Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рестрикционное картирование и клонирование фрагментов ДНК вируса алеутской болезни норок и парвовируса свиней для использования в качестве диагностических ДНК-зондов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Рестрикционное картирование и клонирование фрагментов ДНК вируса алеутской болезни норок и парвовируса свиней для использования в качестве диагностических ДНК-зондов"

V - О ■ <

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ШОДШЬСГВИВ И ЗАКУПКАМ

«ООНОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ ЖК.Й. СКРЯБИНА

На правах рукописи

МЕШКОВ Андрей Крьевич

РЕСТРИКПИОНШЕ КАРТИРОВАНИЕ И КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ Ш ВИРУСА АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК И ПАРВОВИРУСА СВИНЕЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ДНК-ЗОНДОВ

СВ.ОО. Об - вирусология

Авто.реферьт диссертации на соискание ученой степенк кандидата биологических наук

) ( '

МОСКВА 1931

А

Работа выполнена в ЬЬсковсксй ордена Трудового Красного Знамени ветеринаркой.академии иу. К II Скрябина

Научи:1*! Руководитель:

доктор медицинских наук Карелин ЕЕ

Официальные оппоненты:

доктор 5иологичес:;их наук, профессор Озидзе Н. Г. кандидат биологических наук Гринеако Я.&

Ведущая организация: Бсееозскый научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии■ЕАСХНИЛ

Залита состоится " Ь " Сы^-С&к 991 г. в _часов на аа-

седании специализироьаннсго ученого совета К-120.35. CS по присуждению ученой степени кандидата наук в Московской ветеринарной академии им. К. И. Скрябина по адресу: 109472, 1Ьсква, уг. Академика ркрабина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек академик.

i

Автореферат разослан

Ч м cMcpttcj lS91 г

Ученый секретаре специализированного совета

Федосеева Т. Ü

;r„' ■ ■ сгдля ^"¿ггершшпа ршзты

Актуальность ?e;¿ü. В современной ветеринарной практика широч распространены заболевания г^шотньсс. вызываемые парвоЕирусшаь. 1.2Д!1 'таких заболеваний особое место зазюггкт инфекции, вызызае-:э вирусом алеутской болезни норок (АБВ) и парзовирусом . сеи-3 (ПЕС). Это прэ.т-дз всего связано с сирекой распространен-стья ЛЕЗ и ПЕС и значительна.! экономическим ущербом, причиняэ-м данными заболевания^«.. I Так, пгевовирусная болезнь cssaieñ спространена в 30 страна-: taipa. В СШЛ ока была выявлена с по-тг>» серологические исследований в £0-1 СОХ хозяйств.- Увэрб от Золевакий, вызываемых ПЕС, только в С2Л оценивается а 25-75 з. долларов 2 год (ИеНГеЛИНГ В_ JL я др., 1SS5).

Вирус алеутской болезня норок был. выявлен ва всех странах, 5Ещи фермы по вырзгдванкл норок. Экономический у®рб от але-:кой болезни корок для звероводческих хозяйств, выргщпазсвзсс зек. составляет со Дакии, aaicmamsíí 11. место, по экспорту шку-: норок на мировом рынке, 10 миллионов ¡¿арок (Аастед Б., 1QS5).

Учитывая высокое распространение инфекций, вызываемых ПЕС и !, ссобсэ знзчениэ приобретает своевременная диагностика я про-актнка парвоз1фусноЗ болЬзнп свиней к алеутской болезни норок, астояпэе время для специфической профилактики парвовирусной езнн св'шеп применяют'гивьгэ и инактивированные вакцины, а для геостики ЛВС наиболее чарто применяется реакция торыояения ге-глвтинации с эритроцитами морской свинга(РТА). Единственным мэ-зы борьбы с алеутской болезнью корок до сих пор остается выявив инфицированных гивотных и"их забой. В качестве диагности-шго теста на АБВ в зверофермах используется в основном «етод «ции встречного имыуноэлектроосыосфореза (РИЭОЗ». Однако су-гвуювде иеры борьбы с парвовирусныш йнфекцияыи и методы дкаг-:ики вызываешь ими заболеваний имеет ряд недостатков, устра-> которые »йоано только с помощь» методик, основанных на кдних достижениях в области молекулярной биологии и генной нерии и отличающихся от традиционных большей, чувствитель-ыо, специфичностью и быстротой выполнения.

Сель к аадачк исследований. Целью работы являлось молекула ко-биологическое изучение генома отечественных штаммов виру алеутской Солезни норок и парвовируса свиней отечественных шта нов и использование методов генной инженерии для получен ДНК,-зондов, способных выявлять инфицированных этими вирусами л вотньк быстро и с высокой степенью чувствительности и споцнфи кости.

В соответствии с поставленной целью выполнялось следуют

1. Получение иа инфицированной, культуры клеток чистого па вовируса свиней.

2. Получение иа органов зараженных животных чистого виру алеутской болезни норок.

3. Выделение из чистых вирионав ПВС и АБВ вирионной ДНК гарткрование ее с помощью ферментов рестрикции.

4. Молекулярное клонирование фрагментов геномной ДНК ПВС АЕВ в плаанидном векторе.

5. Апробирование полученных рекомбянантных ДНК ПВС в качес ве ДЕК-гондов для выявления парвовируса свиней в культуре клето

6. Апробирование подученных рекоыбинантных ДНК. АЕВ в качес ве да-зондоа для абнарукеЕин вируса алеутспй болезни норок тканях а крови экспериментально и естественно заранэнкых сиво

m.*Y (

Вэвыа в диссертационной работе является: рестрикционная ка та вируса алеутской болезни норок отечественного штамма П-1, о личная от опубликованных в литературе рестрикционных карт AI рестрикционная карта генома парвовируса свиней культуральнс отечественного лггамма й-82 и рестрикционная карта делеционн формы генока ПВО; клонированные в плазмидноы векторе фрагмэи генома ПВС, способные выявлять в инфицированных клетках метол молекулярной гибридизации парвовирус свиней; клонированные плазмидноы векторе фрагменты генома АЕВ. способные выявлять в к филированных клетках методом молекулярной гибридизации вирус ал утекай болезни норок у естественно и экспериментально заражен! гкзотккх; нукаеотидная последовательность ЕсоРЛ-ШпсПП-фрагмеь ДЕК АЕЗ размером в 1614 нуклестндов. которая отличается по 1 нукдеотидам от опубликованного в литературе нуклеотидногс оостг

юна АБВ (штамм Ш-S).

Пластическая ценность работы: полученная реетрикционназ кар-парвовируса аборта свиней штаь!У й-82 ыохет служить как эталон I контроле вагщинных штаммоз ПЕС. Клонированное а плазмиде pUC Pstl-EcoRI- и PvuIIrBsilI-фрагментн ДЦК ИБС вдгут Сыть исполь-заны (после течения) в качестве диагностических ДНК-зондов для 1ару,тэн:!Я парвовируса-езиней в зараженной культуре клеток ыето-i молекулярной гпбридизащг^.'

Кпо.чпрованнкэ а длазмиде pUC19 Haniil-Pstl-. Pstl-EcoRI- и >Я1-Н1пйШ-фрагыелты ДНК АБВ югут Сыть использованы (после ismra) в »«ячестве диагностически ДКН-зондоз для обнаружения )уса алеутской болезни норе;-: у естественно и экспериментально )аг°нньк Л2ШОТН1Г: методом ДНК-зондоз с более высокой чувстви-ibiioCTba, чем пр12.:екне!1ь;е в настоящее время в ветеринарии тес-

Апсобация работк: основные положения диссертации доложены на ¡^ренцня:: ^олсдьсс ученых i£5A в 1387, 12S3 a 1S89 г., на стчет-: научных конференциях МЕД н 1987, 1SS3 и 13ВЭ г.. на отчетные ¡ференциях лаборатории генной инжиерпц и кафедры вирусологии.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 2 статьи.

(Хъен я структура диссертации: диссертация изло?гна на 102 >аницах и включает введение, обзор литературы, материалы и ме-;ы собственных исследований, обсуждение результатов исследоза-!, выводы и прилихения. Список использованной литературы вклю-•т 10-1 источника. Работа содергот б таблиц и 15 рисунков.

GS23EE Ü ШЯОДЦ ИООЛЕДОЗНИП

Объектом иссладован'гй были: перевиваемая культура клеток почек поросят, зараженная вакцинным иатпм парвозируса свиней И-82 и печень, селезенка и лимфоузлы норок, зараженных аысоковируленг-ньь! штаммом вируса алеутской болезни норок ТЫ.

В работе были использованы методы ультрацентрифугирования i градиенте плотности CsCl, электрофореза в агарозкоц к полкакрила-иадном гелях, точечкой молекулярной гибридизации, гибридизации ее шгтроцелдодозкых фильтрах по Саузерну. Обнаружение вирусов ПЮ v. АБЗ в инфицированных клетках проводили с помощью стандартных тестов, используемых в настоящее вреш в ветеринарии (реакция иымун-Еозлектроаскосфореза и реакция торможения гешгглютинации с эритроцитами морской свинки} и методой молекулярной гибридизации с применением в качестве ДНК-зондов клонированых фрагментов ДНК вы-русоз ИБС и АЕВ. ЪЬлекулярное клонирование фрагментов ДНК ПВО и ¿SB проводили в плазмздном Еееторе рИЛ9 с использованием культура клеток £.coli RB1Q1. Пзрзичную структуру EcoRI-HíndlIl-üew**-vsnra ДНК £БВ определили по методу Ьйксаьа и Гилберта.

P2SyJi7'?ATH сШЯЕаПШХ

Выделение чистых шгогаков ПЕС и АБВ . и cojijo кпд пшенной- ДНК.

Целью нашего исследования было получение чистой Еирионной ДНК и клонкрзвание фрагмзнтоз вирусного генома в плазшдноы век-таре для получения ДНК-зондов.

На первом этапе работы Еами била отработана методика выделения очищенных вирионов ПБС с АБВ из инфицированных клеток. В качестве исходного .материала для получения вирионов АЕВ служили печень, селезенка и.лимфоузла зараженных корок, содержащие наибольшее количество вируса. Для заражения виватных использовали вирус ¿52 штамм В-1. Забой проводили через 10 дней после введения АЕВ, когда титр вируса в органах достигал максимального значения. Еи-рионыАБВ центрифугировали в градиенте плотности CsCl. Электрон-

as микроскопия показала наличие вирусных частиц раакером 24 ны о фракциях с плотностью 1,41 г/ил и 1,33 г /ил. При разрушений елкозой оболочки вируса из фракции с плавучее плотностью ,41 г/мл была получена геномная ДНК вируса АБВ размером около 700 нуклеотидов.

Для выделения вирионов ПВС использовали перевиваемую культу-у клеток почек поросят( Аиния ЗЖ Заражение проводили парво-ирусом аборта сиикей штамм И-В2„ изолированным иа тканей, плодов Зортировавших свиноматок. Наделенные вирионы ПЕС центрифугирова-и в градиенте плотности CsCL Зоны с плотностью 1,30 г/ал и 1,39 'мл обладали высокой гемагглигшируицей активностью (титр 1: 2384). Электронная микроскопия показала наличие вируса ПЕС в Зоих фракциях, но гомогенная нирионная ДВЕ ПВС размером около 300 нуклеотидов присутствовала только в вирионак с плавучей еотностъзо 1.33 г/мл. i

Полученная вирианная . ДНЕ ззрусов ПЕС и АЕВ представляла со-зй одноцепочечную ДНК, имеквдао шпилечные структуры, как на 3'-, ж я на 5' -кпнце генома, рззмероа около 200 пар нуклеотидов, что ¿до установлено при обработка полученного препарата яуклеазой SI, щролизупцэй только одноцепочечные структуры.

Получение двухцепочечнсй формы ДНК пзрвовирусов

и рестрикцгднное картирована? вирусных геномов.

Рестрикционное картирование ДНЕ геномов ПВС и АЕВ проводили . основе синтезированной двухцепочечной формы ДНК ПВС и АЕВ (дц К). Синтез осуществляли на матрице вирионной ДНЕ при помощи Н-полимеразы1 (фрагмент Кгенова). используя в качестве прайме-в шпилечные структуры на 3*-конце вирусного генома. Полученную ухцепочечную форму ДНК обрабатывали рестриктазами и с помощью ль-электрофореза определяли, имеются ли сайты рестрикции данной стриктазы в дцДНН. Размеры фрагментов рестрикции определяли авнением полученных фрагментов дцДНК параовирусов и маркерных згментов ДНК в гель-электрофорезе. Расположение точек рестрих-а относительно 3*- и 5' -концов геномов ПВС и АЕВ определяли со зличию в размере рестрикгогенных фрагментов ори электрофорезе а ^тральном и щелочном агарезных гелях.

- б -

В результате проведенных исследований ваш Сшю установлено« что дцДНК ПВС гидролиауется рестриктазаыи EcoRI, HindlII, PstJ. TaqI, Bglll, Sac I, PvuII, ktepL Рестрикгааы Aval. Clal, BamHI. Berll. Hpal. Xhal не имели участков узнавания в дцДНЕ ПВ2. Размеры фрагментов рестрикции дцДНК СВС приведены в таблице

_ — •<= ' • 8= ( ~ Ъ & 5 со- «-=,

. »5 . <5 > ~ о ® «в га .

. ? :£ F £ Û. lu/fflOOffl______5

А »—I—I-1-»-i i V м-~-*nn

0 i , 4700

0 —i— H-)- i ■...... i -i i > t ■ 1 • г 4700

3* й. sr "Е- s « т ¥ ' 3 > fi. Î? о ® * Хшт 5*

л 4400

х. .5 I о Y —> 5 -в

Ï « 4». i S х 5 Г

Jb 4ЯШ)

о ■у- -2S- 2000 3006 40Ç0 501

Рис. 1. Рчгп—щмптгшп кадям гввомсш ПВС(А), ЛВС с делесмвЯСВ) «10(0

На основе полученных данных бы*а построена рестрихционная карта генома ПВС кгаыы К-82. Ова не отличалась от опубликованное в ли-te ратуре рестршщионной карты генома ПВС зарубежного вгамма (Рис. 1А).

Рестрмкционный анализ был проведен таете для репликативной (орш ДК ПВС - РФ ДНК ПВС» прж:утстаупцей В 8арахенных тетках ючек поросят наряду с вирашной ДНК в являющейся .промежуточной

формой геномная ДНК при синтезе генома вируса в ядрах клеток. Реетрикционная карта РФ ДНК ПВС не отличалась от рестрикционной карты синтезированной ш уИго дцДНК ПВС(Рис. 1А). •

I

Г* ВЛИЦА I

Размеры фрагментов рестрикции ДЦ ДНК ЛВС

Рестрикгаза : количество : йамер Зрагыентов

: фрагментов : (а нуклеотидных парах)

БсоШ : 2г : 35т' 1200

Pstl : 2 : 3XL, 44QO

Hindlll : 2 : 3300,14GQ

Taq I : Z : SOD. 4200

fcfcpl : 2 : tflTl. 37QD

Pvall : 2! : 24QD, 23QD

BjIIl : 3 r SOX SO, 65D

Sad : 2. : 4ШЭ» 7CD

Наряду с РФ ДНК в зараженных клетках присутствовала двухце-зочечная ДНК(РФ*ДШ0 размером 4400 п. а. Рестрикционный анализ' эчищэнной в агарознои геле РФ*ДНК показал идентичность рестрикци-энных карт РФ*ДНК и РФ ДНК за исключением одной особенности:, от-:утствие одного из двух BglII-сайтоз и одного SacI-сайта в ?Ф*ДНК, что позволило сделать вывод о наличие в РФ*ДНК делении зазмером в 300 н. в 5*-области генома.ПВС (Рис. 1В).

В двухцепочечяой форме ДНК ДЕВ были обнаружены следующие гчастки рестрикции: Pstl, EcoRI. Hindlll, BamHI, EcoRV, PvuII, UuL Рестриктазы Clal; Hpal, Pvul, Bffll, Sail, Xbal, Xhol, Bfflll le имели участков узнавания в геноме АЕВ. Размеры фрагментов

- в -

рестрикции дцДНК АЕВ приведены в таблице IX.

^Т&ЬЛвДД II

Размеры фрагментов рестрикции Ж ДНК ДЕВ

Рестрикгаза Количество : фрагментов : Размер фрагментов ( в нуклеотидных парах)

EcoRI 2 2500, 2200

PstI 2 2200, 2600

HindiII г 500,

PvuII 2 3000, 1800

EcoRY 2 2900, 1900

BamHI 2 700, 4100

Ш основе подученных двннст была построена рестрикционная карта генома АЕВ шгаш Ib-i. Она не отличалась от опубликованных в литературе рестрикцшнных карт зарубежных штаммов АЕВ за исключением подгоазния Pstl-сайга, который расположен не в 3*-области генома АЕВ (ос £ аарубежном штамме ADV-6), а ближе к Б' -области геномной 'ДНК СЕис. 1С).

Клонирование фрагментов геномов вируса алеутской болезни норок

и парвовируса свиней и их использование в качестве ДНК-зондов.

На основании подученной рестрикционной карты вируса алеутской болезни норок в парвовируса свиней нами были выбраны для клонирования Pstl-EcoRI- и PvuII-EelII-фрагментк ДНК ПВС, составляющие 752 генома и BamHI-fótl-, PstI-EcoRI- и EcoRI-HlndlII-фрагменты ДНК АЕВ, составляющие 801 генома. Клонирование проводили s плазмидном векторе pUCIQ. ^агменты PstI-EcoRI-, BaraHI-Pstl-, Pstl-EcoRI- и, EcoRI-HindIII- клонировали непосредственно по соответствующим участкам рестрикции, имевшимся в полилинкере плазмиды pUC19, a Pvul 1-ВеШ-фрагыент; генома ЛВС клонировали по "тупым концам" со SœaJ-сайту гшилинкера pUCIS. Подученными рекомбинант-ными плазмидами трансформировали клетки E.coli штамма НВ101.

В качестве ДНК-зондов пцдд апробированы все клонированные в аазыидном векторе фрагменты геномов ДНК ПВС и АБВ. При проведе-ии анализа был использован радиоактивный изотоп фосфора32? фирмы Amershanf и нитроцеллвлозные мембраны фирмы "Serva". Pstl-EcoRl-

1с. 2. Дхгамжа обнаружения вируса АБН м антител к нему в крздщ экспериментально даражриншг норок методами ДНК-го.чдов я РЯЭОЗ

Но оси абсцисс - дни после экспериментального заражения животных-, по оси ординат: слева- содержание антител в сыворотке крови (в ед., обратных титру); справа-количество ЛЕВ в пкг вирионной ДНК на 100 мкл крови. & - зависимость титра антител к АЕВ в крови экспериментально зараженных норок от времени после инфицирования. ■

В - зависимость количества вируса АБН (по вирусной ДНК) в крови(экспериментально зараяедных норок от времени инфицирования.

и Pvul I-Bgl 11-фрагменты генома ПВО обнаруживали ДНК ПВС в суммар ной ДНК зараженных клеток почек поросят до 1 пкг вирионной ДНК а 1 мкг суммарной клеточной ДНК. Различие в чувствительности опре деления ПВО между PvuII-BglII- и PstI-EcoRI-фрагментами обнаруиг-но не Лмдр

Клонированные фрагменты ДНК АБВ были использовании в качест ве ДНК-зондов для обнаружения вируса алеутской болезни норок ; условиях экспериментального заражения животных. В качестве «етк был использован радиоактивный фосфор. Чувствительность метода ДН аондов для всех трех клонированных фрагментов была одинакова составляла 1 пкг вирионной ДНК на 1 мкг суммарной клеточной ДНК Метод давал возможность обнаруживать наличие вируса ДЕВ в сгуст ках крови экспериментально зараженных норок на 3-й день после ин фицирования. тогда как с помощью используемого в ветеринарии ме тода РИЭОФ антитела к вирусу АБВ у экспериментально заражении животных обнаруживались спустя 5-7 дней после инфицирования. На видно из Рис. 2 количество вируса АЕВ в первую неделю забодевани увеличивается, достигает пика на 10-12 день и затем снижается тогда как количество антител возрастает в течении первого месяца и, достигнув максимума, в дальнейшем почти ве снижается, тага образом, выявление антител не позволяет определять время инфици рования иивоти"*

Вами было также определено с помощью метода ДНК-зонда коли чество вируса в печени, селезенки и лимфатических (брыжеечной лимфоузлах экспериментально зараженных норок на разных стадия инфицирования. Как видно из данных Таблицы III количество вирус АБВ в клетках печени, селезенки и лифатического узла в первые де недели нарастает, достигает максимума на 10-15 день и затем пос тепенно снижается до значения 10-50 пг. что соответствует б-с геномам на одну клетку. Таким образом, динамика накопления вирус АБВ в органах экспериментально зараженных животных сходна с динг

.<aü оСнарутеви* вируса в крови тех же животных.

Т к В 1 Я Ц А III

Определение количества ¡АБВ в органах экспериментально зараженных яивотных методом ДНК-зонда на различных стадиях инфекции

Органы зараженных животных Щмера : Время после заражения в днях норок S (количество геномов АБВ на клетку)

1 1 з: 5 1 7 ! 10 1 15 i 23 1 30

4-10 ! з : 19 26 ¡381 (121 ! 39 ! 12

SS ЧК1Ь 11-17 t 2 1 14 21 1334 ¡115 ( 44 t 10

18-24 1 4 ! 20 : 25 ¡397 1111 t 40 1 11

i 5 1 5 ! 8 ¡357 ¡224 ! 112 ! 22

CKJE3EBKA п-17 : 4 : б : 10 »375 ¡235 ¡124 i 41

ta-m i 4 : б 5 g 1389 (222 (145 31

4-ю : 5 : 40 ! 54 ¡765 ¡311 ¡153 ! 83

intoysJB п-гз! 5 ( 36 ! 61 (774 ¡256 ¡143 5 81

1»-» : 5 ! 44 ! 50 ¡ 798 1281 ¡147 i 95

Апробирование клонированных фрагментов генома АБВ в качестве зонда было проведено на сыворотке крови 100 норок, отобранных веросовхозе "Пушкинский*', часть из которых имела, по данным да РИЭО®, антитела к АБЕ. Проведенные опыты показали, что су-вуюг различия в результатах, подученных этими двумя, методами, анным РИЭОФ, 71 проба|дала положительный результат на присут-

ствие антител к АБВ» причем тг.тр антител колебался в пределах 1:128 - 1:8192. При анализе'тех же проб ДНК-зондами из 100 образцов положительными оказались 76. Таким образом, иммунологический тест РИЭОФ, применяемый в ветеринарной практике, уступает в чувствительности методу молекулярной гибридизации на 52.

На последнем этапе работы были выполнены эксперименты по определенно гомологии между клонированными фрагментами ДНК АБВ и ПВО. Доя этого мы проводили перекрестную гибридизацию между ЕсоШ-ШпсШ 1-фрагментом ДНК АБВ и РчиП-ВгШ-фрагментом ДНК ПВС, а также определяли возможность обнаружения вируса алеутской болезни норок РуиII -Вг1I1-фрагментом ДНК ПВС и возможность обнаружения вируса ПВС ЕсоКI-НIпс! 111-фрагментом ДНК АБВ. Выбор данных фрагментов для эксперимента был обусловлен тем, что оба они находятся в 5'-области геномов вирусов, т.е. в наиболее консервативной области ДНК вируса. В результате нами было поклзано, что: а) ЕсоИЬНтсИП-фрагмент ДНК АБВ обнаруживал присутствие вируса ПВС в зараженных клетках; б) Рт11-Ве111-фрагмент ДНК ПВС обнаруживал присутствие вируса АБН в инфицированных клетках; в) имелась перекрестная гибридизация между ЕсоИI - Н1 п<1111-фрагментом ДНК АБВ и Руи11-ВеШ-фрагментом ДНК ПВС. Однако интенсивность радиоактивных сигналов находились на уровне предела чувствительности метода диагностики с помощью ДНК-ао'нда. Таким образом, можно сделать вывод, что в первичной структуре геномов парвовируса алеутской болезни норок и парвовируса свиней имеются гомологичные участка, которые могут служить основой для создания общего. ДНК-зонда как для данных парвовирусов. так и для всего семейства Рапкшпйаа.

Определение нухдеотидной последовательности ЕсоМ-ШгаПН-фрагмента ДНК АБВ

Исходя из полученных наш данных о том, что существует гомология в первичной структуре ДНК ПВС и ДНК АБВ, была определена нуклеотидная последовательность ЕсоН1-Шпс1111-фрагмента ДНК вируса АБН. составляющего 332 вирусного генома. Для определения первичной структуры клонированный в .векторе рЦС19 ЕсоШ-нтйШ-фргамент ДНК АБВ разделали на три более мелких фрагмента (ЕсоШ-ЕсоИУ-, ЕсоЯУ-НШсП- и Н1пс11-1Н1пс1Ш-фрагмент), переклонирова-

ЛП ПО "тупому" Е ПЛ23Н2ДН0Ц ВЗКТОрЭ рШ19 ПО SraI-СаЗту ПОЛ1ШЯ-

гсера плазмиды н определяли первичную структуру полученных рекса-бинантоз иетодом Цзксзда и Гилберта. Полученные результаты представлены на Рис. 3. При сравнении опубликованной нуклеотидной последовательности парзовируса свиней с полученой первичной структурой фрагмента ДНК АЕВ пе были обнаружены гомологичные последовательности размером более 15 нуклеотидов, однако были найдены 7-14-членные участка, обладаюцрз гомологией и состазлякшие около 8Z зт всей нуклеотидной последовательности изучаемого фрагмента АБЗ. Гагам образом, выявление клонированным EccRI-Hindll ¡-фрагменте]» !ЩК АЕВ зируса ПВО и Pvul I-Egl I I-фрггсЕНТОМ ДНК ПВС вируса АБВ эбъясияется 8Z-гомологией меаду этими структурами. Полученная тервичная структура EcoRI-HindIII-фрагмента генома АБВ птанм П-1 юзволила таспе провести сравнительный анализ первичной струстуры ЩК отечественного стаима АЕВ (П-1) а птамма ADV-6, полученного и фосеквенщгаванного з США. Для сравнительного анализа были сопос-азлзны нуклеотидные последовательности EccRI-Hindl 11-фрзгх!2Нта ирконной ДНК двух пга\агов. Как оказалось, на 1517 нуклеотидоз, остгзлякзпс EcoRI-Hindl 1I-фрагмент ДНК АЕЗ птамм ADY-G, з craiss -1 ias^ocb 1614, при зтои Сыт' зафиксировано различие по 105 угслеотк^ДЕа Рас.3 снп подчеркнуты). Из них 73 нуклэотвда ргсп-гделэяы по всему _ учзстку изучаешй ДНК АБЗ, а 30 нуклеотидов зстгипгт сраг!л2!гт, полесстьэ отличный от аналогичного фрапйкта ДНК АБЗ птамм ADV-GL Кроне того, был найден 10-членкый участсх £а Ркс.3 адделен етрным гр::фтои). которой сказался сдвинут на 60 ггелестидов по сралненпз с положэнкэы з структуре сгамма ADY-G по шразлежза к 3'-области гепска АБВ. Таким образом, по нуклеотид-¡му составу гомология 12дду отечественным и зарубежным nraiasic! фуса АЕВ для EccHI-Hindlll-fpänsHTOB составила 93.63L

ÀATTCAAAG TAATAAAGAA TGAASTGTAI АТТАШШС ACGCTACTAS AATGGTACAO EcoRI

ATÇAACCAAG CTGACACASA T6AATACTTA ATATTTAAIG CTGGTAEAAC TAGTSATACC

АчААСАЗЛС AAAAAÇAACT AAACT7ASAA TTÏTTTuTAT ATGATGATTT TCACCAACAA

TAATGACAC CTTGSITTÇr AETASAIAS AACGTTÎŒjG GIGTGTGGAT GAGTCCTAAA

СдАСТТТСААС.-АААТОААААС ACTGÎGTAST GAAAITAÇTÎ TGCTTAATTT GQAACAAGAG

ATAGACAATG TAACCATAAA GACTCTAASA GAAACCAACC .AAGGTAACGC ATCÇACCAAG

CAATTCAACA AIGACTTAAC TGCGTCGI7A CASSTIGCTT TASATACTAA CAACATACTG

CCATATACTC CAGCIGCŒC GTTG3GG2AA ACACIGSCT TTSTTCCTTG GAGAGCAACC

AAACCAACCC AATATAGGTA TTATCATCCA TGTTADATTT ACAACASATA TCCTAACATT

EcaRÏ

CAAAAGACGu GgJAGCAATT AGAATS5AUT {ША2АСАА5 AÎGATTACTT GAGTGTGGAT

GAG^AGTATT TTAACTTTAI ÇACTATASAA AACAA2A7AC CTATTAACAT TCTCAGAACG

GGAGATAACT TTCAIACAS3 CTTATATGA3 TTTAAAASTA AACCATGTAA ACTAACCTTA

AGCTAÇCAGA GIACACSTÎG CIÎS2HTTTA ССПСЛСТСТ GCAAACCAAA GACAGATGC7

ACACACAAAG TAACCTCAÇ7 AÇAAAAS33A 2Л£;ЛЛ"АЛ TTTACATAGA GGGACAAGAÇ

AATACCAGAC TAGGICACTT TTG35GÍGAS GAAAGA23IA AGAAGAACGC AGAAATGAAC

AGAGTTAGAC CTTACAACAT AGGTATBJAA TATCCTGGAT GGATAATACC AGCAGGGTTA

CAGGGTAGTT ACTTTGCTGG AGGACCADGA CAGTGGAGTG ACACAACCAA AGGTGCAGGT

ACACACAGTC AACAGITACA ACAGAACTTT AGTACTASAT ACATTTATGA CAGGAACCAC BircII ~ - - . -

GGTGGAGACA ACGASGTAEA CITAITAGAT GGAATACCCA TTCATGAAAG AAG7AACTAC

TACTCAGACC ATGAGATAGA GCAACAIACA GIAAA3IAAC CAAASTTACG TTOACCGCCC

ATTCATCACT CAAAGAIAGA С1САТШЕАА GAEEAAGETT GGCCTGCTGC TTCAGGCACA

CACTTTGAAG ATGASjlTCAT AIACCIAGAC ТАСГПААСТ TTAGTGGTGA ACAAGCAïTA

GAGTT7CCAC ATGAAUTATT AEATGAÎGCT GJTCAAATGA AAAAGCTAC1 ТААСТСАГАС

CAACCAAÇAG TTGCTTTAGA CAAÇGJ7G33 ССТЕГАТАСС CATGGGGACA GATATGGGAC

AAGAAACCTG ATATGGAICA CAAÀCCTASD АТЕААСААПА ŒGCTCCATT TGTATGTAAA

AACAACCCTC CS3GTCAACT СТТТеПААА CIAACASAÍJi /iCCTAACTGA TACATTTAAC

TATGÄTGAAA AICCA5ACAS AÂIAAAAACC 7АТШПАС7 ТТАСПББАЗ ASSCA

HindiII

л

Риг.3. Еукяготцггз noc^sozarer^i^en» EccXI^L'irdlïI-ëpariairni ДНЕ cjpyca i5i¿ >

з а з о д в

1. ГЬлучена рестрикшонная клрта генома отечественного вак-енного стаяла парвозируса свиней 11-82 (ЯВС) и делеционного му-1ята ПН1 Выделенный мутант отличается от вакцинного штамма ПВС-иичнеы з 5'-области генома делеции размером около 300 нуклеоти-

>3.

2. Нлонпрозаны а плазмидном векторе pUCl9 два фрагмента ге-;ыа IH3 (RstI-EccRI н PvuII-BfflII-фрагменты). составляющие 75Z S ПЕС. Полуденные рекомбинантные плазмиды были использованы в i4ecr=e диагностических ДНК-зондов для обнаружения парвовируса лгней з зараггнной культуре клеток.

3. Получена рестрикционная карта генома отечественного высо-5внрулектЕого пггаима вируса алеутской болезни норок П-1 С АБВ), гличагсвнса по положению Pstl-сайта от рестрикционных карт, хубликозанных з литературе для других штаммов АБВ.

-L Клонированы з плазмидном векторе pUC19 три фрагмента ге-зма АЕЗ (BarHI-PstI-, PstI-EcoRI- и EcoRI-HindIII-фрагменты). зстззлягсуе B0Z ДНК АЕВ Полученные рекомбинантные плазмиды ап-збиравгны з качестве диагностических АЕЗ-ДНК-зондов в условиях спершентального и естественного заражения норок. Показано пре-¿ущество ДЕК-зондоз з определен™ вируса АБН по срокам выявления ¿русгоЗ инфекция и по чувствительности метода по сравнению с заменяемым з ветеринарии методом РЛЭ0Ф.

5. Клонированные фрагменты ДНК ПВС и АБВ имели гомологичные хсвеерзатизнке) участки, что делает принципиально возможным соз-mv.e диагностического ДНК-зонда на все семейство парвовирусог..

5. Определена первичная структура EcoRI-HindIII-фрагмсНта ЕЯ АЕВ, находящегося з наиболее консерватиной для семейства г.ар-ЭЕнрусс-з 5*-области генома АЕВ

Сведения о практическом использование- сзлучэкеых гзтапсц нг-■ учных результатов. "Излученные в результате работы ДНК-зонды на основе клонированных в. плазме-Еируса алеутской болезни норок были апробировании в ел=1зезрос хозах "Пушкинский" и "Тимоховский" Шскобско2 области Ергдлзгзн-ный способ обнаружения вируса АБЗ при ыасеовси сйслэ^о^анш: вотккх на наличие АБВ в хозяйствах является бзлас- г^ЗлЕгг^л! сс сравнению- с применяемым В- настоящее вреш штодзм К^Х- и быть внедрен в ветеринаркув практик для сбслгдзьл^н. ьзтсчногс поголовья норок.

Список научных работ, опубликованных со тепа д^ссзргал::^

1. Ь!оеков А.Ю. Рестржционный анализ гедо13 сщзвавируса аборта свиней и клонирование его Рзи-ЕссЯ1-£ргп£знга //

генет., микробшл. с вирусол. - 1237. - 11 4. - С. £2.-35

2. Рестри-сционный анализ ДНЕ Еируса алеутск штал^м П-1/ Мешков А. И, Чеботарев Л И., гин В.С. // Ызлекул. генет., ыикрабиал. с ьирураи. - 1932.-N 12.- а 30-32