Иммунохимические и молекулярно-генетические свойства вируса алеутской болезни (Aleutian disease virus), циркулирующего на юге Приморского края, и разработка методов его диагностики

Мартыненко, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунохимические и молекулярно-генетические свойства вируса алеутской болезни (Aleutian disease virus), циркулирующего на юге Приморского края, и разработка методов его диагностики
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимические и молекулярно-генетические свойства вируса алеутской болезни (Aleutian disease virus), циркулирующего на юге Приморского края, и разработка методов его диагностики"

На правах рукописи

МАРТЫ НЕН КО Марина Владимировна

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ {ALEUTIANDISEASE VIRUS), ЦИРКУЛИРУЮЩЕГО НА ЮГЕ ПРИМОРСКОГО КРАЯ, И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ

03.00.23 — биотехнология 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2006

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научные руководители: академик РАН

Журавлев Юрий Николаевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Минская Любовь Александровна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

старший научный сотрудник, член-корреспондент РАСХН Анненков Борис Глебович

доктор медицинских наук, профессор Леонова Галина Николаевна

Ведущая организация: Дальневосточный государственный

университет МОН РФ

Защита состоится 12 сентября 2006 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета К 005.003.01 при Бисшого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159.

Факс:(4232)31-01-93

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан 3 августа 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Музарок

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Норки (Mustela vison Shreb., американская норка) являются хозяевами для большого числа вирусов из-за их постоянного контакта с источниками и природными резервуарами возбудителей. При клеточном содержании на фермах наиболее часто их инфицируют два парвовируса: (алеутской болезни (ADV) и энтерита норок (MEV) (семейство Parvoviridaé), морбилливирус чумы плотоядных (CDV) (семейство Paramyxoviridae) (Литвинов, Яременко, 1998). В конце 90-х гг. в трех пушных зверохозяйсгвах Приморского края были зарегистрированы случаи массового падежа норок (особенно щенков). Результаты вскрытия павших животных и эпидемиологические данные указывали на вирус алеутской болезни. К тому же, в сыворотке крови животных были обнаружены антитела к ADV (Минская и др.,

2000), однако они могли являться поствакцинальными антителами. Было сделано предварительное заключение, что наиболее вероятным возбудителем является ADV. Требовалось провести видовую идентификацию вируса, определить его патогенность.

2001). В связи с этим, отнесение впервые выявленного на юге Дальнего Востока изолята ADV к группе штаммов определенной патогенност - одна из важных задач при изучении вируса. Это позволит прогнозировать будущие вспышки, будет способствовать снижению экономического ущерба и разработке мероприятий по исправлению эпидемиологической ситуации на звероводческих фермах края.

Литературные данные свидетельствуют о достижении значительных успехов в изучении ADV. Однако, до сих пор не разработаны специфические средства защиты животных от инфицирования вирусом, что во многом обусловлено особенностями его биологии. Предложенные вакцины малоэффективны, так как вирионы не нейтрализуются антителами, а циркулируют в виде инфекционного иммунного комплекса. Поэтому, до настоящего времени, основным средством контроля заболевания, вызываемого ADV, остается выбраковка и изоляция пораженных животных. В ранней диагностике наиболее эффективны современные молекулярно-генетические методы, такие как радиоиммунный анализ, полимеразная цепная реакция, гибридизация нуклеиновых кислот, которые способны выявлять следовые количества вируса. Однако, учитывая, что ADV — не изученный вирус на Дальнем Востоке России, отсутствие данных об антигенных свойствах его капсидных белков и молекулярно-генетических характеристик не позволяет разработать эффективные диагностические тест-системы.

Необходимо отметить, что исследование парвовирусов отстает от аналогичных исследований других вирусов. Во многом это определяется их мелким размером, сложностью культивирования, сильной зависимостью репликации от клетки. Практически отсутствуют сведения об их антигеном родстве. Расшифрованы нукле-отидные последовательности геномов менее половины всех известных парвовирусов. Поэтому, о происхождении и эволюции этих видов известно очень мало. Учиты-

вая выше сказанное, а также то, что парвовирусы представляют угрозу для многих животных и, возможно, для человека, их изучение представляется актуальным и своевременным.

Цель работы состояла в изучении структурно-морфологических, иммуно-химичсских и молекулярно-генетических особенностей нозбудителя алеутской болезни норок - ADV, циркулирующего в зверосовхозах Приморского края и разработке методов нового поколения для его диагностики.

Для этого необходимо бьио решить следующие задачи:

1) получить очищенный препарат вируса;

2) дать характеристику морфологии вирнонов дальневосточного изолята;

3) изучить основные физико-химические свойства (апсидных белков и нуклеиновой кислоты;

4) получить поликлональные антивирусные сыворотки от кроликов и норок и выявить антигенные особенности капсидных белков изолята;

5) определить нуклеотидную последовательность гена, кодирующего структурный белок Vp2;

6) установить филогенетические связи между изолятом и штаммами вируса, выявленными в других географических регионах ранее;

7) отработать методики радиоиммунных методов д.1я диагностики ADV;

9) разработать тест-системы диагностики ADV на основе ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В зверохозяйствах Приморского края снижение численности поголовья норки вызвано парвовирусом алеутской болезни, видом рода Parvovirus, семейства Parvoviridae.

2. Дальневосточный изолят вируса относится к группе сильнопатогенных штаммов вируса и является новым геновариантом американского штамма Utah I.

3. Предложенные условия мечения антигена ADV и ADV-специфических антител позволяют с помощью радиоиммунного анализа эффективно выявлять вирус и дифференцировать формы инфекционного процесса.

4. Отработана технология выявления ДНК ADV в сыворотке крови норок с помощью ПЦР.

5. Предложен способ получения ADV-специфического ДНК-зонда меченного перок-сидазой хрена и доказана его специфичность для детекции штаммов ADV.

Научная новизна. В работе впервые приводятся данные комплексной идентификации парвовируса, вызывающего массовую смертность животных в зверохозяйствах Приморского края. Установлено, что на данной территории циркулирует один геновариант вируса, филогенетически близкий штаммам группы Utah. Показано, что выявленные мутации в гене капсидного белка Vp2, а также делеция аминокислоты в его гипервариабельном участке не влияют на вирулентность штамма. Предложена структура олигонуклеотвдных праймеров для амплификации и секвенирова-11ия полноразмерной копии гена Vp2. Впервые проведен анализ филогенетических групп штаммов ADV выделенных на основе полной нуклеотидной последовательности основного белка оболочки Vp2 и его фрагмента, длиной 231 н. о.

Практическая значимость работы. Установлена принадлежность дальневосточного изолята ADV к группе сильнопатогенных штаммов вируса, что позволяет прогнозировать экономический ущерб и проводить соответствующие противоэпи-

демиологические мероприятия. Впервые получена кроличья антисыворотка к изучаемому изоляту, которая может быть использована для детекции вируса иммунологическими методами. Использование меченных Ш1 антигенных и антительных высокоспецифичных коньюгатов позволяет повысить точность и специфичность иммуно-химических методов диагностики заболевания на ранних стадиях инфекционного процесса. Предложены молекулярные методы диагностики ADV с доказанной специфичностью и высокой чувствительностью.

Апробация работы и внедрение в практику. Результаты работы докладывались иа региональных конференциях «Актуальные проблемы морской биологии и экологии» (2-3 октября, 1998 г., Владивосток) и «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока» (17-18 ноября, 1998 г., Владивосток), международной конференции по проблемам экологии и рационального природопользования стран АТР (16-17 ноября 1999 г., Владивосток), конференциях-конкурсах молодых ученых БПИ ДВО РАН (1999, 2001, 2004 гг.).

Нукпеотидная последовательность гена Vp2 дальневосточного изолята депонирована в международный банк генетических данных NCBI.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация общим объемом 97 страниц состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2-х глав результатов исследования, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 26 рисунками, на которых представлены 3 электронные микрофотографии, 8 электрофореграмм и бло-тов; содержит 8 таблиц. Список литературы насчитывает 264 наименования, из которых 213 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Парвовирусы. Общая характеристика ADV.

Изменчивость. Способы диагностики (литературный обзор)

В литературном обзоре приведены сведения о истории изучения алеутской болезни норок, свойствах вирионов ADV, изменчивости вируса. Подробно рассмотрены классические и современные методы детекции ADV.

Материалы и методы

Материалы исследований. Материалом служили органы норок с положительным ответом в серологических тестах на наличие ADV (название дальневосточного изолята вируса ADV-DV), полученные из зверосовхозов Приморского края (Под-городненский, Силинский, Тавричанский) (1999-2004 гг.). Для сравнения и в качестве контроля использовали вирионы и антитела к ним из коммерческих диагностических наборов: культуральный штамм ADV-G (ТОО «ИМГЕН», г. Новосибирск) и ADV-P1, выделенный от норок в зверосовхозах западного региона России (АО «Вет-звероцентр» г. Москва).

Методы исследований. Препарат вируса получали дифференциальным центрифугированием в трис-буферной системе. Диссоциацию иммунных комплексов осуществляли HCI-гаициновым буфером. От примеси ферритина избавлялись хро-

матографией насефарозе 6В (A.c. № 2052995, 1996). Вирионы негативно контрастировали 2%-ным водным раствором уранилацетата и просматривали в электронном микроскопе JEOL-LEM 100В. Вирусспецифнческие белки анализировали в денатурирующем лолиакриламидном геле (ПААГ) (Атабеков, 2003).

Антисыворотку против ADV-DV получали иммунизацией кроликов препаратом с полным адьювантом Фрейнда по схеме М. Горвица и М. Шарффа (1972) в нашей модификации. IgG из сыворотки крови норок осаждали сульфатом аммония и очищали на колонке сефадекса G-200 (Брок, 1987). Коньюгацию вирусных белков и IgG с '"I осуществляли методом окисления иодата натрия хлорамином Т (Остерман, 1983; Шульфе, 1987). Реакцию двойной иммунодиффузии (РДД) и ракетный имму-ноэлектрофорез (РИЭФ) проводили согласно рекомендаций Р. Гнутовой (1985), встречный иммунозлектрофорез (ВИЭФ) - К. Вильмса (1987).

Выделение суммарной ДНК из органов норок проводили фенольно-детерген-тным методом с протеиназой К. Очистку ДНК ADV осуществляли согласно метода Мешкова с соавт. (1989). Анализ ДНК в агарозном геле (иативные и щелочные условия) осуществляли по обычным методикам (Маниатис и др., 1984).

Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) проводили используя набор для ПЦР с Taq-полимерэзой ЗАО «СибЭнзим». ПЦР-продукты очищали с помощью набора GenElute PCR Clean-Up kit (Sigma). Нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК определяли на секвенаторе ABI PRISM™ 310 (Applied Biosystems).

Дот-блот гибридизацию ДНК проводили на нейлоновых фильтрах Biotrans (ICN Biomed) с диаметром пор 0,2 мкм согласно прилагаемой инструкции. Образцы наносили с помощью аппарата HYBRY-BLOT Manifold, BRL. Химическую модификацию пероксидазы хрена (ПХ) осуществляли согласно протокола М. Renz и С. Kurz (1984) и рекомендаций Ю. Дрыгина с соавт. (1989).

Подбор праймеров проводили с помощью программы Gene Runner (Hastings Software, Inc.). Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, филогенетический анализ выполнены с помощью программы MEGA (Kumar et al., 1993).

Характеристика дальневосточного изолята ADV (результаты исследований)

Первоначально исследование было направлено на выделение и идентификацию вируса.

Очистка и морфология ADV-DV

Из органов (печень, селезенка) норок с клиническими признаками алеутской бо- EjlflL» "''~

лезни получен препарат вируса, спектр поглощения УФ-света которого соответствовал KjJSfcfcí Hyt-спектру очищенного препарата белка, ло- а*уЗр

кальный максимум находился в области длин

волн соответствующей 260 нм, минимум - в Д^МжВгИ,' " области 250 нм. Соотношение E2M/EJ!0 соста- Кйй^гаЯшю^.^^ВтатеиГЖ!* вило 1.1. Соотношение величин поглощения

E¡wl/E¡s(1, характеризующее степень чистоты Ш^ИШШНк^^^Ш вирусных частиц от сопутствующих клеточных белков, составило 2.5, что характерно „ . _ ,

для препаратов ADV (Aasted, 1980). Рис' '

и 1 у ADV-DV. Масштаб 100 нм.

С помощью электронного микроскопа в полученном препарате обнаружены вирионы изометрической формы, диаметром 24-25 нм (рис. 1), что соответствует данным других исследователей (Bloom et al., 1975; Ingram, Cho, 1984; Aasted, 1985).

кДа К M П т.н.о. M

Рис. 2. Определение белкового состава Рис. 3. Определение размера

препарата АОУОУ электрофорезом в ДНК АБУ-ОУ электрофорезом в

12%-ном ПААГ. К - контроль, М - 1%-ном денатурирующем

белки-маркеры, П — вирусный агарозном геле. М — маркер —

препарат. ДНК фага

Денатурирующим электрофорезом в ПААГ было установлено, что вирионы изучаемого изолята содержат два полипептида с м. м. 75 и 85 кДа (рис. 2). Это характерно для частиц ADV (Cotmore, Tattersall, 1987). Содержание белка Vp2 в несколько раз превышало Vpl, что является отличительной особенностью полипептидного состава вириона ADV (Clemens et al., 1992). Частицы других парвовирусов содержат три структурных белка, в частности, MEV состоит из полипептидов с м. м. 77.5, 63.5 и 63 кДа (Ткачев и др., 2002). Нуклеокапсид CDV состоит из 5-7 белков (Филдс, Найп, 1989).

Электрофорсгические профили ДНК, экстрагированной из вирионов, в нейтральных и денатурирующих условиях различались, что свидетельствовало о том, что она является одноцепочечной. Такой тип нуклеиновой кислоты характерен для видов порядка ssDNA viruses. Последний включает семейства бактериофагов (Ino- и Micriviridae), фитовирусов (Gemini- и Naniviridae), вирусов поражающих кур и свиней (Circoviridae), а также семейства Parmviridae (Fauquet et al., 2005). Длина анализируемой ДНК составила около 4800 н. о. (рис. 3). Таким образом, нуклеиновая кислота ADV-DV соответствует параметрам генома ADV (Bloom et al., 1983).

Иммунохимический анализ

Впервые получена кроличья поликлональная антисыворотка против ADV-DV, которая содержала антитела к вирионным белкам, так как реагировала в РДД с препаратом вируса. ADV-DV показал себя средним иммуногеном (титр специфических антител, по данным РДД, 1:512-1024).

Для выявления ADV-специфических антигенных детерминант у ADV-DV ис-

пользовати РДД. В системе антисыворотки, приготовленном к АЭУ-ОУ, штаммы АОУ-Р1 и АЭУ-ЭУ показали реакцию идентичности, так как формировали тонкие сливающиеся линии преципитации (рис. 4). Такой результат свидетельствовал о наличии в антисыворотке антител к капеидным белкам обоих штаммов. Расположение линий преципитации между АОУ-О и АОУ-ОУ в системе той же антисыворотки свидетельствовало о частичной идентичности антигенов.

Эти результаты были подтверждены методом РИЭФ. Для постановки реакции использовали антигены в одинаковой концентрации и антисыворотки против АОУ-ОУ, АОУ-Р1 и АОУ-О в разведении 1:100, 1:50, 1:50 соответственно.

Рис. 4. Антигенного родство между штаммами ADV в РДД.

В центральной лупке -антисыворотка против ADV-DV, в периферических — антигены.

Рис. 5. Выявление ADV-специфических этггопов с помэщью РИЭФ. В геле антисыворотка к: A) ADV-G, Б) ADV-DV. В лунках слева направо антигены: ADV-P1, ADV-G, ADV-DV.

Перекрестные реакции в трех системах показали, что все штаммы имеют общие антигенные детерминанты, так как они формировали преципитат в виде «ракеты» (рис. 5, показаны реакции в двух системах). Высота преципитата зависит от содержания в сыворотке гомологичных антител, способных к перекрестной реакции (Гнутова, 1985), поэтому сделано заключение, что дальневосточный изолят имеет наибольшую степень антигенного родства со штаммом ADV-P1 и наименьшую с ADV-G (менее 50%). Таким образом были подтверждены ране«: полученные результаты в отношении родства ADV-G и ADV-DV - антигены, формирующие в РДД преципитат в виде «шпоры» имели в РИЭФ наименьший процент гомологии.

В делом, иммунохимический анализ позволил получить еще одно подтверждение принадлежности исследуемого вирусного изолята к парвовирусу алеутской болезни, а также показать его близкое антигенное родство со штаммом вируса (ADV-Р1), выделенным ранее в зверосовхозе «Пушкинский» Московской области (Слугин, 1982).

Молекулярно-генетнческая характеристика

Молекулярно-генетические исследования преследов;иш две основные цели. Во-первых, необходимо было подтвердить результаты идентификации вируса. Во-вторых, установить его филогенетический статус среди известных штаммов вируса. Для этого анализировали фрагмент вирусной ДНК длиной 1942 н. о. (более 40% генома), представляющий полную нуклеотидную последовательность, кодирующую капенд-ный белок Vp2. Последний выбран не случайно. Данный полипептид является основным структурным белком вириона (более 80%) и несет главные детерминанты

патогенносги и клеточной специфичности (McKenna et al., 1999).

Используя праймеры 1F-1R (разработаны М. Bloom с соавт., 1997), а также предложенные нами 2F-2R, 3F (табл. 1), удалось амплифицировать анализируемый фрагмент генома вируса. Получение в ПЦР трех фрагментов ДНК, размер которых соответствовал расчетным, однозначно подтверждает правильность результатов идентификации изолята и отнесения его к ADV рода Parvovirus.

Таблица 1

Праймеры, использованные для амплификации гена Vp2

Праймер Структура (5'-3*) Локализация* Длина ампликона (П.Н.)

1 F 1 R CTTGTCACGCTACTAGAATGGT AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT 2587-2608 3251-3279 692

2 F 2 R GGAGATAACTTTCATACAGG AGGTTGTTCACTATTCATGT 3216-3235 4404-4423 1208

3 F 1 R GCAAAGCAGCACAAGAGACCT AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT 2179-2199 3251-3279 1100

* Локализация указана для последовательности штамма ADV-G.

Методом прямого секвенирования полученных ПЦР-фрагментов установлена полная нуклеотидная последовательность гена Vp2 изолята (номер в базе NCBI AY428961), длиной 1942 н. о. В Приморском крае выявлен только один геновариант вируса.

Изменчивость и филогенетический анализ штаммов ADV

Полученную последовательность сравнивали с ранее определенными (табл. 2, полные последовательности). Обнаружено 207 полиморфных нуклеотидных позиций, 85 из которых были филогенетически значимыми.

Генетическое разнообразие штаммов ADV оценивали по нуклеотидным дистанциям (р-дистанции - число нуклеотидных замен на сайт, выраженное в процентах) между полными последовательностями гена Vp2. Значение дистанций варьировало в широких пределах: от 0,00263 ± 0,00118 до 0,07789 ± 0,00615. Среднее составило 0,04150 ± 0,00290. Полученные данные свидетельствуют, что изолят ADV-DV генетически близок американским штаммам Utah 1 и Utah Ikit. Наиболее значительные различия установлены между дальневосточным изолятом и штаммом Pullman.

На NJ-филогенетическом дереве (рис. 6 А) мы выделили 3 кластера. Вершину дерева образует кластер сильнопатогенных американских штаммов группы Utah, который включает и дальневосточный изолят. Второй кластер объединяет сильнопатогенные штаммы TR, SL3 и непагогенпый G. В основе дерева расположен штамм Pullman, патогенный только для норок алеутского генотипа. Воспроизводимость порядка ветвления оказалась чрезвычайно высокой (близкой к 100%). По всей видимости, установленные филогенетические взаимоотношения между штаммами вируса являются наиболее вероятными.

Мутации в гене распределены не равномерно, причем область, содержащая наибольшее количество нуклеотидных замен совпадает у всех штаммов (с 693 по 725 от первого н. о. гена), причем его структура расшифрована для большинства штаммов. В настоящее время в работах, посвященных внутривидовой классификации и

Таблица 2

Нуклеотидные последовательности штаммов ADV, использованные в работе

Штамм Место изоляции Источник GenBank

полные последовательности гена Vp2

Utah 1 США Mustela vison Z18276

Utah 1 Kit США M ustela vison U390015

G США Mustela vison M20036

TR США Mustela vison U390013

Pullman США Mustela vison U3 90014

SU Германия Mustela vison X97629

фрагменты последовательности гена Vp2

365 Япония Mustela putorius furo AB044558

SOI Япония M ustela putorius furo AB044559

F Япония Mustela putorius furo S82723

TH5 США M ustela vison AF124791

GL-cll Дания M ustela vison M63046

GL-c24 Дания Mustela vison M63047

K-k5 Дания Mustela vison M63050

K-k8 Дания M ustela vison M63051

Andres M LI Испания M ustela lutreola AF205380

Colas MV2 Испания Mustela vison AF205381

LL6 Испания Lutra lutra AF205382

Utah 1(2L-11) Дания M ustela vison M63039

Utah 1(2L-15) Дания Mustela vison M63040

Utah l(2L-44) Дания Mustela vison M63042

Utah l(2L-45) Дания M ustela vison M63043

филогении ADV, доминирует система разделения, основанная на анализе коротких нуклеотидных фрагментов и, в частности, с использованием указанного гипервариабельного участка (ГВУ). Впервые такой подход был предложен М. Bloom с соавт. (1987), которые предположили, что в структуре гена Vp2 есть короткий фрагмент, определяющий основные шгаммовые характеристики.

Поскольку нами выявлены филогенетически значимые нуклеотидные замены не только в ГВУ, но и за его пределами (в пределах гена), необходимо было проверить, в какой степени данный участок отражает степень изменчивости всего гена. Для этого сравнивали участок длиной 231 н. о. (локализация 3045-3276 ADV-G) тех же ипаммов, которые анализировали выше (табл. 2, полные последовательности гена Vp2). Среднее значение дивергенции в два раза превышало ранее установленного значения - 0,08292±0,01221. Последнее, видимо, можно объяснить большей изменчивостью «короткого» фрагмента (21.2% вариабельных сайта прэтив 10.7%, содержащихся

в «длинном» фрагменте). По-прежнему, дальневосточный изолят обнаружил наибольшее генетическое родство со штаммами группы Utah, однако максимальный уровень различий зарегистрирован со штаммом TR. Из рис. 6 Б видно, что полученное дерево конгруэнтно предыдущему, так как характер расположения и состав кластеров, а также значения бугсгреп-поддержки, практически не изменились. Наблюдали изменение положения штамма Pullman, который, однако сохранил отдельную позицию. Таким образом, было продемонстрировано, что выбранный фрагмент длиной 231 п. о. достаточно информативен для внутривидовой классификации и корректно отражает выделение филогенетических групп вируса.

Полученный результат позволил нам провести реконструкцию генетических взаимоотношений между всеми штаммами вируса, для которых был известен выбранный нами «короткий» фрагмент (табл. 2). В полученном дереве (рис. 7) на уровне генетических различий 0.03-0.04 штаммы формировали две большие группы, монофилия которых требует дополнительною исследования. Однако отметим, что группообразу-югцие штаммы ADV-G и ADV-Utah во всех предложенных нами системах формировали отдельные эволюционные ветви.

На уровне генетических различий 0,02 штаммы сгруппированы в пять групп. Первую группу образуют испанские штаммы и слабопагогенный, не инфицирующий норок неалеутского генотипа, штамм Pullman. Учитывая существенное отличие структуры ГВУ последнего от других штаммов группы (рис. 8), а также не высокое значение бутстрэп-оценки (менее

60%), эволюционное поло- ^ _wo | Utah 1

жение данного штамма требует дальнейшего исследования.

Вторую и третью группы образуют высоковирулентные, не размножающиеся в культуре ткани, датские штаммы группы К и американские Utah соответственно. Нами убедительно показано, что дальневосточный изолят ADV филогенетически близок штаммам третьей группы.

Четвертая группа объединяет только японские штаммы, выделенные от домашнего хорька (Murakami et al., 2001).

Интересен состав пятой группы, которая

включает авирулентный —^ ¡^ ^ ¡^ ^ (размножающийся только в

культуре) штамм G, слабо „ , ... , . тл..

J _„т Рис. 6. NJ-филогенетические деревья штаммов ADV,

патогенный GL и высоко „ „

... тс ы построенные по полной нуклсотидной

ПЗТОГ6ННЫ6 oLj И 1IV. Их т, _ , , , , _

последовательности гена Vp2 (А) и его фрагмента (Б).

Utah 1 kit

SL3

" Pullman

JSL3

"TR

- Pullman -OV jUtahl Utah 1 kit

Andres M.1 Colas MJ2 LL6

-Мгшп

_I K-k5

99 'к-к8

-ЕЛ/

Utah(2L-15) Utah 1 — Uteh(2L-45) Utah(2L-44) Utah 1 kit 99 |365

'sot

-F

-TR

-7H5

GL-C11

- GL-C24

Utah(2L-11) SL3

Рис. 7. Ш-филогенегичесше дерево, построенное на основании фрагмента нуклеотидной последовательности гена Vp2 длиной 231 н. о. всех известных штаммов ADA/.

близкое эволюционное родство показано ранее зарубежными исследователями при построении таксономической системы на основе матриц дивергенции последовательностей неструктурных белков (Gottschalck et al., 1994; Schuierer et al., 1997). В эту же группу вошел штамм Utah(2L-ll), представляющий собой минорный геновариант, выделенный из природной популяции штамма Utah 1, ген етически близкий непатогенному ADV-G (Oie et al., 1986). Отметим, что ни одна из предложенных на настоящий момент классификаций не отражает принципов общности географического происхояедения и степени патогенное™ штаммов вируса Вероятнее всего, генетические детерминанты данных свойств локализованы не только в генах структурных, но и неструктурных белков (Oie et al., 1996; Olofsson et al., 1999).

В заключение обсуждения вопроса о классификации штаммов ADV отметим следующее. Для разведения маточного поголовья в зверосовхозах Приморского края

232 I

241 I

VAT ETLT WD Л V

. . О .

А . Q S г. Т . 1

A.QS К Т . I

А . Q S Е т . I

А . Q S Б т . I

А . О S Е т С» 1

LGQU Q Е т о т

LGQ D Q Е т G Т

LGQD Q Е т G Т

MGQ . Q Е т О Т

MGQ . О Е т о г

М G О ■ Q Е т G Т

MC1Q . Q Е г а т

MGQ . Q Е т а т

T GQ . — Е т G T

ТОО ■ — Е т GT

S . Q S Q Е т С.Т

S . Q S О Е т G Т

S . Q S Q Е . т G Т

в 70-80-х гг. норок завозили из европейской части России. Можно предположить, что из-за невысокой чувствительности иммунологических диагностикумов того времени произошел занос вируса. На территории России выделено несколько изолятов ADV (Рыжова и др., 2002; Обухов и др., 2003), нуклеотидные последовательности которых не зарегистрированы в международном банке генетических данных. Однако, анализируя представленные в указанных публикациях фрагменты аминокислотных последовательностей, нами было отмечено, что аминокислотная структура гипервариабельной области ADV-DV идентична таковой штамма ADV-P1, выделенного в зверосовхозе пушкинский» и использованного в настоящей работе в качестве контроля (рис. 8). Деления одной аминокислоты является характерным маркером их ГВУ и делает его структуру уникальной среди всех известных штаммов вируса. Можно сделать предположение об их монофилетичности и распространении на территории России сильнопатогенных геновариантов вируса, что должно стать предметом дополнительного исследования.

Сравнение патогенных свойств штамма Utah 1 и его дальневосточного варианта позволило заключить, что «выпадение» аминокислоты Thr из гипервариабельной области капсидного белка не привело к их изменению. Таким образом, ADV-DV является одним из высокопатогенных штаммов вируса.

Разработка методов диагностики ADV-DV

Учитывая, что до настоящего времени не разработаны эффективные вакцины для профилактики алеутской болезни норок (Castebruiz et al., 2005), основной мерой предотвращения распространения вирусной инфекции в хозяйствах является своевременная выбраковка и изоляция зараженных животных. При этом максимальный положительный эффект достигается при индикации возбудителя на ранних стадиях. Мы считаем, что данному условию удовлетворяют две группы методов: иммунохи-мические с радиоизотопной меткой и детекции вирусной нуклеиновой кислоты.

Выявление методом ВИЭФ

Метод является основным в зверохозяйствах Приморского края. Для определения эффективности диагностики вируса исследовали 1000 образцов крови норок, выращиваемых в ЗАО «Подгородненский» (г. Артем, Приморский край). Из 1000 образцов сыворотки 116 дали положительную реакцию. При повторном обследова-

Ulah(2U-ll) GL-cll GL-C24 SL3

TH5

365

SOI

Ferret Pullman Andres ML1 Colas MV2 1.1.6

Utah(2T.-15) Utah(2L-44) lJtah(2L-45) Utah 1 Utah 1 kit DV

P-l (Rus) K

K-k5 K-k8

Рис. 8. Выравненные аминокислотные последовательности ГВУ штаммов ADV. Слева указаны группы штаммов, соответствующие группам на рис. 7.

нии через 30 сут. у 28 животных с отрицательным ответом был выявлен ADV антиген. Относительно данного результата оценивали эффективность разрабатываемых методов диагностики.

Радиоиммунные методы детекции

Нами, впервые для данного вируса, разработаны условия мечения вирусного антигена и противовирусных антител, подобраны оптимальные условия постановки реакций. Установлены следующие параметры меченного йодом дальневосточного изолята ADV: удельная радиоактивность около ЮОГБк на 1 г белка, объемная активность - 12 ГБк/л, степень йодирования близка к единице. В сыворотке крови инфицированной ADV норки с помощью 5 нг меченого антигена при радиоактивности образца 30000 имп./мин в 0.07 мл сыворотки можно показ ¿ль присутствие вируса при концентрации специфических антител до 10 нг.

Оптимизировали условия проведения РИА: соотношение количества |251 меченого антигена ADV и конкурирующего немеченого антигена, концентрацию ADV-специфических антител, необходимых для получения максимального коэффициента связывания комплекса (АГ-АТ), и условия pH среды. Коэффициент связывания (афинность К>сс) определяли по графикам Скэтчарда в диапазоне pH среды 3.2 - 9.0. Было установлено, что диапазон pH 5.8-6.2 является оптимальным, так как при таких условиях наблюдали максимальное осаждение вируссодержащих имунных комплексов из сыворотки крови норок.

Разработанный РИА-диагностикум позволяет дифференцировать формы инфекционного процесса. На примере анализа крови 30 жшютных показаны различия между здоровыми, тяжело больными и животными на ранних стадиях инфекционного процесса. В ходе постановки РИА при контроле радиоактивности 4300 ими,/ мин уровень радиоактивности сыворотки крови больных норок в среднем равен 24300 имп./мин. При ранних формах заболевания уровень радиоактивности сыворотки принимает промежуточное значение между здоровыми и больными животными -10350 импУмин.

Сравнение РИА методов с традиционно используемым ВИЭФ показало, что предлагаемые диагносгикумы превосходят по чувствительности в 10-20 раз. При этом, значительно снижается расход реагентов и появляется возможность дифференцировать формы заболевания.

Для звероводческих хозяйств, до промышленного производства предложенных диагностикумов, возможно использование для мечения антигена и (или) противовирусных антител из наборов для ВИЭФ. Технология мечения 1251 не сложна и может осуществляться согласно протоколам, изложенным в «материалах и методах» диссертации.

Выявление ADV методом ПЦР

Для ПЦР диагностики использовали праймеры F1-R1 (табл. 1), так как они комплиментарны консервативным участкам генома ADV (Bloom et al., 1997).

Для оценки пригодности данной пары праймеров при выявлении вируса, циркулирующего на Дальнем Востоке России, в качестве матрицы в ПЦР использовали суммарную клеточную ДНК из органов инфицированных животных, полученную методом фенольной депротенизации, так как он обеспечивал получение биоироб высокой чистоты. Темпергпурный режим для объема 25 мкл: начальная денатурация 3 мин при 93 °С; 35 циклов: денатурация 30 с при 93 °С, отжиг 10 с при 48 °С, элонгация 45 с при 72 °С. При таких условиях наблюдали амплификацию только

одного фрагмента ДНК длиной около 700 п. н., что соответствовало расчетной величине (рис. 9).

Далее отрабатывали условия выявления вируса в сыворотке. При тестировании необработанной сыворотки животных, с клиническими признаками алеутской болезни и дающих положительную реакцию в ВИЭФ, а также подготовленной методом термического лизиса (инкубация 5 мкл сыворотки с течение 45 с при 70 °С) (Oie et al., 1997) амплификацию специфического фрагмента не наблюдали. Изменение количества вносимой биопробы от 0.5 до 5 мкл не влияло на результат.

Метод щелочного лизиса (кипячение сыворотки в присутствии 0,1 M гидроокиси натрия с последующим центрифугированием) (Ivinson, Taylor, 1991) позволил при использовании в ПЦР 5 мкл подготовленной биопробы идентифицировать специфический фрагмент ДНК ADV. Тестирование метода на чувствительность показало, что при таких условиях вирус успешно выявляется в сыворотке до разведения 1:25б. При анализе сывороток норок, обработанных предложенным методом, из 1000 образцов синтез целевого фрагмента ДНК зарегистрировали в 647 случаях. Сравнение результатов диагностики ADV методами ПЦР и ВИЭФ показало, что первоначальное значение инфицированности животных было занижено более чем в 5 раз.

Выявление методом дот-блот гибридизации ДНК

В качестве зонда использовали ПЦР-прагмент 1F-1R. Достаточно протяженная длина зонда обеспечивает высокую чувствительность метода. Фермент «пришивали» к ДНК-зонду глутаровым альдегидом.

В серии экспериментов установлено, что оптимальная температура гибридизации для данного зонда находится в пределах 50-55 °С. Максимальная чувствительность метода достигнута при концентрации зонда 4-5 мкг/мл и инкубации в течение 16 ч.

Специфичность зонда доказали в тесте молекулярной гибридизации с очищенным препаратом вируса и вирусной ДНК. В качестве положительного контроля использовали немеченый фрагмент 1F-1R. Зонд необратимо отжигался с вирусной ДНК, специфическое окрашивание также наблюдали в точке нанесения препарата вируса (рис. 10). Зонд не реагировал с гетерологичной нуклеиновой кислотой (ДНК горбуши Oncorhynchus gorbuscha). Гибридизационный сигнал также отсутствовал в точке нанесения суммарной клеточной ДНК, полученной от неинфицированной ADV норки. Таким образом была доказана строгая специфичность зонда и его способность необратимо связываться с ДНК ADV.

Для определения чувствительности метода ставили реакцию с использованием мембраны, на которую предварительно наносили серию разведений препарата

п.н. 100003000200015001000750500250-

Рис. 9. Выявление ДНК ADV методом ПЦР. 1. ДНК-маркер 1 Kb Ledder. 2. ДНК-матрица, выделенная из селезенки инфицированной ADV-DV норки. 3-4 - сыворотки инфицированных норок, подвергнутые щелочной обработке. 5. Сыворотка здоровой норки (щелочной лизис). 6, Бланк-контроль.

12 3 4

5 6 7 8

Рис. 10. Установление специфичности метода гибридизации. Пробы: 1 - ДНК горбуши, 2, 3 - ДНК неинфицированной ADV норки, 4, 8 - вирусная ДНК, 5 -препарат ADV-DV, 6 - ПЦР-фрагмент ADV-1F-1R, 7 - тДНК инфицированной норки.

ADV с определенной концентрацией. Метод позволяет выявить ADV, концентрация которого в пятне не менее 3 нг.

Далее отрабатывали способ диагностики вируса в крови животных. При использовали сыворотки инфицированных животных без предварительной обработки специфический гибридизационный сигнал не наблюдали. Для того, чтобы ДНК вируса, содержащуюся в имунных комплексах, сделать доступной для взаимодействия с зондом, тестируемые сыворотки подвергали щелочной обработке. Данную процедуру можно проводить как в отдельности с каждой пробой, так и с фильтром с предварительно нанесенными сыворотками. Предложенный вариант метода позволяет успешно выявлять вирус не только в цельной сыворотке, но и при ее разведении более чем в 1000 раз.

выводы

1. Изучены морфология, физико-химические свойства вирионов, эпитопы капсид-ных белков исследуемого патогена. Это позволило установить, что массовая гибель норок в звероводческих хозяйствах Приморского края вызвана вирусом алеутской болезни (Aleutian disease virus, ADV), рода Parvovirus, семейства Parvoviridae.

2. Впервые получена кроличья поликлональная антисыворотка к дальневосточному изоляту вируса (ADV-DV) и доказано его антигенное родство с другими штаммами ADV в РДЦ. С помощью РИЭФ определен процент гомологии между ними. Показано, что ADV-DV имеет как видо-, так и индивидуальные шгаммоспецифи-ческие эпитопы. Иммунохимические исследования не только подтвердили принадлежность ADV-DV к вирусам рода Pan'ovirus, но и показали близкое антигенное родство со штаммом ADV-P1, выделенным в зверосовхозе «Пушкинский» Московской области.

3. В результате анализа получешюй полной нуклеотидной последовательности кап-сидного белка Vp2 вируса установлено, что дальневосточный изолят является новым геновариантом сильнопатогенного американского штамма Utah 1 вируса алеутской болезни.

4. Показана идентичность аминокислотной последовательности гипервариабельного участка ADV-DV и штамма ADV-P1, что позволяет сделать предположение о завозе вируса на территорию края из европейской части России.

5. Впервые для ADV выбран фрагмент генома длиной 231 н. о. с достаточной информативностью для внутривидовой классификации, корректно отражающий филогенетические отношения штаммов вируса. Среди известных штаммов ADV выделено пять филогенетических групп.

6. Разработаны и апробированы две тест-системы диагностики ADV па основе радиоиммунного анализа и нерадиоактивной гибридизации ДНК. Впервые для ADV разработаны условия мечения радиоактивным йодом вирусного антигена и противовирусных антител. Такие диагностикумы превосходят по чувствительности в 10-20 раз ВИЭФ — основной метод, используемый в зверохозяйствах Приморского края. Метод нерадиоактивной гибридизации ДНК имеет достаточно невысокие требования к анализируемому материалу. Использование в качестве ДНК-зонда протяженного фрагмента ДНК, комплементарного геному вируса, - еще одно преимущество метода, так как повышает его надежность,

7. Отработан метод диагностики ADV-DV в сыворотке крови норок с помощью ПЦР. Показано, что используемые праймеры комплементарны участкам генома вируса, с минимальным количеством нуклеотидных замен.

Список опубликованных работ

1. Мартыненко М.В., Минская Л.А., Мамонтова В.А., Коватевская A.M., Санина И.М. Разработка технологии получения высокоочищенных препаратов возбудителя алеутской болезни норок и использование их в иммунологических тест-системах / Тез. докл. регион, конф. по актуальным проблемам морской биологии и экологии студентов, аспирантов и молодых ученых. Владивосток: ДВГУ, 1998. С. 81-83.

2. Мартыненко М.В., Минская Л.А., Мамонтова В.А. Эффективный контроль за выносом возбудителя алеутской болезни норок в окружающую среду / Тез. докл. регион, конф. «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока». Владивосток: ВГУЭС, 1998. С. 119-120.

3. Мартыненко М.В., Минская Л.А. Лабораторная диагностика алеутской болезни норок как метод экологического мониторинга парвовирусной инфекции / Тез. докл. межд. конф. «Проблемы экологии и рационального природопользования стран АТР». Владивосток: ВГУЭС, 1999. С. 69-71.

4. Минская Л .А,, Набережных Г.Н., Мамонтова В. А., Гладшх Р.В., Ковалевская A.M., Мартыненко М.В., Журавлев Ю.Н. Сравнительная характеристика некоторых свойств возбудителя алеутской болезни норок, циркулирующего на юге Дальнего Востока России / Труды межд. симпозиума дознание и наука: взгляд в будущее». Владивосток: ДВГТУ, 2000. С. 182-197.

5. Minskaya L.A., Naberezhnyh G.N., Mamontova V.A., Martynenko M.V., Zhuravlev Yu.N. The Antigenic and Biochemical diversity of Aleutian mink disease virus strains circulating in western and Far East regions of Russia / Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia. Vol. 3, part 2. Novosibirsk, Russia. 2000. P. 256-258.

6. Минская Л.А., Набережных Г.А., Минская E.C., Слоноза Р.А., Мартыненко М.В., Журавлев Ю.Н. Циркуляция парво-, рабдо- и хантавирусов с негативным геномом, возбудителей регионально-актуальных инфекционных заболеваний животных и растений на Дальнем Востоке России / Труды межд. форума по проблемам науки, техники и образования. Т. 2. М.: Академия наук о Земхе, 2000. С. 79-81.

7. Мартыненко М.В., Беликов С.И., Бутина Т.В., Журавлев Ю.Н. Клонирование гипервариабельной области гена капсидного белка Vp2 дальневосточного изолята вируса алеутской болезни норок / Тез. докл. регион, научно-практической конф. «Молодежь XXI века: шаг в будущее». Благовещенск, 2002. С. 107.

8. Мартыненко М.В., Беликов С.И., Бутина Т.В., Минская Л.А., Журавлев Ю.Н. Дальневосточный штамм вируса алеутской болезни норок: клонирование гипервариабелыюй области генома / Труды межд. симпозиума «Дальний Восток: ресурсный потенциал в начале Ш тысячелетия». Ч.З. Ейадивосток, 2003. С. 152155.

9. Минская Л.А., Мартыненко М.В., Минская Е.С., Журавлев Ю.Н. Генодиагностика ханта- и парвовирусных инфекций. Репликационная стратегия вирусного генома отрицательной полярности / Труды межд. симпозиума «Дальний Восток: ресурсный потенциал в начале П1 тысячелетия». Ч.З. Ейадивосток, 2003. С. 145151.

10. Мартыненко М.В. Использование полимеразной цепной реакции для детекции вируса алеутской болезни норок // Сельхоз. биология. 2004. № 6. С. 119-122.

11. Мартыненко М.В., Минская Л.А., Исаева М.П., Гузев К.В., Журавлев Ю.Н., Рассказов В.А. Генетические взаимоотношения штаммов вируса алеутской болезни норок. - В кн.: Животный и растительный мир Дальнего Востока. Уссурийск: УГПИ, 2004. С. 16-31.

Марина Владимировна Мартыненко

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУПЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ {ALEUTIANDISEASE VIRUS), ЦИРКУЛИРУЮЩЕГО НА ЮГЕ ПРИМОРСКОГО КРАЯ, И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано к печати 31.07.2006 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1.0. Тир. 100 экз. Заказ Отпечатано с оригинала закгзчика в типографии издательства ТИНРО-центра 690950, г. Владивосток, ул. Западная, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мартыненко, Марина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ПАРВОВИРУСЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Вирусы семейства Parvoviridae.

1.2. Вирус алеутской болезни {Aleutian disease virus, ADV).

1.2.1. Общая характеристика вируса.

1.2.2. Физико-химические и антигенные свойства.

1.2.3. Геном ADV: организация, репликация, изменчивость.

1.3. Способы диагностики вируса.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Вирусный материал.

2.2. Получение препарата ADV-DV (дальневосточный изолят).

2.3. Электронная микроскопия.

2.4. Очистка ДНК.

2.5. Электрофорез вирусных белков в ПААГ.

2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.7. Получение кроличьей антисыворотки к ADV.

2.8. Выделение IgG из сыворотки крови норки.

2.9. Мечение IgG и вирионов ADV ,251.

2.10.-Реакция двойной иммунодиффузии.

2.11. Встречный иммуноэлектрофорез.

2.12. Ракетный иммуноэлектрофорез.

2.13. Радиоиммунный анализ.

2.14. Полимеразная цепная реакция.

2.15. Дот-блот гибридизация ДНК.

2.16. Секвенирование ПЦР-фрагментов.

2.17. Анализ генетических данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Морфологические свойства ADV-DV.

3.2. Структурные полипептиды ADV-DV.

3.3. Иммунохимический анализ капсидных белков.

3.4. Молекулярно-генетическая характеристика ADV-DV.

3.4.1. Вирусная нуклеиновая кислота.

3.4.2. Амплификация гена капсидного белка Vp2.

3.4.3. Секвенирование генома ADV-DV и филогенетический анализ j штаммов вируса.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ADV-DV.

4.1 Выявление методом встречного иммуноэлектрофореза.

4.2. Радиоиммунные методы детекции.

4.3. Выявление методом ПЦР.

4.4. Выявление методом дот-блот гибридизации ДНК.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимические и молекулярно-генетические свойства вируса алеутской болезни (Aleutian disease virus), циркулирующего на юге Приморского края, и разработка методов его диагностики"

Актуальность темы. Норки (Mustela vison Shreb., американская норка) являются хозяевами для большого числа вирусов из-за их постоянного контакта с источниками и природными резервуарами возбудителей. При клеточном содержании на фермах наиболее часто их инфицируют два парвовируса норок (алеутской болезни (ADV) и энтерита (MEV) (семейство Parvoviridae) и морбилливирус чумы плотоядных (CDV) (семейство Paramyxoviridae) (Литвинов, Яременко, 1998). В конце 90-х гг. в трех пушных зверохозяйствах Приморского края были зарегистрированы случаи массового падежа норок (особенно щенков). Результаты вскрытия павших животных и эпидемиологические данные указывали на вирус алеутской болезни. К тому же, в сыворотке крови животных были обнаружены антитела к ADV (Минская и др., 2000), однако они могли являться поствакцинальными антителами. Было сделано предварительное заключение, что наиболее вероятным возбудителем является ADV. Требовалось провести видовую идентификацию вируса, определить его патогенность.

Алеутская болезнь норок - контагиозное заболевание пушных зверей. Высокая восприимчивость животных и устойчивость вируса во внешней среде способствуют массовой смертности зверей, доходящей в некоторых случаях до 100% как за рубежом (Bloom et al., 1994), так и в России (Михеев, 2003), обуславливая значительный экономический ущерб пушному звероводству. Для вируса характерна высокая скорость изменчивости (Gottschalck et al., 1991; Olofsson et al., 1999). Показано, что единичные аминокислотные замены в его капсидных белках способны значительно влиять на патогенные свойства штаммов вируса (Oie et al., 1996; Stevenson et al., 2001). В связи с этим, отнесение впервые выявленного на юге Дальнего Востока изолята ADV к группе штаммов определенной патогенности - одна из важных задач при изучении вируса. Это позволит прогнозировать будущие вспышки, будет способствовать снижению экономического ущерба и разработке мероприятий по исправлению эпидемиологической ситуации на звероводческих фермах края.

Литературные данные свидетельствует о достижении значительных успехов в изучении ADV. Однако, до сих пор не разработаны специфические средства защиты животных от инфицирования вирусом, что во многом обусловлено особенностями его биологии. Предложенные вакцины малоэффективны, так как вирионы не нейтрализуются антителами, а циркулируют в виде инфекционного иммунного комплекса. До настоящего времени основным средством контроля заболевания, вызываемого ADV, 4 остается выбраковка и изоляция пораженных животных, эффективность которой необходимо повышать, благодаря использованию современных молекулярно-генетических методов, таких как радиоиммунный анализ, полимеразная цепная реакция, гибридизация нуклеиновых кислот, которые основаны на выявлении следовых количеств вируса. Однако, учитывая, что ADV - не изученный вирус на Дальнем Востоке России, отсутствие данных об антигенных свойствах его капсидных белков и молекулярно-генетических характеристик не позволяет разработать эффективные диагностические тест-системы.

Необходимо отметить, что исследование парвовирусов отстает от аналогичных исследований других вирусов. Во многом это определяется их мелким размером, сложностью культивирования, сильной зависимостью репликации от клетки. Практически отсутствуют сведения об их антигеном родстве. Расшифрованы нуклеотидные последовательности геномов менее половины всех известных парвовирусов. Поэтому, о происхождении и эволюции этих видов известно очень мало. Учитывая выше сказанное, а также то, что парвовирусы представляют угрозу для многих животных и, возможно, для человека, их изучение представляется актуальным и своевременным.

Цель работы состояла в изучении структурно-морфологических, иммунохимических и молекулярно-генетических особенностей возбудителя алеутской болезни норок - ADV, циркулирующего в зверосовхозах Приморского края и разработке методов нового поколения для его диагностики.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) получить очищенный препарат вируса;

2) дать характеристику морфологии вирионов дальневосточного изолята;

3) изучить основные физико-химические свойства капсидных белков и ^ нуклеиновой кислоты;

5) определить нуклеотидную последовательность гена, кодирующего структурный белок Vp2;

7) отработать методики радиоиммунных методов для диагностики ADV;

8) разработать тест-системы диагностики ADV на основе ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мартыненко, Марина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Изучены морфология, физико-химические свойства вирионов, эпитопы капсидных белков исследуемого патогена. Это позволило установить, что массовая гибель норок в звероводческих хозяйствах Приморского края вызвана вирусом алеутской болезни {Aleutian disease virus, ADV), рода Parvovirus, семейства Parvoviridae.

2. Впервые получена кроличья поликлональная антисыворотка к дальневосточному изоляту вируса (ADV-DV) и доказано его антигенное родство с другими штаммами ADV в РДД. С помощью РИЭФ определен процент гомологии между ними. Показано, что ADV-DV имеет как видо-, так и индивидуальные штаммоспецифические эпитопы. Иммунохимические исследования не только подтвердили принадлежность ADV-DV к вирусам рода Parvovirus, но и показали близкое антигенное родство со штаммом ADV-P1, выделенным в зверосовхозе «Пушкинский» Московской области.

3. В результате анализа полученной полной нуклеотидной последовательности капсидного белка Vp2 вируса установлено, что дальневосточный изолят является новым геновариантом сильнопатогенного американского штамма Utah 1 вируса алеутской болезни.

6. Разработаны и апробированы две тест-системы диагностики ADV на основе радиоиммунного анализа и нерадиоактивной гибридизации ДНК. Впервые для ADV разработаны условия мечения радиоактивным йодом вирусного антигена и противовирусных антител. Такие диагностикумы превосходят по чувствительности в 10-20 раз ВИЭФ - основной метод, используемый в зверохозяйствах Приморского края. Метод нерадиоактивной гибридизации ДНК имеет достаточно невысокие требования к анализируемому материалу. Использование в качестве ДНК-зонда протяженного фрагмента ДНК, комплементарного геному вируса, - еще одно преимущество метода, так как повышает его надежность.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартыненко, Марина Владимировна, Владивосток

1. А.с. № 1427651 РФ, Al А61 К 39/00. Способ серологической диагностики алеутской болезни норок / Люцко A.M., Ковалевская A.M., Влазнев В.П., Кальницкий Н.Ф., Набережных Г.А., Гришин Ю.И., Фоминых И.Ф. Опубл. 18.03.86. №3(11).

2. А.с. № 2052995 РФ, С1 6 А 61 К 39/12. Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок / Набережных Г.А., Минская Л.А., Ковалевская A.M., Гладких Р.В. Опубл. 27.01.96.

3. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.А. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. №4. С. 3-8.

4. Амброзиус X. Получение антисывороток от различных животных / Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 9-20.

5. Атабеков И.Г. Практикум по общей вирусологии. М.: МГУ, 2003. 64 с.

6. Антонов Б.И., Яковлева Т.Ф., Дерябина В.И. и др. Лабораторные исследования в ветеринарии. М.: Агропромиздат, 1991. 287 с.

7. Бейли Дж. Методы химии белков. М., 1965. 284 с.

8. Бем Э. Электроиммунный анализ / Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 97-103.

9. Брок Й. Получение препаратов иммуноглобулинов / Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 390-413.

10. Вильмс К. Встречный электрофорез / Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 103-108.

11. Геллер В.И., Семикрасова А.Н., Зеленов Е.Ю. Гистологический метод в диагностике вирусных инфекций пушных зверей // Кролиководство и звероводство. 2003. № 4. С. 29-30.

12. Гендон Ю.З., Поглазов Б.Ф., Тихоненко Т.И. Нуклеиновые кислоты и белкивирионов. М.: Наука, 1975. 368 с.

13. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии. М.: Наука, 1985. С. 74-83.

14. Горвиц М., Шарфф М. Получение антисывороток к вирусным антигенам / Методы вирусологии и молекулярной биологии. М.: Мир, 1972. С. 200-207.

15. Гоулдинг К. Радиоизотопные методы / Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978. С. 185-214.

16. Динец В.Л., Ротшильд Е.В. Звери. Энциклопедия природы России. М.: 1998. С. 100-120.

17. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Пер. с англ. М.: Мир, 1991. 408 с.

18. Дрыгин Ю.Ф., Афонина И.А., Байер К. и др. Детекция Х- и М-вирусов картофеля с помощью ДНК-зондов, меченных пероксидазой хрена // Биоорганическая химия. 1989. Т. 15. № 7. С. 947-951.

19. Дукур Ш.И., Чижов В.А., Акулова В.П. Алеутская болезнь / Болезни пушных зверей. М.: Колос, 1973. С. 215-234.

20. Жданов В.М. Эволюция вирусов. М.: Медицина, 1990. 376 с.

21. Зуев В.А. Медленные вирусные инфекции человека и животных. М.: Медицина, 1988.108 с.

22. Краев В.Г. Современная классификация и номенклатура вирусов растений (По материалам Международного комитета по таксономии вирусов) Ч. 1 // Мпсробюл. журн. 2001. Т. 62. № 5. С. 45-71.

23. Литвинов A.M., Яременко Н.А. Контагиозные болезни плотоядных пушных зверей и их профилактика // Ветеринария. 1998. № 11. С. 3-5.

24. Макова В.М., Обухов И.Л., Уласов В.И., Слугин B.C. Применение полимеразной цепной реакции для выявления вируса алеутской болезни норок // Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства. Киров, 2002. С. 566-567.

25. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.480 с.

26. Мешков А.Ю., Чеботарев М.И., Каледин А.С., Слугин B.C. Рестрикционный анализ ДНК вируса алеутской болезни норок штамм П-1 // Молекулярная генетика. Микробиология и вирусология. 1989. № 12. С. 30-33.

27. Михеев Ю.В. Совершенствование лабораторной диагностики алеутской болезни норок / Автореф. дис. учен. степ. канд. биол. наук. М. 2003. 24 с.

28. Наумов В.А. Васильева Е.Г., Шелим О.С. Патоморфологические изменения при алеутской болезни // Ветеринария. 1980. № 3. С. 35-38.

29. Ноландт О.В. Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот как диагностический тест при вирусных инфекциях человека: (На примере гриппа А и гепатита В) / Автореф. дис. учен. степ. канд. биол. наук. М. 1990. 24 с.

30. Обухов И.Л., Тялина Ю.Ю., Макова В.М. и др. Диагностика и молекулярно-генетическое типирование возбудителя алеутской болезни норок // Ветеринария. 2003. № 10. С. 22-25.

31. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование / Под ред. Г.П. Георгиева. М.: Наука, 1981.288 с.

32. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Подред. Г.П. Георгиева. М.: Наука, 1983. 304 с.

33. Попова Н.А., Церцвадзе Д.К., Циммерман В.Г. и др. Соотношение иммунологических и патоморфологических изменений при алеутской болезни норок // Известия Сибирского отделения АН СССР. Серия биологические науки. 1990. Т. 3. С. 20-22.

34. Рыжова Т.А., Городилова Е.Ю., Машарский А.Э. и др. Изучение изолятов вируса алеутской болезни норок // Ветеринария. 2002. № 2. С. 23-24.

35. Скуматов Д.В., Бельтюкова З.Н. Распространение алеутской болезни норок у свободноживущих куньих // VIII Молодежная научная конференция «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар, 2002. С. 54-56.

36. Слугин B.C. Из истории исследований алеутской болезни // Кролиководство и звероводство. 2002. № 3. С. 27-29.

37. Слугин B.C. Наставление по применению набора антигена и контрольной сыворотки в реакции иммуноэлектроосмофореза для серологической диагностики алеутской болезни норок // Ветеринария. 1978. № 2. С. 114-116.

38. Слугин B.C., Чеботарев М.И. Иммуноэлектроосмофорез при алеутской болезни норок//Ветеринария. 1977. № 10. С. 105-107.

39. Сюрин В.Н., Белоусова В.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. Справочник. М.: Агропромиздат, 1991. 521 с.

40. Ткачев С.Е., Сигитова Е.В., Митрофанова Е.Э и др. Новый изолят парвовируса норок // Вопросы вирусологии. 2002. № 3. С. 35-39.

41. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. Пер. с англ. / Под ред. В.Ю. Полякова. М.: Мир, 1975. 328 с.

42. Уласов В.И., Третьяков А.Д. Вакцинопрофилактика в звероводстве // Кролиководство и звероводство. 1998. № 5-6. С. 20-21.

43. Файзулоев Е.Б. Некоторые молекулярно-биологические и иммунологические аспекты патогенеза алеутской болезни норок // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002. № 6. С. 111-116.

44. Файзулоев Е.Б., Калошин А.А., Лоте В.Д. и др. Культивирование вируса алеутской болезни норок в перевиваемой линии клеток селезенки кошки // Ветеринария. 2002. № 11. С. 17-20.

45. Фальк П. Радиоиммунологический анализ / Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 148-162.

46. Фибих X., Клейст X. Определение афинности антител / Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 42-57.

47. Филдс Б., Найп Д. (ред.). Вирусология: В 3-х т. М.: Мир, 1989. Т. 1. 496 с.

48. Хитрова Д.А. Использование теста нитросинего тетразолия в качестве дополнительного метода диагностики на алеутскую болезнь норок. В кн.: Проблемы и перспективы развития науки в институте ветеринарной медицины ОмГАУ. Омск: ОмГАУ, 2002. С. 221-224.

49. Чард Т. Радиоиммунологические методы. М.: Мир, 1981. 246 с.

50. Шульфе Х.А. Введение радиоактивной метки в белки / Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 457-467.

51. Aasted В. Purification and characterization of Aleutian disease virus // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1980. Vol. 88. № 6. P. 323-328.

52. Aasted B. Aleutian disease of mink. Virology and immunology// Acta Pathol. Microb. Immunol. Scand. Suppl. 1985. Vol. 287. P. 1-47.

53. Aasted B. Mink infected with Aleutian disease virus have an elevated level of CD8-positive T-lymphocytes //Vet. Immunol. Immunopathol. 1989. Vol. 20. P. 375-385.

54. Aasted В., Avery B. Serological analyses of different mink Aleutian disease virus strains//Arch. Virol. 1984. Vol. 80.P. 11-22.

55. Aasted В., Bloom M.E. Mink with aleutian disease have high-affinity antiviral antibodies

56. Scand. J. Immunol. 1984. Vol. 19. P. 411-418.

57. Aasted В., Race R.E, Bloom M.E. Aleutian disease virus, a parvovirus, is proteolytically degraded during in vivo infection in mink // J. Virol. 1984a. Vol. 51. P. 7-13.

58. Aasted В., Tierney G.S., Bloom M.E. Analysis of the quantity of antiviral antibodies from mink infected with different Aleutian disease virus strains // Scand. J. Immunol. 1984b. Vol. 19. P. 395-402.

59. Aasted В., Bloom M.E. Sensitive radioimmune assay for measuring Aleutian disease virus antigen and antibody // J. Clin. Microb. 1983. Vol. 18. P. 637-644.

60. Aasted В., Cohn A. Inhibition of precipitation in counter current electrophoresis. A sensitive method for detection of mink antibodies to Aleutian disease virus // Acta Pathol. Microb. Immunol. Scand. 1982. Vol. 90. P. 15-19.

61. Aasted В., Hauch H. Studies on the progression of aleutian disease in mink //Acta Vet. Scand. 1988. Vol. 29. P. 315-321.

62. Aasted В., Leslie R.G. Virus-specific B-lymphocytes are probably the primary targets for Aleutian disease virus//Vet. Immunol. Immunopathol. 1991. Vol. 28. P. 127-141.

63. ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits. Original and Version 2.0. Protocol. USA: Lincoln Centre Drive, 2002. 80 p.

64. Alexandersen S., Aasted B. Restricted heterogeneity of the early antibody response to Aleutian disease virus in mink kits // Acta Pathol. Microb. Immunol. Scand. 1986. Vol. 94. P. 137-143.

65. Alexandersen S., Hau J. Rocket line immunoelectrophoresis: an improved assay for simultaneous quantification of a mink parvovirus (Aleutian disease virus) antigen and antibody//J. Virol. Methods. 1985. Vol. 10. P. 145-151.

66. Alexandersen S., Jensen A.U., Hansen M. et al. Experimental transmission of Aleutian disease virus to different animal species // Acta Pathol. Microb. Immunol. Scand. 1985. Vol. 93. P. 195-200.

67. Alexandersen S., Bloom M.E. Studies on the sequential development of acute interstitial pneumonia caused by Aleutian disease virus in mink kits // J. Virol. 1987. Vol. 61. P. 81-86.

68. Alexandersen S., Bloom M.E, Perryman S. Detailed transcription map of Aleutian mink disease parvovirus //J. Virol. 1988. Vol. 62. P. 3684-3694.

69. Alexandersen S., Larsen S., Cohn A. et al. Passive transfer of antiviral antibodies restricts replication of Aleutian mink disease parvovirus in vivo // J. Virol. 1989. Vol. 63. P. 9-17.

70. Alexandersen S. Pathogenesis of disease caused by Aleutian mink disease parvovirus //APMIS Suppl. 1990. Vol. 14. P. 1-32.

71. Alexandersen S., Larsen S., Aasted B. et al. Acute interstitial pneumonia in mink kits inoculated with defined isolates of Aleutian mink disease parvovirus // Vet. Pathol. 1994. Vol. 31. P. 216-228.

72. Alexandersen S. Parvovirus in pigs with multifocal interstitial nephritis // Vet. Rec. 2002: Vol. 150. P. 192-198.

73. Allison A.C. Genetic factors in autoimmune disease // J. R Coll. Physicians Lond. 1970. Vol. 4. P. 139-145.

74. An S.H., DePauli F.J., Wright P. et al. Characteristics of inapparent Aleutian disease virus infection in mink//Res. Vet. Sci. 1978. Vol. 24. P. 200-204.

75. An S.H., Ingram D.G. Detection of inapparent Aleutian disease virus infection in mink//Am. J. Vet. Res. 1977. Vol. 38. P. 1619-1624.

76. An S.H., Ingram D.G. Transmission of aleutian disease from mink with inapparent infections //Am. J. Vet. Res. 1978. Vol. 39. P. 309-313.

77. Asano M., Kawahara I. Electron microscopic observations on Chediak-Higashi's granular anomaly in blood cells of mink // Nippon. Ketsueki Gakkai Zasshi. 1972. Vol. 35. P. 146-155. (In Japanese).

78. Bazeley P.L. The nature of aleutian disease in mink. I. Two forms ofhypergammaglobulinemia as related to method of disease transmission and type of lesion// J. Infect. Dis. 1976. Vol. 134. P. 252-257.

79. Berns K.I., Labow M.A. Parvovirus gene regulation // J. Gen. Virol. 1987. Vol 68. P. 601-614.

80. Best S.M., Bloom M.E. Pathogenesis of Aleutian mink disease parvovirus and similarities to В19 infection // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public. Health. 2005. Vol. 52. P. 331-334.

81. Bloom M.E., Alexandersen S, Garon C.F. et al. Nucleotide sequence of the 5'-terminal palindrome of Aleutian mink disease parvovirus and construction of an infectious molecular clone//J. Virol. 1990. Vol. 64. P. 3551-3556.

82. Bloom M.E., Alexandersen S., Perryman S. et al. Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus: sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV // J. Virol. 1988a. Vol. 62. P. 29032915.

83. Bloom M.E., Kaaden O.R., Huggans E. et al. Molecular comparisons of in vivo- and in vitro-derived strains of Aleutian disease of mink parvovirus // J. Virol. 1988b. Vol. 62. P. 132-138.

84. Bloom M.E., Fox J.M., Berry B.D. et al. Construction of pathogenic molecular clones of Aleutian mink disease parvovirus that replicate both in vivo and in vitro // Virol. 1998. Vol. 251. P. 288-296.

85. Bloom M.E., Kanno H., Mori S. et al. Aleutian mink disease: puzzles and paradigms / / Infectious Agents and Disease. 1994. Vol. 3. P. 279-301.

86. Bloom M.E., Mayer L.W., Garon C.F. Characterization of the Aleutian disease virus genome and its intracellular forms //J. Virol. 1983. Vol. 45. P. 977-984.

87. Bloom M.E., Lechner D., Wiedbrauk D.L. et al. Analysis of molecularly cloned DNA reveals minor differences among three virus strains of Aleutian disease of mink parvovirus //Arch. Virol. 1987. Vol. 92. P. 175-181.

88. Bloom M.E., Martin D.A., Oie K.L. et al. Expression of Aleutian mink diseaseparvovirus capsid proteins in defined segments: localization of immunoreactive sites and neutralizing epitopes to specific regions // J. Virol. 1997. Vol. 71. P. 705-714.

89. Bloom M.E., Oie K.L., Wolfmbarger J.B. et al. Evaluation of the polymerase chain reaction as a tool for diagnosing infections with the Aleutian mink disease parvovirus //Scientifur. 1997a. Vol. 21. P. 141-146.

90. Bloom M.E., Race R.E., Hadlow W.J., Chesebro B. Aleutian disease of mink // J. Immunol. 1975. Vol. 115. P. 1034-1037.

91. Bloom M.E., Race R.E., Aasted B. et al. Analysis of Aleutian disease virus infection in vitro and in vivo: demonstration ofAleutian disease virus DNA in tissues of infected mink.//J. Virol. 1985. Vol. 55. P. 696-703.

92. Bloom M.E., Race R.E., Wolfmbarger J.B. Analysis of Aleutian disease of mink parvovirus infection using strand-specific hybridization probes // Intervirol. 1987a. Vol. 27. P. 102-111.

93. Bloom M.E., Race R.E., Wolfmbarger J.B. Characterization of Aleutian disease virus as a parvovirus//J. Virol. 1980. Vol. 35. P. 836-843.

94. Bloom M.E., Race R.E., Wolfmbarger J.B. Identification of a nonvirion protein of Aleutian disease virus: mink with Aleutian disease have antibody to both virion and nonvirion proteins // J. Virol. 1982. Vol. 43. P. 608-616.

95. Borecky L. Interactions between viral infection and immune mechanisms // Сотр. Immunol. Microb. Infect. Dis. 1980. Vol. 3. P. 381-390.

96. Botner A.G., Jorgensen P.H. An outbreak of excessive neonatal mortality in four Danish mink farms. II. Analytic epidemiological investigations // Acta Vet. Scand. 1983. Vol.24.P. 499-511.

97. Brandenburger A., Legendre D., Avalosse В., Rommelaere J. NS-1 and NS-2 proteins may act synergistically in the cytopathogenicity of parvovirus MVMp // Virol. 1990. Vol. 171. P. 576-584.

98. Broil S., Alexandersen S. Investigation of the pathogenesis of transplacental transmission of Aleutian mink disease parvovirus in experimentally infected mink// J. Virol. 1996. Vol. 70. P. 1455-1466.

99. Brummerstedt E. Preparation of antigen for the counterimmunoelectrophoretic test for plasmacytosis in mink//Acta Vet. Scand. 1976. Vol. 17. P. 395-402.

100. Burger D., Sriranganathan N., McDonald T.L. et al. Isolation of virus and antibody containing immune complexes from mink with aleutian disease by affinity chromatography of equine complement// Am. J. Vet. Res. 1983. Vol. 44. P. 86-90.

101. Castelruiz Y., Blixenkrone-Moller M., Aasted B. DNA vaccination with the Aleutian mink disease virus NS 1 gene confers partial protection against disease // Vaccine. 2005. Vol. 23. P. 1225-1231.

102. Chen W., Aasted B. Analyses of leucocytes in blood and lymphoid tissues from mink infected with Aleutian mink disease parvovirus (AMDV) // Vet. Immunol. Immunopathol. 1998. Vol. 63. P. 317-334.

103. Chesebro В., Bloom M., Hadlow W. et al. Purification and ultrastructure of Aleutian disease virus of mink// Nature. 1975. Vol. 254. P. 456-457.

104. Cho H. J., Ingram D.G. Antigen and antibody in aleutian disease in mink. I. Precipitation reaction by agar-gel electrophoresis // J. Immunol. 1972. Vol. 108. P. 555-557.

105. Cho H.J., Ingram D.G. The antigen and virus of aleutian disease in mink // Am. J. Pathol. 1973. Vol. 71. P. 345-348.

106. Cho H.J. Purification and structure of Aleutian disease virus // Front. Biol. 1976. №44. P. 159-174.

107. Cho H.J. Demonstration of heavy and light density populations of Aleutian disease virus // Can. J. Сотр. Med. 1977. Vol. 41. P. 215-218.

108. Cho H.J., Greenfield J. Eradication of Aleutian disease of mink by eliminating positive counterimmunoelectrophoresis test reactors // J. Clin. Microb. 1978. Vol. 7. P. 18-22.

109. Christensen G., Storgaard Т., Bloch B. et al. Expression of Aleutian mink diseseparvovirus proteins in baculovirus vector system // J. Virol. 1993a. Vol. 67. P. 229238.

110. Christensen J., Storgaard Т., Bloch B. et al. Expression of Aleutian mink disease parvovirus proteins in a baculovirus vector system // J. Virol. 1993b. Vol. 67. P. 229238. '

111. Christensen J., Pedersen M., Aasted B. et al. Purification and characterization of the major nonstructural protein (NS-1) of Aleutian mink disease parvovirus // J. Virol. 1995. Vol. 69. P. 1802-1809.

112. Clemens D.L., Wolfinbarger J.B., Mori S. et al. Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins by a recombinant vaccinia virus: self-assembly of capsid proteins into particles // J. Virol. 1992. Vol. 66. P. 3077-3085.

113. Cotmore S.F., Sturzenbecker L.J., Tattersall P. The autonomous parvovirus MVM encodes two nonstructural proteins in addition to its capsid polypeptides // Virol. 1983. Vol. 129. P. 333-343.

114. Cotmore S.F., Tattersall P. Organization of non-structural genes of the autonomous parvovirus minute virus of mice // J. Virol. 1986. Vol. 58. P. 724- 732.

115. Cotmore S.F., Tattersall P. The autonomously replicating parvoviruses //Adv. Virus Res. 1987. Vol. 33. P. 91-174.

116. Cotmore S.F., Tattersall P. The NS-1 protein of minute virus of mice is covalently attached to the 5' termimi of replicative-form DNA and progeny single strands // J. Virol. 1988. Vol. 62. P. 851-860.

117. Crawford T.B., McGuire T.C., Porter D.D. et al. A comparative study of detection methods for aleutian disease viral antibody // J. Immunol. 1977. Vol. 118. P. 12491251.

118. Daoust P.Y., Hunter D.B. Spontaneous Aleutian disease in ferrets // Can. Vet. J. 1978. Vol. 19. P. 133-135.

119. Dworak L J., Wolfinbarger J.B., Bloom M.E. Aleutian mink disease parvovirus infection ofK562 cells is antibody-dependent and is mediated via an Fc(gamma)RII receptor/ /Arch. Virol. 1997. Vol. 142. P. 363-373.

120. Dyer N.W., Ching В., Bloom M.E. Nonsuppurative meningoencephalitis associated with aleutian mink disease parvovirus infection in ranch mink // J. Vet. Diagn. Invest. 2000. Vol. 12. P. 159-162.

121. Eklund C.M., Hadlow W.J., Kennedy R.C. et al. Aleutian disease of mink: propertiesof the etiologic agent and the host responses//J. Infect. Dis. 1968. Vol. 118. P. 510526.

122. Eklund C.M., Hadlow W.J. Implications of slow viral diseases of domestic animals for human disease//Medicine (Baltimore). 1973. Vol. 52.P.357-361.

123. Fauquet C., (eds.). Virus taxonomy: Classification and nomenclature of viruses: Eighth report of the International committee on taxonomy of viruses. Academic Press:1. Hardcover. 2005,1162 p.

124. Felsentein J. Inferring phylogenies. Sinauer Associates, Inc. USA. 2003.580 p.

125. Fomicheva I.I., Popova N. A., Tsertsvadze D.K. Genetic polymorphism of IgG in the mink. 7. Expression of the С gamma-allotypes in domestic mink infected with the Aleutian disease virus//Exp. Clin. Immunogen. 1991. Vol. 8. P. 107-114.

126. Fournier-Chambrillon C., Aasted В., Perrot A. et al. Antibodies to Aleutian mink disease parvovirus in free-ranging European mink (Mustela lutreola) and other small carnivores from southwestern France // J. Wildl. Dis. 2004. Vol. 40. P. 394-402.

127. Fox J.M., Bloom M.E. Identification of a cell surface protein from Crandell feline kidney cells that specifically binds Aleutian mink disease parvovirus // J. Virol. 1999. Vol. 73. P. 3835-3842.

128. FuccilloD.A., Kurent J.E., Sever J.L. Slow virus diseases//Ann. Rev. Microb. 1974. Vol. 28. P. 231-234.

129. Geus В., Eck В., Louw A. et al. Transmission of Aleutian disease virus by air // Scientifur. 1996. Vol. 20. C. 350-354.

130. Gordon D.A. Aleutian disease 1974 // J. Rheumatol. 1974. Vol. 1. P. 4-6.

131. Gorham J.R., Henson J.B., Crawford T.B. et al. The epizootiology of aleutian disease //Front. Biol. 1976. Vol. 44. P. 135-158.

132. Gottschalck E., Alexandersen S., Cohn A. et al. Nucleotide sequence analysis of Aleutian mink disease parvovirus shows that multiple virus types are present in infected mink//J. Virol. 1991. Vol. 65. P. 4378-4386.

133. Gottschalck E., Alexandersen S., Storgaard T. et al. Sequence comparison of the non-structural genes of four different types of Aleutian mink disease parvovirus indicates an unusual degree of variability //Arch. Virol. 1994. Vol. 138. P. 213-231.

134. Gregory M.C., Hammond M.E., Brewer E.D. Renal deposition of cytomegalovirus antigen in immunoglobulin-A nephropathy//Lancet. 1988. Vol. 1. P. 11-14.

135. Gudnadottir M. Slow viral infections of animals: experimental models for human disease//Med. Biol. 1981. Vol. 59. P. 77-84.

136. Haas L., Wohlsein P., Trautwein G. et al. Violet mink develop an acute disease after experimental infection with Aleutian disease virus (ADV) isolate ADV SL3 // Zentralbl. Veterinarmed. 1990. Vol. 37. P. 106-117.

137. Hadlow W.J. Ocular lesions in mink affected with aleutian disease // Vet. Pathol. 1982. Vol. 19. P. 5-15.

138. Hadlow W.J., Race R.E., Jackson T.A. Lymphoreticular proliferative disease in mink homozygous for the Aleutian gene//J. Natl. Cancer Inst. 1972. Vol. 49. P. 1455-1458.

139. Hadlow W.J., Race R.E., Kennedy R.C. Comparative pathogenicity of four strains of Aleutian disease virus for pastel and sapphire mink // Infect. Immun. 1983. Vol. 41. P. 1016-1023.

140. Hadlow W.J., Race R.E., Kennedy R.C. Royal pastel mink respond variously to inoculation with Aleutian disease virus of low virulence // J. Virol. 1984. Vol. 50. P. 38-41.

141. Hadlow W.J., Race R.E., Kennedy R.C. Temporal replication of the pullman strain of Aleutian disease virus in royal pastel mink //J. Virol. 1985. Vol. 55.P. 853-856.

142. Hahn E.C. Immune complexes in aleutian disease: demonstration of antibody on isolated virus//Vet. Immunol. Immunopathol. 1984. Vol. 5.P.313-321.

143. Hahn E.C., Hahn P.S. Autoimmunity in aleutian disease: contribution of antiviral andanti-DNA antibody to hypergammaglobulinemia // Infect. Immun. 1983. Vol. 41. P. 494-500.

144. Hahn E.C., Ramos L., Kenyon A.J. Expression of aleutian mink disease antigen in cell culture // Infect. Immun. 1977. Vol. 15. P. 204-211.

145. Hansen M. Retningslinier for bekae mpelse af plasmacytose // Dansk Pelsdyravl. 1987. T. 50. №6. S. 445-447.

146. Hansen M., Lund E. Pregnancy rate and fetal mortality in Aleutian disease virus infected mink//Acta Vet. Scand. 1988. Vol. 29. P. 271-272.

147. Henry L. W. Multiple myeloma in a mink handler following exposure to aleutian disease // Cancer. 1979. Vol. 44. P. 273-275.

148. Henson J.B., Crawford T.B. The pathogenesis of virus-induced arterial disease -aleutian disease and equine viral arteritis //Adv. Cardiol. 1974. Vol. 13.P. 183-191.

149. Henson J.B., Gorham J.R. Persistent viral infections, immunologically mediated glomerulonephritis and arteritis, dysgammopathies. Aleutian disease of mink // J. Immunol. Meth. 1974. Vol. 4. P. 217-228.

150. Jackson M.K., Ellis L.C., Morrey J.D. et al. Progression of aleutian disease in natural and experimentally induced infections of mink//Am. J. Vet. Res. 1996. Vol. 57. P. 1753-1758.

151. Jackson M.K., Winslow S.G., Dockery L.D. et al. Investigation of an outbreak of aleutian disease on a commercial mink ranch // Am. J. Vet. Res. 1996a. Vol. 57. P. 1706-1710.

152. Jensen K.T., Wolfmbarger J.B., Aasted B. et al. Replication of Aleutian mink disease parvovirus in mink lymph node histocultures // J. Gen. Virol. 2000. Vol. 81. R 335343.

153. Johnson M.I., Henson J.B., Gorham J.R. The influence of genotype on the development of glomerular lesions in mink with Aleutian disease virus //Am. J. Pathol. 1975. Vol. 81. P. 321-336.

154. Kaaden O.R., Haas L., Lochelt M. et al. Replication of Aleutian disease virus in mink lymphocytes infected in vitro // Intervirol. 1986. Vol. 25. P. 201-209.

155. Kanno H., Wolfmbarger J.B., Bloom M.E. Identification of Aleutian mink disease parvovirus transcripts in macrophages of infected adult mink // J. Virol. 1992. Vol. 66. P. 5305-5312.

156. Kanno H., Wolfmbarger J.B., Bloom M.E. Aleutian mink disease parvovirus infection of mink peritoneal macrophages and human macrophage cell lines // J. Virol. 1993. Vol. 67. P. 2075-2082.

157. Kanno H., Wolfmbarger J.B., Bloom M.E. Aleutian mink disease parvovirus infection of mink macrophages and human macrophage cell line U937: demonstration of antibody-dependent enhancement of infection // J. Virol. 1993a. Vol. 67. P. 70177024.

158. Kierek-JaszczukD., Moennig W., Stolze B. et al. Epitopic mapping of structural and nonstructural Aleutian disease virus proteins // Intervirol. 1986. Vol. 26. P. 74-84.

159. X., Rhode S.L. III. Nonstructural protein NS2 of parvovirus H-l is required for efficient viral protein synthesis and virus production in rat cells in vivo and in vitro // Virol. 1991. Vol. 184. P. 117-130.

160. Manas S., Cena J.C., Ruiz-Olmo J. et al. Aleutian mink disease parvovirus in wild riparian carnivores in Spain//J. Wildl. Dis. 2001. Vol. 37. P. 138-144.

161. Mayer L.W., Aasted В., Garon C.F. et al. Molecular cloning of the Aleutian disease virus genome: expression of Aleutian disease virus antigens by a recombinant plasmid // J. Virol. 1983. Vol. 48. P. 573-579.

162. McGuire T.C., Crawford T.B. Antibodies to Aleutian disease virus in human sera // J. Infect. Dis. 1980. Vol. 142. P. 625-630.

163. McKennaR., Olson N.H., Chipman P.R. et al. Three-dimensional structure of Aleutian mink disease parvovirus: implications for disease pathogenicity//J. Virol. 1999. Vol. 73. P. 6882-6891.

164. Moorman-Roest J. Aleutian disease in ferrets from New Zealand // Tijdschr. Diergeneeskd. 2005. Vol. 130. P. 404-406. (In Dutch).

165. Motohashi T. Aleutian disease of mink // Uirusu. 1975. Vol. 25. P. 1-6. (In Japanese). Mouritsen S., Aasted В., Hoier-Madsen M. Mink with aleutian disease haveautoantibodies to some autoantigens //Vet. Immunol. Immunopathol. 1989. Vol. 23. P. 179-186.

166. Muller-Peddinghaus R., Kalden J.R., Meyer zu Schwabedissen H. et al. Immune complex glomerulonephritis of mink with aleutian disease // Contrib. Nephrol. 1980. Vol. 19. P. 101-103.

167. Munoz J., Lodmell D.L., Race R.E. et al. Delayed hypersensitivity in normal andaleutian disease-affected mink // Z. Immunitatsforsch. Exp. Klin. Immunol. 1974. Vol. 147. P. 53-60.

168. Murakami M., Matsuba C., Une Y. et al. Nucleotide sequence and polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism analyses of Aleutian disease virus in ferrets in Japan // J. Vet. Diagn. Invest. 2001. Vol. 13. P. 337-340.

169. Naeger L.K., Salome K., Pintel D.J. NS2 is required for efficient translation of viral mRNA in minute virus of mice-infected murine cells // J. Virol. 1990. Vol. 67. P. 10341043.

170. Nieto J.M., Alvarez C., Flores J.M. et al. Glomerular lesions in aleutian disease of mink (Mustela vison): a morphological and differential morphometrical study // Histol. Histopathol. 1991. Vol. 6. P. 141-148.

171. Nordstoga K., Naess B. The effect of long-term challenge with endotoxin on the growth of sapphire mink with high incidence of infectious plasmacytosis // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1973. Vol. 81. P. 344-346.

172. Norton W.L. Aleutian mink and New Zealand mice: models of viral induced connective tissue disease // Rheumatol. 1970. Vol. 3. P. 194-223.

173. Notani G.W., Hahn E.C., Sarkar N.H. et al. Characterisation of aleutian disease antigens //Nature. 1976. Vol. 261. P. 56-58.

174. Ohshima K., Shen D.T., Henson J.B. et al. Comparison of the lesions of aleutian disease in mink and hypergammaglobulinemia in ferrets //Am. J. Vet. Res. 1978. Vol. 39. P. 653-657.

175. Oleksiewicz M.B., Costello F., Huhtanen M. et al. Subcellular localization of Aleutian mink disease parvovirus proteins and DNA during permissive infection of Crandell feline kidney cells // J. Virol. 1996. Vol. 70. P. 3242-3247.

176. Olofsson A., Mittelholzer C., Berndtsson T.L. et al. Unusual, high genetic diversity of Aleutian mink disease virus// J. Clin. Microb. 1999. Vol. 37. P. 4145-4149.

177. Onions D.E. The immune response to virus infections // Vet. Immunol. Immunopathol. 1983. Vol. 4. P. 237-277.

178. Osetowska E. Human and animal neuropathology and the slow and latent viruses // Neurol. Neurochir. Pol. 1971. Vol. 5. P. 741-748. (In Polish).

179. Oxenham M. Aleutian disease in ferrets // Vet. Rec. 1992. Vol. 131. P. 296-303.

180. Palley L.S., Corning B.F., Fox J.G. et al. Parvovirus-associated syndrome (aleutian disease) in two ferrets // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1992. Vol. 201. P. 100-106.

181. Pan I.C., Tsai K.S., Grinyer I. et al. Glomerulonephritis in aleutian disease of mink: ultrastructural studies // J. Pathol. 1970. Vol. 102. P. 33-40.

182. Pan I.C., Tsai K.S., Karstad L. Glomerulonephritis in aleutian disease of mink: histological and immunofluorescence studies //J. Pathol. 1970a. Vol. 101. P. 119127. •

183. Pennick K.E., Stevenson M.A., Latimer K.S. et al. Persistent viral shedding during asymptomatic aleutian mink disease parvoviral infection in a ferret // J. Vet. Diagn. Invest. 2005. Vol. 17. P. 594-597.

184. Perryman L.E., Banks K.L., McGuire T.C. Lymphocyte abnormalities in Aleutian disease virus infection of mink: decreased T lymphocyte responses and increased В lymphocyte levels in persistent viral infection// J. Immunol. 1975. Vol. 115. P. 22-27.

185. Porter D.D., Larsen A.E., Porter H.G. The pathogenesis of aleutian disease of mink. I. In vivo viral replication and the host antibody response to viral antigen // J. Exp. Med. 1969. Vol. 130. P. 575-593.

186. Porter D.D. Aleutian disease: a persistent parvovirus infection of mink with a maximal but ineffective host humoral immune response // Prog. Med. Virol. 1986. Vol. 33. P. 42-60.

187. Porter D.D., Larsen A.E. Aleutian disease of mink // Prog. Med. Virol. 1974. Vol. 18. P. 32-47.

188. Porter D.D., Larsen A.E., Cox N.A. et al. Isolation of Aleutian disease virus of mink in cell culture//Intervirol. 1977a. Vol. 8.P. 129-144.

189. Porter D.D., Larsen A.E., Porter H.G. Reduced severity of lesions in mink infected transplacental^ with Aleutian disease virus // J. Immunol. 1977b. Vol. 119. P. 872887.

190. Porter D.D., Larsen A.E., Porter H.G. Aleutian disease of mink // Adv. Immunol. 1980. Vol. 29. P. 261-286.

191. Porter D.D., Larsen A.E., Porter H.G. The pathogenesis of aleutian disease of mink. II. Enhancement of tissue lesions following the administration of a killed virus vaccine or passive antibody // J. Immunol. 1972. Vol. 109. P. 1-7.

192. Porter D.D., Larsen A.E., Porter H.G. The pathogenesis of aleutian disease of mink. 3. Immune complex arteritis //Am. J. Pathol. 1973. Vol. 71. P. 331-344.

193. Porter D.D., Porter H.G., Larsen A.E. Aleutian disease parvovirus infection of mink and ferrets elicits an antibody response to a second nonstructural viral protein // J. Virol. 1990. Vol. 64. P. 1859-1860.

194. Porter H.G., Porter D.D., Larsen A.E. Aleutian disease in ferrets // Infect. Immun. 1982. Vol. 36. P. 379-386.

195. Porter D.D., Porter H.G., Suffin S.C., Larsen A.E. Immunoglobulin classes of Aleutian disease virus antibody // Infect. Immun. 1984. Vol. 43. P. 463-466.

196. Porter D.D., Porter H.G., Larsen A.E. Much of the increased IgG in aleutian disease of mink is viral antibody // J. Exp. Pathol. 1984a. Vol. 1. P. 79-88.

197. Qiu J., Cheng F., Burger L.R., Pintel D. The transcriptional profile of Aleutian mink disease virus in CRFK cells is generated by alternative processing of pre-mRNAsproduced from single promoter// J. Virol. 2006. Vol. 80. P. 654-662.

198. Race R.E., Chesebro В., Bloom M.E et al. Monoclonal antibodies against Aleutian disease virus distinguish virus strains and differentiate sites of virus replication from sites of viral antigen sequestration//J. Virol. 1986. Vol. 57. P. 285-293.

199. Rejnek J., Kostka J., Prokesova L. Determination of serum IgG as a diagnostic test for Aleutian mink disease //Vet. Med. 1972. Vol. 17. P. 353-358. (In Czech).

200. Renz M., Kurz Ch. A colorimetric method for DNA hybridization // Nucl. Acids Res. 1984. Vol. 12. P. 3435-3444.

201. Rhode S.L. III. Trans-activation of parvovirus P3g promoter by the 76 К noncapsid protein//J. Virol. 1985. Vol. 55. P. 886-889.

202. Rhode S.L. III. Both excision and replication of cloned autonomous parvovirus DNA require the NS1 (rep) protein // J. Virol. 1989. Vol. 63. P. 4249-4256.

203. Roth S., Kaaden O.R., Van Dawen S., Moennig V. Aleutian disease virus in В and T lymphocytes from blood and spleen and in bone marrow cells from naturally infected mink//Intervirol. 1984. Vol. 22. P. 211-217.

204. Russell A.S., Percy J.S. The antigenicity of polynucleotides in mink, rabbit, and man //J. Rheumatol. 1974. Vol. 1. P. 66-73.

205. Rychlik W., Spencer W., Rhoads R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro // Nucl. Acids Res. 1989.Vol. 18. P. 6409-6412.

206. Saifuddin M., Fox J.G. Identification of a DNA segment in ferret Aleutian disease virus similar to a hypervariable capsid region of mink Aleutian disease parvovirus // Arch. Virol. 1996. Vol. 141. P. 1329-1336.

207. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. 1977. Vol. 74. P. 5463-5467.

208. Schuierer S., Bloom M., Kaaden O., Truyen U. Sequence analysis of the lymphotropic Aleytian disease parvovirus ADV-SL3//Arch. Virol. 1997. Vol. 142. P. 157-166.

209. Shahrabadi M.S., Cho H. J., Marusyk R.G. Characterization of the protein and nucleic acid of Aleutian disease virus // J. Virol. 1977. Vol. 23. P. 353-362.

210. Simpson V.R. Aleutian disease, mink and otters // Vet. Rec. 2001. Vol. 149. P. 720724.

211. Steinel A, Parrish C.R., Bloom M.E., Truyen U. Parvovirus infections in wild carnivores // J. Wildl. Dis. 2001. Vol. 37. P. 594-607.

212. Sterzl J. Aleutian mink disease: a model of an immunopathological disease induced by virus // Cesk. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 1974. Vol. 23. P. 305-317. (In Czech).

213. Stevenson M.A., Fox J.M., Wolfmbarger J.B., Bloom M.E. Effect of a valine residue at codon 352 of the VP2 capsid protein on in vivo replication and pathogenesis of Aleutian disease parvovirus in mink//Am. J. Vet. Res. 2001. Vol. 62. P. 1658-1663.

214. Stewart J.D., Rozengurt N. Aleutian disease in the ferret // Vet. Rec. 1993. Vol. 133. P. 172.

215. Stroop W.G., Baringer J.R. Persistent, slow and latent viral infections // Prog. Med. Virol. 1982. Vol. 28. P. 1-43.

216. Surleraut M., Burhonbay G. Structural polypeptides of a canine parvovirus: study by immunoadsorption and sequencial analysis of infected cells // Arch. Virol. 1984. Vol. 82. P. 233-240.

217. Tabel H., Ingram D.G. The immunoglobulins in aleutian disease (viral plasmacytosis)of mink. Different types of hypergammaglobulinemias // Can. J. Сотр. Med. 1970. Vol. 34. P. 329-332.

218. Trautwein G., Seidler D. Studies on the pathogenesis of Aleutian mink disease. V. Immunofluorescent microscopical findings in the kidney // Zentralbl. Veterinarmed. 1972. Vol. 19. P. 144-157. (In German).

219. Trautwein G. Autoantibodies and autoimmune diseases in animals // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1972. Vol. 79. P. 306-310. (In German).

220. Trautwein G., Schneider P., Ernst E. Pathogenesis of the aleutian mink disease. 8. Depression of antibodies against peroxidase from horseradish // Zentralbl. Veterinarmed. 1974. Vol. 21. P. 467-479. (In German).

221. Trautwein G., Wacker R., Muller-Peddinghaus R. Pathogenesis of aleutian mink disease. IX. The presence of autoantibodies // Zentralbl. Veterinarmed. 1979. Vol. 26. P. 748-771. (In German).

222. Truyen U., Schelp C., Lochelt M., Kaaden O.R. The monomer covalently closed linear replicative form DNA of Aleutian disease parvovirus is infectious after transfection into permissive cells//Zentralbl. Veterinarmed. 1993. Vol. 40. P. 66-72.

223. Tung K.S., Ellis L., Teuscher C. et al. The black mink (Mustela vison). A natural model of immunologic male infertility//J. Exp. Med. 1981. Vol. 154. P. 1016-1032.

224. Une Y., Wakimoto Y., Nakano Y. et al. Spontaneous Aleutian disease in a ferret // J. Vet. Med. Sci. 2000. Vol. 62. P. 553-555.

225. Uttenthal A. Screening for antibodies against Aleutian disease virus (ADV) in mink. Elucidation of dubious results by additive counterimmunoelectrophoresis // Appl. Theor. Electrophor. 1992. Vol. 3. P. 83-84.

226. Uttenthal A., Larsen S., Lund E. et al. Analysis of experimental mink enteritis virus infection in mink: in situ hybridization, serology, and histopathology // J. Virol. 1990. Vol. 64. P. 2768-2779.

227. Van Dawen S., Kaaden O.R., Roth S. Propagation of Aleutian disease parvovirus in cell line CCC clone 81 //Arch. Virol. 1983. Vol. 77. P. 39-50.

228. Van Hille B.N., Duponchel N., Salome N. et al. Limitations to the expression of parvoviral nonstructural proteins may determine the extent of sensitization of EJ-ras-transformed rat cells to minute virus of mice // Virol. 1989. Vol. 171. P. 89-97.

229. Van Rooijen N. Follicular dendritic cell-B cell interactions in virus disease. Common localization but different cell damage caused by antibody immobilized virus // Arch. ViroL 1992. Vol. 122. P. 215-218.

230. Waleed A. Al-Sound, R6dstrum P. Purification and characterization of PCR-inhibotory components in blood cells // J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39. P. 485-493.

231. Welchman D.D., Oxenham M., Done S.H. Aleutian disease in domestic ferrets: diagnostic findings and survey results //Vet. Rec. 1993. Vol. 132. P. 479-484.

232. Wells G.A., Keymer I.F., Barnett K.C. Suspected aleutian disease in a wild otter (Lutra lutra) // Vet Rec. 1989. Vol. 125. P. 232-235.

233. Willwand K., Kaaden O.R. Capsid protein VP1 (p85) of Aleutian disease virus is a major DNA-binding protein//Virol. 1988. Vol. 166. P. 52-57.

234. Willwand K., Kaaden O.R. Proteins of viral and cellular origin bind to the Aleutian disease virus (ADV) DNA З'-terminal hairpin: presentation of a scheme for encapsidation of ADV DNA// J. Virol. 1990. Vol. 64. P. 1598-1605.

235. Wohlsein P., Trautwein G., Stolze B. et al. Antigen distribution in organs of mink with Aleutian disease parvovirus infection // Zentralbl. Veterinarmed. 1990. Vol. 37. P. 651-659.

236. Wright P.F., Wilkie B.N. Detection of antibody in aleutian disease of mink: comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and counterimmunoelectrophoresis // Am. J. Vet. Res. 1982. Vol. 43. P. 865-868.

237. Wu W.H., Bloom M.E., Berry B.D. et al. Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in a baculovirus expression system for potential diagnostic use // J. Vet. Diagn. Invest. 1994. Vol. 6. P. 23-29.

238. Yamaguchi N., Macdonald D.W. Detection of aleutian disease antibodies in feral American mink in southern England//Vet. Rec. 2001. Vol. 20. P. 485-488.

239. Yoon J.W., Kenyon A.J., Good R.A. Demonstration of Aleutian mink disease virus in cell culture //Nat. New Biol. 1973. Vol. 245. P. 205-207.

240. Yoon J.W., Dunker A.K., Kenyon A.J. Characterization of Aleutian mink disease virus//Virol. 1975. Vol. 64. P. 575-580.

Информация о работе

Мартыненко, Марина Владимировна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Иммунохимические и молекулярно-генетические свойства вируса алеутской болезни (Aleutian disease virus), циркулирующего на юге Приморского края, и разработка методов его диагностики - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы