участки 5% сывороткой лошади. Контрольные, исследуемые сыворотки крови и молозива исследовали в одном разведении 1:50, инкубировали при 37°С в течение 1 часа, отмывали и вносили антн-IgO пероксидазный коныогат в разведении 1:10 ООО. Через 60 мин планшеты отмывали и вносили 100 мкл субстратного раствора перекиси водорода с 3,3,5,5,-тетраметилбензидином (ТМБ,«МДЛ», Росссия), инкубировали 20 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию внесением 50 мкл 0,1М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре при ОП450.

По коэффициенту связывания коныогата (Ксв) антителами определяли антитела к вирусам. Чувствительность и специфичность тест-системы ИФА определяли согласно рекомендациям (Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004).

Статистическая обработка результатов проводили по программе «Microsoft Excel». Достоверность результатов подтверждали путем статистической

обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р< 0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Анализ эпизоотической ситуации в хозяйствах РФ

Анализ эпизоотической ситуации в хозяйствах Владимирской, Кировской, Тульской, Пензенской, Рязанской областей РФ за 1994-1999 гг. свидетельствовал о неблагополучии крупного рогатого скота по респираторным болезням телят.

С 1994 г. увеличение удельного веса респираторных заболеваний с 58,2% до 72,3% приходилась на молодняк (по отношению к числу народившихся телят). Так, в 1994 г. заболеваемость респираторными инфекциями у них составила 30,4%, а в 1996 г.— 39,0%. Высокая заболеваемость животных была обусловлена воздействием многих факторов, среди которых следует особо выделить: ухудшение качества кормов, снижение количества концентратов в рационе кормления, как стельных коров, так и молодняка; низкая обеспеченность животных витаминами, а ветеринарной службы - биопрепаратами для специфической профилактики болезней животных вирусной и бактериальной природы и т.д.

С 1997 г. ветеринарными службам была начата целенаправленная работа по внедрению комплексной системы профилактики и терапии болезней телят с использованием общих и специальных мероприятий с применением вакцинных и химиотерапевтических препаратов, что привело в большинстве хозяйств к 2009 году значительное снижение заболеваемости телят.

В 2009 году процент заболеваемости среди молодняка составил -14,5%.

Кроме пневмоний телят в патологии крупного рогатого скота большой удельный вес занимали мастит и эндометриты у коров.

Анализ заболеваемости показал, что с 1994 по 1999 г. имела место тенденция к увеличению заболеваемости коров: в 1994 г. 6,7% коров переболели маститом и 10,5% - эндометритом, в 1999 г. - соответственно 10,4% и 15,5%. По настоящее время прослеживается тенденция к росту этих патологий у животных.

Анализ результатов диагностических исследований показал, что при серологическом исследовании антитела к вирусу диареи-болезни слизистых выявлялись у 85% переболевших эндометритами коров.

Проведенный анализ заболеваемости, падежа и вынужденного убоя обследованного крупного рогатого скота свидетельствовал о неблагополучии животноводства ряда хозяйств по респираторным болезням молодняка и необходимости разработки новых, более эффективных средств и методов их профилактики.

В последние годы в животноводческих хозяйствах, принадлежащих ОАО «Агроплемсоюз», согласно предоставленных ветеринарных отчетов, четко определились четыре основные группы заболеваний у крупного рогатого скота: лейкоз, некробактсриоз, вирусные заболевания молодняка и болезни органов размножения.

2.2.2. Определение этнологической структуры респираторных вирусов в возникновении патологий крупного рогатого скота

При бактериологических исследованиях патологического материала от

павших и вынужденно убитых больных телят в ветеринарных лабораториях при респираторных болезнях чаще всего выделяли пастереллы, стрептококки, стафилококки. При исследовании сывороток крови больных пневмониями животных в диагностических титрах выявляли антитела к антигенам возбудителей инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых, парагриппа-3, респираторно-синцитиалыюй и аденовирусной инфекций.

Кроме того, в фекалиях больных диареей телят методом ИФА и электронной микроскопией обнаруживали антигены рота- и коронавирусов.

На крупных специализированных фермах и комплексах, комплектующих животных из хозяйств - поставщиков, как правило, регистрировали смешанные респираторные инфекции.

Наличие антител в сыворотке крови невакцинированного крупного рогатого скота различных половозрастных групп к антигенам возбудителей

вирусных инфекций свидетельствовал об инфицированное™ или о переболевании.

Проведенные исследования показали, что в этиологической структуре пневмоний телят, мастита и эндометритов у коров в хозяйствах основное место принадлежит вирусам ИРТ и ВД-БС. При исследовании клинически здоровых коров (п=375) антитела к вирусу ИРТ выявлены в 90,9%, а к вирусу диареи-болезни слизистых - в 76,6% случаев, что свидетельствует о широкой циркуляции и об участии их в возникновении различных болезней.

Исследование наличия антител к вирусам ИРТ и ВД-БС у телят до месячного возраста (п=349), полученных от вакцинированных коров, показало, что у молодняка соответственно в 57,3% и 79,1% случаев отмечался высокий уровень колострального иммунитета, обеспечивающий предупреждение заболеваемости животных пневмониями.

У переболевших пневмониями телят в возрасте 2-4-х месяцев (п=365) антитела к антигенам указанных вирусов выявлены в 61,1% и 95,4% случаях соответственно. При изучении роли вирусов ИРТ и ВД-БС в патологии репродуктивных органов коров установлено, что у абортировавших, невакцинированных коров (п=72) антитела к антигену возбудителя инфекционного ринотрахеита установлены в 93,5%, а к вирусу диареи - в 87,6% случаев. Титр антител в среднем составлял от 1:16 до 1:64. У больных послеродовыми эндометритами коров (п=99) антитела определялись соответственно в 85,1% и 97,8% случаев в титре 1:16-1:32. У многократно перегуливающих коров (п=177) количество положительно реагирующих составляло 94,2% и 96% с титром антител -1:256 и выше.

Обследование коров (п=280) из благополучных по гинекологическим заболеваниям хозяйств показало, что число положительно реагирующих среди них было значительно меньше (36-46%), а титр антител низким (1:8-1:16). Переболевание взрослых животных инфекционным ринотрахеитом и вирусной диареей-болезнью слизистых приводило к поражениям репродуктивных органов,

снижению эффективности осеменения и большому количеству послеродовых осложнений.

При изучении роли вирусов ИРТ и ВД-БС в патологии молочной железы установлено, что у клинически здоровых животных (п=107) специфические антитела к указанным антигенам выявлены соответственно в 26,8 и 35,9%; с субклиническим маститом (п=88) в 61,4 и 79,4% и с клинически выраженным маститом (п=139) в 66,8% и 80,9% случаев. Количество положительного реагирующих было наибольшим среди коров, больных клинически выраженным маститом, несколько меньшим - среди животных с субклнпическим воспалением молочной железы.

Таким образом, установлено, что пневмонии телят, мастит и эндометриты у

коров полиэтиологичны. В их возникновении и развитии принимают активное

участие бактерии, вирусные агенты и, конечно, различные предрасполагающие

факторы, снижающие общую резистентность организма.

2.2.3. Совершенствование тест-системы ИФА для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3,РС, ВД-БС и АВ инфекции

Основными специфическими компонентами иммуноферментной тест-

системы являются очищенные и концентрированные антигены вирусов, контрольные положительные сыворотки к вирусу ИРТ, ПГ-3, ВБ-БС, PC, АВ, отрицательная сыворотка и анти-IgG-KPC пероксидазный коныогат. Технологические этапы получения компонентов комплексной иммуноферментной тест-системы вошли в Патент РФ «Комплексная тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота №2371726, 2009».

Культивирование и получение очищенных вирусных препаратов ИРТ, РС-вируса, ПГ-3 проводили совместно с С.В.Кузнецовой, С.А.Гринь, И.И.Кочиш, Т.Ю.Кочиш, С.Ю.Филнпповым.

Усовершенствование тест-системы ИФА заключается в том, что специфические антитела к антигенам 5-ти вирусов определяются одномоментно в одном разведении 1:50. Для этого определяют позитивно-

негативный порог реакции путем тестирования заведомо отрицательных сывороток в базовых реакциях ко всем пяти инфекциям и прибавления к полученным значениям оптических плотностей три значения стандартного отклонения для расчета верхней границы позитивно-негативного порога и прибавления двух значений стандартного отклонения для расчета нижней границы позитивно-негативного порога; допустимые величины оптических плотностей отрицательных и положительных сывороток; диагностическую чувствительность по отношению количества положительных сывороток крови к сумме истинно положительных сывороток и ложно-отрицательных сывороток. Выявление специфических антител к инфекционному ринотрахеиту, парагриппу-3, вирусной диарее-болезни-слизистых, респираторно-синцитиалыюй и аденовирусной инфекций крупного рогатого скота, включает сенсибилизацию ячеек микропанели соответствующими антигенами, параллельное внесение в них проб с тест-сывороткой и исследуемых сывороток; инкубацию; добавление эталонного антивидового конъюгата; измерение оптической плотности раствора и определение титра антител по зависимости показателя оптической плотности от титра антител. Специфичность реакции определяют по отношению количества отрицательных сывороток крови к сумме истинно отрицательных сывороток и ложно-положительных сывороток.

Результаты ИФА считаются достоверными, если значения ОП45о отрицательных сывороток не превышает 0,150 o.e., а значения ОП^о положительного контроля - не менее 0,439 o.e., а среднее значение оптических плотностей, суммированное с утроенным и удвоенным значениями стандартного отклонения составляет 0,261 и 0,216 o.e. соответственно.

Диагностическая чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа составляет 89% и 93% соответственно. (Патент РФ «Способ выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям крупного рогатого скота» №>2008126759, 2010 г.)

2.2.3.1.Получение положительных контрольных сывороток к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД- БС, РС, АВ и отрицательной рефсрснс-сы коротки

Специфичность реферепс-сывороток предопределяет основные аналитические параметры тест-системы ИФА. Специфические антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС, АВ получали иммуноаффинной хроматографией на ВгСЫ-Сефарозе 4В, с иммобилизованными антигенами вирусов.

Отрицательную сыворотку КРС, не содержащую антител к данным вирусам, получали истощением нормальной сыворотки па том же сорбенте.

Анализ специфичности выделенных антител в ИФА показал, что очищенные методом аффинной хроматографии препараты антител, реагировали только с гомологичными антигенами вирусов ОП45оО,870+0,021о.е. и не реагировали с антигенами вируса болезни Ауески, хламидий, сальмонелл, пастерелл.

Значение ОП45оОтрицателыюй сыворотки после истощения с антигенами вирусов ИРТ, ПГ-3,ВД-БС, РС, АВ и гетерологичпыми антигенами составило ОП45оО,120+0,ОЗОо.е.

Полученные в результате исследований положительные сыворотки, содержащие строго специфические для каждого вируса антитела, и отрицательная сыворотка, не содержащая антител к антигенам исследуемых вирусов, были использованы в качестве контрольных в иммуноферментной тест-системе.

Данные исследования легли в основу патента РФ «Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях крупного рогатого скота» № 2392331,2009 г.

2.2.3.2. Получение анш-^С нсроксидазного коныогата

Иммунопероксидазный коныогат антикв получали в четыре этапа: -выделение из нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота аффинной хроматографией на протеин-А Сефарозе 4В;

- иммунизация кроликов препаратом крупного рогатого скота и получение антивидовых сывороток;

- выделение анти- антител на протеин-А Сефарозе 4В; -метка антивидовых антител ферментом пероксидазой.

В результате проведенных исследований получен анти-^О пероксидазный коныогат с рабочим разведением 1:10000, концентрацией по ПХ 220 мкг/см3 и ОП450 1,1650±0,013 с КРС, который использовали в тест-системе для выявления антител к антигенам респираторных вирусов.

2.2.4. Серологический мониторинг поголовья крупного рогатого скота па наличие вирусных респираторных болезней

Клинико-эпизоотологические исследования в хозяйствах,

неблагополучных по массовым респираторным болезням крупного рогатого скота показали, что во всех случаях характер течения и симптоматика болезней телят не позволяют достоверно дифференцировать их этиологическую принадлежность. В этой связи результатам серологического мониторинга необходимо уделять особое внимание.

Разработанная нами иммуноферментная тест-система была использована при исследовании сывороток крови коров и телят из хозяйств Владимирской, Кировской, Тульской, Пензенской, Рязанской областей.

Результаты серологического мониторинга поголовья животных с признаками респираторной патологии, показали, что в 87% исследованных сывороток были выявлены в основном антитела к 3-м вирусам ИРТ, ПГ-3 и РС. Антитела были выявлены одновременно к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС в 74,3% и РС и адено-вируспой инфекции в 56,4% случаев. При серологическом обследовании всех животных этих хозяйств выявлены также специфические антитела к вирусу ВД-БС в 67,3% случаев.

Исследование сывороток крови крупного рогатого скота от телят 45-60 дневного возраста из хозяйств, неблагополучных по рота- и коронавирусным инфекциям, показало наличие антител к вирусам ИРТ в 43,2%, ПГ-3 в 75%, РС в 54,8% случаев. Отмечено, что у телят, переболевших ротавируспой или коронавнрусной диареей, значительно чаще регистрируют респираторные болезни со сложной этиологией, среди которых инфекционный ринотрахент, парагрипп-3, вирусная диарея-болезнь слизистых. После инфицирования этими вирусами часто развивалось, как правило, иммуиодефицитпое состояние организма, повышалась чувствительность к другим инфекциям и резко снижалась эффективность от применяемых вакцин.

Для предупреждения вирусных респираторных заболевании телят и стельных коров вакцинируют за 40-45 суток до отела, с повторной иммунизацией за 21 день до отела.

Наиболее часто в качестве бактериального агента, осложняющего течение заболевания респираторной этиологии, выявляли сальмонеллу (в 58% случаев выделяли Б. ^рЬутипит и с1иЫш от общего числа положительных проб). Культуры пастерелл (сероварам А,В,Д) изолировали от больных телят в 44% случаев.Кроме того, от телят 1-6-ти месячного возраста изолировали культуры стрептококков (30%), стафилококков (25%), микоплазм (10%), хламидии (6%). От телят месячного возраста выделяли Е.соН (33%).

2.2.5.Аналпз результатов серологического мониторинга поголовья крупного рогатого скота

Анализ результатов серологического мониторинга поголовья крупного

рогатого скота показал, что в возникновении и развитии респираторных болезней телят и коров принимают участие: возбудители инфекционного рннотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3, респираторно-синцитиальпой инфекции, а также условно-патогенная бактериальная микрофлора, осложняющая вирусные инфекции или самостоятельно вызывающая заболевания.

Исходя из полученных результатов исследований, усовершенствована комплексная система профилактики и терапии респираторных болезней

молодняка крупного рогатого скота в условиях животноводческих предприятий, которая включает следующие мероприятия:

1) установление диагноза заболевания с применением комплекса эпизо-отологических, клинических, патоморфологических и лабораторных исследований с применением вирусологических, бактериологических, серологических методов (в том числе мониторинг с помощью разработанной и усовершенствованной тест-системы иммунофермснтного анализа для выявления специфических антител к антигенам вирусных респираторных заболеваний крупного рогатого скота);

2) иммунизация коров и полученного от них молодняка в возрасте 1-1,5 месяца и старше вакцинами в зависимости от эпизоотической ситуации хозяйства по указанным выше инфекциям.

Высокопродуктивные коровы с интенсивным обменом веществ и более чувствительной нейрогуморальной регулирующей системой, восприимчивы даже к незначительным изменениям условий содержания и реагируют па это более выраженным нарушением обмена веществ, затрагивающих их иммунобиологический статус. В большинстве стад у таких коров отмечали несбалансированное по сахаропротеиновому отношению и микроэлементам кормление, это предрасполагало к развитию жировой дистрофии печени, ацидозу рубца и иммунодифицитному состоянию.

У телят уровень колостральпых антител обычно снижается к 25-35-му дню после рождения, в это время их переводят на групповое содержание, происходит смена кормления, что приводит к стрессовому состоянию.

Для сохранности молодняка очень важно соблюдение правил содержания телят в телятниках-профилакториях с применением специфических профилактических схем, принятых в хозяйстве, с учетом эпизоотологической ситуации. В последнее время применяется комбинированная вакцина «Комбовак», как для иммунизации телят,так и стельных коров.

Положительные результаты дает выпаивание телятам замороженного остатка первых порций молозива от здоровых коров. Хороший эффект, по

опыту хозяйств Владимирской, Кировской областей дает применение телятам в первые дни ацидофильного молока н других заквасок. В этих областях широко применяется "Холодный метод выращивания телят", но он требует очень серьезного подхода. При его использовании нельзя игнорировать ни одной из рекомендаций по его применению.

При возникновении вирусных заболеваний у телят наряду со специфическими мерами борьбы, описанными выше, очень важно соблюдать (в зависимости от возможности хозяйств) метод разделения телят на больных и условно здоровых и стараться исключить контакт вновь рождающихся телят с инфицированными. Изолирование телят целесообразно размещать па других отделениях, или на территориях ферм, под навесом, в разных местах, чтобы разница в возрасте колебалась 5-7 дней.

Использование в ряде хозяйств РФ комплексной системы профилактики респираторных заболеваний телят и коров способствовало повышению эффективности ведения животноводства, получению дополнительной продукции и снижению затрат на приобретение лечебных препаратов.

з.выводы

1. В современных условиях ведения животноводства широко распространены болезни крупного рогатого скота со сложной этиологией, среди них инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, вирусная диарея-болезнь слизистых и др. После переболевания этими заболеваниями развивается иммунодефицитное состояние организма, повышается чувствительность животных к другим инфекциям и резко снижается эффективность применяемых вакцин.

2. Этиологическими факторами пневмоний телят в наблюдаемых хозяйствах РФ в большинстве случаев являются вирусы ИРТ, ПГ-3 и РС. При исследовании клинически здоровых коров (п=375) антитела к вирусу ИРТ выявлены в 90,9%, к вирусу диареи -болезни слизистых- в 76,6% случаев, что

свидетельствует о широкой циркуляции и об их участии в возникновении других инфекционных заболеваний.

3. Усовершенствована комплексная иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС, АВ инфекций и оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота в одном разведении. Диагностическая чувствительность и специфичность оставляет 89% и 93% соответственно.

4. Оптимизированы схемы получения положительных контрольных сывороток путем применения одноэтапного метода аффинной очистки специфических антител из сыворотки крови и антигенов из вируссодержащих суспензий с использованием ВгС1Ч-Сефарозы 4В при промышленном производстве компонентов тест-системы ИФА.

5. При серологическом мониторинге с помощью разработанной комплексной иммуноферментной тест-системы 3 хозяйств РФ выявлены одновременно специфические антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД-БС в 74,3% и РС и аденовирусной инфекции в 56,4% случаев. Полученные результаты свидетельствуют о сочетанном течении ИРТ, ПГ-3 и РС инфекций. У телят, переболевших ротавирусной или коронавирусной диареей в 45-60-ти дневном возрасте, чаще регистрировали респираторные болезни.

6. Разработаны мероприятия по профилактике респираторных заболеваний крупного рогатого скота, обеспечивающие значительное улучшение эпизоотической ситуации животноводческих хозяйств.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

- «Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного рннотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-сиицитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной иифекции (АВ) крупного рогатого

скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года па секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1, утвержденные 18.03.2007 г. академиком РАСХН A.M. Смирновым;

-Технологический регламент па производство набора компонентов для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного рипотрахеита (ИРТ), парагриппа-З (ПГ-3), респираторно-сшщитиалыюй инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (AB) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе нммупоферментиого анализа (ИФА)", утвержден 21.07. 2007г. директором ГНУ ВНИТИБП;

методические рекомендации «Мероприятия по профилактике респираторных заболеваний н болезней органов размножения круйного рогатого скота», утвержденные 25 мая 2009 г. директором ГНУ ВНИТИБП.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сивков Г.В., Матвеева И.Н., Кочиш И.И., Кузнецова C.B. Патент РФ

«Комплексная тест-система иммуноферментпого анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота». №2371726,2009. Бюл. №30 .-С.841.

2. Матвеева И.Н., Еремец Н.К., Сивков Г.В., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Применение комплексной иммуноферментлой тест-системы для серологического мониторинга респираторных болезней крупного рогатого скота: Тр. Кубанского Гос. Аграрного ун-та. Серия ветеринарные науки.-2009,-№1.-Ч.1.-С.61-63.

3. Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Матвеева И.Н. Изучение репродукции вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота: мат. Междунар. научно-практ. конф., "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково,2007.-С.126-129.

4. Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Матвеева И.Н., Чулков А.К., Крыжановская Е.В. Концентрирование и очистка вируса

аденовирусной инфекции крупного рогатого скота: материалы Междунар. научно-практ. конф. "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов",- Щелково,2007.-С.129-132.

5. Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Матвеева И.Н., Чулков А.К., Крыжановская Е.В. Разработка компонентов тест-системы ИФА для определения уровня антител к возбудителю аденовирусной инфекции крупного рогатого скота: мат. Междунар. научно-практ. копф., "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".-Щелково,2007.-С.132-137.

Отпечатано в ООО «Мещёра», М.О., г. Щёлково, ул. Свирская, 8а Тираж 100 экз. Заказ №703

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сивков, Георгий Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота.

1.1.1. Диагностика инфекционного ринотрахеита.

1.1.1.1. Традиционные методы диагностики инфекционного ринотрахеита

1.1.1.2. Иммуноферментный метод для диагностики ИРТ.

1.1.1.3. Диагностика ИРТ с помощью гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции.

1.1.2. Диагностика вирусной диареи-болезни слизистых.

1.1.2.1. Общие положения в диагностике инфекции.

1.1.2.2. Иммуноферментный анализ в диагностике (ВД-БС).

1.1.3. Лабораторная диагностика РС инфекции.

1.1.4. Лабораторная диагностика парагриппа

1.1.4.1. Ретроспективная диагностика ПГ-3.

1.1.4.2. Сравнение методов серодиагностики парагриппа-3.

1.1.5. Диагностика аденовирусной инфекции.

1.1.5.1. Серологическая идентификация.

1.1.5.2. Ретроспективная диагностика.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа"

Актуальность темы. Успешное ведение селекционно-племенной работы и получение высоких показателей продуктивности, невозможно без поддержания соответствующего ветеринарно-санитарного благополучия хозяйства. Иными словами, здоровье животных, является тем стержнем, опираясь на который можно внедрять современные достижения технологии производства, использовать генетический потенциал и другие составляющие рентабельного сельскохозяйственного производства в полном объеме.

Интенсивное ведение животноводства способствует распространению заболеваний, поражающих дыхательные пути. В.этиологической структуре этих заболеваний значительная, роль принадлежит вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной,диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (РС) и аденовирусной (АВ) инфекций. (В:В:Гуненков, . 1975; В.Н.Сюрин1978; Н.Н.Крюков 1984; Р:В .Белоусова, 1989;С.В .Кузнецова, 1991 ;П. А.Красочко, 1997;В. А.Мищенко, 2001; А.Г.Глотов;2001,Т.И.Глотова,2006; К:П;Юров,2001,2003;, Д.П.Кузнецов, 2002; О.Г.Петрова,2002; О.Г.Новиков,2002; АХ.Е. 1лпаЬег&2003, Н.И. Кот,2003; А.Я.Самуйленко, 1998и др.).

Однако в настоящее время , ветеринарная г практика располагает наборами моно-диагностических тест-систем в основном зарубежного производства.

Поэтому увеличение номенклатуры, совершенствование качества и стандартизация- отечественных диагностических тест-систем для серологического мониторинга респираторных заболеваний крупного рогатого скота является актуальной задачей.

Современное развитие биотехнологии предполагает создание экспресс-методов диагностики на основе иммуноферментных тест-систем (ИФА).

При этом необходимо использование в данных системах высокоэффективных и специфических реагентов, полученных на основе современных технологий в области выделения и очистки вирусных белков, получения специфических сывороток.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

-провести анализ эпизоотической ситуации по респираторным болезням крупного рогатого скота в хозяйствах РФ;

Научная новизна.

Практическая значимость работы.

Результаты исследований использованы при составлении:

- "Методических рекомендаций по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВ) крупного рогатого скота в комплексной- тест-системе иммуноферментного анализа", рассмотренные и одобренные 21 сентября-2007 года на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1; методических рекомендаций «Мероприятия по профилактике респираторных заболеваний и болезней органов размножения крупного рогатого скота», утвержденные 25 мая 2009 г. директором ГНУ ВНИТИБП.

Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность по использованию тест-системы ИФА не только для серологического мониторинга вирусных заболеваний, но и для оптимизации противоэпизоотических мероприятий' с целью установления этиологической структуры респираторных вирусов в возникновении патологий крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ГНУ ВНИТИБП (2005-20 Югг), в виде ежегодных отчетов по темам заданий Российской НТП, а также на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» 2007 г.; на заседаниях секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарной медицины РАСХН, Щелково, 20072008 гг.

Публикации научных работ. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 1 -в издании по перечню ВАК. Получены Патент РФ «Способ выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям крупного рогатого скота» №2008126759, 2010 г. и Патент РФ «Комплексная тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота». №2371726,2009.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

Анализ эпизоотической ситуации по респираторным болезням крупного рогатого скота в хозяйствах РФ.

Определение этиологической структуры респираторных вирусов в возникновении, патологий крупного рогатого скота.

Усовершенствование тест-системы. ИФА для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, nF-3,PC, ВД-БС и АВ'инфекции в сыворотках крови и молозиве крупного рогатого скота:

Личный вклад. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы* проводились совместно с сотрудниками отдела молекулярной биологии ГНУ ВНИТИБП Д.П. Кузнецовым, C.B. Кузнецовой, И.И. Кочиш, Т.Ю. Кочиш, С.Ю.Филипповым, патентоведом института С.И. Бехтеревым. Автор выражает признательность академику РАСХН А.Я: Самуйленко и всем исполнителям и участникам за помощь в выполнении диссертационной работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения,

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Сивков, Георгий Викторович

5. ВЫВОДЫ

2. Этиологическими факторами пневмоний телят в наблюдаемых хозяйствах РФ в большинстве случаев являются вирусы ИРТ, ПГ-3 и РС. При исследовании клинически здоровых коров (11=375) антитела к вирусу ИРТ выявлены в 90,9%, к вирусу диареи —болезни слизистых- в 76,6% случаев, что свидетельствует о широкой циркуляции и об их участии в возникновении других инфекционных заболеваний.

4. Оптимизированы схемы получения положительных контрольных сывороток путем применения одноэтапного' метода аффинной очистки специфических антител из сыворотки крови и антигенов из вируссодержащих суспензий с использованием ВгСЫ-Сефарозы 4В при промышленном производстве компонентов тест-системы ИФА.

6.ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

- «Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1, утвержденные 18.03.2007 г. академиком РАСХН А.М. Смирновым;

-Технологический регламент на производство набора компонентов для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", утвержден 21.07. 2007г. директором ГНУ ВНИТИБП; методические рекомендации «Мероприятия по профилактике респираторных заболеваний и болезней органов размножения крупного рогатого скота», утвержденные 25 мая 2009 г. директором ГНУ ВНИТИБП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вирусы ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС, АВ широко распространены среди популяции крупного рогатого скота и в стационарно неблагополучных очагах болезни могут протекать без проявления явных клинических признаков, т.е субклинически.

МЭБ установило стандарт диагностики ИРТ, который включает отбор и доставку проб биоматериала для исследований, выделение вируса, выявление его антигенов, нуклеиновой кислоты, дифференциацию генотипов вируса и серологические реакции, включающие реакцию нейтрализации в культуре клеток.

Для выявления персистентно инфицированных ВД-БС животных используют микрометод выделения вируса из проб сыворотки крови, ПЦР и ИФА. Параллельно исследуют пробы сыворотки крови на наличие вируснейтрализующих антител вирусу. Референтным методом для диагностики ВД-БС является выделение вируса в культурах клеток с последующей идентификацией выделенного изолята. Выявление уровня антител у животных после естественного заражения ВД-БС или после иммунизации по—прежнему остается стандартным методом (с помощью ИФА и РН).

Лабораторная диагностика РС инфекции заключается в обнаружении антигена в- патологическом материале (мазках-отпечатках, срезах), полученном от больных животных, в РИФ; выделении возбудителя из патологического материала в культуре клеток и его идентификации в РИФ, РН и ПЦР. За рубежом для определения наличия антител и ретроспективной диагностики РС инфекции используется ИФА;а РН применяется реже. В РФ используется РНГА.

Диагноз на ПГ-З основан на выделении вируса в культурах клеток, обнаружении вирусного антигена^ в тканях пораженных органов методом люминесцирующих антител, установлении сероконверсии к вирусу при исследовании парных сывороток крови, взятых в начале болезни и повторно через 3 недели.

В связи с тем, что клинические признаки аденовирусной, инфекции не всегда проявляются* у инфицированных животных, диагностика болезни, основанная на эпизоотологических данных, клинических и патолого-анатомических признаках, невозможна: Лабораторная диагностика АВ инфекции заключается» в обнаружении антигенов вируса в мазках-отпечатках, гистологических срезах, МФА и РСК; выделении возбудителя в культуре клеток ТБ, ПЭК или ЛЭК и его групповой идентификации в серологических реакциях РСК, РДП и РИФ; выявлении антител в пробах сыворотки.

Слабая устойчивость РНК-с о держащих вирусов (РС, ПГ-З) представляет большую проблему при проведении процедуры выделения вируса в. культуре клеток, поскольку эффективность зависит от жизнеспособности самого вируса и наличию в исследуемой пробе других вирусов, обладающих более высокой способностью к репликации. Поэтому увеличение номенклатуры, совершенствование качества и стандартизация отечественных диагностических тест-систем для серологического мониторинга респираторных заболеваний крупного рогатого скота является актуальной задачей.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Вирусы. В исследованиях использовали следующие штаммы: штамм "ТК -А (ВИЭВ) В2" вируса ИРТ; штамм "Oregon C24V" вируса диареи-болезни слизистых оболочек; штамм "ЗКСМ" (ВГНКИ) вируса парагриппа-3; штамм "Randall" (ВГНКИ) PC-вирус; вакцина инактивированная против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Bovine-10 серотип 1 ТУ 1009.09-89.

Культуры клеток. В работе использовали перевиваемые линии клеток МДВК, Тауэр; ПТ-80, Taurus-l (Т-1), первично-трипсинизированные культуры клеток почки (ПЭК), лёгкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца эмбриона коровы (СЭК). В качестве ростовых и поддерживающих сред применяли среды 199, ГЛАХ (г. Москва). Инфекционную активность вирусов определяли в чувствительных культурах клеток, выражая титр вируса в Ig ТЦД 5о/Смз, по общепринятым методам.

Антигены для ИФА.

Антигены вирусов получали обработкой вирусных препаратов ультразвуком при 22кГц импульсивно в течение 10 секунд на установке УЗДН-2Т или 1-2% тритоном Х-100 .Предварительно вирусы ИРТ, ПГ-3, и PC очищали и концентрировали из вируссодержащих суспензий осаждением ПЭГ, сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах. Фракционный состав и молекулярную массу антигенов вирусов устанавливали методом электрофореза по системе U. К. Laemmli (1970 г.) в блоке SDS-PAGE(«Pharmacia»,Швеция) с использованием маркеров молекулярной массы и методом иммуноблотинга на нитроцеллюлозных мембранах (США,0,54мкм). ь

Сыворотки для ИФА. Специфические антитела из антивирусных сывороток выделяли методом аффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В («Pharmacia» ,Швеция) с иммобилизованными вирусными антигенами. Препараты антигенов и антител концентрировали методом ультрафильтрации на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа ФМО 2-200 (СКБ АП АН, Ленинград) с мембранами "Владипор" УАМ-150.

В исследованиях применяли сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота, поступивших из хозяйств РФ, неблагополучных по респираторным заболеваниям и другим патологиям крупного рогатого скота (п=350), коммерческие иммунные сыворотки (п=120), сыворотки крупного рогатого скота боенского происхождения (п=64). В качестве гетерологичных сывороток использовали коммерческие диагностические сыворотки к сальмонеллам, пастереллам и хламидиям (п=30).

Анти-IgG пероксидазный коньюгат. Получение коньюгата включало выделение IgG из нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота методом аффинной хроматографии на сорбенте BrCN сефароза 4В с протеином I

I ) I

A (Sigma). Метку антивидовых антител ферментом пероксидазы из хрена проводили перйодатным методом по P. Nakane и A. Kawaoi (1974).

Непрямой иммуноферментный анализ. Определение антител проводили в твердофазном варианте непрямого ИФА по Engvall и др.(1976), оптимальные условия которого определяли экспериментально. Лунки микроплат адсорбировали антигенами респираторных вирусов, инкубировали 18 час при 4°С, избыток удаляли пятикратной промывкой ФСБТ и блокировали свободные участки 5% сывороткой лошади. Контрольные, исследуемые сыворотки крови и молозива исследовали в одном разведении 1:50, инкубировали при 37°С в течение 1 часа, отмывали и вносили анти-IgG пероксидазный коньюгат в разведении 1:10 ООО. Через 60 мин планшеты отмывали и вносили 100 мкл субстратного раствора перекиси водорода1 с 3,3,5,5,-тетраметилбензидином (ТМБ,«МДЛ», Росссия), инкубировали-20 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию внесением 50 мкл 0,1М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре при ОП450.

По коэффициенту связывания коньюгата (Ксв) антителами определяли антитела к вирусам. Чувствительность и специфичность тест-системы ИФА определяли согласно рекомендациям (Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004).

Статистическая обработка результатов проводили по программе «Microsoft Excel». Достоверность результатов подтверждали путем статистической I обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р< 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Анализ эпизоотической ситуации в хозяйствах РФ

С 1994 г. увеличение удельного веса респираторных заболеваний с 58,2% до 72,3% приходилась на молодняк (по отношению к числу народившихся телят). Так, в 1994 г. заболеваемость респираторными инфекциями у них составила 30,4%, а в.1996 г.— 39,0%. Высокая заболеваемость животных была обусловлена воздействием: многих факторов, среди которых следует особо- выделить: ухудшение качества кормов, снижение количества концентратов? в рационе кормления; как стельных коров,, так. и молодняка; низкая обеспеченность животных витаминами, а ветеринарной службы - биопрепаратами для специфической; профилактики болезней животных вирусной и бактериальной природы и т.д.

С 1997 г. ветеринарными службам былашачатащеленаправленная1работа по внедрению комплексной] системы; профилактики и терапии- болезней' телят с использованием общих и специальных мероприятий,с применением вакцинных и химиотерапевтических препаратов, что привело в большинстве: хозяйств к 2009 году значительное снижение заболеваемости телят.

В 2009 году процент заболеваемости среди молод] шка составил - 14,5%.

Кроме: пневмоний; телят в патологии крупного рогатого скота большой« удельный вес занимали мастит и эндометриты у коров.

Анализ заболеваемости показал, что с 1994 по 1999 г. имела место тенденция м увеличению заболеваемости коров: в 1994 г. 6^7% коров переболели маститом и 10,5% - эндометритом; в 1999 г. - соответственно 10;4% ш 15,5%. По настоящее время прослеживается тенденция к росту этих патологий у животных. Анализ результатов диагностических исследований показал, что при серологическом исследовании антитела к вирусу диареи-болезни слизистых выявлялись у 85% переболевших эндометритами коров.

В последние годы в животноводческих хозяйствах, принадлежащих ОАО «Агроплемсоюз», согласно предоставленных ветеринарных отчетов, четко определились четыре основные группы заболеваний; у крупного рогатого скота: лейкоз, некробактериоз; вирусные заболевания молодняка и болезни; органов размножения.

3.2.0пределение этиологической структуры респираторных вирусов в возникновении патологий крупного рогатого скота

При, бактериологических исследованиях патологического материала от павших и вынужденно убитых больных телят в ветеринарных лабораториях при респираторных болезнях чаще всего выделяли пастереллы, стрептококки, стафилококки. При исследовании; сывороток крови больных пневмониями животных в диагностических титрах; выявляли антитела к антигенам возбудителей инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций.

На крупных специализированных фермах и: комплексах, комплектующих животных из хозяйств - поставщиков, как правило, регистрировали смешанные респираторные инфекции.

Наличие антител в сыворотке крови невакцинированного крупного рогатого скота различных половозрастных групп к антигенам возбудителей вирусных инфекций свидетельствовал об инфицированности или о переболевании:

Переболевание взрослых животных инфекционным ринотрахеитом и вирусной I диареей-болезнью слизистых приводило к поражениям репродуктивных органов, снижению эффективности осеменения и большому количеству послеродовых 1 осложнений. г

При изучении роли вирусов ИРТ и ВД-БС в патологии молочной железы установлено, что у клинически здоровых животных (п=107) специфические антитела к указанным антигенам выявлены соответственно в 26,8 и 35,9%; с субклиническим маститом (п=88) в 61,4 и 79,4% и с клинически выраженным маститом (п=139) в 66,8% и 80,9% случаев. Количество положительного реагирующих было наибольшим среди коров, больных клинически выраженным маститом, несколько меньшим - среди животных с субклиническим воспалением молочной железы.

Таким образом, установлено, что пневмонии телят, мастит и эндометриты у коров полиэтиологичны. В их возникновении и развитии принимают активное участие бактерии, вирусные агенты и, конечно, различные предрасполагающие факторы, снижающие общую резистентность организма.

3.31 Совершенствование тест-системы ИФА для выявления,антител к антигенам.вирусов ИРТ, ПГ-3,РС, ВД-БС и АВ инфекции

Основными специфическими компонентами иммуноферментной тест-системы являются очищенные и концентрированные антигены, вирусов, контрольные положительные сыворотки к вирусу ИРТ, ПГ-З, ВБ-БС, РС, АВ, отрицательная сыворотка и анти-^О-КРС пероксидазный конъюгат. Технологические этапы получения компонентов комплексной иммуноферментной тест-системы вошли в Патент РФ «Комплексная тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня« антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота №2371726, 2009».

Культивирование и получение очищенных вирусных препаратов ИРТ, РС-вируса, ПГ-З проводили совместно с С.В:Кузнецовой, С.А.Гринь, И.И.Кочиш, Т.Ю.Кочиш, С.Ю.Филипповым и Д.П. Кузнецовым.

3.3.1. Промышленное культивирование клеток ПТ-80

Во ВНИТИБП разработаны высокоэффективные процессы репродукции перевиваемых, первично-трипсинизированных клеток и вирусов в биореакторах в суспензии, псевдосуспензии и на микроносителях.

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80 проводили в биореакторе емкостью 25 л (ВНИТИБП, Иркутск НИИХИММАШ) в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и индивидуальными модулями технологической обвязки и управления (ВНИТИБП и НПО «Промавтометика»).

На автоматизированных блочно-модульных установках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителях «Су1:ос1ех», что позволило сравнить продуктивность клеточных культур в зависимости от различных систем культивирования. (Табл.1)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сивков, Георгий Викторович, Щёлково

1. Аберкромби Д., Алленмарк С., Дин П., Джонсон У. Аффинная хроматография.- М., Мир.-1988.-288С.

2. Авилов B.C., Салажов E.JL, Лебедев А.И. Условия получения диагностических сывороток к вирусам инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и диареи крупного рогатого скота //Бюл. ВИЭВ. 1979. Т. 36. - С. 6-9.

3. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. Иммуноферментный анализ // Ветеринария.-1981. №8.- С.33-35.

4. Адамушкин В.Е., Светлышев С.Д., Петрова И.А. // Методы очистки и концентрирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота// Проблемы вирусол., молекул, биологии и гистологии с/х жив., Сб. научн.тр., М., МВА, 1983,18-20.

5. Амиров А.Х. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. вет. наук. Смоленск, 2004. -20 С.

6. Амирбеков М, Юров К.П., Караваев Ю.Д., Степанова С.Н., Махмадшоев А. Опыт профилактики парагриппа-3 и хламидиоза ягнят. // Ветеринария.-1992.№1. -С.34-36.

7. Астаханова Л.Н., Брайнингер М.Г. Методы получения стандартных диагностических сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу // Лаб. дело.-1975.-№12.- С.730-732.

8. Астаханова Л.Н., Брайнингер М.Г. О методах иммунизации пригодных для серийного приготовления диагностических сывороток к PC-вирусу. //Вопр. Этиологии, эпидемиологии, патогенеза и диагностики вирусных заболеваний: Сб./Свердловск, 1976. С.3-9.

9. Атамась В.А., Лаврова И.Г. // Изучение гуморальных поствакцинальных антител у крупного рогатого скота, иммунизированного живой и инактивированной вакцинами против инфекционного ринотрахеита // Инфекц. Инвазионные болезни с.х. жив. Одесса , 1982, 21-25.

10. Атамась В. А., Лаврова И.Г. // Изучение хламидиоза и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.// Современные аспекты профилактики инфекц. болезней молодняка с 32-34.

11. Афонюшкин В.Н. Разработка и применение ДНК-зонда для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. биол. наук. 2002.-20 с.

12. Афонюшкин В.Н., Юрик С.А., Семенихин В.И. Исследование клинически здоровых животных, серопозитивных к вирусу ВД-БС //Ветеринария. 2004. №1.- С. 12-13.

13. Ашмарин И.П., Воробьев В.В.// Статистические методы в микробиологических исследованиях, 1962, Медгиз, Л.

14. Баженов К.С. Распространение вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период. //Бюлл. ВИЭВ. -1983.- Вып.50.- С. 6-8.

15. Белова Н.Б. Оценка эффективности ассоциированной вакцины против рота-корона-ВД-БС вирусов крупного рогатого скота// Ветеринария.-2005.-№4.-С. 18-20.

16. Белоусова Р.В., Третьякова И.В., Лобова Т.П., Исакова В.Р. Иммуноферментная диагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота // Вестник сельскохозяйственной науки. 1990,№3(402).- С.135-138.

17. Белоусова Р.В., Третьякова И.В., Лобова Т.П., Исакова В.Р. Иммуноферментный метод диагностики аденовирусной инфекции КРС // Достижения науки и техники АПК.- 1990.№1.- С. 25-27.

18. Бюллетень ВОЗ. Руководство по стандартизации диагностических препаратов, 2000г. 227 с.

19. Быкова H.H. Разработка иммуноферментного анализа для индикации антигенов вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота и антител к нему: Дис. . к.б. н. Щелково, 1989.- 148 с.

20. Быкова H.H., Лукина В.А., БойкоА.А. // Сравнительная оценка иммуноглобулинов, меченых пероксидазой (иммуноферментных конъюгатов).// Передовой науч.-производст. Опыт в биологической промышленности.-1985.-№9.- С.8-11.

21. Вечеров А.Е., Лисицын В.В., Прохватилова Л.Б., Аянот П.К. Сравнительный анализ вариабельной области гена HN различных штаммов и изолятов вируса парагриппа-3 КРС. // Достижения молодых ученых в ветеринарную практику, Владимир. - 2001. - С.91-97.

22. Глотов Г.П. Связь между введением контаминированной вирусом спермы в хозяйство и заболеванием коров и телят инфекционным ринотрахеитом крупного рогатого скота// Актуальные вопр. ветеринарии.-Новосибирск.-1997.- С.54-55.

23. Глотов Г.П. Обнаружение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в тройничном ганглии латентноинфицированных телят методом молекулярной гибридизации // Актуальные вопросы ветеринарии.- Новосибирск.-1997. С-51-52.

24. Глотов Г.П., Орешкова С.Ф. // Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации // Ветеринария .-1996.№6. С.-24-27.

25. Глотов Г.П., Сергеев А.Н. // Частота выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в пробах патологического материала от больных телят методом молекулярной гибридизации. Актуальные вопр. ветеринарии.-Новосибирск.-1997.- С.47-49.

26. Глотов Г.П., Шкиль H.A., Сергеев А.Н., Глотова Т.И., Никитина Е.Б., Гоппе В.А., НефедченкоА.В., Некрасова Н.В.//Вирусные и ассоциированные вирусно-бактериальные респираторные болезни крупного рогатого скота.-Новосибирск.-2004.-С.З-25.

27. Глотов А.Г., Котенева C.B., Глотова Т.И., Суслопаров М.А., Носкова Н.В., Шуляк А.Ф. Выявление ДНК вируса ИРТ КРС с помощью полимеразной цепной реакции // Ветеринария,- 2003 .№5.- С.21-24.

28. Глотов А.Г., Нефедченко A.B., Глотова Т.Н., Ручинкин М.Н. Влияние вакцинации и иммуномодуляторов на течение ИРТ КРС у быков-производителей.-Ветеринария.-2003.№2. 17с.

29. Глотов А.Г., НефедченкоА.В., Глотова Т.И., Некрасова Н.В., Гоппе В.А. Генотип и вирулентность изолятов вируса ИРТ КРС// Ветеринария.-2003.№11.-С.20-22.

30. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Гоппе В.А. Свойства изолятов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота // Ветеринария . 2005. №5.- С. 2427.

31. Глотов А.Г., НефедченкоА.В., Глотова Т.И., Некрасова Н.В., Гоппе В.А. Экспериментальная респираторная болезнь телят, вызванная вирусами ВД, ИРТ КРС и бактерией Salmonella dublin // Сиб. Вестник сельскохоз. Науки .2005.№2,- С. 44.

32. Глотов А.Г. Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации и особенности эпизоотического процесса заболевания в современных условиях: Автореф. дис. . докт. вет. наук. Новосибирск, 1999.- 39 с.

33. Глотова Т.И. Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота (диагностика, молекулярно-биологические свойства возбудителей, эффективность противовирусных препаратов): Автореф. дис. . докт. биол. наук. Новосибирск, 2006.- 39 с.

34. Глотов А.Г. Респираторные болезни телят вирусно-бактериальной этиологии.- Новосибирск.2008.

35. Гоппе В.А. Этиологическое значение вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи -болезни слизистых в возникновении респираторных болезней телят: Автореф. дис . канд. вет. наук. Новосибирск, 2005.-19 с.

36. ГОСТ 5386-91. Животные сельскохозяйственные, методы лабораторной диагностики лептоспироза.- М.: Из-во стандартов, 1991

37. Гринь С.А. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов: Автореф. дис. . докт. биол. наук.- Щелково, 2008.- 51 с.

38. Дьяконов Л.П., Ситьков Л.И. Животная клетка в культуре.- М.: Компания Спутник +, 2000. С.334-336.

39. Жидков С.А. Вирусная диарея — болезнь слизистых оболочек. Автореф. дис. . д-ра вет. наук, 1994, ВИЭВ.- 20 с.

40. Закутский Н.И., Жестеров В.И., Хухоров И.Ю., Кушнир А.Г., Лагуткин H.A. Герпесвирусные инфекции крупного рогатого скота. Фолиант,-Владимир-Покров 2003 C.-37-85.

41. Закутский Н.И., Жестеров В.И., Вишныков И.Ф., Шевченко A.A. Конакова Л.Д. Схема иммунизации крупного рогатого скота инактивированной вакциной против ИРТ КРС// Пробл. Инфекц. патологии с.х. животных Владимир 1997.-С. 85.

42. Иванов A.B., Хисматуллина H.A., Юсупов- Р.Х., Чернов А.Н. Диагностика и профилактика бешенства животных.- М.: Д44 ФГНУ «Росинформагротех», 2007 .-С. 14-60

43. Иванов B.C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин.// Вирус.болезни с.-х.животных. -Владимир, 1995. -С. 203.

44. Иванов B.C., Майджи О.В. Изучение условий хранения вируса ИРТ, репродуцированного в монослое перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителях. // Тр.ВИЭВ/Всерос.НИИ эксперим.ветеринарии, 2003; Т.73.-С. 173-175.

45. Иванов B.C. К вопросу оральной вакцинации животных против бешенства Опыты на белых мышах и крысах. Вирус, болезни с.-х. животных. -Владимир, 1995.-С. 204.

46. Кочиш Т.Ю. Разработка набора реагентов для определения уровняантител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота виммуноферментном анализе: Дис. . канд. биол. наук. Щелково, 2004.- 160 с.

47. Кузнецов Д.П. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатогоскота: диагностика на основе современных методов биотехнологии: Автореф.дис. . докт. биол. наук. Щелково, 2002.- 40 с.

48. Кузнецова С.В Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов (на модели вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота) Дис. . докт. биол. наук. М., 1991.-40 с.

49. Кузнецова C.B.; Бойко А.А.; Иванов B.C.; Кузнецов П.П. Динамика образования антител к возбудителю ИРТ при введении его кроликам. // Ветеринария.- 1988, Т. 4 I.- С. 35-36.

50. Кузнецова C.B.; Исаевич JI.B.; Кузнецов П.П.; Иванов B.C. Получение антирабической вакцины из иммуногенного компонента гемагглютинина вируса бешенства.// Докл. ВАСХНИЛ,- 1987,Т. 10 - С. 40-41.

51. Курбонбекова З.Д. Эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечным болезням молодняка крупного и мелкого рогатого скота в центральных районах Таджикистана: Автореф. дис. . канд. вет. наук. М., 2007.- 20 с.

52. Куриленко А.Н., Крупальник В.Л., Пименов Н.В. Бактериальные и вирусные болезни молодняка сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 2005. - С.157-190.

53. Кучерявенко Л.И. Реакция связывания комплемента для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. // Дис. . канд. вет. наук. Киев, 1983.- 146 с.

54. Лобова Т.П. Усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2006 .- 20 с.

55. Мищенко В.А. Проблема респираторных смешанных инфекций молодняка КРС // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Мат. Междунар. научно-практ. конф.,30-31 октября 2003 г.- Владимир.-С.72-77.

56. Мищенко В.А., Лисицын В.В., Костыркин Ю.А., Ручное Ю.Е., Гетманский О.И., Яременко Н.А. Вакцинация новорожденных телят против ИРТ и ПГ-3 КРС // Ветеринария. -2003. №7. 19 с.

57. Мищенко В.А., Бабкин В.Ф., Базаров М.А. Иммуномониторинг вирусных инфекций Современные аспекты ветеринарной патологии животных: Материалы конференции Владимир 23-25 ноября 1998.- С.31-33.

58. Муравьев В.Н. Парагрипп крупного рогатого скота //Инфекционные и инвазионные болезни молодняка крупного и мелкого рогатого скота /В.И.Подкопаев, А.В.Степанов, В.Н.Муравьев, р.в. Белоусова. М.: Россельхозиздат, 1985. - С. 103-110.

59. Непоклонова И.В, Выявление антигена вируса ИРТ и антител к нему методом ИФА: Автореф. дис. . канд. вет. наук. М., 1985. — 19 с.

60. Новак М. Культивирование в суспензии эксплантантов легких эмбриона крупного рогатого скота вируса парагриппа-3 и его некоторые биологические свойства: Дис. канд. биол. наук. — М., 1986. -С.38-39.

61. Получение и сравнительная оценка пероксидазных коныогатов на основе чистых антител и Бав-фрагмента ^О /С.С.Маренникова, Н.А.Хабахпашева, Н.Н.Мальцева, Е.Е.Ефремова //ЖМЭИ. -1982. № 9. - С. 99-103.

62. Получение очищенных концентратов миксовирусов /В.МЖданов, В.В.Мчедлишвили, В.М.Зайдес и др. //Молекул, генет., микробиолог, и вирусол. 1984. - № 10. - С. 37-43.

63. Применение иммуноферментных и некоторых других иммунологических методов в диагностике вирусных инфекций /Э.Курстак, П.Тийссен, К.Курстак, Р.Мориссет //Бюл. ВОЗ. 1986. - № 2. -С. 1Ю-124.

64. Ревякина Е.М. Иммуногенные и реактогенные свойства ассоциированной трехвалентной вакцины. Авторф. дис. . канд. вет. наук.- 1998, ВИЭВ.- 20 с.

65. Реджепова Г.Р., Убитина И.В., Зоткин Г.В. Профилактика вирусных респираторных болезней телят Мат. Межд. Научно-практической конф. 2325 сент. 2002 Воронеж Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях.-2002.-С.38.

66. Санитарный кодекс наземных животных МЭБ.- 15 издание, 2006.-С. 113-115, 173-175,353.

67. Сисягин П.Н., Реджепова Г.Р., Убитина И.В., Зоткин Г.В. Профилактика вирусных респираторных болезней телят Актуальные проблемы болезнеймолодняка в современных условиях Мат. междунар. Науч.-практич. Конф. 23-25 сентября 2002.- Воронеж .-38 с.

68. Современные методы диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота: Тез. докл. Междунар. научно-практ. конф., посвященной 120-летию академика К.И. Скрябина. Астана: 1999.- С. 78-80. Жумабаев Х.Ж.

69. Строганова И.Я. Методы контроля размножения и определения инфекционной активности респираторно-синцитиального вируса КРС в культуре клеток Мат.9 Междунар.симп.'Теконструкция гомеостаза" Крсноярск.-16-20 марта, 1998.-Т.4.-Красноярск.- 1998.-С.97-99.

70. Сюрин В., Смоленский В.И. Биотехнологические методы диагностики и профилактики вирусных болезней животных //Междунар. с.-х. ж. 1987. - № 3.-С. 38-43.

71. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология. М.: Колос, 1979.-472 с.

72. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология. М.: Колос, 1984.-376 с.

73. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных М, ВНИТИБП.-1998.-С.285.

74. Теория и практика иммуноферментного анализа// Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М./ М.-Высшая школа.- 1991.

75. Трофимова М.Г., Быков И.Н., Семенова Н.С. Повышение чувствительности реакции пассивной геммаглютинации с эритроцитарным диагности кумом респираторно-синцитиального вируса // Вопросы вирусологии.-1985.№-2. -С.236-239.

76. Тулеева Н.П., Тулеев Ю.В. Иммунопрофилактика респираторных вирусных болезней телят // Ветеринария.- 2005. №8.- С. 18-20.

77. Турсункулов Ш.Ж., Усовершенствование схем иммунизации лошадей, волов и овец-продуцентов гипериммунной антирабической сывороткой: Автореф. дис. . канд. вет. наук.-1990.- 25 с.

78. Усов С.М. Иммунологические аспекты терапии и профилактики инфекций ринотрахеита и вирусной диареи молодняка крупного рогатого скота. Автореф. Дис. Канд. вет. Наук, Минск, 1998.

79. Фарботко Г.Э.; Кондрахина К.Н.; Павлова Л.Д. Эпизоотическая обстановка по инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота на племпредприятии //Ветеринария.- 1994. №8.- С. 27-30.

80. Федоров Ю.Н. Иммунокоррекция: применение и механизм действия иммуномодулирующих препаратов // Ветеринария. 2005. №2. - С.3-6.

81. Федоров Ю.Н. Принципы получения моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам овец //Тр. ВИЭВ. -1960. Т. 51. - С. 106-112.

82. Филиппов С.Ю. Разработка иммуноферментного набора для, определения уровня антител к вирусу парагриппа-3 крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. биол. наук, Щелково, 2004.-22 с.

83. Халенев Г.А. Разработка методов производства диагностикумов и усовершенствование, лабораторной диагностики вирусной диареи и респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота: Дис. канд. вет. наук. М., 1976.- 270с.

84. Халенев Г.А., Гуненков В.В. Респираторно-синцитиальная, реовирусная и риновирусная инфекция крупного рогатого скота //Лекция 15-я.-Моск. вет. академия.-1977.- С.3-9.

85. Шарова Н.К., Букринская А.Г. Белки вируса парагриппа человека //Вопросы вирусологии. 1987.№ 2. - С. 173-175.

86. Шульпин М.И. Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации: Автореф. дис. канд. биол. наук. Владимир, 2004.-20 с.

87. Шульпин М.И. Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации: Автореф. дис. канд. биол. наук. Владимир, 2004. -20 с.

88. Эффективность двух инактивированных вакцин против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота: Сб. науч. тр. М. 1984 - С.20-23. Белоусова Р.В., Литвинов О.Б., Колесникова Л.М., Резова Т.Н.

89. Adair В.М. Immuno fluorescence in the serological diagnosis of parainfluenza type 3 and respiratory syncytial virus infection in calves. // Res. Vet. Sci. 1986.-V. 41 p. 414-416.

90. Adair B.M., Bradford H.E.L., Bryson D.G., Foster J.C., Mcnulty M.S. Effect parainfluenza-3 virus challenge on cell-mediated immune function in parainfluenza-3 vaccinated and non-vaccinated calves. // Res. Vet. Sci. — 2000.-V. 68.-P. 197-199.

91. Adair B.M, Bradford H.E.L, McNulty M.S., Foster J.C. Cytotoxic interactions between bovine alveolar macrophages. // Vet. Immunology and Immunopath. 1999.- V.67-P.285-294.

92. Andrews A.H., Grunsell G.S.C., Hill F.W.G. Respiratory disease in calves//The veterinarry annual Isseu.-1983.-v.23.-p.48-55.

93. Antibodies to respiratory syncytial virus polypeptides and their aignificfnct in human infection/Ward K.A.,Lambden P.R.,Ogilvie M.M., Watt P.J.//J. gen. Virol-1983. V.64.-P. 1867-1876.

94. Armstrong J.A., Pereira H.G., Valentine R.C. Morfphelogy and development of respiratory syncytial virus in cell cultures//Nature.-1962.-vl96.-pl 179-1181.

95. Ackermann M.; Weber H.; Wyler R. // Aspects of infectious bovine rhinotracheitis eradication programmes in a fattening cattle farm // Prev. veter. Med, 1990; T. 9. N2 p. 121-130

96. Arnatadt K.L., Berg D. // Sensitive enayme immunoassay for progesterone in human plasma and soliva. // J.Clin.Chem. and Clin.Biochem., 1981, 19.8, 602603.

97. Aruna D.; Babu T.S. // Prevalence of infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus antibodies in buffaloes of Andhra Pradesh // Indian J.anim.Sc, 1992; T. Vol. 62. N 6P. 540-541

98. Avrameas S. // Enzyme immunoassay and related techniques: development and limitations. // Curr.Top.Microbiol. and Immunol., 1983, 104, 93-99.

99. Avrameas S. Ternynck T. // Peroxidase labeled antibody and Fab conjugates with enchanced intracellular penetration. // Immunochemistiy. 1971, 8, 11751179.

100. A sero-epidemiological survey of infections with the bovine respiratory syncytial virus in firetsea aon gracieng calves /PloegerH.W.,Boon J.H., Klaassen C.H.L., Florent G.van//J.Vet.Med.-1986.-v.33,№4-p311-318.

101. Baker J.C. // Clinical aspects of bovine virus diarrhoea virus infection // Rev scient. techn. Off. Intern. Epizoot, 1990; T. 9. N 1 p. 25-41

102. Baker J.C.; Rust S.R.; Walker R.D. // Transmission of a vaccinal strain of infectious bovine rhinotracheitis virus from intranasally vaccinated steers commingled with nonvaccinated steers // Am. J. veter. Res, 1989; T. 50. N 6 p. 814-816.

103. Beccaria E. // Rapid detection of antibodies to Infectious Bovine Rhinotracheitis by "macro" and:"micro" "ELISA". // Rev. Biolog.Stand., 1982, 52. 141-146.

104. Bommell W.R., Kihm U., Lazarowicz M., Steck. F. // Rapid detection of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus by microenzyme linked immuno-sorbent assay (microELISA). // Proc.2. Int.Symp. Vet.Lab.Diagnost., 1980. 235-239.

105. Coudert M.; Martel J.L.; Fedida M. // The French national network of epidemiological surveillance of bovine disease // Acta veter. scand. Suppl, 1988; T. 84 p. 176-179

106. De B.N.; Chatterjee A.; Sen G.P.; Biswas G. // Investigation of an outbreak of bovine abortion in a large organised dairy farm // Indian veter. J, 1989; T. 66. N 4 p. 283-287

107. Durham P.J.K., Sillars H.M. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serodiagnosis of infectious bovine rhinotracheitis infeciton, with results of a preliminary survey. // New.Zeland Vet.J., 1986, 34, 3, 2734.

108. Edwards A.J. // The effect of stressors like rumen overload and induced abortion on BRD in feedlot cattle // Agri-Pract, 1989; T. 10. N 2 p. 10-15

109. Baker J.C., Ames T.R., Markham R.J.F. Serologie studies of bovine respiratory syncytial virus in Minnesota cattle. //Am. J. veter. Res. -1985. -v.46, N 4. P891-892.

110. Baldridge P., Senterfit L.B. Peraistent infection of cells in culture by respiratory syncytial virus //Proc.Soc. Exp. Biol. Med. —1976. -v. 151. -P.684-688.

111. Bartha A., Benco M., Vetisi F. Bovin respiratory syncytial virusfertozottseg es kovetkezmenyei nagyuzemi szarvasmarhaallamanyckban //Magyar allatov. Lapja. -1986. -v.41. N 8. -P.451-454.

112. Bennatt C.R., Hamre D. Growth and serological characteristics of respiratory syncytial virus //J. inf. Dis. -1962. -v.110. P.8-16.

113. Berthiaume L., Joncas J., Pavilanis V. Comparative structura,morphogenesis and biological characteristics of the respiratory syncytial (RS) virusand the pneumonia virus of mice //Arch. Ges. Virusforach. -1974. —v.45.- P.39-51.

114. Bloth B., Norrby E. Fractionation of respiratory syncytial virus components by centrifiigation techniques //Arch. Ges. Virusforsch. -1966. -v.19. -P.385-392.

115. Belak S., Ballagi-Pordany A. Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology// Vet. Res. Commun.-1993.-V. 17.-P. 5557.

116. Bolin C.A., Zuerner R.L., Trueba G. Comparison of three techniques to detect Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-bovis in bovine urine//Am.J. of Vet. Res.-1989 Vol. 50.№ 7.-P.1001-1003.

117. Brem S. Leptospirose des Rindes//Tierarztl. Umsch.-1984.-Vol.39, № 5.-P.392-399.

118. Brok K.V., Brain D.I., Rouse B.T. Potgieter L.N.D. Molecular cloning of complementary DNA from a pneumopathic strain of bovine viral diarrhea virus and its diagnostic application// Can. J. Vet.Res.-1988.-V.52.-P.451-457.

119. Brok K.V. Diagnosis of bovine viral diarrhea virus infection// Vet. Clin.N. Am. Food Anim. Pract.-1995.-V.ll.-P.549-561.

120. Braun R.K., Osburn B.I., Kebdrick J.W. Immunologic response of bovine fetus to bovine viral diarrhea virus// Am. Vet. Res.-1973.-V.74.-P.l 127-1132.

121. Boulanger D., Dubisson J., Pastoret P. Studies on the neutralization mechanism of bovine viral diarrhea virus//Second Symposium on Ruminant Pestivirus, Annecy,France.-1992.-P. 157.

122. Bovine respiratory syncytial virus infectioon in young dairycattlexlinical and haematologicalfindinys/verhoeff J., Van der VanM., Nieuwstadt A.P.K.M.I.//V et.Rec.-1984. v. 114,№ 1 .-P.9-12.

123. Boye M., Kamstrup S., Dalsgaard K. Specific sequence amplification of bovine viral diarrhea virus (BVDV) and hog cholera virus and sequencing of BVDV nucleic acid//Vet.Microbiol.-1991.-V.29.-P.l-13.

124. Bolin S., Moennig V., Kelso G.N., et al Monoclonal antibodies with neutralizing activity segregate isolates of bovine viral diarrhea virus into groups// Arch. Virol.-1988.- V. 99.-P. 117-123.

125. Donis R.O., Dubovi E.J., Molecular specificity of the antibody responses of cattle naturalle and experimentally infected with cytopathic and noncytopathic bovine viral diarrhea virus biotypes//Am. J.Vet.Res.-1987.- V. 48.-P.1549-1554.

126. Edwards S., Sands J J., Harkness J.W. The application of monoclonal antibody panels to caracterize pestivirus isolates from rumenant in Great Britain//Arch. Virol. 1988.-V.102.-P. 197-206.

127. Ellis W.A. Evaluation des epreuves utilisees pour le diagnostic de la leptospirose des anima ux demestiques// Inter. Office of Epizooties.-1983.-P.57-77.

128. Ellis W.A., Thiermann A.B. Restriction endonuclease analysis of Leptospirosainterrogans serovar hardjio isolates from cattle// Res. in Vet. Sci.-1988.- №44.-P.375379.

129. Ellis W.A. Leptospirosis: a review of veterinary aspects// Irish. Veter. News.1990.-Vol. 12.№2.-P.6-12.

130. Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine viral diarrhoea virus infections// Vet.Microbiol.-1999.-V.64.-P.89-109.

131. Howard C.J. Immunological responses to bovine viral diarrhoea virus infections//Rev. sci.tech.Off.int.Epiz.l990.-V.9,№l.-P.95-103.

132. Jubb K.V.F. et al. Pathology of Domestic Animals. Ed.V.2.Academic Press, N.Y., 1985. P.95-100.

133. Gruber A.D., Greiser-Wilke I.M., Haas L., et al. Detection of bovine viral diarrhea virus RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded brain tissue by nested polymerase chain reaction//J.Virol.Methods.-1993.-V.43.-P.309-320.

134. Gutekunat D.E., Malmquist W.A. Complement-fixing and neutralizing antibody response to bovine viral diarrhea and hog cholera antigens//Can. J. Comp.Med. Vet.Sci.-l964.-V.28.-P. 19-23.

135. Bovine Respiratory syncytial Virus: Host Range in Laboratory Animals and Cell Cultures /Matumoto M., Inaba Y., Kurogi H., Sate K., Omori T., Goto Y., Hirose O. //Arch. Ges. Virusforsch. -1974. -v.44. -P.260-290.

136. Chang W.H., Kim S.J., Seo J.S. Restriction endonuclease DNA analysis of Leptospira Field Isolates from Korea//J. Kor. Soci.Microbiol.-1987.-Vol. 22, .№ 4.-P. 10-12.

137. Chu H.J., Zee Y.C.,Ardans A.A.,Dai K. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine viral diarrhea virus in bovine sera// Vet.Microbiol.-1985.-V.10.-P.325-333.

138. Collins P.L., Huang Y.T., Wertz C.W.Identification of a tenthin RNA of respiratory syncytial virus and assignmeht of polipeptidesto the 10 viral genes//J.Virol.-1984.v.49.-P.572-578.

139. Comparison of a newly developed ensymelinked immunosorbent assay of bovine respiratory syncytial virus infections/Watenbriak P.,Brinkhof J.M.A.,Straver P.J.,Quak J.,De Leeuw P.W.,//Res.Vet.Sci.-1985.-v,№3.-P334-340.

140. Cooney M.K.,Fox J.P., Xall C.E. The Seattle virus watch.YI. Observations of infections with and illness due to parainfluenza, mumps and respiratory syncytial viruses and Mycoplasmapneumaniace//Am.J.Epid.-1975.-v.l01 .-P532-551.

141. Gutlip Paul A. Questions and ans were about serening testa//Disiena Jorn J.AIDS Patent Care.-1987.-v.l .№l-P25-27.

142. GutlipR.S., Lehmkuhl H.D.Leslong in lambe experimentakly infected with bovine respiratory syncytial virus//AM.J.Vet.Res.-1979.-v.40.-P. 1479-1482.

143. Defection of rinderpest antigen by latex agglutination test/Banaal R.P.,Joshi R.S.,Chandra U.,Sharma B.//Acta virol.-1988.-v.32,№3.-P275-277.

144. Diagnosis of bovine respiratory syncytial virus infections improved by virus detection i lung lavage samples/Kimman T.G.,Limmer G.M.,Straver P.J.,De Leeuw P.W.//Am.J.Veter.Res.-1986.-v.47.№ 1 .-P. 143-147.

145. Dubovi E.J., Geratz J.D., Tidwell R.R. Inhibition of respiratory syncytial virus by BIS (5-amidino-2-bensimidazolyl) methane //Virology. -1980. -v. 103. P.502-504.

146. Dubovi E.J., Geratz J.D., Tidwell R.R. Enhancement of respiratory syncytial virus induced cytopathology by trypsin, trombin and plasmin //Infect. Immun. — 1983.-v.40. P.315-358.

147. Ilashary M.A.S.Y., Silim A., Morin M. A natural cutbresk of bovine respiratory disease causend bu bovine respiratory syncytial virus //Cornell Vet. -1982. -v.72. N 3. P.325-333.

148. Electron microscopic evidence for bridges between bovine respiratory syncytial virus particles /Belanger F., Bethiaume L., Alain R., Lussier G., Trudel M. //J. Gen. Virol. -1988. -v.69. N 6.P.1421-1424.

149. Enzyme linked immunosorbent assay for detection of respiratory syncytial virus infection; application to clinical semples /Mo Introsh Kenneth, Hendry

150. Michael R., Fahnestock Margarel L., Pierik Lauren T. //J. Clin. Microbiol. -1982. -v.16.N. 2. P.329-333.

151. Evalution of a new latex agglutination method for detection of antibody to herpes simplex virus /De Girolami P.C., Dokos J., Eichelberger K., Bieno S. //J. Clin. Vicrobiol. -1988. -v.26. N 5.-P. 1024-1025.

152. Experimental pneumonia in gnotobiotic calves produced by respiratory syncytial virus /Thomas L.H., Stott E.J., Collins A.P., Jebbett J. //Br. J. Exp. Path. -1984.-v.65. P. 19-28.

153. Florent G., De Marnette // Enzyme linned immunosorbent assay used to monitor serum antibodies to bovine respiratory disease viruses.// Vet.Microbiol., 1986,11,4,309-317.

154. Fremont G. Utilisation d, unvaccin a virus vivant contrete rotavirus et le coronavirus.-Bul.Des Groupements Techniquens Vet.,1981.-№5.-P.5-14.

155. Frerking H. // IBR immer noch eine Geissel bei "Rinderversammlungen"? // Tierarztl.Umsch., 1998; Jg.53,N3 -S. 163.

156. Forsyth B.R., Coates R.V., Chanock R.M. Biophysical studies of respiratory syncytial virus. //Identification of two soluble complement — foxing antigens of respiratory syncytial virus //J. Bact. -1966. -v.91. P. 1270-1276.

157. Frankena K.; Franken P.; Vandehoek J.; Koskamp G.; Kramps J.A. // Probability of detecting antibodies to bovine herpesvirus 1 in bulk milk after the introduction of a positive animal on to a negative farm // Veter.Rec., 1997; Vol.140,N 4 -P. 90-92.

158. Gillete K.G., Smith P.C. respiratory syncytial virus infection in transported calves //Am. J. Veter. Res. -1985. -v.46. N 12. P.2596.

159. Graham D., Estes M.K. Pretecfitic enhancament of rotavirus infectivity: biologie mechanisms //Virokogy. -1980. -v. 101. N 2. P.432-439.

160. Gorman J.J. Viral peptides with structural homology to protein G of respiratory syncytial virus: Пат.199 729448 Австрия,МПК6 С 07К 014/135, G01N033/569: Biomolecular Research Inst. Ltd.№199729448^bn.04.06.97 Опубл. 03.08.00

161. Hall C.B., Douglas R.G. Modes of transmission of respiratory syncytial virus //J.Pediat. -1981. -v.99. P.100-103.

162. Hall C.B., Douglas R.G., Geiman J.M. Possible transmission by fomitos of respiratory syncytial virus //J. Inf. Dis. -1980. -v.141. P.98-102.

163. Hambling M.H. Survial of respiratory syncytial virus during storage under various conlitions //Brit. J. exp. Path. -1964. -v.45. P.647-655.1 89

164. Hamers C., di Valentin E., Lecomte C. et al. Virus neutralizing antibodies against a panel of 18 BVDV isolates in calves vaccinated with rispoval IM RS-BDD J. Vet. Med.B.-2000.-47,№ 10.-P.721 -726.

165. Haralambiev H.E., Bostandjieva R.M., Georgiev G.K. Cultivation of bovine respiratory syncytial virus jn cell line FLK and other cell cultures of sheep origin //Comptes rendus de 1 Academie bulgare des Sciences. -1982. -v.35. N 11. -P.1611-1613.

166. Honda E.; Katsu Y.; Fujii C. // A comparison of polypeptides and restriction endonuclease sites of BHV-1 isolates and identification of IPV virus in Japan // Japan. J. veter. Sc, 1989; T. 51. N 6.- p. 1143-1149.

167. Jetteur P.; Thiry E.; Pastoret P.P. // Enquete serologique concernant les virus IBR, CHV2, BVD, PI3, RSB et bovipestique chez les petits ruminants au Zaire // Rev.Elevage Med.veter, 1990; T. 4 P. 435-437.

168. Huang Y.T., Wertz G.W. The genome of respiratory syncytial virus is a negative stranded RNA that codes for at least seven mRNA species //J.Virol. — 1982. -v.43. P.150-157.

169. Ivvunovirological studies on human respiratory syncytial virus structural protein /Trudel M., Nadon F., Sequin C., Ghoubril S., Paument P., Trepanier P. //Can. J. Microbiol. -1986. -v.32. N 1. P. 15-17.

170. Improvement of respiratory syncytial virus replication inactively growing Hep-2 cells /Pona Marcal W., Lambert A.L., Lambert D.M., Rochovansky O.M. //J. Virol. Meth, -1983. -v.7. N 4. P.217-221.

171. Infection of gnotobiotic calves with a bovine and human isolate of respiratory syncytial virus. Modification of the response by dexametasone /Thomas L.H., Stott E.J., Collins A.P.,Crouch S., Jebbett J. //Arch. Virol. -1984. -v.79. -P.67

172. Kovarcik K. the development and application of an indirect ELISA test for the detection of antibodies to bovine respiratoty syncytial virus in blood serum// Vet. Med.-2001 .-46,№2.-P.29-35

173. Le Febure R.B., Tiermann A.B. DNA homology studies of leptospires of serogroupsSejroe and Pomona from cattle andswine// J. Vet. Res.-1986.- Vol.47,N 4- P. 959-963.

174. Lehmann R.; Kalbe P. // Unger C. IBR/IPV- (BHV 1-) Sanierung in einer Jungrinderaufzuchtanlage: Kurzmitteilung // Mh. Veter.-Med, 1990; T. 45. N 15 -S. 519-521,

175. Lemaire M.; Meyer G.; Ernst E.; Vanherreweghe V.; Limbourg B.; Pastoret P.P.; Thiry E. // Latent bovine herpesvirus 1 infection in calves protected by colostral immunity // Veter.Rec., 1995; Vol. 137,N 3 -P. 70-71

176. Lindberg A.L.E., Alenius S. Principles for eradication of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) infections in cattle populations // Vet. Microbiol. .-1999.-Vol.64,№2-3.- P. 197-222.

177. Linggi T., Wyler R. Das bovine respirstorische synzytiabvirus als Erreger van Respirationstrakterkrankungen des epidemiologiche Untersuchung in der Schweis //Schweiz. Arch. Teirheilk. -1985. -Bd.127. H.10. -S.651-659.

178. Luekrajang T., Wangsar T., Phanuphak P. Production of antirabies serum in equine origin // Laboratory techniques in rabies.-1996.-P. 401-403.

179. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004, part 2-P. 276-289.

180. Marcus S.; Avraham A.; Zacks M. // A clinical and serological survey in dairy herds vaccinated against IBR, BVD and PI3 infections // Israel J.veter.Med, 1992; Vol. 47,N2-P. 61-66

181. Marshall R.L., Rodrigues L.L., Letchworth G.J., Characterisation of Envelope Proteins of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus, Bovine Herpesvirus I by Biochemical and Immunological Methods., // J. Virol., 1986, 57, 3, 745 — 753.

182. Martin H.T. Indirect haemagglutination test for the detection and assay of antibody to bovine respiratory syncytial virus //Vet.Rec. —1983. —v. 113. N. 3. P.290-293.

183. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of viruses //Intervirology. — 1982.-Vol. 17. P. 104-105.

184. Menulty M.S., Bruson D.G., Allan G.V. Ecsperimental respiratory syncytial virus pneumonia in young calves: Microbiologie and immunofluorescent findings //Am. J. Vet. Res. -1983. -v.44. P. 1656-1659.

185. Monoclonal antibodies protect against respiratory syncytial virus infection in mice /Taulor G., Stott E.G., Bev M., Fernie B.F., Cote F.J., Collins A.P., Hughes M., Jebbett J. //Immunol. -1984. -v.52. P.137-142.

186. Munoz M.C.; Merino N.; Nunez A. // Estudio morfopatologico y serologico en un brote de aborto bovino asociado al virus IBR // Rev. Salud anim, 1989; T. 11. N2. -P. 118-124.

187. Nakane P.K., Kawaoi A. //Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation//!. Histochem,Cytochem.-1974.-Vol.22,№ 12.-P. 1084-1091.

188. Solsona M., Porrin B., Porrin M., Noussa A. // Recherche des anticorps Contre le virus de la rhinotracheite bovine infectieuse par la methode ELISA. // Bui.Acad.Ve.France, 1980, 53, 215-255.

189. Tanyi J.; Bajmocy E. // A szarvasmarha fertozo rhinotracheitis (IBR/IPV) virus okozta agyvelogyulladasahoz // Magyar allatorv. Lapja, 1989; T. 44. N 12 -p. 741-742.

190. Wilson M.B., Nakome P.K. // In: Knapp W.P. Immunofluorescence and related staining techniques. // Amsterdam, Elsevier/North Holland, 1978, 215-224.

191. Van Nieuwstadt A.P., Verhoeff J. Serology for diagnosis and epizootological studies of bovine respiratory syncytial virus infections //Research in Veterinary Science. -1983. -v.35.- P.153-159.

192. Niskanen R., Alenius S., Larsson B., Juntti N. Evaluation of an Enzyme-linked Immunosorbent Assay for detection of Antibodies to bovine virus diarrhea virus in milk// J.Vet. Med.-1989.-V.B36.-P.l 13-118.

193. Niskanen R.Relationship between the levels of antibodies to bovine viral diarrhoea virus in bulk tank milk and the prevalence of cows exposed to the virus// Vet.Rec.-1993 .-V.l 33.-P.341-344.

194. Nucleic acids of respiratory syncytial virus /Lambert D.M., Pons M.W., Mbuy G.N., Dorach-Hasler K. //J. Virol. -1980. -v.36. P.837-846.

195. Nunez A., Caatell S. Defecctien de anticuerpos contra el virus syncytial respiratoric bovine por seroneitralizacion //Rev. Salnd anim. —1987. —v.9. N 3. P.266-267.

196. Palfi V.; Glavits R.; Hornyak A. // The pathology of concurrent bovine viral diarrhoea and infectious bovine rhinotracheitis virus infection in newborn calves // Acta veter. hung, 1989; T. 37. N 1/2 p. 89-95

197. Pirie H.M., Petrie L., Pringle C.R. Acute fetal pneumonia in calves due to respiratory syncytial virus //Vet. Rec. -1981. -v.108.- P.411-416.

198. Porter D.D., Mysk K.B., Prince G.A. The age dependence of respiratory syncytial virus growth in ferret lung can be shown in organ and monolayer cultures //Clin. Immund. Immunopath. -1980. -v.15. N 3.- P.415-423.

199. Propagation of bovine respiratory syncytial virus in calftesticle microcarrier culture /Charlier G., Wellwmans G., Lale A., Strobbe R. //Arch. Exp. Veterinarmed. -1984. -v.38. N 6.- P.894-899.

200. Properties of a respiratory syncytial virus isolated from a sheep with rhinitis /Wermann J.F., Liggitt H.D., Parish S.M., Word A.C.S., Lea Master B.R. //J. Vet. Res. -1985. -v.46. N 4.-P.100-104.

201. Ramadass P., Marshall R.W. Specific differentiations of Leptospira interrogans serovar hardjio strain hardjiobovis from strain hardjioprajitno by DNA slot blot hybridization // Res. in Vet. Science.-1990.-№49.-P. 194-197.

202. Respiratory syncytial virus antibodies in non-human primates and domestic animals /Richardson-Wyatt L.S., Belshe R.B., London W.T., Sly D.L., Camargo E., Chanok R.M. //Lab. Anim. Sci. -1981. -v.31. -P.314-415.

203. Respiratory syncytial virus infections in mice /Taylor G., Stott E., Hughes N., Collins A.P. //Infect. Immun. -1984. -v.43.- P.649-655.

204. Respiratory syncytial virus pneumonia in Friesian calves: physiological findings /Lekeuk P., Verhoeff J., Hajer R., Breukink H.J. //Res. In veter. Sc. -1985.-v.39.N3.

205. Respiratoiy syncytial virus pneumonia in young calves: Clinical and pathologic findings /Bryson D.G., NcNulty M.S., Logan E.F., Cush P.F. //Am. J. Vet. Res. 1983. -v.44. N 9.-P. 1648-1655.

206. Respiratory syncytial virus vaccine, Merck and Ca. Inc. IIaT.46727. hpjiahflhji.saabk. 19.4.78. N768/78. Ony6jiHK. 7.9.83. №61k 39/12, C. 127/08.

207. Rossi C.R., Kiesel G.K. Bovine respiratory syncytial virus infection of bovine embryonic lung cultures: enhancement of infectiviey with diethylaminoethyl-dextran and virus-infected cells //Arch. Virol. -1978. -v.58. N 3.-P.227-236.

208. Sandvik T. Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhoea virus infections in cattleVet. Microbiol.1999.-64.-P. 123-134.

209. Silva F.F.; Castro R.S.; Melo L.E.H.; Abreu S.R.O.; Muniz A.M.M. // Anticorpos neutralizantes contra HVB 1 em bovinos do estado de Pernambuco // Arq. brasil. Med. veter. Zootecn. -Belo Horizonte, 1995.-P. 597-599.

210. Singh E.L. // The potential of semen and embryos for introducing pathogens into the uterus // Congress proceedings. Vol. 5. Abstracts. S.l, 1988.-p. 72-79.

211. Schlafer D.H.; Gillespie J.H.; Foote R.H. // Experimental transmission of bovine viral diseases by insemination with contaminated semen or during embruo transfer // Dt. tierarztl. Wschr, 1990; T. 97. N 2,- S. 68-72

212. Schwartz AJF, York CJ, Zirbel LW, et al // Modification of infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus in tissue culture and development of a vaccine. // Proc Soc Exp Biol Med 1957, 96:453-458,.

213. Senterfit L.B., Baldridge P.B. Separation and concentration of respiratory syncytial virus (RSV) antigens //J. Immunol. Meth. -1974. -v.4. P.349-357.

214. Shahrabadi M.S., Lee Patrick W.K.Calcium reguirement for syncitium formation in Hep-2gells by respiratory syncytial virus//J.Clin. Microbiol.-1988.-v.26.№l.P139-141.

215. Smith M.H., Frey M.L., Dierks R.B. Isolation and characterisation of a bovine syncytial virus/TVet.Rec.-1974.-v.-94.-P.599.

216. Spieck M. // Immunodiffusions test zum Nachweis von Antikörpern der infektiösen bovine Rhinotracheitis in Vergleich mit Neutralisations und Ensum test. // Tierarstl, Umschan, 1986, 41, 958-961.

217. Storch G.A., Reed C.A., Dalu L.A. Evaluation ofa latex agglutination test for herpes simplexvirus//J.Clin.Microbiol.-1988.v.-26.№4.-P.787-788.

218. Sttot E.J., Thomas L.H., Taylor G., Collins A.P., Jebbett J., Crouch S. A comparion of three vaccines against respiratory syncytial virus in calves // J.Hyg-1984. v-93.-P.251-261.

219. Structure of bovine respiratory syncytial virus/Ito Y., Tanaka Y., Inaba Y., Omori T.//Arch.ges.Virusforsch.-l973.-v.40.-P. 198-204.

220. Stott E.J., Taylor G. Respiratory syncytial viras//Arch. Virol.-1985.-v. 84.-P.1-52.

221. The characterisation and uses of monoclonal to respiratoiy syncytial virus/ Stott E.J., Bew M.H. Taylor G., Jebbett J.,Collins A.P.//Develop.Biol.Standart.1984.

222. The detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal aspirates: assesament formulation, and eveluation of monoclonal antibodies as a diagnostic reagent/Freke A., Stott E.J., Roome A.P., Caul E.O.//J.Med.Virol.-1986.-v.18,№2.-P. 181-191.

223. The development of monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and their ugein liagnosis immunofluoreacence/Routledge E.G., Mcquillin J., Smason A.C.R., Toms G.L.//J. Med. Virol.-1985.-vl5.№3.-P305-320.

224. The growth of respiratory syncytial virusin organ cultures of bovine foetal trachea/Thomas L.H., Stoff H.J., Jebbett J., Hemiltot S.//Arch.Virol.-1976.-v.-52.-P251-258.

225. The pathogenesis of respiratory syncytial virus infection in cotton rats/Prince G.A., Jenson A.B., Horawood R.L., Camargo E., Chanock R.M.//Am.J.Pathol.-1978.V.93 .-P.771 -784.

226. TlorentG.,DeMarneffe C.,Boiler E.Bovines respiratorisches syncytial virus(BRSV) in der Sciwei:Eline serologische stutie//Schwauz.I.h.Tiasfeuk.1985.-v.10.-P.127.

227. Trepanier P., Payment P., Trudel M. Concentration of human respiratory syncytial virus sulphatepolysthylene glycol or hollow firbe ultrafiltration//!'Virol.Meth.-1981 .-v.3 .-P.201 -211.

228. Treuhaft M.W. A colorimetric assay for quanti fication of defective interfering particles of respiratory syncytial virus//J.gen. Virol.-1983.-v.64.-P.1301-1309.

229. Trauhaft M.W., Beem M. O. Defective interfering Particles of respiratory syncytial virus infect //Immun.-1982.-v.37.-P. 439-444.

230. Ueba O. Purification and polipeptides of respiratory syncytial virus//Microbiol.Immunol.-1980.-v.24-P.361 -364.

231. Vega S., Rosell R., Paton D.J., Orden J.A. Antigenic characterization of bovine viral diarrhoea virus isolates from Spain witch a panel of monoclonal antibodies//.!. Vet.Med.B.-2000.-Vol.47,№9.-P.701-706.

232. Virus Gross-infection in paediatric wards/Gardner P.S., Gourt S.D.M., Brocklebank J.T., Downham M.A.R.S., Weightman D.//Br. Med.!-1973.v.2.-P.571-575.

233. Welsh E.E., Hruska J. Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins: Identification of the fusion protein// J.Virol.-1983.v.47.-P.171-177.

234. Waleh E.E., Schlesinger J.J. Brandriss M.W. Purification and characterisation of GP90, one of the en velope glycoproteins of respiratory syncytial virus//J.gen.virol.-1984.v.65.-P. 761 -767.

235. Wellemans G.,van Opdenboach E. Vaccination des bovins contre le respiratory syncytial virus (RSB) au moyen d'une souchs attenuee //Ann. Med. Vet. —1978. — v.122.- P.537-543.

236. Young P.L.; Sweeney J.L.; Smith G.A.; Rodwell B.J. // Failure to detect infection of the bovine foetus after inoculation of a prototype Australian strain of bovine herpesvirus 1 // Austral.veter.J, 1994; Vol. 71, N 3 P. 92-93.

237. Veselinovic S.; Veselinovic S.; Medic D.; Ivkov V.; Grgic Z.; Micic R. // Disturbances in bovine reproduction caused by action of IBR/IPV viruses // Proc.ofthe 12.Intern.congr.on animal reproduction. 1992. -P. 1605-1607.

238. Woldehiwent Z. Rabies: recent developments // Res. in Veterinary Science. -2002, Vol.73.-P. 17-25.

Информация о работе

Сивков, Георгий Викторович
кандидата биологических наук
Щёлково, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы