Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия в бактериях E. COLI генов, кодирующих ферменты вируса иммунодефицита человека I типа

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия в бактериях E. COLI генов, кодирующих ферменты вируса иммунодефицита человека I типа"



АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

На npauax рукописи

УДК 578.89:579.842.11+577.27

ШУЛЕНИН Сергей Владимирович

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В БАКТЕРИЯХ Е. COLI ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ФЕР'ЛЕНТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА I ТИПА

Специальность 03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991 г.

Работа выполнена в Институте вирусологии мм. Д. И. Ивановского СССР.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат биологических наук М. Л\. Гараев кандидат биологических наук А. Ф. Бобков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В. Н. Калинин доктор медицинских наук Г. Р. Мацевич

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт эксперементальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР

на заседании Специализированного Совета Д 001.20.01 при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР (123098, Москва, Д-98, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР.

Защита диссертации состоится

в с ' час.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

vi ctu^rr.l

• Г,Л

дальность проблемы. Вирус иммунодефицита человекй i ю (БИЧ i) является одним из двух, идентифицированных до ¡тоящего времени, возбудителей синдрома приобретенного имму-1,ефицита (СПИД) - тяжелого расстройства иммунной системы, [ровождащегося развитием оппортунистических инфекций и не-шстических образований, приводящих к летальному исходу.

Эпидемический характер инфекции, высокая летальность, от-•ствие эффективных средств профилактики и лечения, а также гаанные с этим социальные проблемы - требуют интенсификации :ледований молекулярно-биологических особенностей структуры :войств этого вируса.

Для разработки новых методов химиотерапии и диагностики ъшой интерес представляют белки, осуществляющие' регулятор-и ферментативные функции. Ключевую роль в цикле развития iyca играют ферменты, кодируемые областью pol: протеаза, об-ная транскриптаза, РНКаза Н и интеграза/эндонуклеаза, одна-их получение из вирусных частиц или клеток, зараженных ви-ом, в препаративных количествах является трудоемким, огостоящим и небезопасным процессом.

Представляется перспективным получение этих белков путем робиологического синтеза с использованием современных мето-генетической инженерш.

Пели и задачи исследования. Целью данной работы было поение рекомбинантных плазмид, экспрессирующих в клетках olí гены, кодирующие протеазу и обратную транскриптазу (ОТ) I, получение в препаративных количествах для изучения йств этих ферментов и исследования возможности использова-для поиска эффективных ингибиторов и создания дифференци-ных диагностикуиов.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. Конструирование рекомбинантных плазмид, несущих после-зтельносги, кодирующие протеазу и обратную транскриптазу

I, и изучение экепресси этих плазмид в бактериях Е. coli.

2. Изучение свойств обратной транскриптазы, получаемой из гок бактерий Е.соИ, и сравнение со свойствами фермента, /чаемого из вирусных частиц.

3. Изучение иммунологических свойств обратной транскрип-

Т03Ы V. ИССЛв^ОВЙНЙЭ ВОЗМО^НОСТН ИСПОЛЬЗОВаННЯ Д.7ТР ССЭДЗНН-дифференциальных диагностикумов.

4. Разработка тест-систем для определения активности протеазы.

5. Изучение возможности использования протеазы ВИЧ I да нарезания гибридных белков.

Научная новизна работы В результате проведенной рабой получены рекомбинантные плазмиды, экспрессируищие в клетках Е. coll протеазу и обратную транскриптазу БИЧ I, и изучена экспрессия этих генов.

Показана идентичность обратной транскриптазы, получаемо: из клеток е. coli и вирусных частиц, по исследованным свойства и возможность применения препарата, получаемого из бактери для скрининга новых ингибиторов и создания дифференциальны диагностикуыов.

Разработана тест-система для определения активности про теазы ВИЧ I и проанализированы свойства этого фермента.

Практическое значение работы заключается в возможност использования полученных штаммов, содержащих гибридные плаз ыиды, для препаративного получения и очистки протеазы и обрат ной транскриптазы ВИЧ I. На основе свойств протеазы БИЧ сконструированы экспрессирующие векторы, существенно облегча! щие наработку, выделение и очистку различных белков из клегс бактерий Е. col 1. Подана заявка на атами-продуцент гибридно] белке, содержащего последовательность ОТ.

На защиту выкосятся следующие положения:

1. (¡конструирование рекомбинантные плазмиды рРЯб, рят: pPRT5, pPl детерминируют синтез гибридных белков, способа взаимодействовать с антителами к ВИЧ I.

2. Уровень активности ОТ, синтезирующейся в клетках E.coli, зависит от процессинга белка-предшественника вируссп цифической протеазой.

3. Обратную транскриптазу БИЧ I, синтезирующуюся в Кле ках Е.col i, можно использовать для поиска ингибиторов акти ности и изучения свойств этого фермента.

4. Гибридный белок, содержащий последовательность■* ОТ,, кно использовать для получения специфических антител, а так-создания дифференциальных диагностикумов.

5. Тест-системы определения активности апротеазы ВИЧ I эбны для изучения свойств фермента и поиска ингибиторов ак-зности.

6. Сконс'труированые векторы, содержащие сайт нарезания этеазой БИЧ I, упрощают наработку белков в клетках Е. col 1 и :ледувдую очистку.

Апробация, работы. Основные результаты работы были ложены на конкурсе молодых ученых Института вирусологии име-Д. И. Ивановского АМН СССР (1988г.)- На международной конфе-нции "Biochemical, physiological and related aspects of pep-

chimosln, renin and related proteases" в Дании (1988 г.), международной конференции "Фундаментальные и прикладные просы СПИД вирусных гепатитов и гриппа" в г. Суздаль.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит введения, обзора литературы, экспериментальной части, об-ждения результатов и выводов. Объем работы составляет 104 раницы машинописного текста. Полученные результаты иллюстри-ваны 7 таблицами и 20 рисунками. Список литературы включает 3 наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Получение рекомбинантных плазмид содержащих фрагменты ласти pol генома ВИЧ I, детерминирующих синтез вирусспецифи-ских белков.

В работе в качестве источника ДНК ВИЧ 1 использовали азмиду рВНЮ, предоставленную доктором Р.Галло (США), сконс-уированную на основе вектора pSP64 с Sstl фрагментом ДНК тема вируса размером 8926 пар нуклеогидов (п. я).

На рис. I изображена схема клонирования фрагментов облас-ро1 в векторе pücI9 и схематическая диаграмма генома ВИЧ I. я клонирования были выбраны 2 фрагмента: BgUl/EcoRI раэме-м 2587 пар нуклеотидов( п. н.) с координатами 1642-4229, кода-

рующий протеазу и обратную транскриптазу полностью и часть ин-тегразы/эндонуклеазы и фрагмент Hincl I/EcoRI (2079-4229) размером ( 2150 п. н.), кодирующий 9 С-концевыХ аминокислотных остатков (Ак) протеазы, ОТ полносгьв и 115 N-концевых Ак интег-разы. Фрагмент ВдШ/EcoRI был встроен в ректор рис19, гидро-лизованный рестриктазами BamHI и EcoRI. При этом рамка считывания встраевомого фрагмента совпадет с рамкой считывания lacZ гена, и экспрессия клонированной последовательности будет находиться под контролем промотора этого гена. Фрагмент Hindi/ EcoRI был встроен в вектор рис19 по этим сайтам. При этом также встраивание возможно в одной ориентации и рамки считывания lacZ гена и клонированного фрагмента совпадают. Препаратами ДНК после лигирования соответствующих фрагментов трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма ДН5а. Таким образом были получены две плазшда - рРКб и рКтЗ.

Схема клонирования в векторе pUR290 представлена на рис.1 Фрагмент ВдШ (1642-6618) был встроен в вектор pUR290, гидро-лнзованный ферментом BamHI. Б результате была получена плазми-да рр rт5, у которой ракка считывания фрагмента совпадает с рамкой считывания lacZ гена. Плазиида кодирует полипептид, ({-концевая часть которого представлена полноразмерной бета-галакто-зидазой, а С-концевая - последовательностью Ак области pol (т.е. протеазу, ОТ и интегразу полностью) и часть последовательности области en v.

. Фрагмент Hindin /EcoRI плазмидо pR73 после встраивания по сайту EcoRI адаптора EcoRI /Hindi II и гидролиза ферментом Hindin бьш выделен из легкоплавкой агарозы и встроен в вектор pUR29I, гидролизованный рестриктазой Hlndlll. Таким образом была получена плазшда pPl, у которой рамка считывания клонированного фрагмента ДНК совпадает с рамкой считывания lacZ гена, и-концевая часть белка, кодируемого этой плаз ми до й, представлена полноразмерной бета-галактозидазой, а С-концевая-включает 6 Ак полилинкера pUCl9, 9 Ак С-конца протеазы, полную последовательность ОТ и 115 N-концевых Ак последовательности интегразы.

В в нн . f ff* Н§ Р

Рис. I. Схема клонирования фрагментов области pol генома ВИЧ 1 в векторах серии "pUCl9 и pUR290. В - Bglll, Н - Hindll, i - EcoRI. Цифры вверху соответствуют тысяче нуклеотидных пар.

Экспрессия фрагментов области pol генома ВИЧ 7 в различных векторах.

Антигенные свойства белков, синтезирующихся в клетках Е.соИ, трансформированных плазмидами pPR6, pRT3, рРй"Г5, ppl, 8 также векторов pUR29D и pl)Cl9, были изучены методом иммуноб-лотв с использованием сыворотки пациента, инфицированного ЕИЧ1. Результаты представлены на рис.2. ' Как видно из представленных данных, при анализе препаратов белка, полученного из клеток, содержащих плазмиды ррR6r pRT3, pPRT5, pPl, {треки 3-6), обнаруживаются дополнительные полосы, отсутствующие в случае векторных плаамид pUCl9 и pUR290 (трэки 2 и 7). В препаратах клеток, содержащих плазмиды pPR6 и pPRT5, отсутствует белок-предшественник с молекулярным, весом соответсвукщш расчетному. мажорные полосы в области ббкДа и 51кДа соответствует белкам ревертазного комплекса БИЧ 1, кроме того в препарате

СЗ

р55

с»

-- рбб

«г— р51

Р34 О

р 24 —О I

Г 2 3 4 5 6 ? Ряс. 2. Анализ антигенных свойств Сежов, синтезирующихся в Е.соИ, методом иммуноблота.

1-зкстракт клеток И9/ШВ

2-экстракт клеток Е.соН/рисГЭ

3-экстракт клеток Е. col i /pPR6 (пр+) •4-экстракт клеток E.<cou/pPRT3 (пр-) -_.

5-энстракт клеток E.coli/pPRT5 (пр+)

6-экстракт клеток ЕчсоН/pPl (пр-)

7-эксгракт клеток ЕчсоН/рМг90

_ векторы серии рис

векторы серии pUR

леток, содержащих плазмиду рРЯТб, выявляется дополнительная элоса белка, имеющего молекулярный вес 34кДа, совпадащая по одвижности с интегразой БИЧ I.

Наличие этих белков свидетельствует о правильном процес-инге бежа-предшественника, т.к. плазмиды рРйб и рРйТ5 коди-уют полноразмерную протеазу, видимо, в клетках происходит об-эзованне активной формы этого фермента, который осуществляет равильный процессинг белка-предшественника с образованием ОТ рбб и р51) И' эндонуклеазыСр34). Данный вывод подтверждается тсутствием подобных бежов в препаратах клеток, содержащих лазмиды рКТЗ и рР1. В этих препаратах выявляются полосы белов, соответствующие белкам-предшественникам в области 80кДа рктЗ) и Г?ОкДа (рР1), близкие к рассчитанным теоретически, роке этих выявляются белки меньшего молекулярного веса, кото-ые образуются при неспецифическом гидролизе белков-предшест-енников протеазами клетки. Интересно отметить, что при этом в боих препаратах обнаруживается несколько белков одинакового олекулярного веса (например белки в области 80кДа и 70кДа), то, по-видимому, является отражением неспецифического гидро-иза протеазами белков-предшественников по сайтам, расположен-ым в последовательности ОТ. —

Правильный процессинг белка-предшественника подтверждает-я данными определения активности ОТ в лизатах клеток, содер-ащих полученные плазмиды, стандартными методами (табл.1). Как идно из полученных данных наибольшая активность ОТ выявляется лизатах клеток, содержащих плазмиды, кодирующие полноразмер-ую протеазу ВИЧ I, эта активность на порядок превышает тако-ую в лизатах клеток, содержащих плазмиды рКТЗ и рР1, не коди-укхцие этого фермента. Следует отметить, что активность ОТ в репаратах, полученных из клеток, содержащих плазмиды рйтЗ и ЕС, несколько превышает таковуи в контроле (рис19 и рии290), то, по-видимому, является результатом неспецифического гидро-иза белка-предшественника протеазами клетки. Возможно, что :ри этом нарезание проиводит к образованию белка способного роявлять активность ОТ (например белок р70).

При сравнении активности ОТ в экстрактах клеток, содержащих сходные конструкции на основе разных векторов( pUCl9 и pl)R290): pPR6 и PPRT5, pRT3 и pPI, видно, что вектор pUR290 обеспечивает более высокий уровень экспрессии.

Таким образом, при клонировании фрагментов BgJIl/EcoRI и Hl ndll/еcoRI pol области генома ВИЧ I, в клетках Е.соН проис-

Таблица I.

Определение активности ОТ в белковых экстрактах клеток, трансформированных различными плазмидами.

Название Активность ОТ ( имп/мин. жг )

плазмиды

I опыт I 2 опыт I 3 опыт

-----1 — --------

pUCl9 646 737 393

pUR290 625 985 509

рР R6 9775 5145 1529

рятз 649 1077 629

PPRT5 30224 13552 12526

pPl 1651 1542 804

ходит, синтез вирусспешфических белков, которые специфически взаимодействуют с антителами сыворотки пациентов, инфицированных БИЧ I. В лизатах выявляется активность ОТ, кроме того, правильный процессинг белка-предшественника в препаратах клеток, содержащих плазмиды, кодирующих полную последовательность прстеазы ВИЧ I, свидетельствует об образовании активной фзрмы этого фермента в клегках Е>соИ.

Сравнение свойств ОТ, синтезирующейся в клетках E.coll в получаемой из вирусных частиц.

Для сравнения свойств обратной транскриптазы, получаемой из вируса и синтезирующейся в бактериях, провели определение

гецифичности этих ферментов по отношению к различным матрицам эффективности ингибирования их активности химическими соеди-¡ниями. В табл. 2 приведены данные по активности вирусной об-)тюй транскриптазы и обратной транскриптазы из клеток е. col i i различных матрицах. Максимальное включение метки происходит i матрице полирибоА о лито Т( 12-18), однако, на метилированной 1боматрице ЛолирибоПмет. олигодезоксирибоГ( 12-18) и дезоксири->матрицах А. Т( 12-18) и Е IX12-18) метка включается слабо. Не-

Таблица 2.

Полимеразная активность вирусной и бактериальной ревертаз на различных матрицах.

Полимеразная активность экстрактов

Матрица

бактерий Е. col 1 HBIOI |

-I вируса НИ VI11 в

pUCl9 | pPR6

Поли( рА). олиго( дТ) 156 12-18

5276

995

Поли( дА). олиго( дТ) 868 12-18

1406

148

По ли( рПм). олиго( дГ) 165 12-18

187

210

Поли( ДЦ). олиго( дГ) 106 12-18

162

153

* Полимеразная активность рассчитана как включение соот-етствующего -дНТФ в ТХУ-нерастворимую фракцию за I час реак-ии при использовании I мкл экстракта.

обходимо отметить, что экстракты клеток бактерий, содержащих как. векторную ллазмиду р1)С19, так и гибридную плазмиду рРйб,

Таблица 3.

Сравнительный анализ действия ингибиторов на активность обратной транскриптазы различного происхождения.

| | Активность | Активность

Найме жН Кбнцент-| обратной транскриптазы, | вирусной об-вание ин-| рация, | синтезированной в бак- | ратной транскрип-гибитора | ыкМ | териях Е. со И * | тазы **

| счет | ингибиро- | счет | ингиби-

| (имп. Дин) | _________i вание( %) | (имп. /мин)Г _1_________i рование( %)

0 1962 0 6092 0

0,1 197 90 500 89

1,0 145 93 127 98

10,0 93 95 83 99

100, 0 58 97 82 99

АзТГФ

-I

!

0 7176

0,1 3433

I, 0 526

30,0 83

100,0 0

О 4466

1,0 4085

ФУК 10,0 3185

100,0 3190

О 3179 О

52 1838 43

93 363 89

99 18 99

100 0 100

О - 763 О

9 685 10

29 577 24

64 533 31

Примечание: В реакции использовали (*) I мкл экстракта бактерий Е col i HBI0I/pPR6, приготовленных как описано в материалах и методах, и (**) I мкл лиэата концентрированного препарата вируба. Включение Зн-дАТФ в ТХУ-нерастворииую фракцию за I час.

- II -

сравнению с лизатами вируса обеспечивали высокий уровень, лючения метки при использовании в качестве матрицы полиде-ксирибоА. олигоТ. Причиной этого, по-видимому, является на-чие примесей ДНК-зависимых ДНК-полимераз Е. coli в бактерийных лизатах.

Из полученных данных следует, что ферменты, синтезиругаци-я в бактериях и выделенные из вируса, проявляют одинаковые ойства по отношению к различным матрицам, причем -наибольшая тивность наблюдается при использовании полирибоА. олигоТ.

Для сравнения действия химических препаратов на актив-сть обратной транскриптазы были выбраны азидотимидинтрифос-т(АзТТФ), фосфоноуксусная кислота (ФУК) и фосфо но муравьиная [слота (ФМК). Результаты определения активности фермента при i3личных концентрациях этих ингибиторов приведены в таблице 3. >авнительный анализ зависимости ингибирования ферментативной .тивности ревертаз различного происхождения от концентрации и.шопрепаратов показывает, что оба фермента проявляют одина-|Вую чувствительность к ингибиторам.

I 2 . 3 gpI20-- " "

рбб ___^

P55 _ р51--

р34---;

Рис.3. Исследование экстрактов клеток методом им-муноблота.

I—Н9/1 IIB; 2-Е.coli HBlOI/pUCl9, 3-Е.coli HBlOI/pPR6

Молекулярная масса и антигенные свойства обратной транс-

криптазы, синтезирующейся в клетках E.coli, анализировали с помощью метода Бестерн блота с использованием сыворотки крови пациентов, инфицированных БИЧ 1. Как следует из представленных данных (рис.3), экстракты бактерий E.coli HBIOI/pPR6 содержат белки, специфически взаимодействующие с антителами к ВИЧ I. В экстрактах из клеток, содержащих рис19, подобные белки не идентифицированы. Указанные белки имеют молекулярную массу, по электрофоретической подвижности в ПААГе совпадающую с молекулярной массой двух форм вирус-специфической обратной транс-криптазы из клеток линии НЭП 18, инфицированных ВИЧ I. Наличие этих белков свидетельствует о правильном процессинге белка-предшественника в клетках E.coli, который, осуществляется вирусной протеазой, кодируемой 5' -областью клонированного фрагмента.

Приведенные данные свидетельствуют, что при клонировании фрагмента Bglll/EcoRl области pol ВИЧ I в клетках Е. col 1 осуществляется синтез обратной транскриптазы вируса. Этот фермент по исследованным свойствам не отличается от фермента, получаемого из вирусных частиц.

Изучение иммунологических свойств гибридного белка, содержащего последовательность ОТ.

С целью изучения имыуногенных свойств ОТ, синтезирующейся в клетках E.coli, и способности вызывать образование специфических антител, мы иммунизировали кроликов белковыми препаратами. полученными из клеток, содержащих плазшду рР1, N-кокеи белка, кодируемого этой плазмидой, представлен полно размерно!" бета-галактозидазой, а С-конец - фрагментом pol-предшественнике содержащего полную последовательность Ак ОТ.

Результаты исследования приведены на рис. 4. В качестве контроля использовали сыворотку преиммунного кролика и кролика, иммунизированного белковыми экстрактами клеток, содержащие вектор pUR290. Титр антител определяли методом иммуноблота. ] качестве антигена, иммобилизованного на фильтр, использовал] белки БИЧ I, разделенные в ПААГ с помощью электрофореза. Kai видно из полученных данных, белок обладает высокой нммуноген-

зстыа специфические антитела появляются после второй иммуни-зции (титр 1:200). После седьмой иммунизации титр составлял 1600. Эти антитела специфически взаимодействуют с белками звертазного комплекса (рбб и р51) и не взаимодействуют с дру-ими белками вируса. Подобные антитела не выявлены у преиммун-эго кролика и не образуются при иммунизации экстрактами бел-эв из клеток, содержащих плазмиду pUR29Q

La., m - рбб

_ 2 -- p5I

■ ' 0 -- р24

12345678 Рис4. Анализ сывороток крови кроликов на наличие антител к обратной транскриптазе ВИЧ I методом иммуноблота. -сыворотка крови преиммуного кролика( 1:200), 2-сыворотка крови ролика, иммунизированного препаратом белка клеток E.coli BlOI/pUR29D титр(1:200), 3-9-сыворотки крови кролика, иммунизи-ованного препаратом белка клеток E.coli HBlOI/pPl (3,4 -1:200, -I: 400; 6 -I: 800; 7 -1:1600) 8 - сыворотка крови пациента, нфицированного ВИЧ I (1:1000).

Для исследования возможности использования гибридного елка, . кодируемого плазмидой рШ, для создания дифференциаль-ого днагностикума мы проанализировали ряд сывороток пациен-ов, инфицированных ВИЧ I, на наличие антител к этому белку с • омощью слот-диагностикума. Для этого на нитроцеллюлозный ильтр наносили белковые препараты, полученные из клеток, со-.ержаших плазмиды, кодирующие последовательности env и gag елков ВИЧ I, а также препараты клеток HBIOI/pPI и BI0I/pUR290. Готовые фильтры разрезали на стрипы и каждый ин-убпровали с соответствующей сывороткой. Положительной считаясь сыворотка, дающая на стрипе хотя бы одну интенсивно окра-

шейную специфическую полосу с рекомбинантным антигеном ЕЖ l. По уровню антител к этим белкам сыворотки можно разделить на три группы:

1. С высоким титром антител ко всем антигенам.

2. С высоким титром антител к ОТ и низким к gag и env.

3. Сыворотки, имеющие антитела к gag и env, но низкий титр антител к ОТ.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования данного гибридного белка для получения специфических антител к ОТ и создания дифференциального диагностикума.

Тест-системы определения активности протеазы ВИЧ I.

Для создания тест-систем определения активности протеазы ВИЧ I в качестве субстрата был использован гибридный полипептид с молекулярной массой 165 кДа, N-концевая часть которого представлена полной бета-галактозидазой, а С-концевая-дуплици-рованным участком вирусспецифического предшественника р55, содержащего сайт для вирусспецифической' протеазы, расположенный на границе белков р17 и р21.

На рис. 5 представлены результаты электрофоретического анализа в ПААГе с SDS продуктов нарезания белка р165 экстрактами бактерий HBlOI/pR6. Как следует из представленных данных обработка препаратов р1Б5 экстрактами бактерий, содержащими гибридную плазмиду рРКб, кодирующую протеазу ВИЧ I, резко снижает интенсивность полосы с молекулярной массой 165 кДа и приводит к появлению дополнительных полос с молекулярными массами 42 кДа, 28 кДа, 23 кДа и 19 кДа, а также к усилению интенсивности полосы, соответствующей бета-галактозидазе. Иммунологический анализ продуктов нарезания гибридного полипептида с помощью сыворотки инфицированных пацтентов позволил установить, что все эти белки содержат антигенные детерминанты ВИЧ I. Очевидно, нарезание рекомбинантного белка происходит по специфическим сайтам, расположенным на границе рГ? и р24. Необходимо отметить, что при анализе продуктов гидролиза бежа р165 методом ишушблота мы наблюдали появление дополнительной полосы, соответствующей белку с молекулярной массой 28 кДа, который,

- 15 -

-видимому, образуется в результате неспецифического гидроли-белка протеазаыи клетки. Полученные в результате обработки р165 протеазой белки 19, р23 и р19, по-видимому, являются продуктами полного на-зания предшественника. В то время, как белок р42, вероятно, едставляет собой продукт неполного гидролиза химерного бел-Действительно, при изучении зависимости гидролиза от вре-чено, что одним из первых продуктов является белок р42, при ом его количество возрастает при уменьшении времени инкуба-и и низких■концентрациях протеазы. При увеличении времени кубации и меньших разведениях протеазы происходит усиление

pII9 ~ р42.

р23 •»—

54 67

42

25 21

12,5 6,5

р28 — ¡ ргз4*_

1 2 3 4 5

Г 2 3 4

А

Б

Рис. 13. Нарезание белка р165 протеазой ВИЧ I.

а) Идентификация белков с помощью окрашивания Кумасси R250

1 - р165+протеаза (экстракт клеток Е. col i /pPR6);

2 - pI65; 3 - р165+экстракт клеток Е. col i /рисХЭ

4 - экстракт клеток E.coli/pPR6

5 - маркеры молекулярного веса в кДа

б) Идентификация белков с помощью иммуноблота

1 - р165+протеаза (экстракт клеток Е. col i /pPR6);

2 - pI65; 3 - р165+экстракт клеток Е. col i /pUCl9 4 - экстракт клеток E.coli/pPR6

ни и концентрации экстракта, содержащего протеазу, было от-генсивности полос р23 и р!9 и заметное ослабление интенсив-

ности р42.

Таким образом, разработанная методика определения активности протеазы ВИЧ I может быть использована для скрининга хи-миопрепаратов - возможных специфических ингибиторов активности и изучения свойств фермента.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13

рН-4 рН-5 рН-6 рН-7 рН-8 рН-9 Рис. 6. Гидролиз белка рГ65 протеазой ВИЧ I при различных значениях рН. 1-время инкубации 0 мин. 2, 4,6, 8,10,12-время инкубации 60 мин. 3,5,7,9, II, 13-время инкубации 120 ыин.

Свойства протеазы ВИЧ I.

Изучение влияния рН среды на кинетику гидролиза гибридного белка, позволило установить, что оптимум находится в районе значений рН 6, 0-7, 0. На рис.6 приведены данные анализа продуктов гидролиза с помощью электрофореза в ПААГ и методом имму-ноолоте . Как видно из полученных результатов понижение рН реакционной смеси до значения 5,0 или увеличение свыше'Э, О приводит к практически полной остановке гидролиза.

- 17 -

Изучение возможности применение протеазы для очистки гибридных бежов, содержащих сайт нарезания протеазой. Белок р165, использованный наш для создания тест-системы и определения активности протеазы ВИЧ I, при синтезе в клет-ix Е.со11 образует, так называемые, тельца включения Inclusion bodies"), при этом накапливающийся белковый про-тст более устойчив к протеолизу и менее токсичен для клеток. ,кая структура белка облегчает удаление растворимых- примесей, лако, для последующей очистки необходимо растворение телец лючения, что возможно только в жестких денатурирующих усло-:ях (8М мочевина, рН>11 и т. п.). Кроме того, наличие на

1 2 3 4 5 6 Рис. 7. Исследование растворимости продуктов гидролиза гибридного бежа р165 протеиназой ВИЧ I.

1 - маркеры молекулярного веса в кДа

2 - супернагант препарата pI65 .+ экстракт Е. co-

li DH5a/pPR6 после доведения pH до II, нейтрализаии и переосаадения

3 - то же, что N2, но v предваригльно уменьшен

в двэ раза

4 - препарат р165 + экстракт E.coli DH5a/pPR6

5 - экстракт E.coli 0H5a/pPR6, 6 - препарат pI65

N-конце последовательности бега-галактозидазы, может затруднять использование свойств бежа, присоединенного it С-кон-цу( экранирование отдельных эпитопов при иммунизации и получении ыоноклональных антител, супрессия иммунного ответа, неспецифика при создании диагностикумов). При инкубации белка р165 с протеазой ВИЧ I конечными продуктами гидролиза являются белки рПЭ, р23 и р19. рП9 состоит из бега-галактозидазы и небольшого фрагмента вирусного белка на С-конце, а р23 и р19 -имеют последовательность Ак бежов gag ВИЧ 1. Мы исследовали возможность очистки этих белков от бета-галактозидазы. Для этого тельца включения, обработанные протеазой ВИЧ I, растворяли при рН II, после чего значение рН понижали до 7, при этоь нерастворимые бежи вновь выпадали в осадок, который отделял* центрифугированием. В результате переосаздения происходит разделение бежов рН9 и р19 (рис.7), следовательно достигаете* эффективная очистка р19. Однако, белок р23 остается в нерастворимой фракции, что, возможно, обусловлено свойствами самогс белка, поэтому очистка этого продукта требует подбора условий.

Таким образом, нарезание гибридного белка приводит к гидролизу пептидной связи между белком-носителем ( бета-галактози-дазой) и белком, содержащем на N-конце сайт узнавания протеаз: ВИЧ I, что в некоторых случаях позволяет проводить простую быструю очистку такого полипептида.

Получение векторов, содержащих сайт нарезания протеазо

ВИЧ I.

При создании плазмид за основу бьши взяты векторы сери PUR290, выбор этой системы был обусловлен следующими соображе ниями:

1. Векторы обеспечивают высокий уровень синтеза химернь бежов (до 15-30%).

2. Основная масса рекомбинантного белка находится в вид телец включения.

3. Вавду существования основной массы рекоыбикантш бежов в нерастворимой форме избыточное количество чужеродне

- 19 -

белка не оказывает летального действия на клетку.

4. Молекулярная масса получаемых гибридных белков превы-ет таковую для основной массы белков Е.соИ, что существенно я тестирования этих полипептидов в лизатах клеток.

Однако, как упоминалось выше, подобная система имеет и д недостатков, преодолению которых способствовувт введение ред полилинкерной областью последовательности, кодирующей йт узнавания протеазой ВИЧ I. Нарезание синтезирующегося бридного белка по этому сайгу позволит осуществлять простую эффективную очистку полипептида, кодирующая последователь-сть которого встроена в область полилинкера, по разработан-й выше схеме. На рис. 8 изображена полшгаккерная область по-ченых векторов и последовательность, кодирующая сайт отеазы ВИЧ I.

Кроме того, встраивание в вектор последовательности, ко-руицей par-локус повышает стабильность полученных плазмид.

Таким образом, созданные векторы позволяют осуществлять фективную наработку в клетках Е. coli и последующую очистку лков.

ХЬа 1

Лей Асн Фен про Илэ Сер Hi dl II BamHI Sal Gl EcoRI I AA. TTG AAT TTT CCA АТС TCA AGCffCTAGAGGATCCGTCGACGAATTC I AA TTG AAT TTT CCA АТС TCA AAGCTTCTAGAGGATCCGTCGACGAATTC I AA TTG AAT TTT CCA АТС TCA AAAGCTTCTAGAGGATCCGTCGACGAATTC Рис. 8, Полилинкерная область векторов, кодирующих сайт нарезания протеазой ВИЧ I.

Заключение

В результате проведенных экспериментов получены плазмиды, терминирующие синтез в клетках Е. col i протеазы и обратной анскриптазы £Щ I. Изучение свойтв ОТ показало, что по исс-дованным свойствам фермент, получаемый из клеток Е. coli, не личается от фермента, получаемого из вируса, и поэтому шгет ть использован для скрининга ингибиторов активности и Полунин специфических антител к ОТ. Кроте того, гибридный белок, дерхзщий последовательность этого фермента, когвт быть ис-

пользован для создания дифференциального диагностикума. Проте-аза ВИЧ I обладает высокой специфичностьд оптимум рН реакции гидро

лиза гибридного белка, содержащего последовательность предшественника р55 gag находится в интервале 6-7. Разработана схема очистки белков после вырезания их из гибридного белка лротеазой БИЧ I. Созданы векторы, содержащие сайт для протеазь БИЧ I и полилинкер позволяющий встраивать фрагменты ДНК, кодирующие белковые последовательности в нескольких рамках считывания. Обработка синтезирующегося гибридного белка протеазо? БИЧ 1 будет приводить к гидролизу пептидной связи мзкду белко! -носителем и белков последовательность которого кодируете] клонированным фрагментом ДНК, что в некоторых случаях позволяет осуществлять быструю и простую очистку белкового продукта.

Выводы

1. Получены гибридные плазшды, содержащие фрагменты об ласти pol генома НИЧ I в составе полилинкерной последователь ности векторов pUCl9 и pUR290, обеспечивающие в клетках Е.со! синтез вирусспецифической протеазы и обратной транскриптаз (ОТ).

2. Синтезирующаяся в клетках Е. colf ОТ не отличается по исследованным свойствам от фермента, получаемого из вируснь частиц и может быть использована для поиска новых ингибиторе активности.

3. Гибридный белок, кодируемый плазмидой pPl и содержа^ последовательность ОТ ВИЧ I, может -йыгь использован для пол; чения специфических антител и создания дифференциального диа; ностикума.

4. Разработаны тест-системы определения активности npoTi азы ВИЧ I, позволяющие изучать свойства ферментов и осущес влять поиск ингибиторов активности.

5. Протеаза ВИЧ I обладает высокой специфичность^ макс мальная активность гидролиза природных субстратов наблюда'ет при рН инкубационной среды 6-7.

6. .Сконструированы векторы, содержащие сайт нарезания п

эззй БИЧ I, позволяющие осуществлять клонирование и экспрес-г ив последовательности, кодирующей полипептид в нескольких змках считывания. В некоторых случаях за счет гидролиза пеп-лдной связи с белком-носителем протеазой ВИЧ I мокко осуществить быструю очистку этого полипептида.

Список научных трудов по теме диссертации I. Щуленин С. R Гуль кик С. Е Бобков А. Ф. Тарасова К II )Гданов А. А. Степанов В М. Гараев II М. -"Экспрессия протеазы ipyca иммунодефицита человека в бактериях Escherichia coli". ззисы докладов международной конференции. Суздаль, 25-30 сен-збря 1988 г. Москва, с. 17

2. Гараев М. II Шуленин С. Е Царева Н. Е Ситникова Ю. Е Боб->в А. Ф. -"Энзиматические свойства обратной транскриптазы вируса ямунодефицита человека, синтезирующейся в бактериях Escherichia >li". Тезисы докладов международной конференции. Суздаль, 25-30 штября 1988 г. Москва, с. 17-18

3. Шуленин С. а Царева Н. Е Бобков А. Ф. Гараев М. М. -"Син-¡3 обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека в 1ктериях E.coli". "Фундаментальные и прикладные проблемы ВД", Москва, 1988г. с. 129-133

4.. Шуленин С. Е Тарасова Н. И. Гульник С. Е Бобков А. Ф. (гданов A. А. Степанов Е М. Гараев М. М. -"Клонирование и экс-¡ессия протеазы вируса иммунодефицита человека в клетках бак-¡рий". "Фундаментальные и прикладные проблемы СПЩГ', Москва, 188г. с. 133-137

5. Гараев М. Е Килессо Т. Ю. Галегов Г. А. Краевский А. А. ipycoBa Е Е Атразева Е Д. Куханова 11 К. Бобков А. Ф. Шуле-:н С. Е - "Сравнительный ингибиторный анализ биосинтеза ДНК, тализируемого обратными транскриптазами ретровирусов". "Био-таническая химия", 1990г., т. 16, N4, с. 531-536.

6. Шуленин С. Е Царева Е Е Ситникова Е Е Бобков А. Ф. раев М.М. -"Клонирование и экспрессия в бактериях Escherichia li pol области генома вируса иммунодефицита человека I". ркл. Акад. наук СССР', 1990г. т. 310, Ш, с. 210-213

7. Шуленин С. Е Тарасова Е И. Гульник С. Е Бобков А. Ф.

Богданов A.A. Степанов ЕМ. Гараев M.R "Изучение свойств про-теазы ВИЧ синтезированной в клетках бактерий Escherichia coli". Вопр.вирусол. " 199Ох., 35, нЗ, с. 206-209.

8. Бобков А. Ф. Казеннова Е Е Шуленин С. Е Бобкова М. Р. Лукашевич К Е Гараев М. М. "Экспрессия фрагментов генома ВИЧ в бактериях Escherichia coli". Тезисы докладов Всесоюзной школы-семинара "Молекулярная биология и медицина", г.Ленинград, 12-18 мая 1990г.