Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль компонентов системы транспорта глюкозы в проявлении физиологических свойств бактерий рода Erwinia

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Даценко, Кирилл Александрович, Москва

у

^ БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА

Н.Ф. ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

УДК 579.842.24:579.222.2

ДАЦЕНКО КИРИЛЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Роль компонентов системы транспорта глюкозы в проявлении физиологических свойств бактерий рода Епмша 03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук Большакова Т.Н. доктор биологических наук, профессор Евтушенков А.Н.

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Структура и функции ФТС у энтеробактерий 9

1.2. Общие компоненты ФТС 10

1.2.1. Фермент I 10

1.2.2. Белок НРг 11

1.3. Генетика ФТС. Регуляция синтеза общих и 11 субстратспецифичных компонентов ФТС

1.3.1. Специфические компоненты 12

1.3.2. р1з-оперон 13

1.4. Свойства мутантов энтеробактерий, дефектных по 15 компонентам ФТС

1.5. Участие белков ФТС в регуляции физиологических процессов 15 бактериальной клетки

1.5.1. ФТС и явление «исключение индуктора» 16

1.5.2. Роль компонентов ФТС в регуляции активности 18 аденилатциклазы

1.5.3. Роль ФТС в регуляции генной активности 19

1.6. ФТС бактерий рода Епуппа 22

1.7. Пектолитические ферменты бактерий рода Егмша 24

1.7.1. Генетический контроль синтеза пектолитических ферментов 25 ЕпуЫа

1.7.2. Регуляция синтеза пектатлиаз у Епмта 25

1.8. Целлюлолитические ферменты и регуляция их синтеза у 28 бактерий рода Етииа

Глава 2. Общая характеристика объектов и методов исследования 31 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39

3.1. Получение и характеристика pts-мутантов бактерий рода 39 Erwinia

3.1.1. Выделение мутантов бактерий рода Erwinia с нарушением 3 9 утилизации глюкозы

3.1.2. Утилизация углеводов у выделенных glu"- мутантов 42

3.1.3. Скорость транспорта ФТС-углеводов у выделенных мутантов 51 бактерий рода Erwinia

3.2. Устойчивость продукции пектолитических ферментов к 53 катаболитной репрессии глюкозой

3.3. Клонирование pts-генов бактерий рода Erwinia 54

3.3.1. Клонирование pts-генов бактерий Е. chrysanthemi и Е. 54 atroseptica

3.3.2. Клонирование гена ptsl бактерий рода Erwinia 55 in vivo

3.3.3. Экспрессия ptsl-генов в гомо- и гетерологичных системах 56

3.3.4. Клонирование гена ptsH 64

3.3.5. Клонирование гена Е. chrysanthemi, комплементирующего 66 мутацию в штамме 052. Идентификация мутации

3.4. Картирование генов ptsl и ptsH Е. chrysanthemi 68

3.5. Активность ферментов у транспортных мутантов бактерий Е. 72 chrysanthemi и Е. atroseptica

3.5.1. Синтез Р-галактозидазы у штаммов Е. chrysanthemi и Е. 72 atroseptica, дефектных по общим компонентам ФТС

3.5.2. Внутриклеточная концентрация цАМФ у транспортных 75 мутантов бактерий рода Erwinia

3.5.3. Влияние pts-мутаций на продукцию внеклеточных ферментов 76 бактериями Е. chrysanthemi и Е. atroseptica

3.5.3.1. Влияние мутаций ptsl и ptsH на продукцию пектатлиаз 76 бактериями рода Erwinia

3.5.3.2. Влияние мутаций ptsl и ptsH на динамику синтеза 78 пектатлиазы у Erwinia

3.5.3.3. Регуляция синтеза изоферментов пектатлиаз 85

3.5.3.4. Целлюлолитическая активность ptsl-мутантов 87

3.5.3.5.Изучение патогенных свойств pts-мутантов бактерий Е. atro- 89 séptica в системе «бактерия - растение-хозяин»

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 92

ВЫВОДЫ 114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115

ВВЕДЕНИЕ

Вопрос адаптации бактерий к изменяющимся условиям внешней среды до настоящего времени остается одним из наиболее актуальных в микробиологии. Одним из механизмов такой адаптации является функционирование системы транспорта углеводов: фосфоенолпируват (ФЕП): углевод фосфотрансферазной системы (ФТС) (104). Существование ФТС показано у 64 видов бактерий (79).

ФТС - мультиферментный комплекс, состоящий из ряда цитоплаз-матических общих и мембранных субстратспецифичных белков. Система катализирует ФЕП-зависимое фосфорилирование углеводов Б-глюко- и Б-манно-конфигураций, а также шестиатомных спиртов, называемых ФТС-субстратами. В процессе фосфотрансферазной реакции фосфорильная группа от ФЕП передается общим компонентом ФТС ферментом I (Ф1) на цитоплазматический низкомолекулярный переносчик фосфата - белок НРг, также являющимся общим компонентом системы и выступающим донором этой группы в ее дальнейшей транслокации по цепи субстратспецифичных компонентов ФТС к поступающему в клетку ФТС-субстрату. Специфичные компоненты - ферменты II (ФП) - осуществляют непосредственную передачу фосфата на углевод, и, как правило, связаны с мембраной.

Изучение свойств мутантов, в первую очередь, дефектных по общим белкам, позволило установить, что ФТС, первоначально описанная как транспортная система для ряда источников углерода (76), принимает участие в регуляции многих физиологических процессов у бактерий: утилизация углеводов, не относящихся к ФТС-субстратам; синтез и активность ферментов; вирулентность; катаболитная репрессия; хемотаксис; синтез фимбрий и пил ей; проникновение в бактериальную клетку ДНК фага X и т.д. (103,104). В качестве регуляторов этих процессов выступают как общие (Ф1 и белок

НРг), так и субстратспецифичные (некоторые ФП) компоненты этой системы.

В настоящее время считается, что ФТС, в целом, является координирующей и регулирующей системой, позволяющей бактериальной клетке легко адаптироваться к изменяющимся условиям среды обитания (103,104).

На сегодняшний день наиболее полно, генетически и биохимически, охарактеризована ФТС представителей сем. Enterobacteriaceae - бактерий Escherichia coli и Salmonella typhimurium: картированы и секвенированы pts-гены; определено участие компонентов этой системы в регуляции метаболизма (103).

Однако практически ничего не известно, за исключением данных, приведенных в нескольких публикациях (31, 57) о строении и функциях ФТС у членов этого же семейства - бактерий рода Erwinia. Обладая многими схожими чертами с бактериями Е. coli, эти фитопатогенные микроорганизмы, тем не менее, имеют более сложный комплекс свойств, связанный с присутствием факторов вирулентности, вполне вероятно, также регулируемый ФТС.

Бактерии рода Erwinia повсеместно распространены в природе и вызывают ряд заболеваний высших растений - «черную ножку», «мокрую гниль» и «водянку». По некоторым оценкам прямые потери урожая важнейших сельскохозяйственных культур во время вегетации и хранения огромны (97). Патогенность этих бактерий связана с продукцией деполимеризующих внеклеточных ферментов: пектатлиаз, целлюлаз и протеаз, являющейся существенным фактором вирулентности (70).

В связи с этим, целью настоящей работы являлось изучение роли общих компонентов ФТС на физиологические свойства бактерий Erwinia chrysanthemi и двух подвидов бактерий Erwinia carotovora: carotovora и atroseptica.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

1. Получить штаммы бактерий рода Erwinia с дефектами в общих компонентах глюкозной транспортной системы.

2. Изучить способность мутантных бактерий к утилизации различных источников углерода.

3. Выявить эффекты мутационного повреждения общих компонентов глюкозной ФТС на выражение катаболитчувствительных оперонов у Эрвиний.

4. Определить расположение генов, детерминирующих синтез общих белков этой системы, на хромосоме Erwinia и клонировать данные гены.

Для решения поставленных задач были использованы современные микробиологические, генетические и биохимические методы.

В результате проведенных исследований с помощью двух методов мутагенеза были получены штаммы различных видов Erwinia с дефектами в генах ptsl и ptsH. У выделенных мутантов была нарушена утилизация как ФТС-субстратов, так и источников углерода, имеющих собственные транспортные системы (не-ФТС-субстраты). Оказалось, что в отличие от соответствующих мутантов бактерий Е. coli, уровень цАМФ у мутантных бактерий Erwinia был сравним с таковым у клеток дикого типа. Анализ результатов, полученных при изучении дифференциальной скорости синтеза ß-галактозидазы и продукции внеклеточных ферментов, позволил предложить модель регуляции деятельности индуцибельных оперонов у бактерий рода Erwinia. Впервые было продемонстрировано, что бактерии Е. atroseptica, дефектные по гену ptsl, не способны вызывать развитие симптомов заболевания у растения-хозяина. Клонирован in vivo ген ptsl бактерий Е. chrysanthemi и Е. atroseptica. Путем картирования мутаций у бактерий Е. chrysanthemi показано, что гены, отвечающие за синтез общих

компонентов ФТС, расположены на 100 и 175 минутах генетической карты хромосомы и не образуют группу сцепления.

Анализ полученных данных позволяет предположить, что, как у бактерий Е. coli и S. typhimurium, так и у Erwinia, фосфотрансферазная система занимает, вероятно, одно из центральных мест в регуляции физиологических процессов.

Результаты, полученные в настоящем исследовании, имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Сведения, касающиеся влияния общих компонентов ФТС на продукцию внеклеточных ферментов, являющихся одними из основных факторов вирулентности, можно использовать при изучении процесса патогенеза, понимание механизмов которого должно привести к разработке эффективных способов защиты культурных растений от болезней, вызываемых фитопатогенными Erwinia. Кроме того, поскольку часть экзоферментов (пектатлиаза) применяется в пищевой и текстильной промышленности, а также в научных исследованиях при изучении строения растительных клеточных стенок и структуры пектиновых биополимеров (114), существует необходимость в конструировании штаммов-сверхпродуцентов. Этому могут способствовать полученные данные по регуляции синтеза внеклеточных ферментов со стороны компонентов ФТС.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

На сегодняшний день мало известно о строении и функциях (регуляторных, в особенности) компонентов ФТС у бактерий рода Erwinia. Поэтому кажется логичным построить Обзор литературы следующим образом: 1) описать основные сведения о ФТС близкородственных Erwinia бактерий семейства Enterobacteriaceae - Е. coli и S. typhimurium; 2) обобщить то немногое, что опубликовано об этой системе у изучаемых нами бактерий; 3) дать общую характеристику некоторых факторов вирулентности Erwinia и механизмов регуляции их продукции, как возможных объектов контроля со стороны компонентов ФТС.

1.1. Структура и функции ФТС у энтеробактерий

Многообразие функций ФТС связано с ее сложной структурой и многокомпонентностью. В самом общем случае фосфотрансферазная реакция обеспечивает перенос фосфорильной группы от ее донора -фосфоенолпирувата (ФЕП) - на поступающий в клетку углевод. Такая реакция является первой ступенью катаболизма углеводов и строго ориентирована в пространстве, причем, ее направленность определяется самим комплексом компонентов ФТС - цитоплазматических и мембраносвязанных. Таким образом, можно говорить о векторном метаболизме углеводов у бактерий, а не только о транспорте этих веществ (103,104). Транслокация фосфорильной группы сопровождается образованием устойчивых фосфорилированных форм белков ФТС.

Эти белки подразделяется на общие и углеводспецифичные. Два общих, локализованных в цитоплазме - Фермент I (Ф1) и низкомолекулярный НРг - осуществляют перенос фосфорильного остатка от ФЕП на специфические компоненты системы (103,104). Общие компоненты ФТС необходимы

для транспорта всех углеводов, поступающих в клетку в ходе фосфотрансферазной реакции (ФТС-субстраты). Исключение составляет фруктоза - фосфорильная группа с Ф1, минуя белок НРг, передается на белок FPr - продукт гена fruB, входящего в состав фруктозного оперона (103). Фосфорилированная форма белка НРг (или FPr, в случае фруктозы) передает фосфорильную группу цитоплазматическому субстратспецифичному ферменту Ф11А, который, в свою очередь, фосфорилирует комплекс мембраносвязанных белков - ФПВС (5). С этого комплекса фосфорильная группа переносится на входящий в клетку соответствующий углевод. Общая схема фосфорилирования субстрата компонентами ФТС представлена на рис. 1.

ФЕП + НРг Ф1 Фосфо-(Н1з)НРг + пируват

■4-►

Фосфо-(Шз)НРг + углевод ФП_^ НРг + углевод-Р

Рис 1. Схема переноса фосфорильного остатка по белкам ФТС от ФЕП к углеводу (43).

В настоящее время принята единая номенклатура обозначения суб-стратспецифичных компонентов ФТС (118). В соответствии с ней, указание принадлежности того или иного компонента ФТС обозначается сокращенным названием углевода в верхнем индексе, например, ФПА81и.

1.2. Общие компоненты ФТС. 1.2.1. Фермент I.

Фермент I (Е.С. 2.7.3.9.) у энтеробактерий осуществляет первый перенос фосфогруппы в цепи фосфотрансферазных реакций. Это общий белок, участвующий в переносе в клетку всех ФТС-субстратов (93). Ген ptsl, отвечающий за синтез этого фермента, был клонирован и секвенирован у Е.

coli и S. typhimurium (83,117). Сравнение аминокислотного состава ферментов указанных бактерий выявило почти полную его идентичность (различие лишь в 16 аминокислотных остатках).

Ф1 - цитоплазматический белок, состоящий из двух одинаковых субъединиц, с молекулярным весом в 63.5 кДа каждая (93). В присутствии ФЕП и ионов Mg каждая субъединица способна к автофосфорилиро-ванию. При диссоциации Р-Ф1 на отдельные мономеры происходит фосфорилирование белка НРг (127).

Недавно появилось сообщение о выделении специфической Ф1-кина-зы, зависящей от АТФ и способной фосфорилировать Ф1 (50). Активность киназы зависит от соотношения НАДТНАДН, что приводит к предположению о ее посреднической роли между ФТС и электрон-транспортной цепью.

1.2.2. Белок НРг.

НРг - цитоплазматический гистидинсодержащий термостабильный белок. Он осуществляет реакцию переноса фосфорильной группы с Ф1 на субстратспецифичные ФПА (103) при утилизации всех (кроме фруктозы) ФТС-субстратов.

Структура и аминокислотная последовательность белка НРг известна достаточно давно (34, 128). Это мономер с молекулярным весом 9 кДа. Ген ptsH, кодирующий этот белок, клонирован и секвенирован у ряда энтеробактерий (127). Нуклеотидные последовательности гена высокогомологичны у многих видов бактерий, а у Е. coli и S. typhimurium -идентичны.

1.3. Генетика ФТС. Регуляция синтеза общих и субстратспецифичных

компонентов ФТС.

У энтеробактерий известно по меньшей мере 25 компонентов ФТС (54). Гены, кодирующие субстратспецифичные ФП, как правило, сцеплены в

опероны или регулоны. Исключение составляют гены, кодирующие белки глюкозоспецифичной ФТС. Гены ptsH и ptsl, ответственные за синтез общих компонентов ФТС, а также ген сгг (продукт - ФПАё1и ) у бактерий Е. coli и S. typhimurium образуют pts-onepoH, расположенный на 52 и 51 минуте генетической карты хромосомы, соответственно. Присутствие crr-гена в pts-опероне свидетельствует о роли его продукта, выходящей за рамки утилизации глюкозы (103,104). Ген ptsG, кодирующий ФПВС81и, не сцеплен с сгг-геном и находится у бактерий Е. coli на 24 минуте генетической карты (74).

1.3.1. Специфические компоненты.

Специфичные компоненты ФТС представлены у Enterobacteriaceae комплексом ферментов II (Е.С.2.7.1.69.): ФПА, ФПВ и ФПС (80, 103). Мембраносвязанные компоненты отвечают за векторное фосфорилирование соответствующего субстрата, причем, в отличие от других фосфотрансфе-разных реакций, перенос фосфорильной группы на поступающий углевод -реакция необратимая (58). Кроме того, большинство этих компонентов принимает участие в хемотаксисе (80). Показано также, что субстратспеци-фичные компоненты ФТС могут фосфорилировать не только входящие в клетку, но уже находящиеся там углеводы, например, глюкозу при катаболизме лактозы (58).

Каждый Ф11ВС, обладая наибольшим сродством к своему собственному субстрату, способен, хотя и с меньшей эффективностью, фосфорилировать другие углеводы (80,103, 104).

Часть генов, ответственных за синтез ФП, были клонированы и секве-нированы (80). Лучше других, в силу своих регуляторных особенностей, охарактеризован ФПА2'11 (см. ниже). Молекулярный вес этого белка, находящегося в клетке в виде мономера, составляет около 18 кДа. Нуклеотидные последовательности генов сгг, ответственных за его синтез у бактерий Е. coli и S. typhimurium, различаются лишь по трем позициям (103).

Уровень пермеаз ФТС, в большинстве случаев, повышается в присутствии в ростовой среде соответствующего субстрата. Индуцибельность характерна для маннитной ФТС, обнаруживающей высокий базальный уровень экспрессии генов, детерминирующих образование мембраносвязанных ФП. В литературе приводятся данные о стимуляции фруктозой содержания ферментов ФНА*" и ФПВС*" в 10 раз (125).

В то же время ФП глюкозоспецифичной ФТС синтезируются конститутивно. Как подробно будет сказано ниже, активность промотора, ответственного за транскрипцию гена сгг, не зависит от присутствия глюкозы в ростовой среде. До сих пор не идентифицирована регуляторная область гена ptsG Е. coli, кодирующего ФПВСё1и (104). Лишь в одной работе авторы показывают существование некоего гена umgC, сцепленного с геном ptsG, мутация в котором, по их сведениям, приводит к конститутивной экспрессии гена ptsG (74).

1.3.2. pts-onepoH.

Экспрессия pts-оперона детально рассматривается в ряде работ (36, 52, 55). Суммируя эти сведения, можно констатировать, что:

1) в с