Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и некоторые биохимические особенности рекомбинантного белка р55

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и некоторые биохимические особенности рекомбинантного белка р55"

Р Г Б ОД 1 I ДЕК 199^

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ФАРХУТДИНОВ Мансур Раульевич

УДК 577.96:547.96:576.8.077.3

ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА р55

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа - 1994

Работа выполнена в лаборатории биохимии института И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат", на кафедре биохимии Башкир< Государственного Медицинского института и в Республиканском ц< по профилактике и борьбе со СПИДом (г.Уфа)

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Э.Г.Давлетов; доктор биологических наук ; профессор Т.Г.Нигматуллйн

Официальные оппоненты: академик ДНБ, доктор биологических

профессор В.А.Вахитов; доктор медицинских наук, профессор Ф.Н.Гилькиярова.

Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет

„7СО

Защита диссертации состоится " ......

на заседании специализированного совета К 084.35.02 по зг диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских при Башкирском государственном медицинском институте (450000, ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан." В ш 1994 Г.

Ученый секретарь специализированного совета д.м.н.,' профессор

Э.Г.Давлетс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) был впервые обнаружен в 1981 г. (Gallo, 1981) как необъяснимое прогрессирующее поражение иммунной системы, ассоциированное с развитием оппортунистических инфекций и саркомы Капоши. В 1983 г. был открыт ретровирус, являющийся этиологическим агентом заболевания (Gotlib е.а., 1981). Вирусом преимущественно поражается Т4 лимфоциты человека (так называемые "клетки-помощники" и индукторы, имеющие СД-4 антиген на своей поверхности), без которых не может развиться эффективный иммунный ответ против большинства антигенов.

Результатом инфицирования является уменьшение количества и нарушение функций атакованных Т4 лимфоцитов и как конечный этап -поражение иммунной системы и развитие синдрома приобретенного иммунодефицита.

Способность к продуктивной инфекции в человеческих клетках у различных изолятов ВИЧ неодинакова, что свидетельствует о высокой генотипической изменчивости ВИЧ при пассировании его в клеточных культурах и особенно при репликации в организме человека в процессе естественной циркуляции. Единичные и групповые мутации регистрируют в разных участках вирусного генома. Естествено, что высокая генотипическая изменчивость ВИЧ проявляется в изменении свойств белков вируса. Следовательно, иммунологические свойства белков ВИЧ являются существенными для проведения и оценки результатов диагностики.

Для обнаружения инфицированности ВИЧ большое значение имеет выявление антител к внутренним белкам вируса р17, р24, предшественнику р55, а также к оболочечным гликопротеидам др120, др41 и предшественнику gpl60 (J. Gaidsmit е.а., 1987).

Поскольку получение антигенов для тест-систем путем культивирования ВИЧ биологически' опасно (Хаитов Р. М., 1988), проводятся работы по получению отдельных белков вируса или их блоков с помощью методов биотехнологии с экспрессией в про- или эукариотических клетках (Crowl е.а., 1985). Это позволяет получать антигены ВИЧ практически в неограниченном количестве, причем белки, полученные этими способами, обладают свойствами природных белков и безопасны в работе.

Появление определяемых в сыворотке крови антител может наблюдаться на протяжении от одной недели до нескольких месяцев после инфицирования, что уменьшает возможности серологических тестов для раннего выявления инфицированности. Несмотря на очевидные преимущества иммунологических методов - простоту, высокую чувствительность, они имеют существенный недостаток, связанный с наличием перекрестных реакций нормальных сывороток с белками ВИЧ (Huttall е.а., 1986).

При помощи ДНК-гибридизационного метода нуклеотидная последовательность ВИЧ-1 может определяться в лимфоцитах или тканях (лимфатических узлах, печени, плаценте и т. д.) только у части инфицированных (Shaw е.а., 1984). Harper и соавторы (1986) с помощью данного метода показали, что только в одной из 100000 клеток лимфатических узлов инфицированных людей содержится вирусная последовательность нуклеотидов.

Поэтону в последнее время для увеличения количества необходимой последовательности нуклеотидов стали использовать метод ферментативной амплификации или цепной полимеразной реакции (ПЦР) (Erlich е.а., 1989). Показано, что метод ПЦР для определения ВИЧ РНК в 100000 раз более чувствителен, чем детекция неамплифицированного материала блот-гибридизации згР-мечеными пробами (Byrne е.а., 1988).

В связи с вышеизложенным перед нами была поставлена задача получения рекомбинантного белка вируса иммунодефицита и изучения его некоторых биохимических и иммунологических особенностей.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы -получение рекомбинантного предшественника внутренних белков ВИЧ-1, изучение его физико-химических и иммунологических особенностей, а также возможности использования в инмунохимической диагностике инфицированности ВИЧ-1.

Задачи исследования :

1. Выделить зараженные лимфоциты; провести химико-ферментативный синтез генов, кодирующих внутренние белки ВИЧ-1 с использованием провируса в качестве матрицы.

2. Клонировать синтезированные гены для получения рекомбинантных белков.

3. Исследовать структуру и физико-химические свойства рекомбинантных белков.

4. Изучить иммунологические свойства рекомбинантных белков и возможности их использования для выявления антител к ВИЧ-1.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получена реком&инантная плазмида pGSgag, содержащая гибридный ген, фланкированный вирусными последовательностями. В конструкции находится промотор осповакцины, литированный в соответствующей ориентации с кодирующей частью чужеродного гена.

Получены штаммы-продуценты осповакцины, синтезирующие протеин-предшественник р55-внутренних вирионных белков р17, р24 и р12. Рекомбинантный белок имеет молекулярную массу 55 килодальтон. Она соответствует ожидаемой молекулярной массе полипептида, несущего последовательности р17, р24 и р12.

Показано, что максимальный уровень синтеза рекомбинантных белков отмечается через 36 часов после инфекции.

Обнаружена Ш2-модификация рекомбинантного белка миристиловой кислотой.

При электронно-микроскопическом исследовании клеток, инфицированных рекомбинантной осповакцююй определялись круглые частицы с диаметром 100-150 нм. Частицы определялись как в клетках, инфицированных реконбинантным вирусом, так и в материале, полученном при градиентном центрифугировании.

Рекомбинантный белок использовали для исследования сывороток крови нетодом дот-блоттинга и иммуноблоттинга. В опыте были выявлены все сыворотки, содержащие антитела к внутренним белкам ВИЧ-1. При этом не наблюдалось ложнопозитивных реакций с сыворотками крови здоровых доноров.

Апробация работы. Материалы работы доложены на IV Республиканской научно-практической конференции с участием зарубежных ученых (США) "Лечение внутри- и околосуставных повреждений. Медицина катастроф" (Уфа, 1991), 56-й итоговой научной конференции молодых ученых БГМИ (Уфа, 1991), на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991) и на заседании Уфимского отделения Российского биохимического общества (Уфа, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 3 страницах машинописи, содержит 7 С/ рисунков, <у таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, , выводов и списка литературы ( £2. отечественных и

иностранных источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Плазмидную ДНК выделяли по методу Бирнбойма и Доли (1980). Меченые згР препараты ДНК получали, применяя модификации стандартных методов (Rigby е.а., 1977; Donnis-Keller е.а., 1977).

Обработку рестриктазами, электрофоретическое фракционирование, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию с зондами, а также клонирование проводили по Маниатису и соавт. (Maniatis е.а., 1982).

Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК проводили по методу Максама-Гилберта (Maxam S Gilbert, 1977).

Трансформации клеток E.Coli лигазной смесью или плазмидной ДНК проводили по методу Hersbfeld V.(1974).

Гибридизацию колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, проводили по методу Cami В.(1978).

Гель-электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) с некоторыми модификациями.

Очистку продуктов гена gag осуществляли путем аффинной хроматографии на колонке с ковалентно-связанным человеческим IgG, выделенным из сыворотки инфицированного человека. Выделение и иммобилизацию человеческого IgG на сефарозе осуществляли по известной схеме (Остернан Л. А., 1985).

Выделение белка р55 проводили из культуральной среды и лизата клеток.

Выделение лимфоцитов из крови инфицированного больного проводили, используя градиент фиколла-верографина.

Цепную полимеразную реакцию проводили с использованием праймеров 1-2, 3-4 в буфере для амплификации.

Для проведения техники трансфекции применяли методику, предложенную Гловеррм (1988).

Нами была изучена интенсивность включения миристиловой кислоты и радиоактивного фрсфора 32Р в рекомбирантный белок. Уровень синтеза дад-белка и его имхунохинические свойства изучали при помощи ИФА, дотблоттинга и иммуноблоттинга.

- б -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Химико-ферментативный синтез гена рекомбинантного внутреннего белка р5Ь. —_———-—-—-———————————-———————

Первый этап работы был посвящен получению последовательности gag гена с использованием метода цепной полимеразной активности, клонированию в векторной плазмиде pGS20 для получения рекоибинантного вируса осповакцины, обеспечивающего синтез рекокбинантных белков в эукариотических клетках.

В своих исследованиях при применении метода ПЦР для амплификации ВИЧ мы учитывали экстенсивную гетерогенность вирусного генома (Chiu е.а., 1985). В связи с тем, что несоответствия последовательностей вирусного генома и праймеров существенно влияют на течение и результаты ПЦР, для амплификации использовали олигонуклеотиды, соответствующие началу и концу дад-области ВИЧ-1, а также высококонсервативные участки дад-гена. В выборе праймеров играли также роль длина, присутствие G-C пар, самокомплементарность (Табл. 1).

Таблица 1. Праймеры, использованные в цепной полимеразной реакции.

Н N I.Нуклеотидная последовательность праймеров п/п I

1.

2.

3.

4.

5'-CCATGGGTGGGAGAGGGTCAGT-3• 5'-CCGTTGCTGGGGACGAGTGTTATTTACT-3' 51-CCAAAAGAACCTTTTAGAGACTATGTAGAC-3' 5'-CTGATACATCTGGCCAAGATATTTTGA-3•

В качестве негативного контроля использовали плаэмидную ДН рОС19 и ДНК, выделенную из линфоцитов здоровых людей.

Эксперименты проводились на ДНК, полученной из лимфоцито периферической крови инфицированных людей. Проводили 30 циклов После завершения последнего цикла амплификации образцы помещали лед. Акплифицированную последовательность фракционировали в 1 агарозном геле, после окраски бромистым этидием соответствующи полосы вырезали и элюировали фрагменты. 1/4 часть полученног материала метили радиоактивными трифосфатами методом ник-трансляци и использовали в дот-гибридизации с рестрицированной ДНК плазмид рВНЮ (рис. 1).

& 3

Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения амплифицированной последовательности.

1 - амплифицированная последовательность дад-области ВИЧ-1;

2 - негативный контроль?

3 - позитивный контроль.

На уровне, соответствующем положению последовательности дад-гена, определялась при авторадиографии четкая полоса, свидетельствующая о комплементарности амплифицированного материала. 1/4 часть материала использовали для клонирования в векторную плазмиду рОС19, и рСЭ20. Для этого плазмиду рис19 рестрицировали по ВашН1 сайту, добавляли амплифицированный материал, все трифосфаты и достраивали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы до получения "тупых" концов. Трансформационную смесь высевали на чашки с ЬВ-агаром и подращивали в течении ночи. С чашек, содержащих колонии, получали отпечатки на нитроцеллюлозные фильтры, которые гибридизовали с меченными олигонуклеотидаки (рис. 2).

Рис. 2. Авторадиограмма клонов, гибридизующихся с мечеными нуклеотидами.

После совмещения авторадиограммы с колониями на фильтр отмечали положения гибридизующихся клонов. Таким образок, был отобрано 25 клонов, содержащих последовательность гена gag.

Трансфекция клеток CV-1 рекомбинантными плазмидами. Дл проведения техники трансфекции применяли методику, предложенн) Гловером (1988), используя рекомбинантную пяазниду, несупо последовательность гена "gag", под контролем раннего промотор вируса осповакцины. Экзогенную ДНК вводили за счет гомологично рекомбинации in vivo в культуру клеток, получая кальций-фосфатны преципитат рекомбинантной плазмиды.

В работе были использованы штамм WK вируса осповакцины культура клеток почки зеленой мартышки CV-1. Культуру клеток CV-заражали вирусом осповакцины с множественностью 0,05 БОЕ на клетку Через 2 часа после инфицирования клеток вирусный инокулят удаляли дважды промывали монослой средой, не содержащей сыворотки, и вносил кальций-фосфатный преципитат.

Селекция рекомбинантных вирусов. После трансфекции инфицированных вирусом дикого типа клеток CV-1 рекомбинантным вектором, содержащим последовательности гена ВИЧ-1 "gag", вирусы осповакцины, в которых произошла гомологичная рекомбинация в последовательности гена tk, приобрели tk-фенотип, что позволило в дальнейшем производить отбор рекомбинантных вирусов по фенотипу ТК-на ТК-клетках RAT-2 в присутствии 5-бромдезоксиуридина (Serva, США). Через 20 часов инкубации при 37° С и 5% С02 вирусные бляшки, визуально проявившиеся как прозрачные зоны в окрашенном монослое, отбирали при помощи пастеровской пипетки. Всего было отобрано 20 клонов, имеющих ТК фенотип. Среди этих клонов были как рекомбинантные вирусы, так и спонтанные ТК-мутанты.

Для подтверждения присутствия последовательностей гена "gag" ВИЧ-1 в геноме вируса осповакцины использовали метод блот-гибридизации с мечеными фрагментами ДНК.

В результате селекции ТК-вариантов вируса осповакцины в присутствии BUdR (5-бромдезоксиуридин) и ДНК-ДНК гибридизации из 18 ТК клонов отобрали 5 рекомбинантных клонов, которые давали положительную реакцию при блот-гибридизации с фрагментами гена gag.

Этими клонами заражали клетки CV-1 и в лизатах определяли уровень продукции рекомбинантного белка методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем. Максимальный уровень синтеза белка, реагирующего с антителами сыворотки крови, отмечался в клетках, зараженных клоном N3. Рекомбинантный вирус, обозначенный Rgag, накапливали на культуре клеток почки зеленой мартышки CV-1. Выделение и очистку рекомбинантных вирусов осуществляли в градиенте плотаости сахарозы (Serva, США). Титр данного штамма составлял 6,8-10~ БОЕ на 1 мл.

Изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка р55. Разделение белковых продуктов экспрессии проводили электрофорезом в ПААГ с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны нарезали на полоски шириной 0,3-0,4 см. Для закрытия мест неспецифического связывания полоски инкубировали в 5% растворе сухого молока (1 час при 37°с). Затем фильтр отмывали в буфере. Для выявления антител полоски инкубировали в течение одного часа с испытуемой сывороткой в разведении 1:100-1:200. Определение реакции антиген-антитело осуществляли за счет инкубации полосок с иммунопероксидазным кроличьим конъюгатом против человеческих иммуноглобулинов. Места локализации комплекса выявляли инкубацией полосок в растворе, содержащем хлорнафтол (рис. 3).

Рис. 3. Результаты иммуноблотгинга сывороток крови ВИЧ-инфицированных и здоровых лиц с использованием рекомбинантных белков. Полоски 2,3,8,10,13 с рекомбинантным белком р55, положительно реагирующие с антителами сыворотки крови ВИЧ-1 инфицированных людей. Полоски 14,15,16 - контроль-сыворотка здоровых людей. Полоски 1,4,5,6,7,9,11,12 с рекомбинантным белком, не реагирующим с" ложно " положительными сыворотками.

Полипептид р55 дает возможность выявлять антитела к внутренним белкам ВИЧ-1, которые являются ранним маркером инфекции.

Установлено, что антитела , дающие ложнопозитивные реакции с внутренним белком р24, не реагируют с его предшественником р55, что, по-видимому, связано с пространственной конфигурацией рекомбинантного белка р55.

Полученные данные свидетельствуют, что в клетках, зараженных рекомбинантным вирусом, образуется полипептид, взаимодействующий с антителами сыворотки крови людей, инфицированных ВИЧ-1.

Молекулярную массу полипептидов определяли электрофорезом в БОЭ-ПААГ с последующим иммуноблотом. На иммуноблоте, с использованием сывороток инфицированных людей, отмечалась полоса реакции соответствующая молекулярной массе 55 кД (рис. 4).

1 2 3 4 5 6 7

***

р55 * —р55

»И

«и

р2Г'- в» —р2А

р17°"9— р» -р17

Рис. 4. Иммуноблоттинг с рекомбинантным белком.

1. Реакция сыворотки крови больного СПИД с белками вируса Ш? (отрицательный контроль).

2. Реакция сыворотки крови донора с белками рекомбинантного вируса.

3.-4. Реакция сыворотки крови больного СПИД с белками рекомбинантного вируса.

5.-7. Реакция сыворотки крови больного СПИД в коммерческих тест-системах.

Это свидетельствует о том, что в инфицированных клетках из-за отсутствия специфической протеазы синтезировался предшественник дад-белков.

Использование в иммунохимических реакциях белка р55. Изучен» кинетики синтеза рекомоинантного белка проводили с помощью ИФА. Дт! этого в монослой клеток С7-1 вносили вирус Лдад с множественностью БОЕ. Наличие рекомбинантного белка в клетках и культуральной сре;: определяли через каждые 12 часов (рис. 5).

Рис. 5. Кинетика синтеза рекомбинантного белка с клетках СУ-1.

1 - оптическая плотность лизата клеток,

зараженных рекомбинантным вирусом.

2 - оптическая плотность культуральной

среды клеток, зараженных рекомбинантным вирусом.

3 - оптическая плотность лизата клеток, зараженных вирусом НК

(отрицательный контроль).

4 - оптическая плотность культуральной среды клеток,

зараженных вирусом НИ (отрицательный контроль).

Максимальный уровень синтеза рекомбинантных белков отмечалс через 36 часов после инфекции, в дальнейшем наблюдалось снижени антигенной активности, что объясняется деструктивными явлениями клетках. Активность определялась в лизате клеток, инфицировании рекомбинантным вирусом Идад, и незначительная активность -культуральной среде. По всей видимости, рекомбинантный полипепти накапливается в цитоплазме, а незначительное количество определенное в среде, является следствием лизиса клеток и выходо содержимого наружу, о чем свидетельствует увеличение антигенно активности в культуральной среде после 48 часов культивирования.

Биохимический анализ продуктов экспрессии gag гена. Очистку продуктов экспрессии осуществляли иммуносороционной хроматографией на специально приготовленной колонке со специфическими ВИЧ-антителами. Чистоту выделения оценивали в иммуноблоте, с использованием сыворотки, содержащей антитела к ВИЧ-1 и HPLC, где белок выходил единичным пиком. Определение Ш2-концевой последовательности проводили в аминокислотном секвенаторе фирмы Вескмап.

В' случае с gag-предшественником производные аминокислот в первые 5 циклов деградации не определялись. Этот результат показал, что белок недоступен для деградации по Эдману, и предполагает наличие концевой модификации NH2. В то же время при полной деградации полипептида процентное соотношение аминокислот соответствовало предсказанному по нуклеотидной последовательности (рис. б).

1. Маркеры молекулярного веса.

3. Авторадиограмма рекомбинантного белка, меченого миристиловой кислотой.

4.-5. Авторадиограмма рекомбинантного белка, меченого радиоактивным фосфором.

б. 3 полосхи-иммуноблоттинга:

А - с вирусными частицами, полученными при градиентном центрифугировании; В - с лизатом клеток, зараженных

вирусом штамм ии-отрицательный контроль; Г - с лизатом клеток, зараженных рекомбинантным вирусом.

1 2 3 4 5 Б S а г.

Рис. 6. Изучение биохимических особенностей рекомбинантного белка.

Учитывая, что блокирование NH2—конца миристиловой кисло характерно для некоторых белков ретровирусов, мы исследов введение (ЗН) - миристиловой кислоты в рекомбинантный g предшественник. После мечения клетки лизировали и осветленный ли пропускали через иммуносорбент. Элюат отбирали и. аналиэиров методом электрофореза в SDS ПААГ. Тогда на авторадиогра отмечалась единственная полоса, соответствующая расположенно g предшественника, а при исследовании с использованием икмунобл антитела сорбировались именно в этой области. Полученный резуль свидетельствует о модификации Ш2-конца миристиловой кислотой (р

6)' за.

При исследовании включения Т в белки инфицированных клеток обнаружили фосфорилирование рекомбинантного gag предшественн (рис. б).

Электронно-микроскопическое исследование клеток WR, заражен рекомбинантным вирусом! образование вирусоподобных частиц изуч при помощи электронной микроскопии.

После ультрацентрифугирования лизата клеток в течение 2 ча при 300,000 д, отбирали видимую полосу, образующуюся при плотно 1,15 грамм на миллилитр.

При изучении клеток, инфицированных осповакциной штамма подобное кольцо не образовывалось.

Полученный материал, а также монослой клеток анализировал! помощью электронного микроскопа. Контролем служили клетки инфицированные вирусом осповакцины штамма HR, не несут последовательности генома ВИЧ.

Результаты исследований похазали наличие круглых частиц диаметром 100-150 нм (рис. 7), размер которых соответствует pai описанным ВИЧ-частицам (Schupbach е.а., 1984; Stannard е.а., 1987]

Рис. 7. Электронная микроскопия х 40000.

Ультратонкий срез клеток, зараженных рекомбинантным вирусом (отмечаются округлые частицы).

Частицы определялись как в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, так и в материале, полученном при градиентном центрифугировании, в контроле частицы отсутствовали. Таким образом, gag-предшественник может с успехом образовывать вирусоподобные частицы.

Иммунологический анализ частиц проводили методом иммуноблота. Для этого вирусные частицы ресуспендировали в буфере и фракционировали в 10% SDS-ПААГ. Белки переносили на нитроцеллплозную мембрану и анализировали методом ИФА, с использованием сывороток инфицированных людей. Опыт сопровождался контролем: положительным -лизат клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины Rgag, и отрицательным - лизат клеток, инфицированных вирусом осповакцины штамм WR. Результаты опыта показали (рис. б), что белки фракции вирусных частиц и клетки, зараженные рекомбинантным вирусом, специфически реагируют с антителами сыворотки крови вирусоносителей в области, соответствующей белкам с молекулярной массой 55 кД. Отрицательный контроль не давал такого • взаимодействия. Из результатов опыта следует, что в исследуемых частицах обнаруживается пептид с молекулярной массой 55 кД, который соответствует полноразмерному предшественнику р55 внутреннего белка ВИЧ.

Использование очищенного рекомбинантного полипептида р55 для тестирования сывороток крови людей, инфицированных ВИЧ-1. Наиболее консервативным Белком ВИЧ-1 является продукт экспрессии и процессинга гена gag - р24 (Rather е.а., 1985). Кроме того, антитела к внутренним белкам ВИЧ-1 появляются в ранние сроки после инфицирования и поэтому могут использоваться для диагностики вирусоносительства. Полученный нами штамм осповакцины продуцировал предшественник внутренних белков в составе которого имеются антигенные детерминанты р17, р24, р55. Поэтому мы использовали рекомбинантный белок для исследования сывороток крови методом дот-блота. Предварительно было проведено определение его чувствительности в сравнении с диагностической тест-системой "Антиген". Для этого разведения сыворотки, содержащие антитела к вирусу СПИДа, исследовались с помощью ИФА ("Антиген") и с использованием рекомбинантного белка. Результаты представлены на рис. 8. Они показывают, что по своей чувствительности метод с использованным рекомбинантным белком не уступает коммерческой тест-системе .

А Б

Рис. 8.

А. Использование рекомбинантного белка в твердофаз» иммуноферментном анализе.

Б. Использование рекомбинантного очищенного белка в дс блоттинге.

Дот-блот анализ относится к экспресс-методам, т. к. он требует много времени, прост в исполнении, исключает в отличив метода ИФА использование дорогостоящего оборудования для регистра результатов, однако этот вид гибридизациоиного анализа применим т в случае отсутствия в тест-системах других белков и, следователь! связан с очисткой рекомбинантного полипептида.

Очистку рекомбинантного белка проводили как указано руководстве Д. Гловера (1988), с использованием иммуноафиш хроматографии. Поликлоналыше специфические антитела против 1 получали из сыворотки инфицированных людей, предварительно истос фракцию антител антигенами осповакцины. Затем полученные антит иммобилизовали на СНВг-активированной сефарозе 4В и нанос] осветленный лизат клеток, инфицированных рекомбинантным вирус! Элюирование проводили НаОАС буфером рН 4,0.

Элюат, содержащий очищенный рекомбинантный антиген р55 изуч методом дот-блот гибридизации.

Результаты опыта представлены на рис. 8. Из представленного рисунка видно, что методой дот-блот анализа достоверно выявляется антитела к внутренним белкам ВИЧ-1.

Препарат с рекомбинантным белком р55 использовали для исследования панели сывороток, содержащей 20 положительных образцов, 80 отрицательных и 20 образцов, имевших положительный ответ в ИФА (ложноположительные). Сыворотки параллельно тестировали с помощью коммерческих тест-систем. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнительные результаты исследования сывороток крови с использованием рекомбинантного белка и коммерческих тест-систем.

характер и количество образцов

ИФА-тест

с рекомбинантным белком

тест-система "Dupont"

позитивные 20 негативные 80 ложнопози-

тивные

20

20

20

19

20

Данные таблицы свидетельствуют, что рекомбинантный белок взаимодействует с антителами к gag белкам в 19 исследованных сыворотках. В одном случае имеется отрицательная реакция с белком р55, связанная с отсутствием антител к внутренним белкам ВИЧ-1 и наличием антител к оболочечным белкам, что выявилось при тестировании с тест-системой "Dupont".

Следовательно, рекомбинантный белок р55, обладающий иммуногенными свойствами природного белка, можно использовать для выявления ложнопозитивных сывороток в качестве одного из подтверждающих тестов в твердофазном ИФА и дот-блот анализе. Кроме того, рекомбинантный белок можно использовать также в методе иммуноблотинга, что позволяет избежать стадию очистки.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. С использованием метода полимеразной цепной реакции и олигонуклеотидов, соответствующих началу и концу gag - области ВИЧ-1, а также высококонсервативным участкам gag- гена, осуществлена праймер-направленная амплификация последовательности, кодирующей основной нуклеокапсидный белок р55 ВИЧ-1.

2. Получена рекомбинантная плазмида, несущая последовательность гена "gag" ВИЧ-1 под контролем раннего промотора вируса осповакцины. Показано, что при трансфекции клеток почки зеленой мартышки CV-1 рекомбинантными вирусами происходит синтез и накопление предшественника gag -белков с молекулярной массой 55 кД (полипептид р55).

3. Показано, что рекомбинантный белок накапливается в цитоплазме и максимальный его синтез отмечается через 36 часов после инфекции.

4. Установлено, что рекомбинантный белок р55 обладает физико-химическими свойствами природного дад-белка. Оба имеют модифицированный миристиловой кислотой N-конец, что, видимо, оказывает влияние на их клеточную локализацию.

5. Электронно-микроскопическими исследованиями показано, что рекомбинантный белок р55 в клетках CV-1 образует соответствующие размерам ВИЧ-1 вирусоподобные частицы диаметром 100-150 нм.

6. Показано, что очищенный рекомбинантный белок р55 может быть использован в иммунологических реакциях для выявления антител к внутреннему белку и ранней диагностики инфицированное™ ВИЧ-1.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Фархутдинов М.Р., Галиуллин Ф.Г., Давлетов Э.Г., Габбасов М.И., Сафин В.Н. К проблеме профилактики ВИЧ инфекции в медицине катастроф // Труды IV Респ. научно-практ. конф. с участием зарубежных ученых (США). "Лечение внутри- и околосуставных повреждений. Медицина катастроф".- Уфа, 1991,- С.111-113.

2. Галиуллин Ф.Г. , Гибадуллин P.A., Денисов Г.Ф., Фархутдинов М.Р, Изучение экспрессии отдельных генов ВИЧ-1 в культуре клеток COS // Иммунитет и иммунобиологические препараты (сборник). - Уфа , 1991.- С. 69.

3. Фархутдинов М.Р. Выявление антител к предшественнику внутренних белков ВИЧ-1 // Тез.докл.конф.молодых ученых " Вопросы теоретической и практической медицины." - Уфа, 1991.- С.39-40.

4. Фархутдинов М. Р., Галиуллин Ф.Г., Давлетов Э. Г. Создание рекомбинантных конструкций на основе вируса осповакцины // Материалы 2-го Всесоюзного симпозиума Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии",- Самарканд, 1991.- С.58-59.

5. Фархутдинов М.Р., Галиуллин Ф.Г., Давлетов Э.Г., Габбасов Ш.Ф., Сафин Б.Н. Получение рекомбинантных белков и их использование в методе иммуноблота. // Вопросы мед. химии.-1993.- Том 39, N 3.- С. 60-62 .