Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства парвовируса свиней и его антигенная активность в ассоциации с Leptospira Interrogans

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства парвовируса свиней и его антигенная активность в ассоциации с Leptospira Interrogans"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО КОНТРОЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи ДЛЯ СЛУЖЕБНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ

экз. № 000048 %

СКВОРЦОВА Ирина Ивановна

УДК: 619:578.822:579.834.115

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПАРВОВИРУСА СВИНЕЙ И ЕГО АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ В АССОЦИАЦИИ

С LEPTOSPIRA INTERROGANS

03.00.06 — ВИРУСОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА—1992

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против энтеро- и нейровирусных инфекций и лаборатории контроля и стандартизации препаратов против сальмонеллеза, лептоспироза и эшерихиоза Государственного ордена Трудового Красного Знамени научно-контрольного института ветеринарных препаратов.

Научные руководители: доктор медицинских наук МЕЛЬНИКОВА Л. А., кандидат биологических наук СОБОЛЕВА Г. Л.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук СТАРЧЕУС А. П. (УкрНИВИ),

Украина, г. Киев, кандидат биологических наук СУЛИМОВ А. А. (ГНКИ).

Ведущая организация — Белорусский НИИЭВ им. С. Н. Вы-шелесского (Белоруссия, г. Минск).

Защита диссертации состоится «7^» сИО^ЖхОс, 1992 г. в/о часов на заседании специализированного совета Д. 120.85.01 при Государственном ордена Трудового Красного Знамени научно-контрольном институте ветеринарных препаратов по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ГНКИ.

Просим принять участие в работе совета или выслать Ваш отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНКИ ветпрепаратов. **

Автореферат разослан « /г » ФСа^/ХиЛ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук /О. А. КОЗЫРЕВ

- ï -

О О С G 4 8

I. ОЩШ XAPÂirrSFiîCTHKA РАБОТЫ

^ условиях современного промыглеккого свиноводства бол«гни органов воспроизводства свике8 кнфзашодаой чтиодогия ямсвт яирокое распространенно я наносят хозяйствам ощутикмЯ лсонимячесхиЯ ущерб. Срэдн вирусных заболеваний парво-вирусная ннфенци* свянеЯ приобретает особое значение в связи с особенностями патогенеза, бессхмптаиным течением чнфокдаи и трудность« установления диагноза при нал-том антител « гармвирусу у репродукторного поголовья свиней.

Ларзомруе.чая вяфйышл свиной (¿БИС) кляюгееекк проявляется только у супоросных сьинаы&ток и сопрововдаотея гибздъэ »ибрионов, «унификацией плодов, рокдениеи ыартвнх к ск&бых поросят, уиеньяе-нием таела поросят в помете, бесплодием, прохолостгьи, pesa -абортакя { Ясяее llr.fe ,1981; ^rat-hall et al.:ç>84), У es в otswx других половозрзстккх групп сна протекает в гиде янаппар&тной инфакпия.

Наличке г.арвопмрусиоЯ ккфзкцян свкнеЯ в СССР уст&иозхзнэ з 1932 г. (Б.Г.Орляякин, Л.В.Коааявва, О.Н. Сайте, 1984). Тем не менее, заболевание является сравнительно новым и нэдсстатожо изученным.

Лвптоспироэ б инфекционной патология, еопровоадааярйея порааекиеы органов воспроизводства, заникает не ?îsh«s валкое место. Основными клтшгеескикн признаками лептосгагроза у свиновато» являются аборты, роддэнна картвого млн нэхгазнэспосебнего плода. Абортируют чаде всего катки первого, второго опорооов.

В современных условиях наиболее распространенной формой лептоспироза являвтоя бвссямптокное пврэбояеааииа, а евгзи в чои

вдзкзхза? опредехеккн» уруддссте « ceosspci»Hwois сЗкаружнкя вгафвгзда и oSíens«í6H«K шр ярофштахя s денмшя

якБмашв.

Е хвгяймасг премыалэккогс таг», nps¡ йея&жой жпщ&мгр&шж зшзйяаяг r¿a м»р&?«м*й5йгх rss^wvet, трвомруси&я янфснмгвя сашей к «агя*вопй|кз& яедадо прежний? по «ау ис«еа®ш»8 кифмсцхь", wo прггэдаг* к иаобхвдйжяегя s сж&9Ш> срока ш&ииэхроя»** гоигаша ггрзгйз eössa; бозззкей. Это стакоалтоя в&эмо«ны» при

явп«п*смю*я Accoî-^cspossasaix гахщк„ ксгара® прхеодаг в форикро-sss&9>îsï«ïs. иэвбаодейлго урэзкя s огнокдшш нескольких ssSa-ааа&каВ в ¿exea доротяк» «рока. Шачснзг, пврвгвхткгкш ив^аыа-тш в агмзжшхв яа&ях гфвфшаготевкх гфвпара-ро» ггротяв п«рзв-

» хеездсодюк ееекей «ш*8?ся разработке. »»с»ша!рвв*лимЕ кзгкфщ, водвр&ьдах окао* «ркшвачкэй до&а зжк-reîîa nés?«?, s&sec внфвкшй и eosps^sat®». еров* соядоних недеспркдо-чкзасдаг з xseowsas « SÏÂSÏ бажввн««.

?«>:ofí обуаяовлека. сходка:« ндскн»-

«scesK язэдпдодешз » вй^оюва рйспроетрвнсшгек сй«кх якфеккай.

Нал* яеучзгеь бязло?йчс'»й8е ваойем» па,р»овкрус:а

зкакй (ЕЙ) s afo «к*8гекн£® «enratocrb i асвогмадоя с

S^ptesisira iKtsnvjgass »

3здачя исосздазагый:

- ваусать иакморкз Сяогопячоскка свойства жгаиаюв паразовхру-

CS.

- пг/ш'сь тщз:»у р&спрзстраивннзста п&рвовжрусвой ыкфвкцая г вжакмодоасшк жззяШз?зах;

- sírorosMTb кках7хгзрзм№вг& пвреовкрусгшй rips napa г я кзутато era смтетадуа ахгэталиеегь;

-эггс-йдчкгть отгягаааьныв ео^тиотеяаш «ттнгеггоз пярао м сьюм*- я ¿ептосп»? с цвдь» воздел»'? гс-гсалкро»»»-а»гс 5копр*йара?й*

ИаПрЯЖ&ИЙОГО КВЙС/КЯТвШ У ДИЗорлТЗ?-

шдс кдаотакх к садней;

- опргдзлать врокк фор®рогакйя в 1фсдожда?алг>кос?г>

тага ггрэткв парадшрусной нкфэкшш й я«п¥оегшро8й у сш*%й, прккк-71лг асеоцккровсйюгм пр®пяр&?0н;

- нзу-кть срок гсдхоств ьсестдар-ээакиого биопрепарат«|

- изготовить и йсп«?а?г. отл=яс-??рошг8дв«<иа серж биопрепарата к гроаести кх произведет?®««*® испытает а хоая^зда&х.

Научная нояаат. РайраЗстгш* ус.«сгш йк&кгакагщи ОБС фордг.™ ляиом и изучена яж'нрснд&я ш«ч8ь;к)ет5> ййаятавирогшшых п&расг«-руснйх грзпараигоз а опытах на я«бср&«>ркнх й С8ж*«80зюз«йе?а?.ь*них акватных.

Определены оптшяйыййь соатптняя парвогярусмог-о и ро8яа?о антетекимзе коняоквктов а цваьв с-оа^адая ассодарйв&ннс.-'о йнопропйрата, пра которой являкня яойхзфэки^н »¡^ыгогкчлвша процессов не набжядаяоеь.

Эксг.9ргш8а?ал&кэ сбосковвя я споесО »згоусаг^кул

ассодагров&кноЯ аакцякы та оскогя гшквдпмгснэ* взякда* ВГШН просив лвптосплроаа сеяв.скокоал«стганн8Х зкяхотнш * анак?язя?ро-вакнкх препаратов парновнруса с синей.

На ассоцяировалиу» вакцану протав гвптогпйроэ& ;г пхрвоэмрус-ной инфакцик евшей получено авторское свкдетайъство 1533305 с приоритетом от 21 кадя 1587 г.

Пршсткчвская цснчость рабски, Установхакэ «шзгакэ ОБИС в свиноводческих хозяйствах страны, выделен яташ парзоЕягуса свиней к изучены эго биодогячвеказ сзолоте».

йзучзка карата распространенности ПВКС в хозяйствах раэяичксЯ производственной мощности. С гтомогзьс РТ'РА выявлена аирокая дариу-

яйцйя ПВО ерзда СЕКнай раэяжошх половозрастня* групп.

Разра^от&н лабораторный регшяок?, промышленная технология подомом к ттртмнешя ассоциированной в&ктэдтг протав лэптосш-рсза » парвэБЯруеной ймфзкцкй евшей. Производство в&кцаны освоено ка Ставропольской бнофабрикв. Разработаны иэтоды контроля п&кцянм.

введено амрокое проиаводсяпеккое испытание «ссоцикрс-шшгого биопрепарата в квбх&голояучкых по ааптосшрояу к парее-вкруской кнфаяцяи связей хойкйст'Бгх.

Агя&бвтя. Основ»» »¿атвряаяы проведениях исследований йвдеабка к обсувд-эиу ка пятой» десятой и едникздаатой конфэрвк-ц»яг ксаэдасг уггзагг ВГНКК вегпрвпьрьтов (йосква, 1583 г., 1938 г., 1939 г.), к» ееседеззш Ученого совета ВГгКй воторвп&ралоз (1391 г.) на тяхлбор&чощоч соввс-анкя сотрудщжов ВШШ ваттееггарагов <1991 г.).

Зйкжзчнмяьнкв аадли кос&едо&змкЗ прсалн хомгсскоиксе кеиы-уакяв в ЕШСМ ввгпрегсарат&в и ГУВ Гогжгрепрош СССР. Ассоциированная в&кцина. прошв яетпгоегарояа к первоаирусной кифвкцкк свиней окспонхровалась иа ВДНХ СССР (19-31 г.).

ЙУбйтаажп.. йа те»* диссертация спубглясгакм 3 работа, подг-суоЕй»ио 9 ибрц&ткякэ-гехизгсееккх догукентов, утзерздзнних ГУБ Госы^окгрока СССР, получено авторское сгвдетогьстБО не ассо-цгагрож&яхую вакцнцу промяв дсптоспкрозЕ и парзоЕируснаЯ кнфзкцин ешшй.

¡¡зрвгметржроешо Z отггега по каучяс-ке еяедоватагьской рабом: .Ш ©19:616:615:372:616.986.7, » гос.регистрации 01840065125 и Ш 619:053.5:659.2, № гос. р»гнетрацш 01860107522.

а структур, диестотатик. Диссертация изложена на страницах иатаяопгского текста й вздадает введение, об?,ор гури, авбвггаоддо вемвдовакия, обсувдвгете рвсульт&тов, выводы,

практические предложения и список литературы. Работа иллвстриро-вана таблицами и 3 рисунками. Список использованной

литературы вклячает 1&В источников, из них ¡¿Л иностранных.

Автор благодарит заведующих лабораторий - заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора, доктора зетеркнарных наук Малахова О.А. и доктора ветеринарнчх наук Ивановского Э.В. за научно-мвгодическуо помощь в организации и проведении исследований.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССВДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в соответствии с заданием (9 116-14 от II.03.1983 г.) ГУБ МСХ СССР по межотраслевой научно-еехничаской программе (02.01.Л) во Всесоюзном государственном научно-контроль-ноы институте ветеринарных препаратов.

Опвгано-промшленные серии ассоциированной вакцины против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней изготовлены на Ставропольской бкофабрике и испытаны в ряде свиноводческих хозяйств России и Украины, неблагополучных по ПВИС н лептоспирозу.

Вирусы.При проведении экспериментов использовали референтные штаммы " Ьеипеп" (получен из Франции), " САРЗ -V - 197" (получен из ЧСФР) и эпизоотические штаммы "К" (ввдалвн нами из внутренних органов абортировавшей свиноматки 1982 г.), вй-82" (выделен Б.Г. Орлянкиннм и соавт.1982 г.).

Культуры клеток. Прииеняли первичные культуры клеток! почки эмбриона свиньи (ГОС), тестикул поросят (ТЛ), цитовидной яелэзы свиней (ЩС), почки теленка (ДГ); перевиваемые линии клеток: почки эмбриона свиньи (СЛЭЗ), почки поросенка (ЛЖ), почки теленка (ЛГ-80). Кроме того, использовали эксплантаты легких и кишечника

эмбриона свиньи (ЭЛИС и ЭКЛС),

Гипопикиуннуй сыворотки к ЛВС получали от подсвинков массой 40-60 кг и кроликов массой 3-3,5 кг, иммунизированных концентрированными препаратами ПВС. Титр антигемагглютинирущих антител составляя у кроликов 1:128-1:256, у свиней 1:512-1:2048.

Вы.вдлоня? и идентификация парвовируса сринэй. Выделение отвага ПВС осуцвствляли в первичной культуре клеток 11ЭС, которую вырацниада в ергдз 0,5^-ного гндролнэата лактальбушна с добавлением 105« сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков. Иденти-фж&цгш вида лонного иташга проводили в реакции нейтрализации с сывороткою: к референтному и выдаленному штахыгш, а такке с помогаю катодов юздунофлуоросцонции и электронной микроскопии.

Изучают ремаггявтннярувяей активности ПБС проводили с эритро-цнгакарской свинки, цыпленка, белой шш, барана, коровы, норки, ляекца, свиньи, лошади и собаки. РГА ставили кикроиетодом в различных буфэрных системах (фосфатно-буферноы растворе, вероналовом и ацетатном буфере) при рН-среды 5,0-7,8; теипературе 4°С, 20°С и 37°С, концентрации эритроцитов 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4$. Титром гемагглютинирущей активности вируса считали наибольшее разведение исследуемого материала, при которой наблюдалась полная агглютинация эритроцитов морской свинки.

Титрование вирусов. Степень размножения вирусов устанавливали по гемагглятинируюцвй активности в РГА, ее значение вырагали в ГАЕ (геьштлоткнирувврсс единицах).

Титрование сывороток. Для выявления и количественной оценки специфических антител к парвовирусу свиней использовали РТГА. Сыворотки ррока перед постановкой реакции освобождали от терыолабиль-гаос, терыостабильных ингибиторов геиагглютинации и неспецифических

гемагглнгянинов. За титр антител пригашали продельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглптннируюцуп активность антигена. Диагностическим титром считали нали-гле в кспшуемнл сыворотках специфических антител в разведении 1:64 и вьше.

Лептоспиры. В работе использовали 24 производственных и диагностических штамма лептоспир 22 сероваров 20 сарогрупп.

Питательные среди для выращивания лептоспир, Лептоспиры вкра-цивали в жидкой сывороточной среде, основой которой являлся стерильный фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4. Питательную среду готовили добавлением к стерильному фосфатно-буферному раствору Ъ% сыворотки крови барана.

Методы работы со штаммами лептоспир. Накопление, морфологию и подвижность лептоспир оценивали просмотром культур в луче света осветителя и микроскопией культур в темной поле зрения микроскопа. Концентрации лептоспир определяли подсчетом в камере Петрова-Хауссера. Чистоту культур лептоспир контролировали микроскопией раздавленной капли и высевами на ЫПА, ЫПБ, МПДБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро. Работу по поддержании, культивированию производственных и диагностических птаммов лептоспир проводила кандидат биологических наук Соболева Г.Л.

Серогрупповую принадлежность производственных атамуов лептоспиз. наличие специфических антител к лептоспирам в сыворотке крови животных и антигенные свойства ассоциированного биопрепарата определяли в РМА по стандартной методике.

Вирулентность лептоспир определяли по величине 50^-ной летальной дозы (ЛДвд) для золотистых хомячков, выраженной количеством микробных клеток.

Превентивные свойства сыворотки крови иммунизнрованных жи-

вотных определяли внутримышечным введением 0,5 см3 исследуемой сыворотки 10 золотистым хомячкам. Через 2 часа животных заражали внутркбршинно 10 ЛД-q вирулентного итамма лептосгтир серогруппы Pomona . Контрольным хомячкам вводили сыворотку крови невакци-няров&нных животных.

Нивотныа. В опытах использовали белых мышей беспородных (массой 16-18 г) 100 голов, золотистых хомячков (массой 45-50 г) 3500 голов, морских свинок (массой 350-400 г) 120 голов, крали-ков порода нкншияа (массой 3-3,5 кг) 765 голов, свиней крупной бзлой породы (кассой 45-50 кг) 130 голов и (кассой 25-30 кг) 35 голов. Дроизводственныв испытания проводили на поголовье около 98 тыс. свиноматок.

Статистическая обработка результатов. Результаты исследований статистически обработаны по методам И.П.Ашмарина, А.А.Воробьева (1962) к Б.С.Бессмертного (1967).

2.2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Выделение, идентификация парвовируса свиней шт."К" и изучение его геиагглвтинирующих свойств.

Во время вспышки заболевания с признаками нарушения функции воспроизводства свиноматок, из внутренних органов абортированных плодов 50-60 дневного возраста гутем серийного пассирования в первичной культуре клеток ДЭС выделили шт."К" парвовируса свиней (совхоз "50-лет СССР, Московской области,1982 г).

С помощью перекрестной реакции нейтрализации установили антигенное родство между референтным штаммом " Leanen " и исследуемым штейном "К". Методом имцунофлуоресценции определили, что у обоих штаммов синтез вкрусспецкфического белка начинался в ядре инфици-

- Э -

рованных клеток через 6 часов после заражения и достигал ышсси-нуиа к 10-12 часам. В присутствии 5-брон, 2-дезокснурндина наблюдали ингибицив размножения референтного и выделенного яташса и не отмечали таковой у вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней ( шт. " v - 91"что свидетельствовало о наличии ДНК у исследуемых вирусов. Действие эфира, хлороформа и трипсина не влияло на инфекционные свойства референтного и выделенного штаммов. Нагревание вирусов до 56°С в течение I часа, хранзипе при 4°С и минус 20°С (в течение года) не снижало титра янфекционности. Плавучая плотность референтного и исследуемого штамма в градиенте плотности хлористого цезия составляла 1,38 г/см3. Электронномивроскопи-чески установлено наличие изометрических частиц около 20 нм.

Таким образом, выделенный птамм по своим морфологическим, антигенным и физико-химическим свойствам не отличался от референтного штамма " Ьаиявп " • Работа проводилась совместно с доктором медицинских наук Мельниковой I.A. и кандидатом биологических наук Николаевой Н.Д.

Гемагглютикирующие свойства парвовируса свиней имеет некоторую вариабельность в зависимости от итаима. В связи с этим изучали гемагглютинируицую активность выделенного атамка парвовируса свиней.

Установили, что вирус агглютинировал эритроциты цыпленка, белой мыши и морской свинки; эритроциты норки, лисицы, собаки, свиньи, барана и крупного рогатого скота он не агглютинировал. Наибольшей чувствительностью к ПВС обладали эритроциты морской свинки.

Максимальная гемагглвгинирущая активность ЛВС от."К" проявлялась при использовании фосфатно-буфврного раствора рН-7,2 ,

температурного режима 4°С, экспозиции смеси 1,5 ч с 0,бС-ной взбосыз эритроцитов морской свинки.

Специфичность РГА с парзоЕнруеным антигеном проверяла в РТГЛ с гомологичными к гетерологичншм сыворотками. Специфическая ( гяшркнцукная) сыворотка к ПВО полностью годавллла гакагглсти-к&цйв п&реэвируса шт. "К'\ в то время как специфические сыворотки к ротавярусу свиной, вирусам энтерита корок, трянсыиссивного гастроэнтерита свиней 15 классической чуки свккой на вызывали ее задзркху.

Результаты проделанной работы позволили заклячить, что выде-яанкнй кт&ии по своки ге¡¿аг'гдагя'кирусвойствам но отличался от раяаз изучеш'^х нтажов.

2.2.2. Распространенность гтервовирусной икфетаии в ориноводчзекях хо эяйс твах

Серологическое обследование свиноводческих хозяйств, та.иалк-33&_ЗШ2х. В период с 1335 по 1939 гг исследовали с поморье РТГ'А сыворотки крое;; свиней из хозяйств разных регионов (Россия, Украина, Эстония, Лктва). У свинзиаток наблюдает бесплодие, мало-чкелвнии® пометы, мумификации, квртворовдзния, рождение слабых поросят, аборты. Лшпюстачаекжи титром считали наличие в испытуемых сыворотках специфических антител к ПБС в разведении 1:54 и вше.

Установили кирокую распространенность ПВИС в свиноводческих хозяйствах различной производственной косности: из 1? хозяйств -в 15(83,250 обнаружили пояожкталько реагирующих ясивотннх. Б обс;Эы, из 497 исследовал них проб сыворотки содзркаля спецнфичзскиз антитала к ЛВС 315 (63,3£), при этом в половике из них обнаружили

антигвмагглюгикинн в титре 1:1024 - 1:36384 в 16 и болээ раз превышающем диагностический. Обследованием свиней раяличных поло-зозрвст!гых групп выявили наиболее значительную часть положительно реагирупчих животных среда основных и ремонтных свиноматок (78 и 74,соответственно).

Полученные данные позволяют заключить о широкой распространенности ШИС в хозяйствах.

2.2.3. Получение кнактивированного сорбированного

препарата парЕовкруса свиней и его испытание в качестве моноантигена

Изготовление инактнвированного сорбированного парвовирусного препарата. Использовали химически чистый формалин, содержаний ие менее 37% формальдегида, который вносили в вируссодвржащую суспензию шт."И-82" (титр гекагглютининов до инактивации 1:512 -1:2048 ГАЕ/0,025 см3 ) до достижения конечной концентрации 0,05 0,25 , 0,5^ и инкубировали при температуре 37°С в течение 72-120 часов.

Полноту инактивации вируса определяли по отсутствия его репродукции в культуре клеток ШК в течение 3 пассажей. Влияние инактиватора на гемагглютинирущую активность ПВС оценивали по титру гемагглютининов до и после инактивации. Безопасный парво-вирусный препарат с максимальной гемагглюткнирующвй активностью получили при инактивации вируса 0,2555-ньм формалином в течекие 72 ч при температуре 37°С.

Изготовление сорбированного парвовирусного препарата производили смешиванием инактивированной формалином вирусной суспензии со стерильным гелем 2^-ноЙ гидроокиси алюминия в соотношении 5:3.

Изуадинэ антигенной активности киактивированных сорбиво-ванта препаратов парвдвяруса свиней проводили на кроликах и подсвинках к оценивали еа по титру ангигемагглютюшрующих антител« выявляемых в РТГА. Кроликов (90 голов) прививали однократно пнутришшачно или внутривенно в объема 0,5 1,0 2,0 см3. Дэ ю&огкиэ&цгш и № 14, 21, 35, 42, 63 дки после прививки у тавотных брали кровь для определения титра антител.

Наиболее выраженная интенсивность аитителообразования наблюдалась при внутривенном введении инаятивированного препарата в дом 1(0 см3 (р 0,001). На 21 день после инъекции препарата в такой дозе титр антигеыагглвтиикнов составлял 1:294+5,9,в последующие сроки исследования - 1:182+3,6 1:120+3,0 1:74+5,6 соответственно. В дальнейшем антигенную активность инактивиро-ванннх препаратов ЛВС определяли однократным внутривенным введе-КВ8Ы юс крохкхам в объеме 1,0 см3 с последующим определением татра антител в крови на 21 день после прививки.

С цель» определения антигенной активности инактивированных препаратов ЛВС в организме естественно восприимчивого хозяина провали опыт на 35 поросятах (массой 25-30 кг),которых разделил« на 7 групп (6 опытных,I контрольная) и иммунизировали внутрнш-тчно однократно хлм двукратно препаратами ЛВС в объме 2,3,5 см8 с ревакцинацией 3 групп животных (через 14 дней) в таких хе доаах. Контрольную группу животных не вахцинировали. В опытах испольвовали поросят с минимальным титром антител к ЛВС (1:16 -1:64). Исследование крови проводили в динамике перед вакцинацией ж на 21,45,59 я 70 день после введения препарата. У всех поросят однократное или двукратное введение препарата вызывало иммунный

ответ, сопровождавшийся выработкой антигеиагглютинииов в титрах от 1:512 - 1:8192. При однократной иммунизации наиболее высокий титр антител наблюдали после введения препарата в объеме 5 смэ(титр антител на 21 день составлял 1:2236+15,6 , в последующие сроки - 1:2160+15,1 , 1:1985+15,5). Несколько менее была интенсивность иммунного ответа при введении препарата в дозе 2 и 3 см3 {р <г 0,01). К 70 дни исследования уровни антител у животных, привитых однократно в дозах 2 и 3 сн3, практически выравнивались. Повторная вакцинация не приводила к статистически достоверному увеличению уровня специфических антител (р<0,01).

На основании проведенных исследований для изучения антигенной активности инактивированных сорбированных препаратов ПВС на подсвинках была выбрана доза 2 см3 - ыикяыалькая из доз, давшая достаточно выраженный иыцунныЯ ответ.

Полученные результаты свидетельствует о выраженных антигенных свойствах препаратов ПВС.

2.2.4. Определение оптимальных.соотношений парвовирусного и лептоспироэного антигенов с целью создания ассоциированного биопрепарата

В работе использовали лабораторные серии инактквировакного парвовирусного препарата (с титром гемагглютининов до инактивации не ниже 1:1024 ГАЕ/0,025 см3) и смэсь инактивированных производственных штаммов дептоспир серогрупп Роимш ( TaraaeovV (накопление бактериальной массы 75-80 млн/см3), взятых в равных количествах. Ыикросерки ассоциированного препарата готовили смешиванием лептоспироэного и парвовирусного антигенов в пяти

вариантах со следующими сочетаниями антигенных кокпононтов 1:1 1:1,5 1:2 1,5:2 1:3.

Оценку имцуногекных свойств вакцины, приготовленной с различным соотношением антигенов, проводили на кроликах по титру антител и, кроме того, по отношению к лептоспнрам по превентивный свойствам сыворотки крови вакцинированных животных для золотистых хомячков, зараженных 10 ДД0д вирулентного штамма лептоспир. Кроликов массой 3-3,5 кг делили на группы по 5-7 голов в каждой и прививали вакциной однократно внутривенно дозами 1,0 1,25 1,5 1,75 2,0 см3. В указанных дозах содеряание антигенов лептоспир составляло 0,5 0,5 0,5 0,75 и 0,5 см3; антигенов парвовируса - 0,5 0,75 1,0 1,0 1,5 см3 соответственно. В качестве контроля использовали группу кроликов, которым однократно внутривенно вводили монопрепарагьг в дозах - 0,75 см3 лептоспироэного антигена и 0,5 0,75 1,0 1,5 см3 парвовирус-ного препарата, а также группу невакцинированных кроликов. Через 14, 21, 40 дней после введения препарата с различным соотношением антигенов брали кровь для исследования з РГГА с антигенами парвовируса свиней и РИА - с антигенами лептоспир, входящими в состав ассоциированного препарата.

Установили, что иммунитет формировался как по отношению к парвовирусноцу, так и к лептоспирозному антигенным компонентам. Из отмечалось разницы в динамике формирования иммунитета у животных, привитых ассоциированной вакциной против жептоспи-роза и ЛВИС, н раздельно против этих инфекций. Оптимальным сочетанием антигенных компонентов в препарате являлось 1:1. При этом соотношении антигенов наблюдался наибольший иммунный ответ как по отношению к парвовкрусу (титр антигемагглютинирувщих антител

s РТГА ка 14, 21, 25, 40 день составлял 1:123+9,0 1:256+0,4 1:112+14,4 1:32+12,9), так и го откоыении к лептоспирам (титр агглютинирующих антител d FÎÎA 1:125 1:305 1:695 1:1395 соответственно). Введ«иа сыворотки крови кроликов, привита ассоциированным грепаратоы с соткоагакием антигенов 1:1, на 4.0 день после вакцинация заедало от заражения 100% подопытных золотистых хомячков.

2.2.5. Разработка и испытание аесо-.деировакда2 вакцины

против лептоспирсзг и пар во вирусной инф&кцкя еткеЯ

яивотнкгх, вакцинированных ассоциированным прргасатои» Икмуно-геннув активность ассоциированного препарата оценивали г;.з тит'^у специфических антител >.■ еувороткг кг-овн, а, кроме того, к пир&ц по превентивной активности сыворотки крови вакцккяроaatnux

содсвинкоь . для золотистых хомячков. "ЗаЭЙТН5М" уровнем ЙН?!?~

тзл к парвовярусной инфекции считали наличие в сыворотке крова

подопытных животных титра янтигемагглютякинов не нияо 1:126,

что согласуется с исследованиями Paul et al.1980; ïiengeliag s t

1979,1980; Chez® ,1983; no отношении к яелтоспирозу исходил-: из ранее установленного критерия, что в&кциикый препарат проявляет свое защитное действие, если сыворотка крови привитых подсвинков предохраняет от заражения не мзкее 30а имцукизира-8затих золотистых хомячков, зараженных смертельной дозой жептоспир (Ю.А.Малахов, B.C.Соловьева,1977).

Изготовили 4 опытные какросерни ассоциированного препарата в пяти вариантах, которые составляли смааиванивм антигенных компонентов парвовируса и лептоспир в следующих сочетаниях

%

Таблица I

Антигенная активность ассоциированной вакцины по отношении к парбовирусу

: Титры антнгемагглютининов в сыворотке крови подсвинков Препарат: Доза в см3 : до вакци- : на день после вакцинации

нации .21 . 30 45 . 60 . 90 . 120

4,0 9,8+1,1 1595+127 1317+118 1097+106 808+11 664+126 430+11

Ассоцииро- 6,0 9,9+1,1 1128+118 985+118 654+122 461+124 304+11 215+13

ванный 7.0 40,9+11,3 1070+148 947+116 689+120 487+127 304+13 181+12

8,0 45,2+11,1 574+19 461+11 343+11 128+0 101+11 9,8+1,9

9,0 36,7+11,3 406+20 343+11 201+15 101+15 50+11 8,0+0

Парвовирусный (контроль) 2,0 27,2+16,9 1545+122 1022+131 622+131 361+125 256+13 181+12

а * 4

Таблица 2

Антигенная активность ассоциированной вакцины по отношению к лептосгираы

Титр агглютинируиргх антител в сыворотке крови подсвинков на

Препарат: Дрза : Аень Бак«инации

В СЦ*' 21 30 45 60 90 120

4,0 I 150 1:185 1:100 1:о5 1:30 1:21

Ассоцииро- I 175 1:185 1:105 1:65 1:35 1:21

ванный 7,0 I 160 1:175 1:105 1:50 1:32 1:12

8,0 I 140 1:175 1:113 1:65 1:28 1:14 1—»

9,0 I 160 1:185 1:105 1:60 1:30 1:17 1

2,0

Лептоспи- 4,0 розный

(контроль) 5,0 6,0 7,0

п =4

I 140 1:175

I 160 1:200

I 150' 1:160

I 175 1:160

I 150 1:150

1:125 1:65

1:115 1:65

1:115 1:70

1:105 1:55

1:115 1:65

I 40 I 19

I 30 I 23

I 28 I 15

I 32 I 12

I 35 I 16

Таблица 3

Превентивная активность сыворотки крови вакцинированных подсвинков для золотистых хомячков

Сыворотка | Количество (%) выливших золотистых хомячков, иммунизированных сывороткой крови

| вакцинированных подсвинков, и зараженных 10 ДД50 вирулентного штамма лептоспир:

!-

крови, взятая на ...

иммуни-СЛе! ассоциированным препаратом в зации ' дозе (см )

! лептоспироэным препаратом в ! дозе (см )

! не иы!у-I низкра-I ванных

! 4,0 ! 6,0 ! 7,0 1 ! 8,0 ! I 9,0 1 ! 2,0 1 ! 4,0 ! 5,0 1 1 6,0 ! 7,0!

21 50 60 60 50 50 60 40 60 50 40

30 80 80 70 80 70 90 90 80 90 90

45 100 100 100 100 100 100 90 100 100 100

60 90 100 90 100 100 100 100 90 100 90

90 70 80 80 70 70 80 80 70 70 90

120 40 30 40 40 40 30 30 40 40 30

со

I

1:1 2:1 2,5:1 3:1 3,5:1 соответственно. Иммуногекность вакцины изучали на 130 подсвинках 5-6 иес возраста, разделенных на группы по 4-6 ролов в каждой по принципу аналогов. Ассоциированный препарат вводили однократно внутримышечно в дозах 4,0 6,0 7,0 8,0 9,0 см3. В указанных дозах содержание антигена парвоиируса составляло 2 см3, количество лептоспирозного компонента варьировало.

Животных в контрольных группах приписали однократно внутримышечно кнактивированной парвозирусной вакциной в дозз 2 смэ и лептоспирозной вакциной в дозах 2,0 4,0 5,0 6,0 7,0 сы3. Сыворотку крови исследовали до вахцинации и через 21, 30, 45, 60, 90, 120 дней после нее. ПрвЕвктквкыз свойства сыворотки крови сеинэй изучали в те ве сроки.

фи исследовании сыворотки крови свиней, вакцинированных ассоциированным препаратом в дозе 4 и 6 см3, на 21 день послэ прививки выявляли специфические антигекагглютиннрующие антитела в максимальных титрах (табл.1). Впоследствии, их уровень уменьшился к 45 и 60 дню исследования и оставался на довольно высоком уровне до 120 дней после вакцинации.

Ишуногенная активность ассоциированной вакцины по отнове-нию к антигенам лептоспир представлена в табл.2 и 3. Как следует из материалов табл.2, с увеличением дозы ассоциированного препарата, титр антител к лептоспирам практически не повысился. Сыворотка крови подсвинков, привитых ассоциированным препаратом, защищала от заражения летальной дозой лептоспир 30-100/озолотис-тых хомячков (табл.3). Имцунитет достаточной напряженности наступал у вакцинированных животных к 21 дно, оставался на довольно высоком уровне до 120 дней (срок наблюдения) и не

уступал таковому в контроле.

Установили, что оптимальной имцунизирующей дозой асссцииро-ванного биопрепарата дл;: подсвинков являлась - 4 см3, при введении которой наблюдался максимальный иммунологический эффект.

Имцу но генные- свойства ассоциированной вакцины, кроив того, изучали в условиях совхозов "Коммунист" Вологодской области, "Х-лет Октября" Московской области, "Железногорский" Курской области. Основных и ремонтных свиноматок (около 20 тыс.голов) прививали за 2-4 недели до осеменения однократно внутримышечно в дозе 5 см3. Выборочное крововзятие и изучение превентивных свойств сыворотки крови проводили в те же сроки. Обобщенные результаты исследований приведены в табл.4.

Таблица 4

Антигенная и иыцуногенная активность ассоциированной вакцины против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней в хозяйствах

Титр антител в сыворотке крови свиней

День

исследо-

п^^а к парвови-:к лептоспираы -

нации

Помона:Тарассови

Превентивная активность сыворотки крови вакцинированных животных для

золотистых хоиччков (?)

0 1:138+93 - 1:10 -

21 1:1164+122 1:400+100 1:350+72 70

45 1:1114+122 1:265+68 1:185+58 90

90 1:978+21 1:851119 1:70+67 70

120 1:753+57 1:45+22 1:23+10 50

180 1:539+69 1:30+12 1:20+7 30

Установили, что в крови шздуняэирозакнмх »кготхнх форшро- \ вались епецифячесхир антитела к парвовирусу и лэятоспяраа в достаточна вчеокнх татрях, причем напряженный кивфиита? сохранялся у яквотных ко tt-змоа 180 дней.

2.2.6. Изготовление, контроль и испытание опытно-иромыи-декних сераЯ ассоцйнровгшной вакцины против лептосгкроза и парвовнрусной инфекция сеяной

В период 19Э7-19Э0 гг на Ставропольской бяофабрика согласно временной норнатиЕИО-тахкичвской документация и отработкой как» технологией производства изготовлено 8 стгою-проиыазвккга сари Я ассоциированной ваицинн против «ептеепироза и парвовкрус-кой кнфэкшш СЕкнай c6ujiss об-ьемом 4912 литров (S82400 доз). Качество к«эдой серии биопрепарата проверяли кеккссионко.

Установили., что асе опытно-прошгзленкнв с зря; в&кцнкн были стерильны , безвредны дяя лабораторных жизотвых и сввкзй, обладали высокой антигенной активность» как по отиоззкип к парвовй-русног^у, так и к ягятсепкроэкоиу антигенным хс&шонентан (татр антегйл у кроликов к парвовирусу поело вакцинация составвял 1:64-1:512, к лептоспнрам 1:400-1:3200} и бшти прязиакы пр?!Год-иыми для практического пришнвгая.

Производственные испытания ассоциированной вг-ицякы протез лепхоспнроэа a парзовирусной анфэкцж? сайкой пропздэш а неблагополучных по этим болазшш свяиоводчвскзх хозяйствах России и Укр-зинч. Вакцинировано около 980 тж. голов свянзй.

Применение ассоциированной вакцины позволило сократить KOsmacTBo болэзкяЯ органов воспроизводства свинокаток лептосга?-роаноЯ а парвовкрусной этиологии, а танао увеличило сохранность н выход поросят на один опорос. В средней, от кавдой вакцкнаро-

ванной свиноматки пра опоросе получено на 0,6 -1,2 поросешсб бояьав, чем от нввакциннро»ашо8. Рвау/лтати испытаний обобьются.

вывода

1. Установлена этнологк";сск?.к роль п&рБОЕкрусе. свиней в патологкк санкции воспроизводства сеянзй. Из внутренних органов пяодов свкиокатки путан серийного лаесироеаяия в чуаоткятельнов культуре клеток, непосредственного обварувения возбудителя завжтроняой мякроскопивй, его антигена мотодри ккцуио^о рве ценили и выявления антигенного родства с поиоцыо перекрестной ре&хцшг нейтрализации, ввдвгвн ктакм иарвовхруеа свиней, которцГ; по свои* Сис-логичзсхим свойствам »¿в отличаясь- от референтного ит&даа вируса.

2. Изучена репродухция штаммов парвовируса свиней при различных значениях рН культур&льноЯ яидхосук и кх температурный ражхм р&змногешя. Установлено, что темпаратура 37°С к рН среды 7,2-7,4 является оптамадькшн дня репродукция вируса, независимо ОТ ГГС&Кйа.

3. Пра пассирований парювируса свиней ь перзнчних, перавн-ваешх и пврвямвачщих цудьтур&х клеток разного происхоздвния, установили, что чувствительными к зйруе-у были только культуры клеток «зякого происхоядвния: первичная культура клеток почек экбряонов свкнзЯ (ГЕЮ) и перевиваемая яикия клеток почек поросят (ПШ); менее чевстнительной - перевнвазиая линия клеток цитоеидной яеяззы евянзй (ЩС). Оптимальной клеточной системой, обеспечавава^ай наибольшее накопление парвовмрусного антигена является перевиваемая линия клеток ШК.

4. Установлена высокая распространенность гтарвовкруса в

сэкнааодчсгкнх хозяйствах раэгичнкх регионов: *» 17 хозяйств -

в 15 (В3,2л-) обнаруяеиы положительно рзагяруяцив внвотныв, Сг.тффячъсхт аитчтеза в диагностическом титре обкаруявнн » в среднем, у 61,72 бс ледовядашх е&воткнх. Около 50!« свиней ктт антитела з титра 1:1024-1:15384, значительно превышающее дн агностический. Колнчестоо полоеэт&дыгь-х у основных к . ремонтных сввноматок существенно не различалось и составляло еоотватетБенж! 73 я 74,

а. Отработана -¡жраиетри получения безопасного яиактязнро-иамкого еорйяроу.анкого парво«ярусного препарат»,обладающего ¡?ы-

сокоч антиганкой ахтарностьв и этаакма^го у подопытных яявот-нь'х образование на.тряя9й?»01'0 темпуиитета.

5. Установлено отсутстьяз конкурвкцхи к оптямкльксз сача-мо антнпенишс компонентов парвоаируса а лзптссттир в ассоциированном препарата, аоетазяяччаа 1:1.

Разработана и кепытана в зярокож гроязвсдстввином о пате ассоциированная! вакцин*« содврямш^й антигены Ьер*овр1га 1пЬаггойаав сврогрупп Уоаопа(БПКй-б) к '.гагаваст?! (ВГШИ-4), гадеосодерЕШДО ку;п»туральну» яидхоеть Рагуоу1г«в рогошг. зтат.. "й-82", а ха«зствв кнактиватара - форыалнн и 5 качестве адьоваи-та-сквеь геля гидроокиси алшиния я белка сиворотки крови.

8, Ассоциированная закцика против легтоспирозз а парьо-вируснэй инфекции свкхей является зысокояикуногенким бхопрзпа-ратом. Продолжительность поствакцикалъиого иммунитета составяява; не ывнее б месяцев, Имцуногенная активность биопрепарата сохраняется в точение 12 месяцев при температура 4-5°С.

9. Разработан метод контроля антигенной и ммхуногонно!» активности ассоциированной вакцины против лептоспкроза я парао-

вирусной кнфакщвд свкиэЯ, оахлсчооздйс;т б однократной внутривенном ввадгннн препарата пяти крояияш б доза 1,0 см3 с последующим через 23 дня взятием крови и исследованием сыворотки в РИА к РГГА.

ПРШШЕС&Ш ПРЕДИОЕЕШ

1. Разработана г.роыыялекная технологий производства ассоциированной вакцины против яептоепироэа и пвриовирусной инфекции сввкай. Утверадеиа постоянно действуощач норкативно-техикческая докуизнтацня на препарат: инструкции vo изготовление и контролю, технически© условия, наставление по приметни», карта технического уровня и качества продукции, заявка на разработку, техническое аадаше.

2. На Ставропольской бкофабрнке освоено г.роныяленное производство вакцины ассоциированной против леггтоспироза и чарвовирус-кой ннфэкцкн свиней. Изготовлено и реализовано для практического пргвазнеюш на I ионя IS9I г 10 серий препарата общим объедай 7201 лмгров (1440200 доз).

3. Для специфической профилактакн лептоспнроза и п&рвовиоус-ной инфзкцкй сзкнзй в хозяйотьах России и Украины, неблагополучных по этка заболеваниям, нспользок&иа ассоциированная вакцина против яептостгароэа и парвсвирусноЯ инфекции свиней. Рекламация на биопрепарат не поступало.

СПЛОOK РАБОТ, ОПЖШЮВМйШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ассоциированная вакцина против лелтоспироэа и г,арвовирусной ннфакцаи свинэй/ Скворцов» И.И., Соболева Р.Л.,Малахов Ю.А., Кздьшкова Я.А., Кас»к И.И., Ивановский Э.В.// Авторское свидетельство № 1533305.- от 21.07.1337.

2. Мельникова I.A., Касюк И.VI., Скворцова H.V5. Парвовирус свиная // Тез.кокфен.:"Патология членистоногих и биологические средства борьбы с вредными организмами" (сентябрь 1Ж32 г), г.Канев.-1982.-с.19-22.

3. Скворцова И.И. Использование реакции торможения гемагглв-танация при диагностике парвовнрусной болезни свиней// В кн.: Контроль и стандартизация средств специфической профилактики и даагкосгкки туберкулеза, бруцеллеза и вирусных болезней животных. 1983.-с.138-142.

4. Скворцова И.И., Соболева Г.Я., Мельникова Л.А. Профилактика яаптоспнроза я парвовнрусной инфекции свиней// Достижения науки и техники АПК.-1989.-РЛ2.-с.47.

Ъшография АГ2.3ак.Ь002сп