Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические особенности патогенных и непатогенных энтеробактерий в зависимости от источников азотного и углеродногоп питания

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические особенности патогенных и непатогенных энтеробактерий в зависимости от источников азотного и углеродногоп питания"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОЗАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

На празах рукописи

пищик

Вероника Николаевна

УДК 576.8.095.31.32: 576.851.49

Ф И 3 И О Л О ГО- Б И ОХ Н М И Ч Е С к и Е ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕННЫХ И НЕПАТОГЕННЫХ ЭИТЕРОБАКТЕРИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИСТОЧНИКОВ АЗОТНОГО И УГЛЕРОДНОГО ПИТАНИЯ

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Диссертационная работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург).

Научный руководитель — кандидат биологических наук И. И. Черняева.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Р. И. Гвоздик; кандидат биологических наук Ю. С. Оследкин.

Ведущее учреждение — Институт микробиологии АН БССР (г. Минск).

Защита состоится « у » 1991 г. в час. на засе-

дании Специализированного совета Х020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, г. Санкт-Петербург—Пушкин, шоссе Подбельского, 3, ВНИИСХМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук А. Н. Зарсцкая

■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из экологических проблем современности является загрязнение окружающей среды нитратами. Загрязнение увеличило нитратную нагрузку на человека и животных /Алексеев, 1978; Ильницкий, 1988/. Вероятной причиной возрастания случаев дисбактериозов у людей и тавотных является высокий уровень нитратов в сельскохозяйственной продукции и воде. В процессе превращения нитратов в токсичные вещества - нитриты и нитрозосоединения принимают участие бактерии семейства Bnterobacteriaceao /Шле-гель, 1937; Hill, 1933/. Эти бактерии широко распространены в природе, обладают близкими физиолого-биохимическими свойствами. В семейство Enterobscteriaceae входят как сапрофитные, так и патогенные бактерии, вызывающе различные заболевания человека, животных и растений. Наиболее распространенными заболеваниями человека и животных являются желудочно-кишечные заболевания; сельскохозяйственных культур - мягкие гнили, вызываемые представителями соответствующих род<?в знтеробактерий.

Жизнедеятельность фитопатогенных бактерий, как известно, зависит от взаимоотношений их с сапрофитными бактериями /Воронкевич, 1974/ и условий питания. Поэтому уточнение различий физиолого--биохимических свойств патогенных и сапрофитных бактерий семейства Enterobacteriaceae в зависимости от условий азотного и углеродного питания является одной из актуальных проблем обо;ей и сельскохозяйственной микробиологии,

" Цель и задачи исследований. Целью работы являлось выяснение особенностей метаболизма различных' по патогенности энтеробактерий в зависимости от источников азотного и углеродного питания. В работе предусматривалось решить следующие задачи:

- выявить различия в метаболизме фитопатогенных и сапрофитных бактерий Brwiaia carotovora при развитии на средах, содержащих различные источники азотного•и углеродного питания;

- выяснить влияние различных источников азотного и углеродного питания на газообмен других патогенных и сапрофитных представителей семейства Enterobacterlacoaej

т- изучить влияние условий культивирования и различных источников азотного и углеводного питания на образование нитритов бактериями;

- исследовать возможность применения сапрофитных бактерий Sr-wluia carotovora и Agrobacterium для защиты картофеля от бактериальной гнили,' вызываемой фитопатогенными бактериями Srwisia carotovora.

Научная новизна. Экспериментально доказана различная реакция на присутствие окисленных форм азота в среде бактерий семейства Snterobacteriaceae . Развитие непатогенных энтеробактерий родов Brwinia, Bachericha, Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Cltro-bacter ингибируется при наличии нитратов и нитритов в среде. В то же время окисленные формы азота способствуют развитию патогенных энтеробактерий: нитриты стимулируют рост бактерий рода Salmo-oella , а нитраты - патогенных S.coli.

Толерантность фитопатогенных бактерий Brwinia carotovora к нитратам и нитритам объясняется тем, что они обладают более слабой нитратредуктазной активностью /по сравнению с сапрофитными бактериями/. Следовательно, фитопатогенные бактерии накапливают в среде нитриты в меньших количествах, кроме того они обладают более активной нитритредуктазой.

Показано, что при совместном культивировании на средах с нитратами изменяется процентное соотношение сапрофитных и фитопатогенных бактерий в пользу преобладания последних.

Изучена возможность применения сапрофитных бактерий Erwinla carotovora в качестве антагонистов к патогенным бактериям того же вида в вегетационном опыте при выращивании картофеля.

При исследовании соотношения сапрофитных и патогенных бактерий Erwinia carotovora в клубнях картофеля, выращенного на различном фоне азотного питания, выявлена следующая тенденция. С повышением содержания нитратов в клубнях соотношение бактерий изменилось в пользу преобладания патогенных форм. С возрастанием дозы азотных удобрений отмечалось ухудшение качества продукции /накопление нитратов, снижение лежкости, высокая поражаемость бактериа-г льными гниляыи/.

Практическая ценность. Определение газохроматбграфических характеристик развития бактерий /COgj Ogj Hg/ на средах с пептоном., .сахарами и различными источниками азотного питания позволяет усовершенствовать процесс идентификации бактерий семейства Snterobacteriaceae по родам и патогенности.

Показана возможность использования непатогенных бактерий родов Bmrioia и Agrobacterium для защиты картофеля от бактериальной гнили. Бактеризация приводила к снижении порачсаемости картофеля и повышению урожайности от 19 до 625?.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всесоюзных конференциях /Цущино, 1989; Львов, Киев, Ленинград, 1990/, на ученом совете ВНИИСХМ /1990 г./, а также используются в лекционном курсе на кафедре агрохимии ЛГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "Объекты и методы исследования", четырех глав, содержащих результаты исследований и их обсуждение. Работа напечатана на lbq страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц, Ц рисунков и Ю фото. В списке литературы 2.05 названий, из них 96 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В главе рассматриваются вопросы накопления нитратов в окружающей среде, особенности нитратредуктазных систем микроорганизмов, биологические свойства и вопросы классификации энтеробактерий.

Плава П. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактерии семейства Enterobacteriaceae , различной патогеннос-ти, используемые в работе,были получены из коллекций Института микробиологии и вирусологии им.Заболотного АН УССР, Всесоюзного института защиты растений, Всесоюзного института сельскохозяйственной микробиологии, Института микробиологии и вирусологии им. Пастера, Белорусского государственного университета. В работе было исп'ользовано свыше 135 штаммов энтеробактерий.

В опытах по изучению газообмена состав газовой фазы и концентрации компонентов /СО^; Og," Hg; N20; N2s CgH^/ определяли на газовых хроматографах типа "Хром-4" и "Цвет" по методическим указаниям /Широкова, Евдокимов, 1981/. Бактерии выращивали в течение трех суток при температуре 20°С д стеклянных флаконах, емкостью 50 мл, на 20 мл жидкой питательной среды.

В исследованиях применяли питательные среды Омелянского, Хыо--Лейфсона, Деберрей, мясопептонный бульон, сусло-отвар и др. /Hugh , Leifson , 1953; Пименова, Гречушкина, Козлова, 1976/.

В минеральных средах заменяли источники азотного и углеродного питания: восстановленную форму азота на окисленную в виде нитратов и нитритов; вводили различные источники углеродного питания. В органические среды вносили добавки: K-NH^ - I г/л, и-ко, -1,3 г/л, IJ-H02 - 0,9 г/л, пептон - 10 г/л.

При изучении условий аэрации на образование нитритов, бактерии культивировали в течение трех суток в 300 мл колбах в стационарных условиях и на ротационной качалке при 80 об/мин.

Концентрацию нитратов и рН определяли потенциометрическим спо- • собом, численность бактерий определяли методом предельных разведений /Селибер, 1962/ и фотокалометрическим. Концентрацию глюкозы ' измеряли калориметрически: по методу с применением 2,3,5 трифенил-тетразолеума хлорида /Майорова, 1971/. Концентрацию нитритов определяли методом Грисса /Егоров, 1937/.

Для разделения вирулентных и авирулентных бактерий Erwinia carotovora при их совместном культивировании использовали метод Фридмана /Friedman , 1964/ в модификации Лазарева A.M. /1985/, а также реакции коагглютинации /Kronvall , 1973/ и иымунофлюорес-ценции /Allan, Kelman , 1977/.

Для выявления влияния бактерий - антагонистов на урожай картофеля проводили вегетационные опыты в течение двух лет. ■

Использовали хорошо окультуренную, слабосуглинистую дерково--подзолистую почву с высоким уровнем плодородия. Удобрения вносили по методическим указаниям ЛСХИ /1975/. Азотные удобрения вно-. сили из расчета: 0; 90; 180 /кг/га/ в форме мочевины /1939 г./ и аммиачной селитры /1990 г./. Фосфорные /СаНРО^/ и калийные /КС1/ вносились из расчета: РК - 90 кг/га. При набивке сосудов в качестве известкующего материала вносили мел.

Инфекционный фон и бактеризацию создавали, замачивая клубни картофеля на 15 минут в суспензии бактерий, плотностью 1x10^ кл/мл культуральной жидкости. Бактерии выращивали на мясолептонном бульоне, затем наносили на разрезы на клубнях и в лунки по 10 мл соответственно по вариантам опыта. Бактеризацию проводили по рекомендации сотрудников ВИЗР. В опытах использовали картофель сор-.тов "Детскосельский" и "Приекульский ранний". Статистическую обработку данных с помощью дисперсионного анализа проводили по Дос-пехову /1985/ с использованием вычислительной машины "Электроника ДЗ-28".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава Ш. ВЛИЯНИЕ ИСТОЧНИКОВ АЗОТНОГО И УГЛЕРОДНОГО ПИТАНИЯ НА МЕТАБОЛИЗМ БАКТЕРИЙ РОДА ЕШ1Н1А

В работе экспериментально доказано, что авирулентные и слабовирулентные штаммы Егу/1п1а сагоЬоуога практически на всех использованных средах /за исключением сред содержащих аланик, аспарагин и картофельную мезгу/развивались лучше сильновирулентных, что согласуется с данными, полученными другими исследователям!! /Рамадан, 1977; Лазарев, 1985/. В процессе ферментации Сахаров авирулентные штаммы продуцируют в значительных количествах СО^; Нр, интенсивно поглощают О,,. Вирулентные штаммы характеризуются слабой гидроге-назной активностью. Бактерии ЕпЛп1а саго-Ьоусга при развитии на средах, содержащих белковые источники и органические спирты, водород не продуцировали.

. Показано, что нитраты и нитрита подавляют развитие ненатоген-ных бактерий Епг1п1а саго-Ьоуога , незначительно влияя на патогенные. 3 присутствии нитратов и нитритов резко уменьшается интенсивность дыхания, потребление сахара и численность авирулент-ных бактерий Егяап1а сагойоуогг , тогда как данные показатели для сильновирулентных бактерий этого же вида практически не меняются /рисЛ/. Нитраты ингибирувт продуцирование водорода бактериями .

При изучении способности бактерий Егте1п1а сагоЬоуога продуцировать этилен, оказалось, что вирулентные бактерии являются более активными этяленпродуцентами', несмотря на их меньшую численность. Возможно, этилен способствует патогенезу при поражении растений бактериям!! рода Еги1п1а. Продуцирование этилена уменьшается с увеличение!! концентрации нитратов в среде.

Разная реакция на введение нитратов в среду приводит к изменению соотношения вирулентных и авирулентных бактерий ' сагоЬоуога при их совместном культивиротзании /табл.1/. При замене восстановленной формы азота окисленной уменьшается общая численность бактерий Егтсхп1а сагаЪоуога п 3,5 раза. Причем количество авирулентных бактерий уменьшается приблизительно в иесть раз, тогда как вирулентных - в два раза.

20 15 Ю 5

0 5 10

8.0 6.0 Чо 2.0

Выделено ССЬ о5. %

2 5 Ч 5

исалг.

В

Поточено Оц

Об.%

Потреблено

ГЛЮ*.0ЪЬ{,НГ/МА.

ш

4 5"

нсРо.5-г.о

Щ

П&БО^0^ лш

ЛйнРалеитные . бивалентные

Рис.1. Влияние источников азотного питания на интенсивность газообмена и потребление глюкозы бактриями Егяшха . caгotovora

Варианты: 1. Глюкоза +

2. Глюкоза + НН4Т + К03

3. Глюкоза + ИН4+ ♦ Н02"

4. Глюкоза + пептон + НН^*

5. Глюкоза + пептон + ИН4+ + Н0?"

6. Пептон + нн4+

4

3

Таблица I

Влияние источников азотного питания на соотношение авирулентных /11800/ и вирулентных /П884/ оактериЯ Егет1п1а саго*;о-уога /в основе среда Омелянского/

Источник Количество колоний Соотношение. %

питания Вс0ГО В том числе П880 П884

П880 П884

488 284 204 58 42

141 48 93 34 66

НС И о. 05 13 12» Количество вирулентных бактерий Еот1п1а саго-Ьоуога /штамм.П884/

при совместном культивировании с авирулентными /П880/ на среде Омелянского с нитратами составляет семьдесят процентов, в то время как при развитии на стандартно? среде Омелянского ./с восстановленной формой азота/количество вирулентных бактерий /П884/ составляет лишь 40% от общей численности. При дальнейшем пересева на аналогичные среды соотношение бактерий стабилизируется. Вероятно, происходит адаптация бактерий к условиям среды. Подобные результаты были получены'при использовании мутантных бактерий Ег»1п1а сагоЪоуога с ослабленным пектатлиазным комплексом /36 Л/544/. Нитраты изменили соотношение в пользу преобладания исходного сильновирулентного штамма /36 А/ /с 36$ на восстановленной форме азота до 66$ на окисленной форпэ азота/. Аналогичные тенденции по влиянию нитратов на развитие бактерий.были по- , лучены и для других видов рода Егзг3.п1а.

Дополнительное введение Сахаров в среду с пептоном приводит к 'активации развития преимущественно непатогенных бактерий рода Егт71п1&. Различная реакция авирулентных и вирулентных бактерий • рода Ете1п1а на дополнительное введение сахаров в среду связана, по-видимому, с различиями в их ферментном комплексе. Авирулентные бактерии'обладают преимущественно "сахаролитическими" ферментами, тогда как для вирулентных бактерий более характерны протеолитиче-ские ферменты. В литературных источниках имеются сведения.о том, что протеолитические ферменты широко распространены среди фито-патогенных бактерий./Рагозина, 1970/. Предполагается их.участие на начальном этапе развития патогенеза.

Глава 1У. ВЛИЯНИЕ ИСТОЧНИКОВ АЗОТНОГО И УГЛЕРОДНОГО ПИТАНИЯ НА МЕТАБОЛИЗМ ДРУГИХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА EHTEROBACTE-

НХАСЕДЕ

Исследования показали, что другие представители семейства Enterobacter iaceae на дополнительное введение Сахаров и окисленных форм азота в среду реагируют подобно бактериям рода Erwinia.

Непатогенные бактерии В.coli резко увеличивали интенсивность выделения COg /в 1,5-3 раза/ и количество продуцируемого водоро- ■ да у них было на порядок вьте, чем у патогенных. В то же время патогенные E.coli практически не реагировали на введение сахара в среду.

Нзпатогенные Enterobacter и Klebsiella вели себя аналогично непатогенным бактериям рода Erwiziia и E.coli. В то асе время, при добавлении в среду глюкозы патогенные бактерии рода Salmonella незначительно увеличивали продуцирование COg'/рис.2/. Вероятно, разная реакция патогенных и непатогенных бактерий на дополнительное введение Сахаров в среду с пептоном может служить экспресс-методом отбора и первичной оценки различных по патоген-ности бактерий семейства Enterobacteriaceae. Различная реакция на добавление углевода в среду связана, вероятно, с различиями в их ферментном комплексе. Авирулентные бактерии обладают преимущественно сахаролнтическим ферментным комплексом, тогда как для патогенных бактерий, по-видимому, более характерны протеолитичес-кие ферменты.

" При изменении восстановленной формы азота на окисленную реакция бактерий - других представителей семейства Ent.e'robacteria-сеае была, подобна'реакции бактерий рода Erwinia . При введении в среду нитратов ингибируется развитие непатогенных E.coli и преимущественное развитие получают патогенные бактерии.

Развитие непатогенных энтеробэктерий, таких как Enterobacter ■ aakar, Enterobacter citrovoruir и других, а также близких к ним по физиолого-биохимичееким показателям клебсиелл подавляется в присутствии нг.тратов и нитритов. Нитриты способствовали развитию, патогенных бактерий рода Salmonella /рис.3/.

Таким образом, у патогенных и непатогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae отмечена разная реакция на присутствие нитратов и нитритов в среде. Нитраты и нитриты ингибируют непатогенные

40

20

&ыАепено СО^.

П атогенные

Л

X. •

"Ч \

П

1

Напатогенгте

ЬМгяопеНа гпК ЬъсЬ'ПсИ'.а. 1:гк)1гн<1. СгиЛлга

соЦ сигсшога. ЬегЬ|со1а.

яэ-1 о ьг п&чп

У

г^г

4

ЕьсЬе ЕпНгоШсНГ;

сиг -

Рис.2. Влияние различных источников питания на продуцирование СС>2 бактериями семейства ЕпЪегоЬасЪег1асеае

Условные обозначения О пептон ЕЭ псптоц* гллкоьа ЕЗ пептон»глю<оъа »//-УОа

Нги/.П| з саг. П

Е.соИ ЬгИщопеИа 01 бч ел ¡¿ела 2 Патогенной

£.со1| Рп^сгоЬас^-ег 1-127 «ка-гП-бУ/

Не па гоГснно¡.е

ХЛг _ слг-.

гто

Рис.3. Влияние нитратов и нитритов на продуцирование С02 бактериями семейства Sntвrobaot0гiaceaв

Условные обозначения □ ц-инн ЕЗ Л/.А/Съ

бактерии семейства Enterobacteriaceae. В то же время нитраты способствуют развитию патогенных E.ooli и Erwinia carotovora, а нитриты способствуют развитию бактерий рода Salmonella.

На основании полученных данных можно предположить, что одной из причин дисбактериоза у людей и животных,.повышения поражаемос-ти растений бактериальными гниляыи являются повышенный уровень нитратов в пищевых продуктах, в воде и почве. Экспериментальные данные по газообмену бактерий рода Klebsiella свидетельствуют, что бактерии, выделенные из больногЬ и здорового организма не различались по реакции на добавление Сахаров и окисленных форм азота в среду с пептоном. Аналогичная тенденция отмечена для бактерий рода Citrobacter. Полученные данные подтверждают, что бактерии родов Klebsiella и Citrobacter являются условно патогенными организмами и их локализация в очагах инфекции есть следствие дисбактериоза. Результаты работы согласуются с исследованиями, выполняемыми в Институте эпидемиологии и микробиологии им.Пастера.

Бактерии рода Proteus , которые также выделяют при дисбакте-рнозах'кишечника, практически не реагируют на введение Сахаров и нитратов. Вероятно, это связано с тем, что бактерии рода Proteus обладают мощным протеолитическим комплексом.

Результаты наших исследований показали, что различные представители родов бактерий семейства Enterobacteriaceae отличаются по газовым характеристикам при развитии на средах с углеводами. Это может быть использовано для целей усовершенствования процесса идентификации энтеробактерий по родам. Кроме того, нами было показано, что на дополнительное введение к среде с пептоном сахароз, а также на присутствие нитратов и нитритов в среде реагируют, преимущественно, энтеробактерии, обладающие бутандноловым типом сбраживания Сахаров /такие,как Enterobacter, Klebsiella , Berrat.ia и другие/. В то те время энтеробактерии, осуществляющие 'брожение смешанного типа, к которым преимущественно относятся патогенные формы /такие, как Salmonella, Escherichia, Shigella фитопатогенные бактерии рода Erwinia / как правило не реагируют на введение в среду с пептоном И-НО,, N-H02 и сахаров.

Глава У. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ АЗОТНОГО И УГЛЕРОДНОГО ПИТАНИЯ И УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ШТРАТРВДУКТАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ EAKTITllü СЕмЕЛСТВА EKTEROBACTERIACEAE Установлено, что непатогенные бактерии Erwinia carotovora,. обладая более "активней нитратредуктаэой, образует балыке нитритов

по сравнению с патогенными бактериями. В то же время нитритредук-таза более активна у патогенных бактерий, что объясняет их толерантность к нитратам и нитритам. С увеличением концентраций окисленных соединений уменьшается численность бактерий и активность их нитрат- и нитритредуктаз. Бактерии Erwinia carotovora восстанавливают нитраты до нитритов и закиси азота, причем авирулентные бактерии образуют Н20 в 3-5 раз больше вирулентных. Следует отметить, что в большинстве случаев редукция нитратов для вирулентных бактерий завершается стадией образования нитритов.

Не обнаружена способность к диссимиляционному образованию аммония у исследуемых штаммов B.coli и Klebsiella , что вероятно, объясняется биологическими особенностями представленных штаммов и условиями культивирования.

При использовании цитрата натрия в качестве источника углеродного питания увеличивается нитратредуктазная активность бактерий, что согласуется с результатами других исследователей /Тохвер, 1976/. Кислород оказывает большое влияние на нитратредуктазную активность бактерий /табл.2/.

Таблица 2

Нитратредуктазные системы бактерий семейства Enterobacterlaceaa /в основе среда Омелянс-кого НН^, /

Вариант И02~3мг/мл Усвоено N-HOj. ,% Усвоено н-нн4 % . Оптическая плотность к.лс.

авирулентные

Erwinia аэр. 3,3 7 ■ .60 1,30

carotovora стац. 154-, 0 37 8 0,68

сильновирулентные

Erwinia аэр. 0,35 5 55 1,35 .

carotovora стац. 92,0 59 б 0,72

Enterobacter аэр. 5,0 10 38 1,39

ер-. стац. 90,8 75 13 0,57

Escherichia .аэр. 5,1 9 42 1,52

coli стац. 128,5 , 65 Ю С,65

При одновременном присутствии восстановленной и окисленной форм азота в условиях аэрации среды происходит преимущественное

усвоение аммонийного азота изучаемыми бактериями, снижается их чувствительность к нитратам, возрастает численность.

Глава У1.' ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САПРОФИТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В КАЧЕСТВЕ АНТАГОНИСТОВ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ И МЕДИЦИНЕ

Для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных, вызываемых бактериями семейства Katerobacteria-ееае применяют микробиологические препараты.'В качестве таких пробиотичгских организмов применяют'непатогенные изаметы тех же видов, которые вызывают инфекцию, например E.coli . Предполагают, что защитный эффект этих бактерий связан с соревнованием за экологическую нишу -/Duval-Iflah et al. /.

Возможно, подобная конкуренция будет наблюдаться при применении непатогенных изолятов в растениеводстве для защиты растений. В вегетационных опытах была изучена возможность применения сапрофитных бактерий Erwinia caxotovora для защиты картофеля от поранения мягкой гнилью,вызываемой фитолатогеяными бактериями этого , пе. вида-. Бактерии рода Agrobacteriuia были использованы для сравнения, как хорошо известные антагонисты, с успехом применяющиеся при бактеризации/

При исследовании соотношения сапрофитных и патогенных бактерий Erwiüia carokovora выявилась следующая тенденция. С повышением содержания нитратов в клубнях картофеля соотношение бактерий изменяется в пользу патогенных форм. Так, при выращивании картофеля, без азотных удобрений содержание нитратов в клубнях составляет 13,5 мг/кг, а количество патогенных бактерий Erwinia carotovora - При дозе азота 90 кг/га в клубнях содержится 25,1 мг/кг нитратов, количество патогенных бактерий возрастает до 45S. При дозе удобрений 180 кг/га количество нитратов составляет в клубнях 126,3 мг/кг и отмечается максимальное количество патогенных бактерий - 60$. С возрастанием дозы азотных удобрений независимо от их формы и сорта картофеля отмечалось ухудшение качества продукции и более высокая поражаемость бактериальными гнилями, снижение легкости картофеля. При создании провокационных условий при месячной инкубации с увеличением дозы удобрений сгнило соответственно - 20, 50, 90% исследуемого материала. При обработке клубней бактериями- антагонистами отмечалось улучшение качества продукции и возрастание урот.ая /рис.4/. Наибольшую эффективность бпктерш-антагсиксты показали при высоких дозах лэетных удобре-.

НСР0,05- Ш.& HC.Po.Oo = НСРо.оз- и.9

Рис.4. Влияние бактерий родов Ег»1п1а и АкгоЬас*;ег1ша . На урожай картофеля /Приекульский, Г990 г./

Условные обозначения

к - контроль без инокуляции

ф - инфекц.фон - саго1;оуога Л8£Й

Бактерии-антагонисты: 1. 36 А/544 - слабовирул.Кш1п1а

саго'Ьоуога

2. Егетз.п1а carotovora - авирул.П880

3. Ест»1а1а сагоЪоУога С853 - авирул.

4. АвгоЪасЪе1-1шя зр. 12-6

5. АбгоЬас^еПша зр. 03.

ний и на инфекционном фоне. В этом случае прибавка урожая в зависимости от вида бактерий достигала от 19 до 62$. Высокая конкурентноспособность, сапрофитных бактерий по отношению к патогенным в условиях вегетационных опытов обеспечивала снижение поражаемости растений и увеличение урожая. Результаты вегетационных опытов показывают возможность применения бактерий-антагонистов родов Erwi-nia и Agrobacterium для защиты картофеля от поражения мягкой гнилью при высоких дозах азотных удобрений.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что нитраты и нитриты ингибируют развитие авиру-лентных бактерий Erwinia carotovora , не оказывая существенного влияния на вирулентные, при совместном культивировании смещают соотношение в пользу преобладания последних. Это проявляется в уровне потребления глюкозы, продуцирования этилена и водорода, изменении численности бактерий и интенсивности их дыхания.

2. Отмечена аналогичная закономерность для других бактерий '

' семейства Enterobaoteriaceae. Развитие■непатогенных видов Escherichia, Enterobacter»Erwluia подавляется в присутствии нитратов и нитритов, тогда как нитриты способствуют развитию, патогенных бактерий рода Salmonella , а нитраты - патогенных B.coli.

3. Показана разная реакция авирулентных и вирулентных бактерий ■ семейства Enterobaoteriaceae на дополнительное введение в среду

с пептоном Сахаров, а именно: активизируется развитие преимущественно непатогенных бактерий этого семейства. Выявленные тенденции могут стать основой ускоренного метода первичной оценки бактерий семейства Enterobaoteriaceae на патогенность.

4. Условная патогенность бактерий родов Klebsiella и Citrobacter подтверждена опытным путем. Бактерии рода Klebsiella » независимо от источника выделения,не различались по реакции на добавление свхаров и окисленных форм азота в среду с пептоном. Аналогичная реакция выявлена для бактерий рода Citrobacter.

5. Полученные экспериментальные данные по газовым характеристикам /соотношению CO«; Hgj 0^/ при развитии бактерий на средах с пептоном и сахарами и различными источниками азотного питания позволяет усовершенствовать' процесс идентификации бактерий семейства Euterobecteriaceae по родам.

6. Установлено, что непатогенные бактерии Erwinia carotovora, обладая активней нитратредуктазой, образуют больше нитритов, по

К

сравнению с патогенными бактериями. В то же время нитритредуктаза более активна у патогенных бактерий, что объясняет их толерантность к нитратам и нитритам.

7. Показано, что кислород, ингибируя диссимиляцию нитратов и нитритов,снижает чувствительности энтеробактерий к присутствию окисленных форм азота. При одновременном присутствии аммонийной и нитратной форм азота и постоянной аэрации среды преимущественно усваиваются ионы аммония.

"8. Результаты вегетационного опыта показывают, что с возрастанием дозы азотных.удобрений /независимо от их формы и сорта картофеля/ отмечалось ухудшение качества продукции, более высокая поражаемость бактериальными гнилями, снижение легкости картофеля. С повышением содержания нитритов в клубнях картофеля соотношение бактерий изменяется в пользу преобладания патогенных форм Впг1п1а сагсботога.

9."Доказана возможность применения бактерий-антагонистов родов Ег«г1п1а и 1вгоЪасЪег1ша для защиты картофеля от поражения мягкой гнилью при высоких дозах азотных удобрений.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Пищик В.Н., Зуева Т.П. и др. Влияние, состава питательной среды на физиолого-биохимические свойства бактерий Вги1п1а рйуЬо-рЪЪога. Вестник ЛГУ, серия 3, вып.4 /5*24/ - 1907. - с.114-115.

2. Пищик В.Н., Черняева И.И. и др. Влияние нитратов на физиолого-биохимические свойства бактерий Ег«1п1а р1цгЬорМ;11ога. Вестник ЛГУ, серия 3, вып.4 -№24/. - с.92.

3. Пищик .В.Н., Черняева И.И. Метаболизм бактерий рода Е гиЛта.

в'зависимости от источников азотного и углеродного питания. Тезисы докладов Всес.конф. "Регуляция микробного метаболизма". Цущино, 1989. - с.167.

4. Пищик В.Н., Черняева И.И. Влияние нитратов на метаболизм различных по патогенности бактерий рода Еп*1п1а. Тезисы докладов Всес.конф; "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде". Пущино, 1989. - с.108.

5. Черняева И.И., Пищик В.Н. Сахаролитические и протеолитичес-кие свойства сапрофитных и фитбпатогенных бактерий рода Ег»1п1а. Тезисы докладов Всес. конф. "<5итон• <ды.' Бактериальные болезни растений". Киев - Львов, 1990. - с.14-15.

6. Черняева И.И., Пищик В.Н. Отношение к нитратам и нитритам патогенной и непатогекиой микрофлоры. Тезисы докладов П Всес. симпозиума по экологической онкологии, Киев, 1990. - с.42.

7. Черняева И.И., Пищик В.Н. Влияние азотных удобрений на соотношение фитопатогеиной и сапрофитной микрофлоры. Тезисы докладов Всес. совещаяия "Перспективы создания экологически чистых технологий возделывания сельскохозяйственных культур". Ленинград, 1991.

- с.59.

РТП.Тип.сО.¿ак.ГЧ,.Тар..С.11. £7.3.'.Л

г.'ЗСЧЛй'ГП.