Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика генетической изменчивости вируса мозаики цветной капусты (дальневосточные изоляты) и разработка методов его диагностики

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика генетической изменчивости вируса мозаики цветной капусты (дальневосточные изоляты) и разработка методов его диагностики"

На правах рукописи

БОГУНОВ ЮРИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВИРУСА МОЗАИКИ ЦВЕТНОЙ КАПУСТЫ (ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЕ ИЗОЛЯТЫ) И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ

03.00.23 - биотехнология 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена в лаборатории вирусологии Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Гнутова Раиса Васильевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Слонова Раиса Александровна

кандидат биологических наук, с.н.с. Змеева Вера Николаевна

Ведущая организация: Дальневосточный государственный

университет МО РФ

Защита состоится 17 сентября 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 005.003.01 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр. 100-лет Владивостоку, 159.

Факс:(4232)31-01-93

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан 23 июля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И.Музарок

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Результаты ежегодного фитосанитарного мониторинга поражаемости сельскохозяйственных культур свидетельствуют о наличии в дальневосточном регионе России ранее не изученных вирусов. В последние годы стало известно, что в агроценозах циркулируют не только РНК-геномные, но также и ДНК-геномные фитовирусы рода Caulimovirus: вирусы мозаики цветной капусты (Cauliflower mosaic virus, ВМЦК) и мозаики георгина (Dahlia mosaic virus, BMP) (Gnutova, Tolkach, 2000).

Шесть изолятов ВМЦК с различающимися биологическими свойствами выделены из растений сем. Brassicaceae (цветная и белокочанная капусты, редис) (Толкач, Гнутова, 2000). Из результатов зарубежных исследователей следует, что различия в вызываемых симптомах и круге растений-хозяев изолятов являются следствием изменения первичной структуры определенных участков генома вируса (Daubert, Routh, 1990; Polanichelvan et al., 2000). В связи с этим, возникла необходимость исследования генетической изменчивости дальневосточных изолятов ВМЦК, так как это важно не только при идентификации вируса и его штаммов, но и позволяет разрабатывать эффективные диагностические тесты на основе вирусных нуклеиновых кислот. До сих пор еще не получен эффективный иммунодиагностикум против ВМЦК. В последние годы для разработки тестов используют молекулярные методы детекции вирусной ДНК, вследствие их высокой чувствительности и специфичности. Предложенный за рубежом радиоактивно-гибридизационный метод выявления ВМЦК показал хорошие результаты, но он не получил широкого распространения, главным образом, из-за трудоемкости (Maule et al., 1983). Мы считаем, что более доступным может стать его вариант с использованием нерадиоактивных зондов. Перспективность такого подхода показана российскими вирусологами на РНК-геномных фитовирусах (Дрыгин и др., 1989). Кроме того, выявление промотора 35S РНК ВМЦК в трансгенных растениях с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) оказалось более быстрым и доступным (Wolf et al., 2000; Melnychuk et al., 2002), что свидетельствует о перспективности и этого метода диагностики. Необходимо отметить также, что изучение изменчивости ВМЦК является актуальной задачей не только для вирусологии, но и для генной инженерии, которая успешно использует геном этого вируса для получения трансгенных растений.

Таким образом, необходимость дальнейшей идентификации дальневосточных изолятов ВМЦК до штамма, подбора условий их поддержания и накопления в тест-растениях, неизученность генетических аспектов разнообразия и отсутствие отечественных диагностических тестов, определили выбор диссертационной темы. Наличие еще одного нового для региона каулимовируса, позволило провести сравнительную характеристику эпитопов капсидных белков ВМЦК и ВМГ - как видов одного рода.

Цель и задачи исследования. Цель - характеристика структурных белков и изменчивости вирусного генома, изучение цитопатогенных свойств для определения штаммового разнообразия ВМЦК, выявленного на Дальнем Востоке России, а также разработка молекулярных методов его диагностики.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Подобрать методику получения препарата обычного штамма ВМЦК (ВМЦКо).

2. Оценить возможность поддержания и накопления вируса in vitro в культуре каллусной ткани системного хозяина Brassica caulifJora (Mill) Lizg.

3. Определить морфологию и размер вирионов ВМЦКо.

4. Дать характеристику ВМЦК-индуцированным внутриклеточным включениям и определить места их локализации.

5. Изучить ультраструктурные изменения в клетках инфицированных растений.

6. Получить антисыворотку против ВМЦКо от различных животных-продуцентов специфических антител.

7. Выявить родо-, видо- и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков ВМЦК и ВМГ.

8. Отработать методику выделения нуклеиновой кислоты ВМЦКо, определить ее тип и размер.

9. Подобрать структуру олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена белка цитоплазматических включений (ГБЦВ) ВМЦК на основе известных нуклеотидных последовательностей вируса.

10. Провести молекулярно-генетический анализ изменчивости дальневосточных изолятов ВМЦК.

11. Разработать вариант нерадиоактивной блот-гибридизации ДНК для детекции ВМЦК.

12. Разработать систему диагностики ВМЦК с помощью ПЦР.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получены дополнительные доказательства принадлежности шести дальневосточных изолятов ВМЦК к виду Cauliflower mosaic virus рода Caulimovirus сем. Caulimoviridae.

2. Культура каллусной ткани, полученная от инфицированных ВМЦКо растений, сохраняет инфекционность до 4-х месяцев. Однако из-за низкой концентрации вируса она не может быть использована для накопления вируса in vitro.

3. Установлено антигенное родство между всеми дальневосточными изолятами ВМЦК и ВМЦКо и дальневосточным изолятом ВМГ.

4. Выявленные на Дальнем Востоке России изоляты ВМЦК по результатам метода выявления полимерфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) относятся к одному генотипу.

5. Разработаны две видоспецифические тест-системы диагностики ВМЦК: на основе ПЦР и нерадиоактивной блот-гибридизации ДНК.

Научная новизна. Впервые дана характеристика морфологии вирионов ВМЦКо и показаны ультраструктурные изменения в инфицированных клетках, изучены физико-химические и антигенные свойства. Впервые в России получены кроличья и крысиная поликлональные моноштаммовые антисыворотки против ВМЦКо. Подобраны условия ПЦР для амплификации полноразмерной копии ГБЦВ ВМЦК. Методом ПЦР-ПДРФ проанализирован генетический полиморфизм дальневосточных российских изолятов ВМЦК. Полученные данные подтверждают предположение о том, что на данной территории циркулирует генетически однородная популяция ВМЦК. Показано антигенное родство ВМЦК с дальневосточным изолятом ВМГ.

Теоретическое и практическое значение. Результаты работы расширяют знания о видовом и штаммовом разнообразии ДНК-геномных фитовирусов на Дальнем Востоке России. Предложенный вариант ПЦР-ПДРФ анализа может быть

использован для более широкого изучения изменчивости ВМЦК. Разработанные молекулярные способы диагностики ВМЦК могут быть использованы сельскохозяйственными и научными учреждениями для изучения его распространенности, патогенности и др.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на региональной конференции молодых ученых "Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока" (Владивосток, 2000), на IV региональной научной конференции "Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2001), VII Международной конференции "Патология растений" (Прага, 2002), региональной конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты микробиологии на Дальнем Востоке" (Владивосток, 2003), ежегодных конференциях-конкурсах молодых ученых БПИ ДВО РАН (Владивосток, 2002, 2003).

Работа получила финансовую поддержку на конкурсе проектов Дальневосточного отделения РАН, 2002 г. и РФФИ (фант № 02-04-58852), 2002 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация общим объемом 109 страниц состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2-х глав результатов исследования, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 26 рисунками, на которых представлено 10 микрофотографий, содержит 17 таблиц. Список литературы насчитывает 217 наименований, из которых 194 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ДНК-геномные вирусы растений: таксономия, свойства, диагностика (литературный обзор)

Все двухцепочечные (дц) ДНК-геномные вирусы растений объединяются в семейство Caulimoviridae, в которое наряду с родом Caulimovims включаются еще 5 родов, общей численностью 30 видов (Van Regenmortel, 2000). В основе их объединения, главным образом, лежит особенность структуры геномов (размер, расположение и количество открытых рамок считывания (ОРС)) и их репликации.

Род Caulimovirus включает 9 видов и 3 предполагаемых. Вирионы изометрические, диаметром 40-50 нм. Антигенное родство установлено лишь между некоторыми видами рода (Цит. по Краеву, 2000). Большинство видов описаны лишь в последние 10-15 лет. Отсутствие полных сведений о структуре и особенностях функционирования их геномов, белковом составе сдерживает работу по созданию таксономической структуры, отражающей общность эволюционного происхождения вирусов данного рода и семейства в целом.

Типичный представитель рода - ВМЦК. Первая публикация по биологическим свойствам ВМЦК сделана L. Broadbent (1957). В 2001 г. он был зарегистрирован в Приморском крае (Толкач, Гнутова, 2001). В соседних странах: в Китае в 1979 г. (Liang, 1998) и в Японии в 1937 г. (Tomaru, 1998).

В естественных условиях вирус поражает растения из сем. крестоцветные: капусту, (Al-Kaff, Covey, 1995; Raybould et al., 1999), редис, турнепс, дайкон, рапс, сорные и дикорастущие виды крестоцветных (Власов и др., 1973). В экспериментальных условиях отдельные штаммы заражают растения сем. пасленовые (Mevel, Kerlan, 1990).

Характерная особенность ВМЦК - формирование округлых внутриклеточных включений. До настоящего времени остается не окончательно выясненным белковый состав вирионов ВМЦК. Денатурирующим электрофорезом препаратов вируса выявляется до 10 белковых зон. Кроме того, получены доказательства, что в растении накапливаются вирионы, различного белкового состава (Mesnard et al., 1993).

На сегодняшний день приходится констатировать, что еще не существует надежного метода детекции вируса. Изучение структуры и изменчивости генома ВМЦК должно положительно отразиться на решении данной проблемы.

Вирус активно используется как модельный объект в генетической инженерии, предприняты попытки изучения ВМЦК in vitro (протопласты, культура изолированных тканей).

Организация вирусного генома, его репликация и функции белковых продуктов обстоятельно изучены (Mesnard, Carriere, 1995). Рестрикционным анализом (ПДРФ-анализ) и секвенированием показано, что на генетическом уровне существуют значительные отличия между штаммами вируса, что затрудняет установление филогенетических взаимоотношений между ними (Chenault, Melcher, 1994). Поэтому на сегодняшний день изучение генетического разнообразия ВМЦК является своевременной и актуальной.

Глава 2. Материалы и методы Материалы исследований

Исследования проводились в 2000-2004 гг. на материале, собранном на территории Приморского края и идентифицированном по биологическим свойствам к.б.н. В.Ф.Толкач: из цветной (ВМЦКо, ВМЦК-7) и белокочанной (ВМЦК-1, ВМЦК-6) капусты, редиса (ВМЦК Р-1, ВМЦК Р-2).

Отработку методов выделения вируса, его нуклеиновой кислоты осуществляли на дальневосточном изоляте ВМЦК- ВМЦКо, который по биологическим свойствам более всего соответствовал обычному ВМЦК, описанному за рубежом. К нему же получали антисыворотки. Родовую принадлежность ВМЦК подтверждали путем определения антигенного родства с другим каулимовирусом - ВМГ (Gnutova, Tolkach, 2000), обнаруженным в дальневосточном регионе России.

При постановке РДД и ДНК-гибридизации в качестве контроля использовали препараты вирусов мозаики арбуза 1 (ВМА-1), огуречной мозаики ( ВОМ), желтой мозаики фасоли (ВЖМФ) и ВТМ.

Методы исследований

Для изучения ВМЦК был применен комплекс классических вирусологических методов изучения физико-химических и антигенных свойств структурных белков и ДНК, а также молекулярно-генетические методы исследования геномного полиморфизма штаммов вирусов.

Способы передачи вируса. Поддержание и передачу изолятов ВМЦК осуществляли по методу В.Ф.Толкач (1995).

Вирусные включения выявляли по методу М. Гольдина (1963).

Негативное контрастирование частиц ВМЦК производили 2%-ным водным раствором уранилацетата.

Ультратонкие срезы тканей растений получали традиционными методами (Уикли,1975), контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом и просматривали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭН) JEOL - JEM 100 В.

Для получения каллусной ткани В. cauliflora экспланты выращивали на агаризованной питательной среде, содержащей микро- и макросоли по прописи Murashige и Skoog, 1962 с дополнительными компонентами (Булгаков и др., 1991). В качестве гормонов роста использовали кинетин (0,2 мг/л) и 2.4-D (1,0 мг/л).

Очистка ВМЦК. Вирус из сока листьев Raphanus. sativus L выделяли по методу Т. Morris et al. (1980) в нашей модификации: материал гомогенизировали в 0,5 М калийфосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 1,5 М мочевины, 0,2% 2-меркаптоэтанола. Гомогенат осветляли смесью хлороформа и n-бутанола, вирионы осаждали 10%-ным ПЭГ (м. м. 6000) в присутствии 0,1 М NaCI. Дальнейшую очистку осуществляли дифференциальным центрифугированием и центрифугированием в 10-40%-ном линейном градиенте сахарозы. Фракционирование градиента, определение вируса во фракциях, его концентрации и чистоты осуществляли традиционными методами (Атабеков (ред.), 2003).

Получение поликлональных моноштаммовых антисывороток. Крысиную антисыворотку приготовили путем интраперитонеального введения препарата ВМЦКо белым беспородным крысам по следующей схеме: 1 день-150 мкгантигена; 7-й и 14-й дни - по 200 мкг; 21 день - взятие крови из хвостовой вены. Кроликов иммунизировали по схеме, предложенной Р. Гнутовой (1993). На всех этапах иммунизации использовали полный адъювант Фрейнда.

Реакция двойной иммунодиффузии (РДЦ). Титр специфических антител и антигенные взаимоотношения вирусов (изолятов) изучали с помощью РДД (Гнутова, 1985).

Очистку ДНК ВМЦК осуществляли по методу R.Richins, R.Shepherd (1983). Суммарную ДНК растений выделяли фенольно-детергентным методом с протеиназой К (Klostermeyer, 2000) и с помощью цетилтриэтиламмоний бромида (Дрейпер и др., 1991).

Электрофорез структурных белков ВМЦКо проводили в 15%-ном денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) (Остерман, 1981; Xiong et al., 1982).

Анализ ДНК электрофорезом в ПААГ и агарозном гелях осуществляли по обычным методикам (Маниатис и др, 1984).

Тип нуклеиновой кислоты изолятов определяли методом ферментативного гидролиза в сочетании с электрофорезом (Халл, 1988).

Для определения величин фрагментов ДНК использовали калибровочные фрагменты ДНК фага лямбда, рестрицированной HindlU, 1 Kb ДНК маркеры, 100 Ьр+1,5 Kb ДНК маркеры (СибЭнзим), а также программу RFLPScan Plus (Scanalytics).

Полимеразно-цепная реакция. Амплификацию ГБЦВ ВМЦК проводили в 50 мкл смеси, содержащей ПЦР буфер (0,01 М трис-HCI, рН 9,0; 0,2 М MgCI2, 0,5 М KCI, 0,01%-ный желатин; 0,1%-ный Тритон Х-100; 0,0002 М каждого dNTP), 10 пМ каждого праймера (F1-R1); 0,2 ед. Taq-полимеразы и 10 нг вирусной ДНК. Амплификацию осуществляли в термоциклере UNO II (Biometra, Germany) при следующих температурных условиях: начальная денатурация - 3 мин при 94 °С; 30 циклов: денатурация -1 мин при 94°С, отжиг- 1 мин при 42 °С, элонгация - 2 мин при 72 °С; заключительный цикл элонгации - 5 мин при 72°С.

ПЦР с праймерами 2F-2R проводили в 25 мкл смеси, содержащей указанный

выше ПЦР буфер, 10 пМ каждого праймера, 0,2-0,5 мкл суммарной ДНК. Температурные условия: начальная денатурация - 2 мин при 95 СС; 40 циклов: денатурация -1 мин при 95 °С, отжиг -1 мин при 45 °С, элонгация - 50 с при 72 СС. Заключительный этап элонгации 5 мин при 72 °С.

Температуру отжига (Тт) праймеров рассчитывали по формуле Rychlik et al. (1989). Олигонуклеотиды синтезированы в ЗАО "СибЭнзим".

Рестрикционный анализ ДНК. Расщепление ПЦР фрагментов эндонуклеазами рестрикции проводили согласно условий производителя ферментов (СибЭнзим).

Синтез нерадиоактивных ДНК зондов осуществляли согласно прописи М. Renz, С. Kurz (1984) в модификации Ю. Дрыгина с соавт. (1989).

Блот-гибридизацияДНК Образцы наносили на фильтры Biotrans (ICN Biomed.) с диаметром пор 0,2 мкм, фиксировали УФ-облучением и далее обрабатывали согласно инструкции изготовителя фильтров. В качестве ДНК зонда использовали ампликон ВМЦКо 1 F + 1 R1913B концентрации 5-7 мкг/мл, а в качестве метки -пероксидазу хрена (ПХ). Гибридизацию проводили при 50 СС в течение! 6 ч.

Глава 3. Характеристика дальневосточного изолята - ВМЦКо

3.1. Цитологические и ультраструктурные особенности инфицированных ВМЦКо клеток

Было показано, что репликация ВМЦК сопровождается специфическими изменениями структуры инфицированной клетки. Так, в клетках верхнего эпидермиса листьев R. sativus, инфицированного вирусом, с помощью светового микроскопа были обнаружены цитоплазматические образования, не встречающиеся в контроле. Округлые белковые вироплазмы располагались околоядерно в количестве 6-9 и более на клетку (рис. 1). Ультраструктурным анализом показано, что вироплазмы состоят из электронноплотного матрикса, в котором равномерно распределены сферические вирионы диаметром 40-50 нм (рис. 2 А). Морфология и расположение выявленных клеточных структур характерны для включений, образуемых каулимовирусами (Martelli, Castellano, 1971). Кроме того, они имеют округлые электроннопрозрачные участки, не содержащие вируса (рис. 2 Б), что является характерным признаком включений ВМЦК (Al-Kaff, Covey, 1996).

3.2. Физико-химическая характеристика ВМЦКо

3.2.1.Подбор методики получения препарата ВМЦК

Рис 1. Срезы клеток листа R sativus сорта Илка инфицированного ВМЦКо. Я - ядро, В - вирусные включения.

Рис. 2. Ультраструктура клеток R sativus сорта Илка (А) и В. cauliflora сорта Снежный шар (Б), инфицированных ВМЦКо.

В - вирус, Кс - клеточная стенка, Цв - центральная вакуоль.

Масштаб 500 нм.

Испытывали два способа накопления ВМЦКо: in vitro (в культуре каллусной ткани) и in vivo (в растении).

От здоровых и инфицированных ВМЦКо растений В. cauliflora сорта Снежный шар получены каллусы, морфофизиологические характеристики которых практически не отличались: они имели светло-желтую окраску, блестящую поверхность и среднеглобулярную структуру (рис. 3).

Для оценки накопления ВМЦК in vitro, от инфицированных растений-доноров получили 10 каллусных линий, от которых дважды в месяц отбирали пробы. Содержание вируса определяли механической инокуляцией здоровых растений и блот-гибридизацией ДНК. Было установлено, что изначально каллусы отличаются по количеству содержащегося в них вируса. Так, в 2-х из 10-ти линий клеток специфические ДНК выявить не удалось, в 5 линиях гибридизационный сигнал был очень слабым, и лишь 3 отвечали сильным сигналом. На протяжении 6 мес. ДНК ВМЦК выявляли в тканях только двух линий. К концу 7-го месяца выявить присутствие вируса в каллусах не удавалось. Результаты гибридизационного анализа и биологического тестирования в целом подтверждают друг друга, так как инфекционностью. обладали только те линии (3,8), которые отвечали максимальным сигналом в гибридизации. Способность заражать растения сохранялась у данных каллусов в течение 4-х мес. Таким образом, только две линии клеток позволяли поддерживать ВМЦКо в течение продолжительного времени. Их использовали для очистки вируса.

Для накопления вируса in vivo использовали редис посевной различных сортов.

Рис. 3. 35-дневный каллус, полученный от инфицированного ВМЦКо В. ааиЬЛога сорта Снежный шар.

Изоляты хорошо накапливались в растениях лишь в течение весенне-осенних месяцев. Максимальный выход вируса получен при его очистки согласно трем испытанным методам: два FT" специально разработанные для очистки ВМЦК (Pirone et al ,1961; Hull et al., 1976), третий применялся для выделения каулимовируса окаймления жилок земляники (Morns et al., 1980). Учитывая достоинства и недостатки испытанных методов была предложена модифицированная методика, позволившая получить вирусные препараты высокого качества. Так, препараты ВМЦКо обладали спектром УФ-поглощения, характерным для нуклео-протеидов с максимумом при 260 нм и минимумом при 240 нм.

Отношение оптических плотностей А 260/280 составило 1,36, что соответствует литературным данным (Hull et al., 1976). Максимальный выход вируса по предложенной нами методике составил 6 мг/кг инфицированной ткани, что по сообщениям ряда авторов характерно для других изолятов ВМЦК (Shepherd, Bruening, 1970, Hull et al., 1976) С помощью ТЭМ в препаратах обнаруживали только сферические частицы диаметром 50 нм (рис. 4).

При выделении ВМЦКо из каллусов использовали предложенную нами методику, но пропускали этап экстракции пигментов органическими растворителями. Для выделения брали 10 г каллусной ткани, дающей положительную реакцию на наличие вируса в гибридизацион-ном тесте. При просмотре в ТЭМ сеточек, предварительно погруженных в суспензию, полученную после первого ультрацентрифугиро-вания, вирионы не обнаруживали. Отсутствие вируса можно объяснить низким его содержанием в исходной ткани, что предварительно было продемонстрировано гибриди-зационным тестом, атакже за счет адсорбции вирионов на ПЭГ. Это основные факторы, делающие невозможным выделение ВМЦК из каллусных тканей.

Таким образом, отработана

•Лш* - V

I

1 V i

/ ч

Рис..

4. Электронная микрофотография вирионов ВМЦКо Масштаб 100 нм.

методика очистки ВМЦКо из растений редиса. Изучение морфологии вируса показало, что вирионы ВМЦКо сферические, диаметром SO нм, характерные для ВМЦК. Очищенные препараты использовали далее в качестве иммуногенов, а также для характеристики белков ВМЦКо.

3.2.2. Структурные полипептиды ВМЦКо

Денатурирующим электрофорезом в

препарате ВМЦКо выявлены только два белковых компонента с м. м. 42 и 44 кДа (рис. S), которые отсутствовали в соке контрольных растений. Полученные данные свидетельствуют о высокой степени очистки ВМЦКо, так как в препарате отсутствуют белки растения-хозяина.

Сравнивая наши данные с результатами зарубежных исследователей отметим, что диапазон м. м. 37-44 кДа считается характерным для препаратов ВМЦК (Ani et al., 1980; Gong et al., 1990). Кроме того, в наших препаратах отсутствуют полипептиды с м. м. SS-100 кДа, соответствующие вирусспецифическим белкам, образующимся in vivo, но не входящим в состав вирионов (Hahn, Shepherd, 1982).

3.2.3. Характеристика нуклеиновой кислоты ВМЦКо

После инкубации выделенной из вирионов НК с ДНКазой электрофоретический профиль исчезал, чего не наблюдали при обработке РНКазой и в контроле. Таким образом, было установлено, что вирионы ВМЦКо содержат ДНК. В агарозном геле она мигрировала в виде смеси фрагментов (рис. б), наиболее подвижный из которых имел длину около 8 тыс. пар нуклеотидов (п. н.), что соответствует, согласно литературным данным, линейной форме ДНК ВМЦК (Franck et al., 1980). Аналогичный профиль наблюдали при анализе ДНК всех дальневосточных изолятов вируса. На сегодняшний день все дцДНК-геномные фитовирусы объединяют в семейство Caulimoviridae (Краев, 2000).

3.3. Антигеннаяхарактеристика

капсидных белков ВМЦКо и выявление видо-, штаммо- иродоспецифических эпитопов ВМЦКо и ВМГ

Были получены моноштаммовые крысиная и

Рис. 5. Электрофореграмма белков препарата ВМЦКо (2) и сока инфицированного R. sativus (3). (1) белки-маркеры (м. м.указаны в кДа).

Рис. 6. Электрофореграмма ДНК ВМЦКо (2). (1) ДНК л/ Hmd\\\. Стрелкой указана линейная форма ДНК ВМЦКо. Гель - 1%-ная агароза.

кроличья антисыворотки против ВМЦКо, с помощью которых изучали его антигенные и иммуногенные свойства. Первая была строго специфичной и не реагировала с компонентами сока здоровых растений. Титр специфических антител в РДД составил1:64. Крысиная антисыворотка с соком здоровых растений также не реагировала, но в отличие от кроличьей титр ее специфических антител был значительно ниже - 1:2.

С помощью кроличьей антисыворотки выявляли видоспецифические эпитопы у других, выявленных в дальневосточном регионе, изолятов ВМЦК. В РДД все изоляты формировали тонкие непересекающиеся линии преципитации, образующих кольцо вокруг лунки с антисывороткой, что доказывает идентичность антигенных детерминант на поверхности их капсидных белков.

В системе крысиной антисыворотки в РДД наблюдали формирование полосы преципитации с соком растения георгина, инфицированного ВМГ, которая пересекала линию преципитации, образованную гомологичным антигеном, формируя характерную "шпору". Такое расположение линий преципитации свидетельствовало о наличии у обоих антигенов общих эпитопов, что характеризует их как членов одного рода. В то же время, они имеют и видоспецифические эпитопы, не позволяющие линиям преципитации сливаться.

Таким образом, продемонстрировано близкое антигенное родство между всеми исследуемыми дальневосточными изолятами ВМЦК, а также их отдаленное родство с ВМГ, другим видом рода Caulimovirus, обнаруженном на Дальнем Востоке России. Кроме того, было установлено, что в соке инфицированных растений, ВМЦК не может быть четко выявлен при использовании капельной агглютинации и РДД. Вероятнее всего, необходим более чувствительный диагностикум.

Глава 4. Разработка молекулярных методов диагностики ВМЦК на основе анализа его генетической изменчивости

4.1. АмплификацияГБЦВ дальневосточныхизолятовВМЦК Для анализа генетических характеристик изолятов ВМЦК использовали фрагмент вирусного генома, определяющий симптомы у изолятов, а также специфичность круга заражаемых ими растений. Для ВМЦК это область ДНК, кодирующая белок цитоплазматических включений (ОРС VI) (Оегу в! а1., 1999). Для подбора праймеров, позволяющих его амплифицировать, был проведен анализ всех нуклеотидных последовательностей ВМЦК, информация о которых имеется в ОепБапк. Анализ фрагмента генома 12 штаммов длиной 1990 п. н., располагающийся между ОРС V и второй длинной межгенной областью, показал, что нуклеотидные замены равномерно распределены по всей его длине, однако с 5'- и З'-концов располагаются относительно консервативные участки, принадлежащие малой и второй длинной межгенной областям соответственно, которые были использованы в качестве мишени для ПЦР. Характеристики праймеров представлены в табл. 1.

Подобранные условия постановки ПЦР обеспечивали амплификацию специфических фрагментов ДНК всех дальневосточных изолятов ВМЦК, что необходимо для определения их генетических характеристик. Причем, размер ампликонов соответствовал расчетному (рис. 7).

Таблица 1

Характеристика праймеров, использованных для амплификации ГБЦВ ВМЦК

Праймер Последовательность Длина (п. н.) Температура отжига (°С) Длина ампликона in н)

1 F S'-TGCGGACTTCCTTTCAAGAG-S' 20 46,68 1913

1 R 5'-AACCCTATAAGAACCCTAAT-3' 20 42,57

4.2. Анализ генетической изменчивости ВМЦК

Фрагмент 1F+1R1913 изолятов был расщеплен 9 эндонуклеазами рестрикции. Для 8 ферментов (А1и\, BsuR), EcoRlHindu, Kzo9\, Msp\, Sse9\, Taq\) набор рестрикционных фрагментов у всех изолятов был идентичным (Рис. 8 А). Количество сайтов узнавания варьировало от двух до пяти. Отличия между изолятами выявлены с помощью Tru9\. Профиль рестрикции был идентичен для изолятов ВМЦКо, ВМЦК-1, ВМЦК Р-1, ВМЦК Р-2, ВМЦК-7 (первый Тги9\-геновариант). ВМЦК-6 является вторым -геновариантом, так как несмотря на совпадение 3-х фрагментов с изолятами первого 7ш91-геноварианта, у него отсутствует фрагмент ДНК длиной около 622 п. н. Видимо, в результате замены нуклеотида в нем появился дополнительный сайт рестрикции, что привело к появлению двух более коротких фрагментов: 509 и 171 п. н. В целом, из 33-х выявленных сайта рестрикции, только один являлся полиморфными.

Для того, чтобы сравнить изменчивость ГБЦВ у дальневосточных и зарубежных изолятов, из нуклеотидных последовательностей последних были "вырезаны" фрагменты, ограниченные праймерами 1F-1R. С помощью программы GeneRunner (ver. 3,0) проведено картирование фрагментов зарубежных штаммов. При сопоставлении предполагаемых профилей рестрикции с профилями дальневосточных изолятов обнаружено, что российские изоляты чаще всего обладают специфическими профилями рестрикции ГБЦВ. Примечательно, что изменчивость нуклеотидных последовательностей ГБЦВ зарубежных штаммов ВМЦК, выявленная с помощью одного набора рестриктаз, по сравнению с дальневосточными, значительно выше.

Таким образом, помощью ПЦР-ПДРФ анализа показано, что размер ампликонов, полученных при использовании праймеров 1F-1R у всех изолятов совпадает и в их последовательностях выявлена только одна нуклеотидная замена.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК изолятов ВМЦК с праймерами 1F -1 R. (1) 1Мэ ДНК маркеры, (2) ВМЦКо, (3) ВМЦК-1, (4) ВМЦК Р-1, (5) ВМЦК Р-2, (6) ВМЦК-6, (7) ВМЦК-7, (8) ДНЮНшШИ. Гель - 0,8%-ная агароза.

Рис. 8 Примеры ПДРФ-профилей ГБЦВ дальневосточных изолятов ВМЦК (1) 100 Ьр+1,5 КЬ ДНК, (2) ВМЦКо, (3) ВМЦК-1. (4) ВМЦК Р-1, (5) ВМЦК Р-2, (6) ВМЦК-6, (7) ВМЦК-7. А - ГадI (2%-ный агарозный гель), Б - 7ш91 (5%-ный ПААГ)

Рис. 9. Пример схемы ПДРФ-профилей ГБЦВ штаммов ВМЦК различного географического происхождения, построенные на основе нуклеотидных последовательностей. Для сравнения приведены профили 2-х дальневосточных изолятов - ВМЦКо и ВМЦК-6

Обобщая полученные данные мы имеем основание предположить, что ВМЦК в дальневосточном регионе России представляет своеобразную, достаточно однородную популяцию Это одно из возможных объяснений столь существенных отличий исследуемых изолятов от зарубежных Сделанный вывод свидетельствует

об актуальности дальнейшего изучения ВМЦК, выделенного в дальневосточном регионе. Более обстоятельно генетические и филогенетические взаимоотношения зарубежных и дальневосточных штаммов можно будет исследовать после секвенирования последних.

4.3. ПЦР диагностика ВМЦК

Для индикации дальневосточных изолятов вируса можно было бы использовать ГБЦВ, так как продемонстрирована его стабильность. Однако, в целом, как следует из литературных данных и наших исследований, структура ГБЦВ часто подвержена перестройкам. Поэтому, исследование начинали с поиска консервативных участков в геноме вируса. Анализировали штаммы ВВС, CaBB-D/H, Cabb-S, CM 1841, CMV-1, NY8153, Xinjing. С помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) установлено, что наименьшее число нуклеотидных различий отмечается в не кодирующих участках генома, к которым относятся короткая, 1-я и 2-я длинные межгенные области. Можно предположить, что использование названных областей позволит подобрать праймеры, специфичные максимальному числу изолятов и эффективно выявлять вирус даже в случае "завозной" инфекции.

Для ПЦР была рассчитана пара праймеров на 2-ю длинную межгенную область генома (табл. 2), фланкирующая участок длиной около 600 п. н.

Таблица 2

Характеристика праймеров, использованных для индикации ВМЦК

Праймер Последовательность Длина (п. н.) Температура отжига (°С) Длина ампликона (п.н.)

2 F 5'-TTTAAGCGGGGGCTTATGCGGA-3' 22 48,72 600

2 R 5'-А ТТТСА TTTG GAGAGGACA CG С-3* 22 47,83

Экспериментальным путем получили, что можно выявить ВМЦК, если концентрация праймеров в 25 мкл ПЦР смеси не менее 10 пМ, температура отжига олигонуклеотидов 45°С и количество циклов - 35-40. При таких условиях наблюдали появление ПЦР-продуктов при использовании всех дальневосточных изолятов ВМЦК, причем их длина соответствовала

расчетной (рис. 10).

Специфичность амплификации проверяли постановкой реакции с ДНК, выделенной из не инфицированных вирусом растений сем. крестоцветные.

Рис. 10. Выявление ВМЦК в образцах ДНК: (2-7) полученных из R.sativus, инфицированных изолятами вируса; (8) из неинфицированных растений; (9) бланк-контроль; (10) ДНК, выделенная из препарата ВМЦКо; (1)1 КЬ ДНК маркер. Гель - 1%-ная агароза.

В отрицательном контроле (ДНК из здорового растения), а также в бланк-контроле (ПЦР-смесь без ДНК) продукты амплификации отсутствовали, что свидетельствует о специфичности системы.

В ПЦР использовали суммарную ДНК, которую выделяли двумя методами (см. Глава 2). Как показал наш опыт, оба t етода подходят в равной мере.

Таким образом, разработана видоспецифичная ПЦР тест-система, позволяющая выявлять ВМЦК циркулирующий в дальневосточном регионе России.

4.4. Выявление ВМЦКметодом точечной ДНК-гибридизации

Первоначально сконструировали ДНК-зонд. Для этого использовали фрагмент ^+^1913, а в качестве метки - (ПХ). Экспериментально подбирали концентрацию зонда, температуру и продолжительность реакции. Установлено, что при температуре инкубации более 60 °С эффективность отжига зонда с ДНК-мишенью резко снижалась, а при 48 °С и менее заметно возрастало фоновое окрашивание. Таким образом, оптимальная температура гибридизации для данного зонда лежит в пределах 50-55 °С. Продолжительность реакции 16 ч. Концентрация ДНК-зонда не менее 5 мкг/мл.

Специфичность метода была показана в тесте гибридизации с препаратами вирусов, имеющимися в коллекции лаборатории: ВОМ, ВТМ, ВМА-1, ВЖМФ, а также с препаратами ДНК, полученными от здоровых и инфицированных ВМЦК растений. В качестве положительного контроля использовали немеченый пероксидазой фрагмент 1Р+1Я1913 (рис. 11). Из рисунка следует, что зонд необратимо отжигался с ДНК всех дальневосточных изолятов ВМЦК. В то же время, ни в одной точке нанесения гетерологичных вирусов реакции не наблюдали, равно как и в точке с ДНК, выделенной из здорового растения. Таким образом, полученный нами зонд обладал строгой специфичностью.

Далее подбирали условия для выявления ВМЦК в соке инфицированных растений. Было установлено, что сок здоровых растений дает фоновое окрашивание до разведения 1:27-1:81, в то время как сигнал в точках нанесения сока инфицированных растений регистрируется до разведения более 1:6561. Вероятнее всего, неспецифическое окрашивание в контроле обусловлено содержанием в соке растений эндогенной пероксидазы, которая, тем не менее, не является препятствием для использования предложенного метода детекции ВМЦК. Высокая чувствительность гибридизационного теста позволяет работать с большими разведениями сока, при которых неспецифических реакций не наблюдается. Исследованием показано, что оптимальным разведением сока для выявления ВМЦК является 1:243-1:729.

Итак, разработан вариант метода гибридизации нуклеиновых кислот для детекции ВМЦК в суммарной фракции нуклеиновых кислот и в соке инфицированных растений.

I 2 3 4 S

Рис. 11. Определение специфичности блот-гибиридизации с ДНК-зондом, меченым ПХ. А,-А6 препараты изолятов ВМЦК; суммарная ДНК из инфицированных ВМЦКо R. sativus

(Б,), В. oleracea (Б2), В. caubflora (Б3); Б4-Б6 - тоже, но ДНК не инфицированных растений; В, - ампликон 1F+1R1913, В2 -препарат ВОМ, В3 - ВТМ, В4 - ВМА-1, В5 -

ВЖМФ, Вв - контроль.

Выводы

1. Вирионы ВМЦК сосредоточены в округлых белковых образованиях (вироплазмах), которые располагаются околоядерно, что характерно для вирусов рода Caulimovirus. Вироплазмы состоят из электронно плотного матрикса, в котором равномерно распределены сферические частицы ВМЦК диаметром 40-50 нм.

2. Показано, что линии пассируемой клеточной культуры системного хозяина В. cauliflora, полученные от инфицированных ВМЦК растений, были неоднородны по содержанию вируса; лишь одна из десяти каллусных линий сохраняла инфекционность в течение 4 мес. Выделить вирус из полученных каллусов не удалось.

3. Выявлены два вирусспецифических белка с м. м. 42 и 44 кДа. Отсутствие низкомолекулярных белков и их димеров свидетельствует о высокой стабильности белка капсидной оболочки ВМЦКо.

4. Показано, что ДНК ВМЦКо мигрирует в геле в виде смеси молекул. Наиболее подвижная форма имеет размер около 8 тыс. п. н.

5. Получена поликлональная моноштаммовая антисыворотка к ВМЦКо от двух видов животных (кроличья и крысиная). Установлено антигенное родство между шестью дальневосточными изолятами ВМЦК. Выявлены родоспецифические эпитопы на поверхности капсидных белков у ВМЦК и другого каулимовируса, выявленного в Приморском крае на георгине - вирусом мозаики георгина.

6. Амплифицирована полноразмерная копия ГБЦВ ВМЦК. ПЦР-ПДРФ анализ показал, что ВМЦК на Дальнем Востоке России представляет собой генетически однородную популяцию. Показано наличие существенных различий рестрикционных профилей у российских изолятов и зарубежных штаммов ВМЦК, что позволяет сделать предположение, что на Юге Дальнего Востока России циркулирует самостоятельная популяция ВМЦК.

7. Разработаны две видоспецифические тест-системы диагностики ВМЦК: на основе ПЦР и нерадиоактивной блот-гибридизации ДНК.

Список опубликованных работ

1. Богунов Ю.В., Толкач В.Ф., Гнутова Р.В. Вирус мозаики цветной капусты, обнаруженный в ходе фитосанитарного мониторинга овощных культур в Приморском крае / Мат. IV региональной конференции молодых ученых "Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока" Владивосток, 2000 г. С. 87-88.

2. Богунов Ю.В. Вирусы семейства Caulimovirida - потенциальные векторы для генетической инженерии растений / Тез. IV Региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии студентов, аспирантов и молодых ученых. - Владивосток, 2001 г. С. 12-13.

3. Богунов Ю.В., Гнутова Р.В. Результаты и перспективы изучения вируса мозаики цветной капусты // Вестник ДВО РАН. 2002. № 3. С.118-126.

4. Gnutova R.V, Tolkach V.F., Bogunov Yu.V. Comparison description of biological properties of cauliflower mosaic virus1 strains / Abstr. 6-th conf. "European Foundation for Plant Patology". Prague, 2002. P. 23.

5. Gnutova R.V., Tolkach V.R, Bogunov Yu.V. Criteria for identification cauliflower mosaic virus' of the Far Eastern strains // Plant Protection Science. 2002. V. 38 (3). P. 258-260.

6. Толкач В.Ф., Богунов Ю.В., Гнутова Р.В. Вирус мозаики цветной капусты в Приморском крае // Вестник защиты растений. 2002. №. 1. С. 51-58.

7. Гнутова Р.В., Толкач В.Ф., Богунов Ю.В. Критерии идентификации дальневосточных штаммов вируса мозаики цветной капусты / Мат. региональной конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты микробиологии на Дальнем Востоке". Владивосток, 2003. С 171-174.

8. Богунов Ю.В., Гнутова Р.В. Ультраструктура клеток растений, пораженных вирусом мозаики цветной капусты // Бюлл. Гл. Бот. Сада. 2004. Вып. 187. С.182-185.

Юрий Васильевич БОГУНОВ

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВИРУСА МОЗАИКИ ЦВЕТНОЙ КАПУСТЫ (ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЕ ИЗОЛЯТЫ) И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ

Автореферат

Изд. лиц. ИД № 05497 от 01.08.2001 г. Подписано к печати 12.07.2004 г. Формат 60x90/16. Печать офсетная. Усл. п. л. 1,13. Уч.-изд. л. 1,02. Тираж 100 экз. Заказ 117.

Отпечатано в типографии ФГУП «Издательство "Дальнаука"» ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио, 7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богунов, Юрий Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ДНК- ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ: ТАКСОНОМИЯ,

СВОЙСТВА, ДИАГНОСТИКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Общая характеристика вирусов рода СаиПтоу1гт семейства СаиНтоутс1ае.

1.2. Вирус мозаики цветной капусты - типовой представитель рода СаиИтоупия.

1.3. Характеристика репликации и изменчивости вирусного генома

1.4. Модельные системы для изучения ВМЦК.

1.5. Использование генома ВМЦК в генетической инженерии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. ВМЦК и его изоляты.

2.2. Способы передачи вируса.

2.3. Световая и электронная микроскопия.

2.3.1. Изучение внутриклеточных вирусных включений методом световой микроскопии.

2.3.2. Негативное контрастирование частиц ВМЦК для электронномикроскопического исследования

2.3.3. Ультратонкие срезы.

2.4. Получение каллусной ткани цветной капусты.

2.5. Очистка ВМЦК.

2.6. Получение поликлональных моноштаммовых антисывороток.

2.7. Реакция двойной иммунодиффузии.

2.8. Методы выделения ДНК.

2.9. Электрофорез структурных белков в ПААГ.

2.10. Анализ ДНК электрофорезом в акриламидном и агарозном гелях.

2.11. Полимеразная цепная реакция.

2.12. Рестрикционный анализ ДНК.

2.13. Синтез нерадиоактивных ДНК-зондов.

2.14. Блот-гибридизация ДНК.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ШТАММА

ВМЦКо.

ЗЛ. Цитологические и ультраструктурные особенности инфицированных ВМЦКо клеток.

3.2. Физико-химическая характеристика ВМЦКо.

3.2.1. Подбор методики получения препарата ВМЦК.

3.2.2. Структурные полипептиды ВМЦКо.

3.2.3. Характеристика нуклеиновой кислоты ВМЦКо.

3.3. Антигенная характеристика капсидных белков ВМЦКо и выявление штаммо-, видо- и родоспецифических эпитопов ВМЦК и ВМГ.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВМЦК НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЕГО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ.

4.1. Амплификация ГБЦВ дальневосточных изолятов ВМЦК.

4.2. Анализ генетической изменчивости ВМЦК.

4.3. ПЦР диагностика ВМЦК.

4.4. Диагностика ВМЦК с помощью ДНК-гибридизации.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика генетической изменчивости вируса мозаики цветной капусты (дальневосточные изоляты) и разработка методов его диагностики"

Своеобразие гео-климатических условий юга Дальнего Востока России определяет повышенный инфекционный фон в агроценозах. Здесь циркулируют вирусы растений, поражающие важные в экономическом плане культуры: овощные, картофель, злаковые, бобовые, декоративные. К настоящему моменту в дальневосточном регионе выявлено около 50 фитовирусов из 16 родов и еще больше описано их штаммов (Гнутова, 2003). Результаты ежегодного фитосанитарного мониторинга поражаемости сельскохозяйственных культур вирусами свидетельствуют о наличии в биоценозах ранее не изученных вирусов и их штаммов. Так, оказалось, что овощные культуры, изучение вирусов которых интенсивно проводится в последние годы, поражаются не только РНК-, но и ДНК-геномными вирусами. Идентифицирован новый вид для дальневосточного региона - вирус мозаики цветной капусты - Cauliflower mosaic virus рода Caulimovirus семейства Caulimoviridae (Gnutova, Tolkach, 2000). Вид выделен из культурных растений сем. крестоцветные: капусты, редиса. Особый интерес представляет то, что в Приморском крае известно шесть изолятов вируса. При этом они отличаются как по биологическим, так и по физическим свойствам, что дает основание сделать предположение о высокой изменчивости ВМЦК в данном регионе.

Современный подход к изучению штаммов ВМЦК должен опираться не только на комплекс классических методов вирусологии, но и на методы молекулярной биологии, поскольку все фенотипические особенности изолятов генетически детерминированы (Chenault, Melcher, 1994). Поэтому для дополнения ранее полученных результатов по штаммовому разнообразию ВМЦК в дальневосточном регионе необходимо было продолжить дальнейшую идентификацию изолятов и получить данные по генетической изменчивости, которые подтверждали или отвергали их статус как самостоятельных штаммов. Кроме того, на георгине по биологическим свойствам был выявлен еще один вид рода Caulimovirus - вирус мозаики георгина — Dahlia mosaic virus (Tolkach, Gnutova, 2002), что позволило провести сравнительную характеристику эпитопов капсидных белков ВМЦК и ВМГ - как видов одного рода.

Знание особенностей генетической изменчивости ВМЦК важно не только при изучении штаммового состава вируса, но и позволяет разработать для него эффективные методы диагностики. По литературным данным до сих пор пор еще не получен эффективный иммунодиагностикум против ВМЦК. В последние годы для этих целей используют молекулярные методы детекции вирусной ДНК, вследствие их высокой чувствительности и специфичности. Разработанный за рубежом радиоактивно-гибридизационный метод выявления ВМЦК довольно перспективен, однако в практике он не нашел применения, главным образом, из-за трудоемкости и необходимости соблюдения строгих мер безопасности (Maule et al., 1983). Более доступным может стать его вариант с использованием нерадиоактивных зондов. Выявление промотора 35S РНК ВМЦК в трансгенных растениях с помощью ПЦР со специфическими праймерами - более быстрый и доступный способ (Melnychuk et al., 2002), что свидетельствует о его перспективности. Необходимо отметить также, что изучение изменчивости ВМЦК - актуальная задача не только для вирусологии, но и для генной инженерии, которая успешно использует геном вируса и его фрагменты как модельные объекты для получения трансгенных растений.

При работе одновременно с несколькими изолятами ВМЦК особое значение имеет длительное содержание их в растениях и сохранение моноинфекции. Известно, что растения сем. крестоцветные, на которых поддерживается вирус, являются объектом питания для насекомых-переносчиков вирусов, что создает опасность для сохранении чистоты отдельного штамма. Мы решили показать перспективность длительного содержания ВМЦК in vitro - в культуре изолированных тканей растений.Такой подход позволил бы сократить дорогостоящие площади теплиц и исключить влияние насекомых-переносчиков и мало контролируемых факторов на рост растений.

Исходя из выше изложенного, цель настоящей работы состояла в характеристике структурных белков и изменчивости вирусного генома, изучении цитопатогенных свойств для определения штаммового разнообразия ВМЦК, а также разработке молекулярных методов их диагностики.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать методику получения препарата обычного штамма ВМЦК (ВМЦКо).

2. Оценить возможность поддержания и накопления вируса in vitro в культуре каллусной ткани системного хозяина Brassica cauliflora.

3. Определить морфологию и размер вирионов ВМЦКо.

4. Дать характеристику ВМЦК-индуцированным внутриклеточным включениям и определить места их локализации.

5. Изучить ультраструктурные изменения в клетках инфицированных растений.

6. Получить антисыворотку против ВМЦКо от различных животных-продуцентов специфических антител.

7. Выявить родо-, видо- и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков ВМЦК и ВМГ.

8. Отработать методику выделения нуклеиновой кислоты вируса, определить ее тип и размер.

9. Подобрать структуру олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена белка цитоплазматических включений ВМЦК на основе известных нуклеотидных последовательностей вируса.

10. Провести молекулярно-генетический анализ изменчивости дальневосточных изолятов ВМЦК.

11. Разработать вариант нерадиоактивной блот-гибридизации для детекции ВМЦК.

12. Разработать систему диагностики ВМЦК с помощью ПЦР.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Богунов, Юрий Васильевич

ВЫВОДЫ

1.Вирионы ВМЦК сосредоточены в округлых белковых образованиях (вироплазмах), которые располагаются околоядерно, что характерно для вирусов рода СаиНтоу1Гш. Вироплазмы состоят из электронно плотного матрикса, в котором равномерно распределены сферические частицы ВМЦК диаметром 40-50 нм.

2. Показано, что линии пассируемой клеточной линии системного хозяина В. саиИ/1ога, полученные от инфицированных ВМЦК растений, были неоднородны по содержанию вируса; лишь одна из десяти каллусных линий сохраняла инфекционность в течение 4 мес. Выделить вирус из полученных каллусов не удалось.

3. Выявлены два вирусспецифических белка с м. м. 42 и 44 кДа. Отсутствие низкомолекулярных белков и их димеров свидетельствует о высокой стабильности белка капсидной оболочки ВМЦКо.

4. Показано, что ДНК ВМЦКо мигрирует в геле в виде смеси молекул. Наиболее подвижная форма имеет размер около 8 тыс. п. н.

5. Получена поликлональная моноштаммовая антисыворотка к ВМЦКо от двух видов животных (кроличья и крысиная). Установлено антигенное родство между шестью дальневосточными изолятами ВМЦК. Выявлены родоспецифические эпитопы на поверхности капсидных белков у ВМЦК и другого каулимовируса, выявленного в Приморском крае на георгине -вирусом созаики георгина.

6. Амплифицирована полноразмерная копия гена белка цитоплазматических включений ВМЦК. ПЦР-ПДРФ анализ показал, что ВМЦК на Дальнем Востоке России представляет собой генетически однородную популяцию. Показано наличие существенных различий рестрикционных профилей у российских изолятов и зарубежных штаммов ВМЦК, что позволяет сделать предположение, что на Юге Дальнего Востока России циркулирует самостоятельная популяция ВМЦК.

7. Разработаны две видоспецифические тест-системы диагностики ВМЦК: на основе ПЦР и нерадиоактивной блот-гибридизации ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богунов, Юрий Васильевич, Владивосток

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. Т. 38. № 9. С. 1173-1195.

2. Атабеков И.Г. (ред.). Практикум по общей вирусологии. М.: Изд-во МГУ, 2003. 191 с.

3. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М. Содержание даммарановых гликозидов в различных каллусных линиях Panax ginseng Mey // Растит, ресурсы. 1991. Т. 27. С. 94-100.

4. Власов Ю.И., Редько Т.А., Лытаева Г.К. Вирусные болезни овощных и бахчевых культур. Л.: Колос, 1973. 72 с.

5. Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. М.: Мир, 1978. 430 с.

6. Гнутова Р.В. Иммунохимические методы в фитовирусологии. М.: Наука, 1985. 183 с.

7. Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. М.: Наука, 1993.301 с.

8. Гнутова Р.В. Таксономический статус фитовирусов и их штаммов, идентифицированных на российской азиатской территории. В кн. Фундаментальные и прикладные аспекты микробиологии на Дальнем Востоке. 2003. С. 155-159.

9. Гольдин М.И. Вирусные включения в растительной клетке и природа вирусов. М.: Изд-во АН СССР, 1963. 203 с.

10. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Геннная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер. с англ. М.: Мир, 1991. 408 с.

11. Дрыгин Ю.Ф., Афонина И.А., Байер К. и др. Детекция Х- и М-вирусов картофеля с помощью ДНК-зондов, меченных пероксидазой хрена // Биоорганическая химия. Т. 15. С. 947-951.

12. Ковган А.А, Жданов В.М. Структура и функция генома вируса мозаики цветной капусты и его использование в генной инженерии // Вопросы вирусологии. 1989. № 5. С. 523-533.

13. Краев В.Г. Современная классификация и номенклатура вирусов растений

14. По материалам Международного комитета по таксономии вирусов). Ч. 1 // Мкробюл. журн. 2000. Т. 62. № 5. С. 45-71.

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

16. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. 288 с.

17. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988.304 с.

18. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. М.: Мир, 1985. 385 с.

19. Толкач В.Ф. Идентификация и биологическая характеристика поти- и тобамовирусов (дальневосточные изоляты). Автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток: Дальнаука, 1995. 24 с.

20. Толкач В.Ф., Гнутова Р.В. Возбудители вирусных заболеваний овощных культур на юге Дальнего Востока. / Тез. Меж. конф. "Биоресурсы и вирусы". Киев. 2001. с. 102.

21. Толкач В.Ф., Гнутова Р.В., Богунов Ю.В. Вирус мозаики цветной капусты в Приморском крае // Вестник защиты растений. С-Пб., 2002. № 1. С. 51-57.

22. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. Пер. с англ. /Под ред. В. Полякова. М.: Мир, 1975. 327 с.

23. Халл Р. Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика вирусов (преимущественно вирусов растений) // Вирусология. Методы. М.: Мир, 1988. С. 12-43.

24. Шибата Д. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов / В кн.: Молекулярная генетическая диагностика. Методы. М.: Мир, 1999. С. 395-427.

25. Albrecht Н., Gelbreich A., Menissier de Murcia J. et al. Cauliflower mosaic virus gene I product detected in a cell-wall-enriched fraction // Virology. 1988. Vol. 163. P. 503-508.

26. AI-KafFN.S, Covey S.N. Variation in biological properties of cauliflower mosaic virus clones //J. Gen. Virol. 1994. Vol. 75. P. 3137-3145.

27. Al-Kaff N.S., Covey S.N. Biological diversity of cauliflower mosaic-virus isolates expressed in 2 brassica species // Plant Pathology. 1995. Vol. 44. P. 516-526.

28. Al-Kaff N.S., Covey S.N. Unusual accumulation of CaMV in local lesion, dark green leaftissue, and roots of infected plants // Mol. Plant-Microb. Interactions. 1996. Vol. 9. P. 357-363.

29. Ani R., Pfeffer P., Lebeurier G. The structure of cauliflower mosaic virus. II. Identity and location of the viral polypeptides // Virology. 1979. Vol. 93. P. 188-197.

30. Ansa O.A., Bowyer J. W., Shepherd R.). Evidence for replication of cauliflower mosaic virus DNA in plant nuclei //Virology. 1982. Vol. 121. P. 147-156.

31. Armour S.L., Melcher T.P., Pirone T.P. et al. Helper component for aphid transmission encoded by region II of cauliflower mosaic virus DNA// Virology. 1983. Vol. 129. P. 25-30.

32. Balazs E., Guilley H., Jonard G., Richards K. Nucleotide sequence of DNA from an altered-virulence isolate D/H of cauliflower mosaic virus // Gene. 1982. Vol. 19. P. 239-249.

33. Balazs E., Lebeurier G. Arabidopsis is a host of cauliflower mosaic virus // Arabidopsis Information Service. 1981. № 18. P. 130-134.

34. Bannister A., Maule A., Covey S. Cauliflower mosaic virus particles alter the sensitivity of Arabidopsis thaliana seedlings to 2,4-D // J. Plant Physiol. 1993. Vol. 141. P. 502-504.

35. Bassi M., Favali M.A., Conti G.G. Cell wall protrusions induced by cauliflower mosaic virus in Chinese cabbage leaves: a cytochemical and autoradiographic study//Virology. 1974. Vol. 60. P. 353-358.

36. Baughman G., Jacobs J., Howell S. Cauliflower mosaic virus gene VI produces a symptomatic phenotype in transgenic tobacco plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 733-737.

37. Bedford I., Kelly A., Blank G. et al. The effect of Pymetrizine, a feeding inhibitor of Homoptera, in preventing transmission of cauliflower mosaic virus by the aphid species Myzus persicae //Ann. Appl. Biol. 1998. Vol. 132. P. 453-462.

38. Benfey P., Ren L., Chua N. Tissue-specific expression from CaMV 35S enhancer subdomains in early stages of plant development // EMBO J. 1990a. Vol. 9.1. P. 1677-1684.

39. Benfey P., Ren L., Chua N. Combinatorial and synergistic properties of CaMV 35S enhancer subdomains // EMBO J. 19906. Vol. 9. P. 1685-1696.

40. Blanc S., Schmidt I., Vantard M. et al. The aphid transmission factor of cauliflower mosaic virus forms a stable complex with microtubules in both insect and plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 15158-15163.

41. Bonneville J., Volovitch M., Modjtahedi et al. In vitro synthesis of cauliflower mosaic virus DNA in viroplasms // Adv. Exp. Med. Biol. 1984. Vol. 179. P. 113-119.

42. Borneman J., Tritz R., Hampel A., Altschuler M. Detection of cleavage products from an in vivo transcribed cis hairpin ribozyme in turnips using the CaMV plant virus //Gene. 1995. Vol. 159. P. 137-142.

43. Brisson N., Hohn T. Plant-virus vectors cauliflower mosaic virus // Methods in Enzymology. 1986. Vol. 118. P. 659-668.

44. Brisson N., Paszkowski J., Penswick J. et al. Expression of a bacterial gene in plants by using a viral vector //Nature. 1984. Vol. 310. P. 511-514.

45. Broadbent L. Investigation of virus diseases of Brassica crops // Agric. Res. Counc. Rep. Ser. 1957. Vol. 14. P. 12-19.

46. Broglio E. Mutational analysis of cauliflower mosaic virus gene VI changes in host-range, symptoms, and discovery of transactivation-positive, noninfectious mutants // Mol. Plant-Microb. Interactions. 1995. Vol. 8. P. 755-760.

47. Brunt A. Partial purification, morphology, and serology of dahlia mosaic virus / /Virology. 1966. Vol. 28. P. 778-780.

48. Brunt A., Barton R., Tremaine J., Stacemith R. Composition of cauliflower mosaic virus protein // J. Gen. Virol. 1975. Vol. 27. P. 101-106.

49. Burger J., Du Plessis D. Detection of partially proteolyzed cauliflower mosaic virus coat protein in infected leaf tissue by western blotting//J. Virol. Methods. 1983. Vol. 7. P. 11-19.

50. Chapdelaine Y., Hohn T. The cauliflower mosaic virus capsid protein: assembly and nucleic acid binding in vitro // Virus Genes. 1998. Vol. 17. P. 139-150.

51. Chapdelaine Y., Kirk D., Karsies A. et al. Mutation of capsid proteinphosphorylation sites abolishes cauliflower mosaic virus infectivity // J. Virol. 2002. Vol. 76. P. 11748-11752.

52. Chenault K., Melcher U. Patterns of nucleotide sequence variation among cauliflower mosaic virus isolates // Biochimie. 1994. Vol. 76. P. 3-8.

53. Chenault K., Melcher U. Phylogenetic relationships reveal recombination among isolates of cauliflower mosaic virus // J. Mol. Evol. 1994. Vol. 39. P. 496-505.

54. Cheng R.H., Olson N.H., Baker T.S. Cauliflower mosaic virus: a 420 subunit (T=7), multilayer structure //Virology. 1992. Vol. 186. P. 655-668.

55. Citovsky V., Knorr D., Zambryski P. Gene-I, a potential cell-to-cell movement locus of cauliflower mosaic virus, encodes an RNA-Binding protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 2476-2480.

56. Conti G.G, Vegetti G., Bassi M., Favali M. Some ultrastructural and cytochemical observations on Chinese cabbage leaves infected with cauliflower mosaic virus / /Virology. 1972. Vol. 96. P. 694-770.

57. Covey S.N., Hull R. Transcription of cauliflower mosaic virus DNA: detection of transcripts, properties, and location of the gene encoding the virus inclusion body protein // Virology. 1981. Vol. 111. P. 463-474.

58. Covey S., Turner D. Changes in population of cauliflower mosaic virus DNA and RNA forms during turnip callus proliferation // J. Gen. Virol. 1993. Vol. 74. P. 1887-1839.

59. Covey S.N., Turner D.S., Lusy A.P., Saunders K. Host regulation of cauliflower mosaic virus replication cycle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 1633-1637.

60. Daubert S., Shepherd R., Gardner R. Insertion mutagenesis of cauliflower mosaic virus genome //Gene. 1983. Vol. 25. P. 201-208.

61. Dautel S., Guidasci T., Pique M. et al. The full-length product of cauliflower mosaic vims open reading frame III is associated with the viral particles // Virology. 1994. Vol. 202. P. 1043-1045.

62. Day M.F., Venables D.G The transmission of cauliflower mosaic virus by aphids //Australian J.Biol. Sci. 1961. Vol. 14. P. 187-197.

63. Dixon L., Koenig I., Hohn T. Mutagenesis of cauliflower mosaic virus // Gene. 1983. Vol. 25. P. 189-199.

64. Dominguez D., Hohn T., Schmidt-Puchta W. Cellular proteins bind to multiple sites of the leader region of cauliflower mosaic virus 35S RNA//Virology. 1996. Vol.226. P. 374-383.

65. Drucker M., Froissart R., Hebrard E. et al. Intracellular distribution of virus gene products regulates a complex mechanism of cauliflower mosaic virus acquisition by its aphid vector // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 19. P. 2422-2427.

66. Du Plessis D.H., Wechmar M.B. Detection of cauliflower mosaic virus in leaf extracts, protoplasts and aphids by ELISA // Phytopathol. Z. 1981. Bol. 100. S. 270-278.

67. Ducasse D. A., Mushegian A.R., Sheperd R.J. Gene-I mutants of peanut chlorotic streak virus, a caulimovirus, replicate in plants but, do not move from cell to cell // J. Virol. 1995. Vol. 69. P. 5781-5786.

68. Espinosa A. M., Markham P.G., Maule A.J., Hull R. In vitro biological activity associated with the aphid transmission factor of cauliflower mosaic virus // J. Gen. Virol. 1988. Vol. 69. P. 1819-1830.

69. Franck A., Guilley H., Jonard G. et al. Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA // Cell. 1980. Vol. 21. P. 285-294.

70. Furusawa I., Okuno T. Infection with BMV of mesophyll protoplasts isolated from five plant species // J. Gen. Virol. 1978. Vol. 40. P. 489-491.

71. Futterer Y., Gordon K., Sanfacon H. et al. Positive and negative control of translation by the leader sequence of cauliflower mosaic virus pregenomic 35S RNA//EMBOJ. 1990. Vol. 9. P. 1697-1707.

72. Futterer Y., Kiss-Laszlo Z., Hohn T. Nonlinear ribosome migration on CaMV 35S RNA//Cell. 1993. Vol. 73. P. 789-802.

73. Futterer, J., Bonneville, J., Hohn T. Cauliflower mosaic virus as a gene expression vector for plants//Physiologia Plantarum. 1990. Vol. 79. P. 154-157.

74. Garcia-Arenal F., Fraile A., Malpica J. Variability and genetic structure of plant virus populations //Annu. Rev. Phytopathol. 2001. Vol. 39. P. 157-186.

75. Gardner R., Howarth A., Hahn P. et al. The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by Ml 3mp7 shot gun sequencing / /Nucleic Acids Res. 1981. Vol. 9. P. 2871-2887.

76. Gardner R., Shepherd R. A procedure for rapid isolation and analysis of cauliflower mosaic virus DNA//Virology. 1980. Vol. 106. P. 159-161.

77. Gearge R.A., Converse R.H. Methods for the enrichment of desired B-cell population before anti-cauliflower mosaic virus hybridoma formation // Phytopathology. 1988. Vol. 78. P. 1631-1636.

78. Geri C., Cecchini E., Giannakou M., C. et al. Altered patterns of gene expression in Arabidopsis elicited by cauliflower mosaic virus infection and by a CaMV gene VI transgene // Mol. Plant-Microb. Interactions. 1999. Vol. 12. P. 377-384.

79. Giband M., Mesnard J., Lebeurier G. The gene III product (P15) of cauliflower mosaic virus is a DNA-binding protein while an immunologically related PII polypeptide is associated with virions // EMBO J. 1986. Vol. 5. P. 2433-2438.

80. Giband M., Stoeckel M., Lebeurier G. Use of the immune-gold technique for in situ localization of cauliflower mosaic virus particles and the major protein of the inclusion bodies // J. Virol. Methods. 1984. Vol. 9. P. 277-281.

81. Gnutova R. V., Tolkach V.F. Taxonomy of phytopathogenic viruses identified in the Russian Far East //Arch. Phytopath. Pflanz. 2000. Bd. 33. S. 187-205.

82. Gnutova R.V., Tolkach V.F., Bogunov Yu.V. Criteria for identification of cauliflower mosaic virus's of the Far Eastern strains // Plant Protect. 2002. Vol. 38. P. 258-260.

83. Goldberg K., Kiernan J., Shepherd R. A didease syndrome associated with expression of gene-VI of caulimoviruses may be a nonhost reaction // Mol. Plant Microbe Interaction. 1991. Vol. 4. P. 182-189.

84. Gong Z.X., Wu H., Cheng R.H., Hull R., Rossmann M. G. Crystallization of cauliflower mosaic virus // Agronomie. 1990. Vol. 10. P. 749-758.

85. Gracia O., Shepherd R. Cauliflower mosaic virus in the nucleus of Nicotiana // Virology. 1985. Vol. 146. P. 141-145.

86. Hagen T.J., D.B.Taylor, R.Meagher. Rocket Immunoelectrophoresis assay for cauliflower mosaic virus // Phytopathology. 1982. Vol. 72. P. 239-242.

87. Hahn P., Shepherd R.J. Evidence for a 58-kilodalton polypeptide as precursor of the coat protein of cauliflower mosaic virus // Virology. 1982. Vol. 116. P. 480-488.

88. Hardwick N.V., Davies J.L., Wright D.M. The incidence of 3 virus diseases of winter oilseed rape in England and Wales in the 1991/92 and 1992/93 growing seasons // Plant Pathol. 1994. Vol. 43. P. 1045-1049.

89. Harker C.L., Woolston C.J., Markham P.G., Maule A.J. Cauliflower mosaic virus aphid transmission factor protein is expressed in cells infected with some aphid nontransmissible isolates // Virology. 1987. Vol. 160. P. 252-254.

90. Hemmings-Mieszczak M., Steger G., Hohn T. Regulation of CaMV 35S RNAtranslation is mediated by a stable hairpin in the leader // RNA-Publ. RNA Soc. 1998. Vol. 4. P. 101-111.

91. Hepp R.F., Converse R.H. Blueberry red ringspot virus is serologically related to cauliflower mosaic virus // Phytopathology. 1987. Vol. 77. P. 1239-1239.

92. Himmelbach A., Chapdelaine J., Hohn T. Interaction between cauliflower mosaic virus inclusion body protein and capsid protein: implycations for viral assembly //Virology. 1996. Vol. 217. P. 147-157.m

93. Hohn T., Richards K., Lebeurier G. Cauliflower mosaic virus on its way to becoming a useful plant vector // Current Topics in Microbiology and Immunology. 1982. Vol. 96. P. 193-236.

94. Horvath J., Besada W., Juretic N., Mamula D. Some data on properties of cauliflower mosaic virus in Hungary // Tagungsbericht. Berlin Akad. der Landwirtschaftswissenschaften der DDR. 1980. Bd. 184. S. 53-60.

95. Howarth A., Gargner R., Messing J., Shepherd R. Nucleotide sequence of ^ naturally occurring deletion mutants of cauliflower mosaic virus // Virology. 1981.1. Vol. 112. P. 678-685.

96. Howell S., Hull R. Expression of virus genome in plant protoplast infected with cauliflower mosaic virus and its DNA // Plant Physiol. 1977. Vol. 59. P. 105-106.

97. Howell S.H., Hull R. Replication of cauliflower mosaic virus and transcription of its genome in Turnip leaf protoplasts // Virology. 1978. Vol. 86. R 468-481.

98. Hull R. Structure of cauliflower mosaic virus genome III. Restriction endonuclease mapping of thirty-three isolates // Virology. 1980. Vol. 100. P. 76-90.

99. Hull R., Covey S. Structure and replication of caulimovirus genomes // J. Cell Science. 1987. Vol. 7. P. 213-229.

100. Hull R., Howell S.H. Structure of the cauliflower mosaic virus genome. II. Variation in DNA structure and sequence between isolates // Virology. 1978. Vol. 86. P. 482-493.

101. Hull R., Shepherd R.J., Harvey J.D. Cauliflower mosaic virus: an improved purification procedure and some properties of the virus particles // J. Gen. Virol. 1976. Vol. 31. P. 93-100.

102. Hull R., Shepherd R.J. The coat proteins of cauliflower mosaic virus // Virology. 1976. Vol. 70.217-220.

103. Hussain M., Melcher U., Essenberg R. Infection of vacuolated turnip protoplasts with liposome-packaged cauliflower mosaic virus // Plant Cell Reports. 1985. Vol. 4. P. 58-62.

104. Jacquot E., Geldreich A., Keller M., Yot P. Mapping regions of the cauliflower mosaic virus ORF III product required for infectivity // Virology. 1998. Vol. 242. P. 395-402.

105. Karsies A., Merkle T., Szurek B. et al. Regulated nuclear targeting of cauliflower mosaic virus//J. Gen. Virol. 2002. Vol. 83. P. 1783-1790.

106. Kasteel, D.T., Perbal, M.C., Boyer, J.C. et al. The movement proteins of cowpea mosaic virus and cauliflower mosaic virus induce tubular structures in plant and insect cells//J. Gen. Virol. 1996. Vol. 77. P. 2857-2864.

107. Keinonen-Mettala K., Papinen A., Weissenberg K. Comparisons of the efficiency of some promoters in silver birch (Betula pendula) // Plant Cell Reports. 1998. Vol. 17. P. 356-361.

108. Kelly D.C., Cooper J., Walker D.G.A. Cauliflower mosaic virus proteins // Microbios. 1974. Vol. 10. P. 239-245.

109. Kennedy J.S., Day M.F., Eastop V.F. A conspectus of aphids as vectors ofplant viruses / In: Comminwealth Inst, of Entomology, 1962. P. 38-51.

110. Kiraly L., Cole A., Bourque J., Schoelz J. Systemic cell death is elicited by the interaction of a single gene in Nicitiana clevelandii and gene VI of cauliflower mosaic virus // Mol. Plant-Microb. Interactions. 1999. Vol. 12. P. 919-925.

111. Kiss-Laszlo Z., Blanc S., Hohn T. Splicing of cauliflower mosaic virus 35S RNA is essential for viral infectivity//EMBO J. 1995. Vol. 14. P. 3552-3562.

112. Kobayashi K., Nakayashiki H., Tsuge S., Mise K., Furusawa I. Accumulation kinetics of viral gene products in cauliflower mosaic virus-infected turnip protoplasts // Microbiology and Immunology. 1998. Vol. 42. P. 65-69.

113. Kruse J., Timmins P., Witz J. The spherically averaged structure of a DNA isometric plant virus cauliflower mosaic virus // Virology. 1987. Vol. 159. P. 166-168.

114. Lawson R.H., Civerolo E.L. Carnation etched ring virus: purification, stability of inclusions, and properties of the nucleic acid. // Phytopathology. 1978. Vol. 68. P. 181-188.

115. Lebeurier G., Hirph V., Hohn T., Hohn B. Infectivities of native and cloned DNA of cauliflower mosaic virus //Gene. 1980. Vol. 12. P. 139-146.

116. Leclerc D., Chadelaine Y., Hohn T. Nuclear targeting of the cauliflower mosaic virus coat protein //J. Virology. 1999. Vol. 73. P. 553-560.

117. Leh V., JacquotE., Geldreich A. et al. Aphid transmission of cauliflower mosaic virus requires the viral PIII protein // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 7077-7085.

118. Leh V., Yot P., Keller M. The cauliflower mosaic virus translational transactivator interacts with the 60S ribosomal subunit protein LI8 of Arabidopsis thaliana // Virology. 2000. Vol. 266. P. 1-7.

119. Liang Ji. Cauliflower mosaic virus (Caulimovirus) // Plant viruses in Azia. 1998. Gadjah Mada University Press. Indonesia. P. 51-53.

120. Lin H., Rubio L., Smythe A. et al. Genetic diversity and biological variationamong California isolates of cucumber mosaic virus // J. Gen. Virol. 2003. Vol. 84. P. 249-258.

121. Lung M.S., Pirone T.P. Studies on the reason for differential transmissibility of cauliflower mosaic virus-isolates by aphids // Phytopathology. 1973. Vol. 63. P. 910-914.

122. Lung M.S., Pirone T.P. Acquisition factor required for aphid transmission of purified cauliflower mosaic virus // Virology. 1974. Vol. 60. P. 260-264.

123. Maiti I., Shepherd R. Isolation and expression analysis of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCIS V) full-length transcript (FLt) promoter in transgenic plants / / Biochem. Biophys. Res. Commum. 1998. Vol. 244. P. 440-444.

124. Markham P.G., Pinner M.S., Raccah B., Hull R. The acquisition of caulimovirus by different aphid species//Ann. Appl. Biol. 1987.№ 111. P. 571-587.

125. Marsh L., Kuzj A. Identification and characterization of cauliflower mosaic virus replication complexes analogy to hepatitis-B viruses // Virology. 1985. Vol. 143. P. 212-223.

126. Martelli G.P., Castellano M.A. Light and electron microscopy of the intracellular inclusions of cauliflower mosaic virus // J. Gen. Virol. 1971. Vol. 13. P. 133-140.

127. Martinez-Izquierdo J.A., Futterer J., Hohn I. Protein encoded by ORF I of cauliflower mosaic virus is port of the viral inclusion body // Virology. 1987. Vol. 160. P. 527-530.

128. Maule A J. Infection of protoplasts from several Brassica species with cauliflower mosaic virus following inoculation using polyethylene-glycol II J. Gen. Virol. 1983. Vol. 64. P. 2655-2660.

129. Maule A.J., Harker C.L., Wilson I.G. The pattern of accumulation of cauliflower mosaic virus-specific products in infected turnips // Virology. 1989. Vol. 169. P. 436-446.

130. Meagner R., Shepherd R., Boyer H. A Restriction endonuclease map of cauliflower mosaic virus DNA// Virology. 1977. Vol. 80. P. 362-375.

131. Melcher U. Symptoms of cauliflower mosaic virus infection in Arabidopsis thaliana and turnip//Botanical gazette. 1989. Vol. 150. P. 139-147.

132. Melcher U., Choe I., Lebeurier G. et al. Selective allele loss and interferencebetween cauliflower mosaic virus DNAs // Mol. Gen. Genet. 1986. Vol. 203. P. 230-236.

133. Melcher U., Hein R., Gardner C. et al. An inderect radioimmunoassay of cauliflower mosaic virus // Phytopathology. 1980. Vol. 70. P. 954-957.

134. Melnychuk M.D., Dubin A.V., Spyrydonov V.G., Melnychuk S.D. Detection and identification of the transgenes in the genetically modified plants on the example of Bt-potatp // Microbiol. J. 2002. Vol. 64. P. 26-32.

135. Menissier J, Hunting D.J., Murcia G. Electron microscopic mapping of single-stranded discontinuities in cauliflower mosaic virus DNA by means of the biotin-avidin technique//Anal. Biochemistry. 1985. Vol. 148.339-343.

136. Menissier J., Demurcia G., Lebeurier G., Hirth L. Electron-microscopic studies of the different topological forms of the cauliflower mosaic virus DNA Knotted encapsidated DNA and nuclear minichromosome // EMBO J. 1983. Vol. 2. P. 1067-1071.

137. Mesnard J., Carriere C. Comparison of packaging strategy in Retroviruses and Pararetroviruses//Virology. 1995. Vol. 213. P. 1-6.

138. Mesnard J., Mougeot J. Geldreich A., Lebeurier G. Characterization of different electrophoretic forms of cauliflower mosaic virus virions (strain Cabb-S) // Biochimie. 1993. Vol. 75. P. 645-649.

139. Mevel S., Kerlan C. Biological properties of different isolates of cauliflower mosaic virus. 1. Solanaceous hosts //Agronomie. 1990. Vol. 10. P. 749-752.

140. Morris T.J., Mullian R.H., Schlegel D.E. et al. Isolation of caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vein banding virus // Phytopathology. 1980. Vol. 70. P. 156-160.

141. Mougeot J., Guidasch T., Wurch T. et al. Identification of C-terminal amino acid residues of cauliflower mosaic virus open reading frame III protein responsible for its DNA binding activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 1470-1473.

142. Mraz I., Petrzik K., Franova-Honetslegrova J. Detection of strawberry vein banding virus by polymerase chain reaction and dot blot hybridization // Acta Virologica. 1997. Vol. 41. P. 241-242.

143. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

144. Mushegian A., Shepherd R. Genetic elements of plant-viruses as tools for genetic engineering//Microbiologicol Reviews. 1995. Vol. 59. P. 548-569.

145. Namba R., Sylvester E. Transmission of cauliflower mosaic virus by the green peach, turnip, cabbage, and pea aphids (Homoptera, aphididae) // J. Econ. Entomol. 1981. Vol. 74. P. 546-551.

146. Natti J.J. Influense of cauliflower mosaic and turnip mosaic viruses on yields of cabbage in New York state // Plant Dis. Rep. 1956. Vol. 40. P. 591-595.

147. Odell J.T., Dudley R.K., Howell S.H. Structure of the 19S RNA transcript encoded by the cauliflower mosaic virus genome // Virology. 1981. Vol. 111. P. 377-385.

148. Olszewski N., Guilfoyle T. Nuclei purified from cauliflower mosaic virus infected turnip leaves contain subgenomic, covalently closed circular cauliflower mosaic virus DNAs//Nucl. Acids Res. 1983. Vol. 11. P. 8901-8914.

149. Olszewski N., Hagen G., Guilfoyle T. A transcriptionally active, covalently closed minichromosome of cauliflower mosaic virus // Cell. 1982. Vol. 29. P. 395-402.

150. Palanichelvan K., Schoelz J. A comparative analysis of the avirulence and translational transactivator functions of gene VI of cauliflower mosaic virus // Virology. 2002. Vol. 293. P. 225-233.

151. Pauk J., Stefanov I., Fekete S. et al. A study of different (CaMV 35S and MAS) promotor activities and rish assessment of field use in transgenic rapeseed plants //Euphytica. 1995. Vol. 85. P. 411-416.

152. Petrzik K., Benes V., Mraz I. et al. Carnation etched ring virus definitive member of the genes caulimovirus //Virus genes. 1998. Vol. 16. P. 303-305.

153. Pfeiffer P., Hohn T. Involvement of reverse transcription in the replication of cauliflower mosaic virus: a detailed model and test of some aspects // Cell. 1983. Vol. 33. P. 781-789.

154. Pfeiffer P., Mesnard J.M. The interplay of host and virus genes in the specificityand pathogenicity of cauliflower mosaic virus // Pathogenesis and host specificity in plant diseases. Oxford. Elsevier. 1995. Vol. III. P. 269-288.

155. Pirone T.P., Blanc S. Helper-dependent vector transmission of plant viruses // Annu. Rev. Phytol. 1996. Vol. 34. P. 227-247.

156. Pirone T.P., Pound G.S., Shepherd R.J. Properties and serology of purified cauliflower mosaic virus // Phytopathology. 1961. Vol. 51. P. 541 -546.

157. Pooggin M., Futterer J., Skryabin K., Hohn T. A short open reading frame terminating in front of a stable hairpin is the conserved feature in pregenomic RNA leaders of plant pararetroviruses // J. Gen. Virol. 1999. Vol. 80. P. 2217-2228.

158. Qiu S.; Schoelz J. Three regions of cauliflower mosaic virus strain W260 are involve in systemic infection of solanaceous hosts // Virology. 1992. Vol. 190. P. 773-782.

159. Qiu S., Wintermantel W.; Sha Y., Schoelz J. Light-dependent systemic infection of solanaceous species by cauliflower mosaic virus can be conditioned by viral gene encoding an aphid transmission factor // Virology. 1997. Vol. 227. P. 180-189.

160. Raybould A.F., Maskell L.C., Edwards M.L. et al. The prevalence and spatial distribution of viruses in natural populations of Brassica oleracea // New Phytologist. 1999. Vol. 141. P. 265-275.

161. Richins R.D., Shepherd R. J. Physical maps of the genomes of dahlia mosaic virus and mirabilis mosaic virus two members of the caulimovirus group // Virology. 1983. Vol. 124. P. 208-214.

162. Riederer M., Grimsley N., Hohn B., Jiricny J. The mode of cauliflower mosaic virus propagation in the plant allows rapid amplification of viable mutant strains // J. Gen. Vorol. 1992. Vol. 73. P. 1449-1456.

163. Rollo F., Covey S. Cauliflower mosaic virus DN A persists as supercoiled forms in cultured turnip cells // J. Gen. Virol. 1985. Vol. 66. P. 603-608.

164. Rothnie H., Chapdelaine Y., Hohn T. Pararetroviruses and retroviruses: a comparative review of viral structure and gene expression strategies // Adv. Virus Res. 1994. Vol. 44. P. 1-67.

165. Rubio-Huertos M., Matsui C., Yamaguchi A., Kamei T. Electron microscopy of X-body formation in cells of cabbage infected with Brassica virus 3 // Phytopathology. 1968. Vol. 58. P. 548-549.

166. Russell G.J., Follett E.A.C., Subak-Sharpe J.H., Harrison B.D. The double-stranded DNA of cauliflower mosaic virus // J. Gen Virol. 1971. Vol. 11. P. 129-138.

167. Ryabova L., Pooggin M., Domínguez D., Hohn T. Continuous and discontinuous ribosome scanning on the cauliflower mosaic virus 35S RNA leader is controlled by short open reading frames // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 24. P. 37278-37284.

168. Rychlik W., Spencer W., Rhoads R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro //Nucl. Acids Res. 1989. Vol. 18. P. 6409-6412.

169. Salmanian A., Gushchin A., Medvedeva T. et al. Synthesis and expression of tee gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants // Biotechnol. Lett. 1996. Vol. 18. P. 1095-1098.

170. Sanger M., Daubert S., Goodman R.M. The regions of sequence variation in caulimovirus geneVI //Virology. 1991. Vol. 182. P. 830-834.

171. Saunders K., Lucy A.P., Covey S.N. Susceptibility of Brassica species to cauliflower mosaic virus infection is related to a specific stage in the virus multiplication cycle//J. Gen Virol. 1990. Vol. 71. P. 1641-1647.

172. Schoelz J.E., Shepherd R.J. Host range control of cauliflower mosaic virus // Virology. 1988. Vol. 162. P. 30-37.

173. Schoelz J.E., Shepherd R.J., Daubert S. Region VI of cauliflower mosaic virus encodes a host range determinant // Mol. Cell Biol. 1986. Vol. 6. P. 2632-2637.

174. Schoelz J.E., Shepherd R.J., Richins R.D. Properties of unusual strain of cauliflower mosaic virus // Phytopathology. 1986. Vol. 76. P. 451-454.

175. Scholthof H., Wu F., Kiernan J., Shepherd R. The putative zing finger of a caulimovirus is essential for infectivity but does not influence gene expression / /J. Gen. Virol. 1993. Vol. 74. P. 775-780.

176. Schroeder H., Schotz A., Wardleyrichardson T. et al. Transformation and regeneration of 2 cultivars of rea (Pisum sativum L) // Plant Physiol. 1993. Vol. 101. P. 751-757.

177. Schultz E.S. A trasmissible mosaic disease of Chinese cabbage, mustard and turnip // J. agric. Res. 1921. Vol. 22. P. 173-177.

178. Shepherd R.J. Cauliflower mosaic virus // C.M.I./A.A.B. 1970. № 24. 3 p.

179. Shepherd R.J. DNA viruses of higher plants. P. 305-339 in: Laufler M.A. et al. Adv. Virus Res. 1976. Vol. 20. Ac. Press. New York.

180. Shepherd R.J., Bruening G.E., Wakeman R.J. Double-stranded DNA from cauliflower mosaic virus // Virology. 1970. Vol. 41. P. 339-347.

181. Shepherd R.J., Richings R., ShallaT.A. Isolation and properties of the inclusion bodies of cauliflower mosaic virus //Virology. 1980. Vol. 102. P. 389-400.

182. Shepherd R.J., Wakeman R.J. Observation on the size and morphology of cauliflower mosaic virus//Phytopathology. 1971. Vol. 61. P. 188-193.

183. Shepherd R.J., Wakeman R.J., Romanko R.R. DNA in cauliflower mosaic virus //Virology. 1968. Vol. 36. P. 150-153.

184. Shewmaker C., Caton J., Houck C., Gardner C. Transcription of cauliflower mosaic virus integrated into plant genomes // Virology. 1985. Vol. 140. P. 281-288.

185. Shukla D.D., Schmelzer K. Studies on viruses and virus diseases of cruciferous plants. VII. Occurrence and effects of cabbage black ring and cauliflower mosaic viruses on brassica crops // Acta Phytopathol. Acad. Sci. Hung. 1972. Vol. 7. P. 325-342.

186. Sinilkumar G., Mohr L., Lopata-Finch E. et al. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promotor in cotton as revealed by GFP // Plant Mol. Biol. 2002. Vol. 50. P. 463-474.

187. Sohal A., Love A., Cecchini E. et al. Cauliflower mosaic virus infection stimulates lipid transfer protein gene expression in Arabidopsis // J. Experimental Botany. 1999. Vol. 50. P. 1727-1733.

188. Staar G. Blumenkohlvirosen // Deutsche Akad. Landwirtschaftswiss. Tagungsber. 1962. Bol. 51. S. 45-51.

189. Sun L., Cai H., Xu W., Hu Y., Lin Z. CaMV 35S promoter directs beta-glucuronidase expression in Ganoderma lucidum and Pleurotus citrinopileatus / / Mol. Biotechnol. 2002. Vol. 20. P. 239-244.

190. Tezuka N., Taniguchi T. Stepwise degradation of cauliflower mosaic virus by pronase // Virology. 1972. Vol. 47. P. 142-146.

191. Thomas C., Maule A. Identification of structural domains within the cauliflower mosaic virus movement protein by scanning deletion mutagenesis and epitope tagging//Plant Cell. 1995. Vol. 7. P. 561-572.

192. Thomas C., Perbal C, Maule, A. A mutation of cauliflower mosaic virus gene I interferes with virus movement but not virus replication // Virology. 1993. Vol. 192. P. 415-421.

193. Tolkach V.F., Gnutova R.V. The new for South Far East Russia of Caulimoviruses: cauliflower mosaic and dahlia mosaic / Abstr. VH-th Intern. Symp. "Plant virus Epidemiology". Germany. Aschersleben. 2002. P. 123.

194. Tomaru K. Cauliflower mosaic virus (Caulimovirus) // Plant viruses in Azia. 1998. Gadjah Mada University Press. Indonesia. P. 501-503.

195. Tomlinson J.A., Shepherd R.J., Walker J.C. Purification, properties and serology of cucumber mosaic virus // Phytopatology. 1959. Vol. 49. P. 293-299.

196. Tomlinson J. A., Walker V.M. Further studies on seed transmission in the ecology of some aphidtransmitted viruses //Ann. Appl. Biol. 1973. Vol. 73. P. 293-298.

197. Torruella M., Gordon K., Hohn T. Cauliflower mosaic virus produces an aspartic proteinase to cleave its polyproteins // EMBO J. 1989. Vol. 8. P. 2819-2825

198. Tsuge S., Kobayashi K., Nakayachiki H. et al. Cauliflower mosaic virus ORF III product forms a tetramer on planta: its implication in viral DNA folding during encapsidation // Microbiology and Immunology. 1999. Vol. 43. P. 773-780.

199. Turner D., McCallum D., Covey S. Roles of the 35S promoter and multiple overlapping domains in the pathogenicity of the pararetrovirus cauliflower mosaicvirus // J. Virol. 1996. Vol. 70. P. 4514-4521.

200. Vaden V., Melcher U. Recombination sites in cauliflower mosaic virus DNAs: implications for mechanisms of recombination // Virology. 1990. Vol. 177. P. 717-726.

201. Van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. Virus taxonomy. (7-th rep. of the Intern. Com. on Taxonomy of Viruses). San Diego: Acad. Press, 2000. 1121 p.

202. Volovitch M., Drufeon G., Yot P. Studies on the single-strended discontinuities of the cauliflower mosaic virus genome // Nucleic Acids Res. 1978. Vol. 5. P. 2913-2925.

203. Volovitch M., Modjtahedi N., Chouikh Y., Yot P. Conserved and non-conserved restriction sites are interspersed in the DNA of cauliflower mosaic virus // Biochemistry International. 1981. Vol. 3. P. 225-232.

204. Walker J.C., Lebeau F.J., Pound G.S. Viruses associated with cabbage mosaic // J. Agr. Res. 1945. Vol. 70. P. 379-404.

205. Woolston C.J., Covey S.N., Penswick J.R., Davies J.W. Aphid transmission and a polypeptide are specified by a defined region of the cauliflower mosaic virus//Gene. 1983. Vol. 23. P. 15-23.

206. Woolston C.J., Czaplewsku L.G., Marham P.G. et al. Location and sequence of a region of cauliflower mosaic virus gene II responsible for aphid transmissibility //Virology. 1987. Vol. 160. P. 246-251.

207. Xiong C., Balazs E., Lebeurier G. et al. Comparative cytology of 2 isolates of cauliflower mosaic virus // J. Gen. Virol. 1982. Vol. 61. P. 75-81.

208. Yamaoka N., Furusawa I., Yamamoto M. Infection of turnip protoplasts with cauliflower mosaic virus DNA//Virology. 1982. Vol. 122. P. 503-505.

209. Yamaoka N., Morita T., Furusawa I., Yamamoto M. Effect of temperature on the multiplication of cauliflower mosaic virus // J. Gen. Virol. 1982. Vol. 61. P. 283-287.

210. Young M.J., Daubert S.D., Shephert R.J. Gene I products of cauliflower mosaic virus detected in extracts of infected tissue // Virology. 1987. Vol. 158. P. 444-446.

211. Zhang X.S., Melcher U. Competition between isolates and variants of cauliflower mosaic virus in infected turnip plants // J. Gen. Virol. 1989. Vol. 70. P. 3427-3437.

212. Zijlstra C., Scharer-Hemandez N., Gal S., Hohn T. Arabidopsis thaliana expressing the cauliflower mosaic virus ORF VI transgene has a late flowering phenotype / /Virus genes. 1996. Vol. 13. P. 5-17.