Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточные пектатлиазы бактерий рода ERWINIA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточные пектатлиазы бактерий рода ERWINIA"

' АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

Р Г Б О А

2 О

УДК 579.22: 579.25: 573.6.086.83

ЕВТУШЕНКОВ АНАТОЛИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПЕКТАТЛИАЗЫ БАКТЕРИЙ РОДА ЕИ\У1МА

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Минск - 1997

Работа выполнена на кафедре микробиологии Белорусского государственного университета

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Фомичев Ю.К.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Цыганков, доктор биологических наук, профессор А.И. Нетрусов доктор биологических наук А.И. Зинченко

Оппонирующая организация - Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Москва)

Защита состоится 1997 г. ч.

на заседании совета по защите диссертации Д 01.34.01 в Институте микробиологии АНБ по адресу: 220141, г. Минск, Жодинская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан .9?..Р......

Ученый секретарь /

совета по защите диссертаций к.б.н. Л.И. Стефанович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основными факторами вирулентности для пектолитических видов бактерий рода Erwinia являются внеклеточные деполимеризующие ферменты, в том числе пектолитические, целлюлолитические, протеолитические, а также некоторые другае, роль которых до конца не выяснена (Barras et al., 1994). Важную роль как фактора вирулентности среди пектолитических ферментов бактерий рода Erwinia играет пектатлиаза, представленная несколькими изоферментами (Kotoujansky, 1987). В начале наших исследований имелись лишь разрозненные сведения о синтезе пектатлиаз штаммами бактерий рода Erwinia и отсутствовал сравнительный анализ изоферментов, продуцируемых основными пектолитнческнми видами Erwinia, что и послужило поводом для проведения широкого сравнительного анализа препаратов пектатлиаз бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica, а также выяснения основных закономерностей регуляции их синтеза. Анализ имеющейся информации по проблеме показывает, что регуляторные механизмы синтеза ферментов изучены, в основном, для внутриклеточных ферментов и, в меньшей степени, для секретируемых из клеток • в среду. Пектатлиазы бактерий рода Erwinia являются удобной моделью для изучения основных закономерностей синтеза и секреции внеклеточных ферментов, что крайне важно для решения как общебиологической проблемы секреции клетками белков, так и для решения частных проблем биотехнологии.

Спектр пектолитических ферментов, продуцируемых бактериями рода Erwinia, чрезвычайно широк и разнообразен, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных продуцентов этих веществ (Rombouts, Pilnik, 1980). Пектолитические ферменты, продуцируемые бактериями рода Erwinia, могуг найти применение в пищевой промышленности, сельском хозяйстве и научных исследованиях. Деполимеразы, катализирующие расщепление полимеров растительной клеточной стенки, незаменимы в процессах переработки растительного сырья, таких как получение льноволокна, изолированных растительных клеток, протопластов. Поскольку пектолитические ферментные препараты в Республике Беларусь не производятся, представляются актуальными поиск и селекция соответствующих продуцентов, оптимизация условий- их культивирования, разработка регламентов получения ферментов и применения. Успешное решение указанных вопросов будет способствовать развитию отечественной биотехнологии.

Основные бактериозы, характерные для Беларуси- это мягкие шили и "черная ножка" картофеля, возбудителями которых являются Е.сапЯоуога яиЬзр. сагоЮуога и Е. сагоюуога эиЬйр. аКоэерйса, соответственно. Особенно значительные потери картофеля наблюдаются при поражении бактериями Е. сагоюуога БиЬэр. аитеерПса, которые способны поражать растения как в период вегетации, вызывая сосудистый бактериоз "черную ножку" картофеля, так и при хранении в зимнее время, провоцируя мягкие гнили (Дорожкин, 1974). Несомненно, что изучение факторов вирулентности данных микроорганизмов будет способствовать пониманию механизмов взаимодействия патогенов с растениями и выработке эффективных методов защиты от инфекций. (

Связь_работы_с_крупными_наузными_программами, темами.

Диссертационная работа выполнена на кафедре микробиологии Белгосуниверситета в течение 1981-1995 гг. как часть плановых тем: № 81012682 "Изучение переноса генетического материала и его выражение в гомологичных и гетерологичных системах грамотрицательных бактерий" (1981-1985); № 01860002420 "Изучить генетическую организацию грамотрицательных фитопатогенных бактерий и бактерий, утилизирующих одно- и двууглеродные соединения" (1986-1990); № 01860000064 "Разработать эффективный способ первичной обработки льносырья на основе изучения регуляции синтеза пектатлиаз клетками бактерий рода Епмша; выдать заинтересованным организациям рекомендации по практическому использованию этого способа" (1986-1987г.г.); № 01910035949 "Изучение детерминант вирулентности и сравнительный анализ организации геномов бактерий рода Егтша" (1991-1995); "Генетическое и биохимическое изучение фосфоенолпируват-зависимой

глюкозофосфотрансферазной системы Егшгпа сЬгузатЬегш и ее участие в регуляции синтеза и секреции внеклеточных эидопектатлиаз и эндоглюканазы"( 1994-1995), финансировавшейся Международным научным фондом (гранты ЮУАООО, ИЛМАЗОО); № 736/57 "Изучение генетической организации и особенностей регуляции детерминант вирулентности бактерий Ег\У1ша сагоЮУога " (1996-1998).

Цел;, и задачи исследования. Цель работы: сравнительный анализ пектатлиаз Е. сИгувалЛегш, Е. сагоцп'ога БиЬБр. сагоюуога и Е. сагоюуога виЬэр. аиоверНса, установление закономерностей продукции внеклеточных пектолических ферментов бактериями Е. сЬгуБагиИегш, Е. саго^уога виЬэр. сагоюуога и Е. сагоюуога вчЬвр. аихиерНса, выявление молекулярно-гсиетических особенностей регуляции их синтеза и секреции, направленное получение высокоактивных продуцентов пектатлиазы для практического использования.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

-разработка методов очистки н электрофоретического анализа изоферментов пектатлиазы;

-анализ нзофермешнот состава иектатлиаз у разных видов фитопатогенных бактерии рода Ег\уша;

-выяснение влияния факторов среды на синтез пектатлиаз и изоферментный состав;

- изучение рефляции синтеза и секреции пектатлиаз;

- клонирование генов пектатлиаз бактерий рода Егшша и изучение их экспрессии в гомологичных и гетерологпчных системах;

-отбор бактерий, высокоактивных продуцентов ферментов;

-получение ферментных препаратов мацерирукнцего действия и оценка перспектив их применения.

Научная новизна полученных результатов. Впервые проведено сравнительное изучение изоферментного состава и свойств внеклеточных пектатлиаз бактерий Е. ЛгуБатЬегш, Е. сагоюуога БиЬяр. сагоюуога и Е. сагоюуога БиЬхр. ат^ер^са, что позволило идентифицировать 12 групп изоферментов пектатлиазы, различающихся основными физико-химическими свойствами. Причем у бактерий Е. сагоюуога БцЬяр. сагоюуога и Е. сагоюуога БиЬвр. агпкериса выявлены лишь- небольшие различия в нзоферментном составе пектатлиаз. Показано, что обязательным компонентом пектолитического комплекса бактерий Е. сЬгувапИтепи является пектннметилэстераза, а у бактерий Е. сагоюуога виЬвр. сагоюуога и Е. сагоюуога виЬБр. аиояерПса таким компонентом является эндополигалактуроназа.

Изучена регуляция синтеза пектатлиаз у бактерий Е. сЬгузатЬет!, Е. сагоюуога Б^р. сагоюуога и Е. сагоюуога виЬБр. аигаерйса и установлено, что синтез данных ферментов индуцируется пектиновыми веществами и подвержен катаболнтной репрессии глюкозой. Выявлены различия в степени индукции и чувствительности к катаболнтной репрессии глюкозой отдельных изоферментных форм пектатлиазы. Наиболее "регулируемыми" ферментами оказались пектатлиазы ЕсЬ4 и ЕсЬ5 бактерий Е. сЬгуБапШет» и ЕсаЗ и Еса4 у клеток Е. сагоюуога яиЬяр. саго(о\'ога н Е. сагоюуога БиЬзр. аГгояер^са. Синтез других изоферментов в меньшей степени индуцируется пектиновыми веществами и репрессируется глюкозой. Показано, что варьируя состав питательных сред для культивирования бактерий, можно нолучап. ферментные препараты с определенным набором изоферментов.

Впервые получены мутанты Е. сЬгузашЬепн ENA49, резистентные к катаболнтной репрессии глюкозой и характеризующиеся повышенной

продукцией пектатлиаз (полученные штаммы защищены авторскими свидетельствами). Аналогичные мутации были индуцированы у бактерий Е. carotovora subsp. atroseptica 36А.

Изучены организация и некоторые свойства фосфоенолпируват-зависимой глюкозофосфотрансферазной системы Е. chrysanthemi и определено ее участие в регуляции синтеза и секреции внеклеточных эндопектатлиаз. Проведено молекулярное клонирование и частичное секвенирование ptsl гена бактерий Е. chrysanthemi ENA49.

Клонированы структурные гены основных изоферментов пектатлиазы бактерий Е. chrysanthemi ENA49 и Е. chrysanthemi ЕС 16, Е. carotovora subsp. carotovora 17А и Е. carotovora subsp. atroseptica 36А и изучена экспрессия пектатлиазных генов в клетках бактерий Escherichia coli и Erwinia.

Впервые для изучения феномена секреции пектатлиаз были использованы клонированные гены бактерий Erwinia, что позволило выявить некоторые особенности процесса: специфичность системы секреции пектатлиаз определенного вида бактерий и двухстадийность процесса секреции (первая стадия - экспорт через цитонлазматическую мембрану, вторая стадия - секреция через наружную мембрану), причем эффективность секреции пектатлиаз гораздо выше через цитоплазматнческую мембрану, чем наружную. Получены мутанты с измененной секрецией пектатлиаз и выявлены некоторые различия в составе мембранных белков клеток дикого типа и мутантных бактерий.

Практическая значимость_полученных_результатов. Созданы

перспективные в промышленном отношении продуценты пектолитических ферментов. Штаммы Е. chrysanthemi ENA49, обладающие повышенным уровнем синтеза внеклеточных пектатлиаз и резистентные к катаболитной репрессии глюкозой, защищены авторскими свидетельствами. Разработан и защищен авторским свидетельством способ твердофазной ферментации льносоломки с использованием бактерий Е. chrysanthemi, позволяющий повысить выход длинного льноволокна и сократить время процесса мацерации. Разработана дешевая питательная среда для выращивания бактерий, предназначаемых для процесса твердофазной ферментации льносоломки (а.с. 1307845). Разработаны методы получения растительных протопластов и изолированных клеток растений с использованием пектолитических ферментных препаратов бактерий рода Erwinia (на способы получены патенты Российской Федерации).

Метод электрофоретического анализа изоферментов пектатлиазы используется сотрудниками и студентами кафедры микробиологии и лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов в научных исследованиях. Разработанные методы селекции штаммов-продуцентов

пектатлиаз, мутантные штаммы Erwinia используются при проведении лабораторных занятий по спецкурсам и спецпрактикумам.

Выявленные особенности регуляции синтеза и секреции изоферментов пектатлиаз - основных факторов вирулентности бактерий рода Erwinia, расширяют наши знания о физиологии патогенов растений и могут быть использованы для разработки специфических средств защиты растений от мягких гнилей.

- высокоактивных продуцентов пектнндеполимераз, н разработанный на их основе способ приготовления льноволокна из льносоломкн, новые ферментные препараты мацерирующего действия и методы получения протопластов и растительных клеток для научных исследований и нужд промышленности являются коммерческими продуктами и могут быть реализованы заинтересованным предприятиям и организациям.

Внеклеточные пектатлназы бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica различаются по физико-химическим свойствам, образуя 12 групп изоферментов (6 групп среди бактерий Е. chrysanthemi и 6 групп для Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica). Все изученные штаммы бактерий Е. carotovora subsp. carotovora н Е. carotovora subsp. atroseptica обладают полным набором указанных изоферментов, в то время как у разных штаммов Е. chrysanthemi отмечаются существенные различия в нзоферментном составе пектатлиаз, что отражает биологическую гетерогенность этого вида бактерий. Обязательным компонентом пектолнтического комплекса бактерий Е. chrysanthemi является пектинметнлэстераза, а у бактерий Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica - эндополигалактуроназа.

Синтез пектатлиаз у бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica индуцируется пектиновыми веществами и подвержен катаболитной репрессии глюкозой. В наибольшей степени это выражено в отношении изоферментов Ech4, Ech5 Е. chrysanthemi, и ЕсаЗ, Еса4 Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica. Синтез других изоферментов в меньшей степени индуцируется пектиновыми веществами и репрессируется глюкозой. Изменение состава питательных сред культивирования бактерий приводит к продукции ферментных комплексов определенного состава.

Новые продуценты пектатлназы штаммы Е. chrysanthemi, резистентные к катаболитной репрессии глюкозой и с повышенной продукцией пектатлиаз, отличаются от ранее известных набором ферментов и активностью последних.

Фосфоенолпируватзависимая глюкозофосфотрансферазная система бактерий Е. chrysanthemi участвует в регуляции синтеза и секреции внеклеточных эндонектатлиаз.

Экспрессия клонированных структурных lenoo основных нзоферментов пектатлиаз Е. chrysanthemi ENA49 и Е. chrysanthemi ЕС 16, Е. carotovora subsp. carotovora 17А и Е. carotovora subsp. atroseptica 36А в клетках бактерии Е. coli и Erwinia выражена в разной степени, что свидетельствует о наличии у бактерий рода Erwinia иных механизмов регуляции синтеза пектатлиаз. Об этом же свидетельствует возможность получения мутантов с повышенной продукцией пектатлиаз. Использование клонированных генов пектатлиаз бактерий рода Erwinia для изучения феномена секреции позволяет выявить некоторые особенности этого процесса: специфичность системы секреции собственных пектатлиаз и двухстадийность процесса секреции (вначале секреция через цитоплазматическую мембрану, затем - через наружную), причем эффективность секреции пектатлиаз гораздо выше через цитоплазматическую мембрану, чем через наружную.

Новый способ твердофазной ферментации лыюсоломки с использованием бактерий Е. chrysanthemi позволяет существенно сократить время мацерации.

Пектолитические ферментные препараты бактерий рода Erwinia могут использоваться для получения протопластов растений и отдельных растительных клеток.

Личный вклад соискателя. Научно аргументировано направление исследований, осуществлена постановка задач, разработаны методы их решения, получен и обобщен экспериментальный материал работы. Соавторами ряда научных трудов диссертанта являются сотрудники Проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной биологии и кафедры микробиологии Белгосуниверситета, участвовавшие в выполнении некоторых экспериментов.

Апробация результатов диссертации. Основные положения работы доложены на: Международном симпозиуме ФЕМО (Пущино, 1983), научных конференциях республик Прибалтики и Белоруссии (Рига, 1983; Таллин, 1985), Всесозной конференции по фитопатогенным бактериям (Ужгород, 1985), конференции молодых ученых АН БССР (Минск, 1986), V съезде БелОГиС (Горкн, 1986), IV съезде ЭстОГиС (Таллин, 1986), Всесозной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1986), V Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических реактивов" (Рига, 1987), V съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Москва, 1987), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Всесозной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989), Всесоюзных совещаниях по секреции белков

у микроорганизмов (Пущино, 1989, 1990, 1991), Всесоюзной конференции по фнтопатогенным бактериям (Киев, 1990), Всесоюзной конференции "Мнкробнолошческие и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1990), VI съезде БелОГиС (Горки, 1992), Международной конференции по фнтопатогенным бактериям (Версаль, Франция, 1992), ежегодных конференциях ученых биологического факультета Б ГУ (Минск, 1994, 1996), семинарах сектора микробиологии Института биохимии и биофизики ПАН (Варшава, 1994, 1996). В завершенном виде диссертационная работа доложена на заседании Совета биологического факультета Белгосуниверснтета (Минск, 1997) и заседании Ученого Совета Института микробиологии АН Беларуси (Минск, 1997).

Опубликованность результатов. Результаты исследований опубликованы в 22 журнальных статьях, 22 тезисах докладов различных симпозиумов, съездов, конференций, 5 авторских свидетельствах на изобретения и 2 патентах Российской федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, анализа и обобщения результатов исследований, выводов, списка использованных источников.

Работа изложена на 195 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц, 39 рисунков, список использованных источников, включающий 263 наименования.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1 диссертационной работы является обзором литературы, состоящим из трех разделов. В первом разделе приводится характеристика пектиновых субстратов, описаны свойства пектолитических ферментов, разрушающих пектиновые вещества, в особенности пектатлиаз бактерий рода Ег\лчта. В следующем разделе рассматриваются механизмы регуляции синтеза внеклеточных пектатлиаз у фитонатогенных бактерий рода ЕшЫа. В третьем разделе анализируются данные по механизмам секреции внеклеточных ферментов грамотрицательнымн бактериями и в частности пектатлиаз.

В главе 2 представлена характеристика используемых в работе штаммов бактерий, плазмид и методов исследования.

Объектами изучения были пектолнтические виды Е. сЬгузатЬепн, Е. сагоЮуога зиЬвр. сагоЮуога и Е. сагоЮуога виЬзр. а^озериса. Большинство использованных в работе штаммов Е. саго1оуога БиЬБр. сагоит>га и Е. сагоЮуога виЬБр. аЦ-ояерИса были изолированы и идентифицированы на

кафедре микробиологии БГУ. Штаммы Е. сЬгузапЛеть а также часть штаммов Е. сагоЮУога эиЬэр. сагоюуога и Е. сагоюуога яиЬяр. а(го8ерпса( были получены из международных коллекции.

Основными объектами исследований являлись бактерии Е. сЬгузамЬепн ЕЫА49, Е. сЬгуБамЬепн ЕС 16, Е. сагоюуога БиЬвр. аитоерйса 36А, Е. сагоюуога БиЬэр. сагоюуога 17А н полученные из этих бактерий мутанты с нарушенной регуляцией синтеза и секреции нектатлиаз, а также штаммы, сконструированные путем введения в них плазмид с клонированными структурными генами пектатлиаз.

Для культивирования бактерии использовали жидкую и плотную минеральную среду 1А и полноценную питательную среду ЬВ (Миллер, 1976). Источники углерода вносили в минеральную среду 1А в количестве 0,5%. Для выращивания бактерий, мацерирующих льносоломку, использовали стерильную экстрактивную жидкость, полученную при замачивании стеблей льна. Полнпектат натрия готовили путем щелочной деэтерификации свекловичного, яблочного или цитрусового пектинов (Арасимович и др., 1970). Высокометилированный пектин получали из цитрусового пектина путем его этерификации метанолом (КотЬоШБ, 1972). Препараты полипектата натрия с различной степенью метилирования карбоксильных групп получали лимитированной деэтерификацией пектина с максимальной степенью метилирования.

Выявление пектолитической активности у бактерий осуществлялось следующим образом: на поверхность 1,5%-ой агаризованной среды (20 мл), содержащей 0,025 М хлористый кальций, в чашках Петри после подсушивания наслаивали 3 мл 1%-го раствора полипектата натрия, который через 20-40 минут уплотнялся в гель.

Для получения бактериальной биомассы и анализа пектолитической активности клетки выращивали в колбах Эрленмейера (объем 250 мл), содержащих по 50-70 мл ЬВ-бульона или минеральной среды 1А с 0,5% источника углерода, при 28-37°С на качалке при 180-200 об/мин. В качестве посевного материала использовали ночную культуру бактерий (12-20 часов), которую разводили свежей средой в 10-20 раз.

Активность ферментов определяли в культуралыюй жидкости, периплазматических и цитоплазматических фракциях клеток и выражали в Е/мл культуралыюй жидкости, в Е/мл экстракта, в Е/мг белка биомассы (специфическая активность, продуцирующая способность), в Е/мг белка препарата (удельная активность).

Пектатлиазную активность определяли по образованию ненасыщенной дигалактуроновой кислоты путем спектрофотометрнческого измерения увеличения поглощения реакционной смеси при длине волны 235 им в

термостатируемых (30°С) кварцевых кюветах. К 3 мл 0,05%-го раствора полипектата натрия в трнс-íICl буфере (0,05 М, pH 8,5), содержащего 0,1 мМ хлорнд кальция добавляли 10-20 мкл раствора фермента. Для расчета активности некгатлиазы использовали коэффициент молярной экстшшнн 4800 М"'. За единицу активности пектатлназы (Е) принимали количество фермента, вызывающее образование 1 мкмоль ненасыщенной дигалактуроновой кислоты за 1 мин, что в условиях опыта соответствовало приросту оптической плотности на 1,6 оптических единиц за 1 мин (Moran et al., 1968).

Пектинметилэстеразу выявляли качественной реакцией по закнсленшо реакционной смеси, происходящему вследствие деметнлирования пектина в смеси 1%-го раствора пектина, содержащего 0,05 M хлорид натрия и 0,05% универсального индикатора Хингона (Moran et al., 1968). Исходная красная окраска смеси в процесе инкубации при 30°С изменялась на желтую.

Для количественного определения пектинметнлэстеразной активности использовали потепциометрическое титрование реакционной смеси при pH 7,0 (Moran et al., 1968).

Эндоглюканазиую активность колоний определяли на чашках, содержащих 0,1% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), после окрашивания Конго красным (Boyer et al., 1987). Энзиматическую активность препаратов определяли, используя в качестве субстрата 0,1% раствор КМЦ в 0,1 M фосфатном буфере. Редуцирующие сахара определяли по реакции с дннитросалициловой кислотой, используя в качестве стандарта глюкозу. За единицу активности эндоппоканазы принимали количество фермента, вызывающее образование 1 мкмоль глюкозного эквивалента за 1 мин при 37°С (Boyer et al., 1987).

Активность протеазы определяли модифицированным методом Anson (1939), белок - с использованием кумасси синего G250 (Bradford, 1976), активность ß-галактозидазы - как описано в руководстве Миллера (1976), щелочной фосфатазы - по Краморову с соавт. (1985), внутриклеточную концентрацию цАМФ - со стандартным набором реактивов Amersham (Sy, Richter, 1972).

Удельную скорость секреции пектатл!ты определяли по формуле qs=dp/dt-x, аналогичной формуле для образования продукта (Перт, 1978), где р-копцентрация внеклеточного фермента (в Е/мл), х- биомасса (в мг белка на» мл культуральной жидкости), qs -удельная скорость секреции пектатлназы, Г -время (в часах).

При получении внеклеточных пектатлиаз ферменты из культуральной жидкости осаждали ацетоном. Фракции периплазматических белков выделял» из клеток методом осмотического шока (Copeland et al., 1982), а клетки1,

после разрушеннпя ультразвуком (24 кгц, 10 сек, 3 цикла), использовали для выделения клеточных мембран (Nakamura, Mizushinia,1986) и цитоплазматической фракции.

Электрофорстический анализ ферментных препаратов в неденатурирующих условиях проводили в 7%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в модифицированной кислой системе (Евтушенков и др., 1984,1986) и щелочной системе (Ornstein, Davis, 1964). Белки из гелей эллюировали трис-HCl буфером (0,05 М, pH 8,5) в течение 48 часов при +4°С. SDS-электрофорез по Laemmli (1970) проводили в вертикальных пластинах (0,1x12x14см) 10%-го ПААГ либо с градиентом его концентрации 5-15%, а также в пластинах ПААГ с градиентом концентрации 8-20% при проведении пептидного картирования по Gooderham (1987). SDS-электрофорез в присутствии 8 М мочевины по Mizushima и Yamada (1985) проводили в 10% ПААГ (для анализа белкового состава наружных мембран). Изоэлектрическое фокусирование проводили на приборе "Multiphor" (LKB, Швеция) на готовых пластинах "Servalyt" (pH 3,0-10,0 и pH 5,0-8,0) при мощности тока 8-10 Вт в течение 2-2,5 часов.

Фосфотрансферазную активность (ФТС) в экстрактах клеток определяли по Waygood и Meadow (1982) и выражали в наномолях фосфата углевода, образованного за 45 мин инкубации при 30° С в пересчете на 1 мг белка экстракта. Скорости аккумуляции углеводов измеряли с использованием меченых субстратов в концентрации 10"5 М при соответствующей температуре (Bourd et al., 1975). Определение радиоактивности проб проводилось в стандартном толуолыюм сцинтиляторе на приборе фирмы Beckman.

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу Bimboim и Doly (1979), трансформацию бактерий плазмидной ДНК - с использованием хлористого кальция, как описано в руководстве Маниатис и соавт. (1984), рестрикцию и лигирование ДНК проводили по общепринятым методам, описанным в руководстве Маниатис и соавт. (1984).

Секвенирование ДНК производилось методом терминации цепей, используя двухцепочечные матрицы (pUC18 плазмида с клонированными фрагментами ДНК). В качестве "затравок" служили универсальный М13-праймер и М13-обратный праймер (Short Protocols ...,1995).

Протопласты из ткани листьев растений получали по методу, описанному в руководстве Гловер (1988). Кусочки листьев (около 0,5 см2) помещали в чашки Петри (d=3,5 см) с 2 мл среды CPW21S, вносили ферментный раствор (смесь целлюлаз и пектатлиаз) и инкубировали в темноте при 28°С, периодически контролируя количество образующихся протопластов путем подсчета их под микроскопом.

Мацерацию льносоломки культурами бактерий рода Erwinia проводили во влажной термостатируемо» камере 28-30°С в течение 16-24 часов. Степень мацерации оценивали но шкале от "-" (отсутствие мацерации) до "++++" (полная мацерапия).

Полученные цифровые данные подвергали статистической обработке методами, приведенными в руководствах Плохнпского (1962) и Рокицкого (1973). Среднюю арифметическую и ошибку средней вычисляли по результатам не менее трех независимых экспериментов.

В главе 3 анализируется продукция внеклеточных пектолитических ферментов у четырех штаммов Е. atroseptica, четырех - Е. carotovora и семн-Е. Chrysanthemi. Наибольшая внеклеточная пектаглиазная активность была зарегистрирована при выращивании клеток на средах, содержащих свекловичный или цитрусовый полнпектаты натрия в концентрации 0,5%. При выделении пектолитических ферментов из культуралыюй жидкости наилучших результатов удалось добиться при использовании ацетона, обеспечивающею практически полное осаждение пектатлиаз, а также полигалактуроназы и нектинметилэстеразы, т.е. всего пектолигического комплекса. Применение ионообменной хромагофафин для дальнейшей очистки пектолитических ферментов Е. chrysanthemi ENA49 позволило выделить две фракции, обладающие пектатлиазной активностью (ПЛ1 и ПЛ2), первая нз которых обнаруживала также пектннметилэстеразную активность.

Для анализа изоформ пектатлиазы были использованы щелочная, кислая (Reisfeld et al., 1962) и модифицированная нами кислая (Евтушенков и др., 1984) электрофорегнческне системы. Электрофоретическое разделение ферментного препарата в щелочной системе позволило выявить три белка, обладающие пектатлиазной активностью, на долю которых приходится не более 20% от исходной ферментативной активности препарата. Использование кислой электрофоретической системы дало неудовлетворительные результаты, поскольку в ней происходила практически полная инактивация ферментов. Кислую систему удалось модифицировать (Евтушенков и др., 1984), что позволило выявить в исследуемом ферментном препарате пять белков, обладающих пектатлиазной активностью, составляющей не менее 80% от исходной активности препарата.

Методом электрофореза во внеклеточных препаратах пектатлиаз обнаружено от двух до шести (в зависимости от штамма) белковых фракций, обладающих пектатлиазной активностью, а также пектинметилэстеразная активность у бактерий Е. chrysanthemi и нолигалактуроназная активность у всех бактерий Е. atroseptica, Е. carotovora и у Е. chrysanthemi ЕС 16. Все белки, обладающие пектатлиазной активностью, были распределены на шесть

групп для Е. chrysanthemí (Ech0-Ech6) и шесть групп для бактерий Е. atroseptica и Е. carotovora (Ecal-Ecaó). Основанием для отнесения ферментов к той или иной группе служили значения их Rf в модифицированной кислой системе, которые достаточно хорошо. коррелируют со значениями изоэлектрических точек (pl) этих белков. При этом для ферментов нз групп Ech2 и Ech4, несколько различающихся по молекулярным массам и изоэлектрическим точкам, представлялось целесообразным ввести дополнительные буквенные обозначения (табл. 1).

Изучение субстратной специфичности пектатлиаз показало, что только фермент Ech4, и в известной степени EchO, можно отнести к "истинным" пектатлиазам, поскольку лучшим субстратом для них является полностью деметилированный или низкометилированный полипектат натрия. Остальные молекулярные формы пектатлиазы проявляют максимальную активность на пектинах со" степенью метилирования СООН- групп от 17 до 45%. Пектатлиаза Еса5 занимает промежуточное положение между "истинными" пектатлиазами и пектинлиазами. Оптимальная для проявления ее действия степень метилирования пектина составляет 35 - 45%. Всем изученным пектатлиазам присущи определенные оптимальные значения рН, лежащие в щелочной области. Однако бактерии Е. chrysanthemí проявляют достаточно высокую (не менее 20-25% от максимальной) пектатлиазную активность и в нейтральной и в слабокислой области рН, в то время как пектатлиазы Е. carotovora активны только при щелочной реакции среды и при рН 7,0 сохраняют лишв.зШ-15% от максимального уровня. Следует отметить, что в реакционной смеси, содержащей 0,05%-ный полипектат натрия без добавления СаСЬ, различные молекулярные формы пектатлиазы проявляют ферментативную активность, составляющую от 2-3% (Echl и Ech4) до 2550% (ЕсаЗ, Еса5 и Есаб) от таковой, определяющейся в среде с оптимальной концентрацией ионов Са2+. Из других катионов только ионы Sr2t активируют пектатлиазу EchO. Причем ферментативная активность составляет в этом случае 25% от таковой с ионами Са2+ (оптимальные концентрации обоих катионов одинаковы). Все другие молекулярные формы пектатлиазы не активируются ни одним из использованных катионов. Напротив, ионы Zn2+ полностью ингибируют активность пектатлиаз всех двенадцати групп, а Ва2+ - ферменты шести групп Ech, даже в том случае, когда в реакционной смеси содержатся ионы Са2+.

В главе 4 представлены результаты изучения продукции пектатлиаз клетками Erwinia в зависимости от состава сред культивирования. У бактерий Е. chrysanthemí синтез пектатлиазы индуцируется полипектатом в 15 раз, а у Е. atroseptica и Е. caratoуога-только в 4-5 раз. В то же время на

Таблица 1

Характеристика молекулярных форм пектатлиаз Е. chrysanthemi (Ech) и Е. carotovora (Еса)

Группы Оптимальные для ферментативной активности:

изофер- PI Rf* Молекулярная масса концентрация pH степень температура

ментов (кД) СаС12 (мМ) метилирования пектата {%) (°С)

EchO 4,7 . 75 8,0 0-17 -

Echl 7,2 0,04-0,09 39,7 100 9,0 36 55

Ech2a 8,2 0,14-0,20 37,5 75 8.5 25 55-60

Ech2b 8,8 0,20 39,7 75 8.5 25 55

Ech4a 9,6 0,36 40,4 75-200 7,5-8,5 0-25 50

Ech4b - 0,33-0,39 42,0 75-200 7,5-8,5 0-25 45

Ech4e 9,8 0,42 44,0 75-200 7,5-8,5 0-25 50

Ech4r - 0,31 43,0 75-200 7,0-8,0 0-17 50

Ech5 10,0 0,44-0,48 43,0 50-75 9,5 17 60

Ech6 10,2 0,55 32,0 500 8,5 25

Ecal - 0,02 i 200-600 9,0 25 -

Eca2 0,15 32,0 200-600 9,0 25 -

ЕсаЗ 9,5 0,26-0,28 37,5 50-75 9,0 25 55-60

Eca4 9,7 0,36-0,40 38,5 200 9,0 25 55

Eca5 10,2 0,55-0,60 37,8 200-400 9,7 36-45 60

Есаб 10,2 0,72 28,0 600 10,0 25 -

Примечание:* значения Rf в модифицированной кислой электрофоретическон системе

среде с глюкозой добавление полипектата натрия приводит лишь к 2-3-х кратному возрастанию пектатлназной активности у Е. carotovora и Б. Chrysanthemi.

Бактерии Е. atroseptica и Е. carotovora на всех трех средах, не содержащих полипектат натрия, продуцируют примерно одинаковое количество пектатлназы. Добавление в среду с глюкозой полипектата натрия не оказывает влияния на качественный состав изофермептов пектатлиаз, синтезируемых клетками E.carotovora 550, но в культурапьной жидкости E.chrysanthemi ENA49 возрастает в 60 раз количество пектатлиазы Ech4, а у E.atroseptica 36А увеличивается в 5 раз количество фермента Еса4 (табл. 2).

При выращивании всех трех штаммов на других средах, содержащих полипектат натрия, но без глюкозы, в культуралыюй жидкости заметно возрастает количество щелочных пектатлиаз Еса4, Еса5, Есаб и Ech4, Ech5, Echó, на которые в этом случае приходится 80-95% всей внеклеточной активности. В культуралыюй жидкости бактерий Е. Chrysanthemi ENA49, выращиваемых на среде с триптоном и полнпектатом, выявляется примерно в 50 раз больше пектатлиазы Echó и в 1,5-2 раза больше фермента Ech5, чем на среде с глицерином и полипектатом. На основании вышеприведенных результатов можно предположить, что регуляция синтеза каждой молекулярной формы пектатлиазы у бактерий рода Erwinia осуществляется независимо. Только продукция ферментов Ecal, Еса2 и Ech2, Echl, no видимому, контролируется общим механизмом, о чем косвенно свидетельствуют их примерно одинаковые количественные соотношения на разных средах.

При изучении неизвестной ранее пектатлиазы Echó представлялось целесообразным сопоставление ее молекулярной структуры с другими пектатлиазами Ech. Пептидное картирование ферментов Echó, продуцируемых клетками Е. chrysanthemi ENA49 и Е. chrysanthemi ЕС 16, выявило определенное сходство молекулярной структуры этих белков с таковой пектатлиаз Ech5 и Ech46.

Проведенные эксперименты показали, что уровень продукции клетками Е. atroseptica и Е. carotovora полнгалактуроназы достаточно четкс коррелирует с уровнем пектатлиазы Еса5. У бактерий Е. chrysanthemi ENA49 регистрируется высокий уровень конститутивного сннтезг пектинметилэстеразы: на средах с глюкозой и с глицерином на долю этогс фермента приходится 30-40% общего внеклеточного белка.

Бактерии Е. carotovora 550, Е. chrysanthemi ENA49 и Е. atroseptic; 36А, выращенные на "льняной" среде, продуцируют такой же набо[ нектолитических ферментов, как на минеральной среде с глюкозой и

Таблица 2

Продукция* внеклеточных пектатлиаз клетками Erwinia lia средах различного состава

Штаммы Пектатлназа С реды

ГЛ ГЛ+ПП ГЦ ГЦ+ПП Т Т+ПП

Е. chrysan- Echl 0,16 0,32 0,16 3.07 0,13 3,05

themi Ech2 0,30 0,51 0,30 4,30 0,21 4,67

ENA49 Ech4 0,06 3,69 0,06 30,74 0,78 25,35

Ech5 0,30 0,30 0,62 22,75 0,01 29,26

Echó - - 0,18 - 9,15

Е. caroto- Ecal 0,01 0,01 0,01 0,02 - 0,01

vora 550 Eca2 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 0,02

ЕсаЗ - - - 0,87 0,01 0,85

Eca4 0,18 0,54 0,28 0,94 0,01 0,71

Eca5 - - - 0,57 0,25 0,53

Ecaó - - - 0,03 - 0,01

Е. atrosep- Eca2 0,02 0,02 0,02 0,04 0,01 0,02

tica 36A ЕсаЗ 0,24 0,56 0,24 1,50 0.20 1,12

Eca4 0,20 0,98 0,34 2,40 0,30 1,46

Eca5 0,54 0,14 0,60 1,06 0,50 1,16

Примечание: * - продукция выражена в Е/мг белка биомассы;

** - активность ниже 0,01 Е/мг белка. Среды: ГЛ - 1А, 0,5 % глюкоза; ГЛ+ПП - 1А, 0,5 % глюкоза, 0,5 % полипектат; ГЦ - 1А, 0,5 % глицерин, ГЦ+ПП - 1А, 0,5 % глицерин, 0,5 % полипектат; Т - 1 % триптон; Т+ПП -1А, 1 % триптон, 0,5 % полипектат.

полипектатом, а на "картофельной" - примерно такой же, как на минеральной среде с. трнптоном и полипектатом, однако количество пектатлиазы Echó на "картофельной" среде несколько меньше. Таким образом культивирование бактерий на "льняной" и "картофельной" средах подтвердило предположение, что закономерности продукции пектолитическйх ферментов, установленные на искусственных средах, можно экстраполировать и на среды более сложного состава.

Изученные штаммы бактерий рода Erwinia* характеризовались различной мацерирующей активностью. Исследования показали, что у бактерий с высокой мацерирующей активностью максимальная пектатлиазная активность регистрировалась в культуралыюй жидкости через 8 часов культивирования, в то время как у бактерий с низкой мацерирующей

активностью - только через 20 часов, что, возможно, объясняется более медленным накоплением в среде галактуроновых кислот, являющихся индукторами синтеза пектатлиазы.

Интенсивный синтез пектатлиаз у всех бактерий начинался в середине экспоненциальной фазы роста и первоначально фермент накапливался внутри клеток. К концу экспоненциального роста уровень внутриклеточной пектатлиазной активности снижается (рис. 1). То есть, накопление фермента внутри клеток бактерий является временным.

Рис. 1. Продукция пектатлиаз клетками Е. сЬгувагнЬепп ЕЫА49 на минеральной среде с полипектатом натрия: 1 - рост культуры; 2 - внеклеточная пектатлиаза; 3 - периплазматическая пектатлиаза; 4 - цитоплазматическая пектатлиаза.

Изоферментный состав периплазматической и внеклеточной пектатлиаз, продуцируемых Е. а^оэерпса 36А, Е. ат^ерпса 3-2 и Е. сИгуБатЬепн ЕЫА49, полностью совпадает, однако несколько изменены количественные соотношения между различными молекулярными формами. Так, если в культуралыюй жидкости бактерий Е. аншерпса обоих штаммов в наибольшей степени выражена пектатлиаза Еса4, то в периплазме возрастает доля пектатлиаз ЕсаЗ и Еса5, а также пектатлиазы Еса2, которая не была выявлена во внеклеточной среде. У бактерий Е. сЬгуватЬет! ЕЫА49 примерно 70% внутриклеточной пектатлиазной активности обусловлено

ферментами Echl и Ech2, остальная приходится на долю Ech4, а в культуралыюй жидкости не менее 80% активности приходится на долю ферментов Ech4 и Ech5, а остальная обеспечивается ферментами Echl и Ech2. Идентичность изоферментного состава пектатлиаз в периплазме клеток бактерий и в среде может указывать на то, что периплазма является промежуточным этапом на пути секреции фермента из цитоплазмы во внешнюю среду.

Электрофоретнческий анализ белков внешних мембран, изолированных из клеток, находящихся на разных фазах роста культуры, показал, что начало интенсивной секреции во внешнюю среду пектатлиазы коррелирует с заметным повышением количества трипсинчувствителыюго, не модифицируемого нагреванием белка с молекулярной массой 31 кДа.

Для определения некоторых параметров процесса секреции пектатлиаз у разных видов Erwinia использовали плазмиду pPL41 с клонированными генами пектатлиаз (рис. 2). Посредством введения в клетки бактерий плазмиды обеспечивался высокий уровень конститутивного синтеза данных ферментов. Рекомбинантная плазмида pPL41 методом трехфакторного скрещивания с использованием мобилизующей плазмиды RP4Kms из клеток E.coli TG1 была перенесена в клетки Е. chrysanthemi ЕС16, ENA49 и Е. carotovora subsp. atroseptica ЗбА. В препаратах пектатлиаз, приготовленных

EcoRI

Рцс.2. Карта рестрикции плазмиды рРЬ41. Толстая линия - ДНК космиды рММВЗЗ, тонкая - клонированная ДНК хромосомы Е. сЬгузагпЬепи ЕС16.

из культуралыюй жидкости бактерий Е. сЬгувашЬепн ЕС16рРЬ41, Е. ' сЬгувапЛет» ЕЫА49рРЬ41, Е. сагоЮУога БиЬяр. а(гоБерИса 36АрРЬ41, выращенных на среде ЬВ или ЬВ с полипектатом натрия, основными

ферментами были пектатлиазы ЕсЬ1 и ЕсЬ2, детерминированные клонированными генами. Эти же ферменты обнаруживались и в перинлазматических фракциях исследуемых бактерии. Высокий уровень синтеза пектатлиаз, детерминированных клонированными генами, предполагает, что одновременное накопление пектатлиаз в культуральной жидкости и в периплазме бактерий обусловливается "насыщением" системы секреции пектатлиаз вследствие их повышенного синтеза. Исходя из этого предположения, при определении динамики накопления ферментов в культуральной жидкости была рассчитана секреторная способность клеток (табл. 3). На средах с индуктором удельная скорость секреции пектатлиазы была выше в 6-8 раз, чем на среде без индуктора, что свидетельствует о существовании индуцибельных белковых факторов секреции. Учитывая, что удельная активность пектатлиаз ЕсЬ1 и ЕсЬ2 после препаративного электрофореза равнялась 1600 Е/мг белка, а молекулярные массы этих пектатлиаз равны 39 кЭ, и для Е. сЬгуватЬегш ЕЫА49рРЬ41 максимальная удельная скорость секреции пектатлиазы на среде с индуктором достигала, примерно, 17 Е/мг час, что равнялось 28,2х1013 молекул пектатлиазы, секретируемой в расчете на 1 мг белка биомассы бактерий за 1 час или 8,3х104 молекул пектатлиазы на 1 клетку бактерий за 1 час (примерно 1300 молекул за 1 минуту).

Таблица 3

Секреторная способность клеток бактерий рода Ег\У1ша на различных

средах

Штаммы Среды Максимальное значение qs,

Е/мг час

Е. carotovora

subsp. atroseptica LB 0,34

36ApPL41 LB+пектат 2,43

E. chrysanthemi LB 2,88

ENA49pPL41 LB+пектат 17,0

E. chrysanthemi LB 3,06

EC16pPL41 LB+пектат 21,68

Следует отметить, что эта величина значительно меньше (примерно в 10 раз), чем скорость транслокации пептидов через цитоилазматическую мембрану Е. coli. У изучавшихся штаммов бактерий рода Erwinia скорость

транслокации пектатлназ через цитоплазматнческуго. мембрану, по-видимому, выше, чем через внешнюю, о чем свидетельствует накопление пектатлназ в периплазме бактерий. Полученные в представляемой работе результаты позволяют предположить, что взаимодействие клеток бактерий рода Erwinia с растениями может регулироваться как на уровне синтеза пектатлназ, так и на уровне их секреции.

С целью клонирования генов пектатлназ были созданы банки генов Erwinia с использованием фагового вектора >.47.1, плазмиды pUC19 и фазмидного вектора pSL5. Отбор клеток с клонированными генами осуществлялся на селективных пектатных средах, позволяющих выявить клоны Е. coli по проявлению соответстствующей активности in situ.

Из банка генов бактерий Е. chrysanthemi ENA49, созданного с помощью фагового и фазмидного векторов, были клонированы в клетках Е. coli структурные гены пектатлназ Echl и Ech2, Ech4 и пектинметилэстеразы. Из бактерий Е. carotovora subsp. carotovora 17А и Е. carotovora subsp. atroseptica 36А были клонированы структурные гены для пектатлназ ЕсаЗ, Еса4, Еса5. Клонированные гены были субклонированы в плазмидные векторы pUC19, pAYC31, рМТ2, рММВЗЗ, удобные для переноса данных генов в клетки других бактерий.

Анализ экспрессии клонированных генов пектатлназ бактерий рода Erwinia в клетках Е. coli выявил общие закономерности: все изученные ферменты в клетках локализовались в периплазме или цитоплазме, в то время как у бактерий Erwinia они секретировались в культуральную жидкость. Ферменты, изолированные из периплазмы или цитоплазмы клеток Е. coli, по физико-химическим свойствам не отличались от соответствующих ферментов, обнаруживаемых в культуралыюй жидкости бактерий рода Erwinia, что свидетельствовало об их нормальном процессинге при секреции через цитоплазматическую мембрану Е. coli. Наиболее активно экспрессируются в клетках Е. coli гены pelB и pelC, детерминирующие синтез нейтральных пектатлназ Е. chrysanthemi ENA49 и Е. chrysanthemi ЕС 16: пектатлиазная активность Е. coli PL4-2 превышает примерно в 5 раз внеклеточную пектатлиазную активность бактерий Е. chrysanthemi ENA49, выращенных на среде с индуктором (табл. 4). Если учесть, что в препаратах пектатлназ бактерий Е. chrysanthemi ENA49 на долю изофермента Echl приходится около 5-10% от суммарной внеклеточной активности, то клетки Е. coli синтезировали в 25-50 раз больше этой пектатлиазы, чем Е. chrysanthemi ENA49. С другой стороны, экспрессия гена реЮ пектатлиазы Ech4 Е. chrysanthemi ENA49 в клетках E.coli на порядок ниже, чем гена pelB, хотя в клетках Е. chrysanthemi ENA49 на долю этой пектатлиазы приходится до 50% от суммарной пектатлиазной активности. Эти факты

позволяют предполагать наличие в клетках Е. сИгуБашЬегш Е^49 особых регуляторных механизмов, дифференцированно усиливающих экспрессию

Таблица 4

Экспрессия генов пектатлиаз бактерий рода Ег\у1ша, клонированных в клетках Е. соН НВ101

Плазми-ДЫ Гены и бактерии Ферменты Фракция клеток Активность пектатлиаз, Е/мг белка биомассы

pPL4-2 pelB, E. chrysanthemi ENA49 Echl (PLb) периплазма 200,0

pPL16-l pelB, С, E. chrysanthemi ЕС 16 Echl (PLb) Ech2 (PLc) периплазма 81,0

pPL5-l pelB, С, E. chrysanthemi ENA49 Echl (PLb) Ech2 (PLc) периплазма 177,0

pPL7 pelD, E. chrysanthemi ENA49 Ech4 (PLd) периплазма цитоплазма 4,4 12,9

p361 pel3, 4, 5 E. atroseptica 36A ЕсаЗ, Eca4, Eca5 периплазма цитоплазма 0,41 1,35

pPL271 pel3, 4, 5 E. carotovora 17A ЕсаЗ, Eca4, Eca5 периплазма цитоплазма 0,49 0,48

одних генов (типа pelD) и репрессирующих другие (pelB, pelC). Гены пектатлиаз бактерий Е. carotovora крайне слабо экспрессировались в клетках Е. coli. При этом следует отметить, что пектатлиазы бактерий Е. carotovora, синтезированные в клетках Е. coli, преимущественно локализовались в цитоплазме и периплазме, также, как и пектатлиаза Ech4 Е. Chrysanthen^ ENA49, в то время как нейтральные пектатлиазы Echl, Ech2 Е. Chrysanthemi накапливались в периплазме клеток Е. coli.

Анализ результатов экспрессии генов пектатлиаз Erwinia в клетках гомологичных (одного вида) и гетерологичных (другого вида) хозяев (табл. 5) позволяет предположить, что у клеток Е. carotovora наружная мембрана клеточной стенки препятствует секреции гетерологнчной пектатлиазы Echl в культуральную жидкость, в то время как для собственных пектолитических ферментов она не является барьером. В отличие от описанной ситуации клетки Е. Chrysanthemi ЕС16, имеющие плазмиду pPTLl с геном

пектатлиазы ЕсЫ, секретируют данный фермент в- культуральнуго жидкость и не накапливают его ни в периплазматическом пространстве, ни в цитоплазме (табл. 5). Различная локализация пектатлиазы ЕсЫ

Таблица 5

Пектатлиазная активность бактерий рода Егмта, несущих клонированные гены пектатлиаз, на среде 1А с полипектатом натрия

Штаммы Пектатлиазная активность, Е/мг белка биомассы

культуральная периплазма цитоплазма общая

жидкость

Е. сапЯоуога

БиЬяр. сагоюуога

17А 38,0 0,15 0,35 38,5

17АрРТЬ42 17,14 0 0,13 17,27

I7ApPTLI 32,90 11,70 16,43 61,03

53А 8,40 0,20 0,50 9,1

53АрРТЬ42 7,0 0,06 0,67 7,73

53АрРТЬ1 25,0 14,88 18,29 58,17

Е. сагоюуога

виЬэр. аГговерПса

36А 2,30 0,01 0,33 2,64

36Ар27-1 6,20 2,36 1,00 9,56

36рЕА364 29,57 0,59 0 30,10

36рРЬ5-1 9,22 16,0 0 25,22

36АрРЬ41 1,22 18,6 16,3 36,12

Е. сЬгуБапЛеш!

ЕС16 22,0 0,01 0,05 22,06

ЕС16рРТЫ 25,63 0,01 0,03 25,67

ЕС16рРТЬ41 7,5 0,01 0,01 7,52

ЕЫА49 41,50 0,08 0,13 41,71

ЕИА49рРТЬ42 10,25 1,47 3,79 15,51

ЕИА49рРЕ41 6,6 0,7 1,12 8,42

Е. сЬгуБатЬепн Е^49 в клетках Е. сагоюуога и Е. сИгузапЛепн ЕС16 может указывать на разную специфичность либо эффективность секреторных механизмов этих бактерий.

Экспрессию генов пектатлиаз Е. сЬгуБатЬегш ЕЫА49 (плазмида рРЬ5-1), Е. сагоГоуога 17А (плазмида р27-1) и Е. а(гоБерГ1са 36А (плазмида рЕА364) анализировали также в клетках Е. аиояериса 36А. При этом особое

внимание уделялось анализу эффекта увеличения дозы гена и наличия чужеродных изоферментов на секрецию пектатлиаз, детерминируемых резидентными хромосомальными генами. У бактерий, несущих гибридные нлазмиды рРЬ5-1, р27-1 и рЕА364, продукция фермента начинается несколько раньше, что может быть результатом экспрессии клонированных генов. Практически весь фермент секретируется клетками Е. ат«ерПса 36А и их производными с шшмидой рЕА364 в среду, при этом внутриклеточная (периплазматическая и цитоплазматнческая) активность пектатлиазы хотя и возрастала в клетках Е. ацгозерйса ЗбА рЕА364 по сравнению с таковой родительского штамма, но составляла не более 4% сумарного количества фермента как в среде с индуктором, так и без него. Существенное накопление пектатлиазы регистрировалось в периплазме Е. аГгозериса 36Ар27-1 в середине логарифмической фазы роста культуры. Образование временного периплазматического пула фермента было связано с продукцией клетками Е. атэБериса 36Ар27-1 пектатлиаз, детерминируемых клонированными генами. Этот факт, в свою очередь, говорит о высокой специфичности секреторных систем пектнназ у бактерий, принадлежащих не только к разным видам Егшша, но и даже подвидам. В дальнейшем при переходе культуры в позднюю логарифмическую фазу роста основная часть фермента выделяется этими бактериями в среду.

В клетках Е. аиовериса 36АрРЬ5-1 выявлялась очень высокая пектатлиазная активность, полностью обусловленная изоферментами ЕсЫ и ЕсЬ2 бактерий Е-сЬтузапШепн ENA49 (табл. 5). Если у бактерий Е. аишер^са 36А, а также Е. аиоБериса 36Ар27-1 и Е. а(го$ерПса 36АрЕА364, синтез фермента носил индуцибельный характер, то при выращивании бактерий Е. аЦтеерНса 36АрРЬ5-1 в средах, содержащих и несодержащих полипектат натрия, не наблюдалось существенной разницы в продукции пектатлиазы, что свидетельствовало о неспособности белков-регуляторов Е. аигоерйса контролировать экспрессию пектатлиазных генов Е. сЬгуБапШепц. Наличие в клетках Е. а^оэериса 36А генов чужеродных пектатлиаз не приводило к уменьшению продукции собственных изоферментов, синтез которых сохранял иццуцибельный характер. В количественном отношении плазмидные штаммы синтезировали в 5-7 раз больше пектатлиазы, чем исходный штамм, что можно использовать для конструирования штаммов-продуцентов ферментов.

Для дальнейшего изучения секреции пектатлиаз путем химического и транспозонового мутагенеза получены мутанты бактерий Е. а^оБер^са ЗбА, Е. сагоюуога 291-1, Е. сЬгувапШепп ЕЫА49 со сниженной секрецией пектатлиазы, но накапливающие ферменты в периплазме (от-муганты). Очистка и электрофоретический анализ ферментов цитоплазматической и периилазматической фракций позволили установить, что количественные

соотношения между различными молекулярными' формами пектатлиазы внугрн клеток мугаитов и в культуралышй жидкости бактерии дикого типа во многом совпадают, а также идентичны и их физико-химические свойства.

Мутация out' (pat3) картирована на 30 мин генетической карты бактерий Е. chrysanthemi ENA49. Другая мутация, приводящая к нарушению секреции у бактерий Е. chrysanthemi ENA49 и обозначенная pat6, картировалась на 55 мин. Эта мутация приводила к снижению пектатлиазной активности бактерий и накоплению внутри клеток до 30% синтезированного фермента.

Путем обработки бактерии Е. chrysanthemi VY1-10 нитрозогуанндином был изолирован Суа-мутант, клетки которого утратили способность сбраживать ряд Сахаров, но добавление в среду цАМФ (5-103моль) восстанавливало исходный фенотип. Мутанты Суа" утрачивали способность как синтезировать, так и секретировать внеклеточные пектатлиазы. Мутанты • СггР (резистентные к катаболитной репрессии глюкозой) были получены в результате обработки клеток Е. chrysanthemi VY1449 нитрозогуанндином и селекции клонов, разжижающих пектатный гель при наличии в среде глюкозы. Мутации сгтР картированы в двух локусах генетической карты хромосомы Е. chrysanthemi ENA 49 (crrPl на 36 -й минуте и сгтР2 на 136-й минуте карты). СггР- мутации вызывали повышение уровня продукции внеклеточных эндопектатлиаз и обусловливали их частичный конститутивный синтез (табл. 6). Путем конъюгации были получены рекомбннантные бактерии, в клетках которых были совмещены указанные две мутации (суа и сггР). Такие двойные мутанты восстанавливали

Таблица 6

Ферментативные активности бактерий Е. chrysanthemi VY1449 и их

мутантов

Бактерии Щелочная ß-галакто- Внеклеточная Аденилат-

Е. chrysanthemi фосфатаза зидаза пектатлиаза циклаза

(мкмоль/мин/ (мкмоль/мин/ (Е/мг) (пмоль/мин/

мг) мг) мг)

VY1449 1,62 16,8 52,0 14,7

1449суа5 1,85 0,4 6,0 1,38

1449сггР1 1,62 17,1 200,0 8,78

1449сггР2 1,57 16,0 109,0 12,4

1449суа5 crrPl 1.19 0,4 98,0 2,29

1449суа5 сггР2 0,87 0,9 84,0 0,39

способность секретировать пектатлиазу во внешнюю среду, причем пектатлиазная активность мугантных бактерии бьит даже выше, чем бактерий дикого типа. Аденилатциклазная активность двойных мутантов оставалась на уровне суа" - вариантов, то есть сггР- мутации восстанавливали экспрессию пектатлиазных генов при сниженной внутриклеточной концентрации цАМФ.

Кроме того, СггР 1-бактерии синтезировали повышенное количество голубого водонерастворимого пигмента на средах с углеводами. Влияние мутаций на синтез эндопектатлиаз было достаточно специфическим, так как у двойных мутантов Суа5сггР1 и Суа5сггР2 не восстанавливался синтез цитоплазматического фермента - ß-галактозидазы (табл. 6). Учитывая, что двойные мутанты (суа, сггР) достаточно эффективно секретировали пехтатлиазы, можно предположить, что процесс секреции этого фермента клетками Е. Chrysanthemi либо не зависит от внутриклеточной концентрации цАМФ, либо мутации сггР восстанавливают и синтез пекгатлиаз у Суа-мутантов, и их секрецию.

Фосфоснолпируватзависимая углевод фосфотрансферазная система (ФТС) осуществляет фосфорилирование ряда углеводов в процессе их транспорта через цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки. Для изучения данной системы у бактерий Е. chrysfanthemi ENA49 были получены мутанты с нарушением транспорта н фосфорилнровашш глюкозы и некоторых других Сахаров. Полученные мутации картировались в 4 локусах генетической карты хромосомы бактерий Е. Chrysanthemi ENA49 : на 3 мин - мутация ptsOl, на 100 мин - мутация ptsl69, на 175 мин - мутация pts02 и на 185 мин - мутация pts052. В экспериментах по изучению фосфоршшрования глюкозы мутантными бактериями было выявлено восстановление фосфоршшрующей активности при смешивании экстрактов клеток мутантов Е. Chrysanthemi ptsl69 и pts02 друг с другом. Фосфоршшрующая. активность также восстанавливалась при смешивании экстрактов мутантов ptsl69 Е. Chrysanthemi и ptsH E.coli, а также Е. Chrysanthemi pts02 и ptsl E.coli, что позволяет идентифицировать мутацию pts02 как ptsH, а мутацию ptsl69 Е. chrysanthemi как ptsl.

Мутация ptsl 69 была получена с помощью транспозонового мутагенеза, что позволило клонировать фрагменты хромосомы Е. chrysanthemi ENA49 с инсерцией транспозонов. Пугем определения первичной нуклеотцдной последовательности ДНК установлено, что включение транспозона произошло в ген Е. chrysanthemi ENA49, имеющий 74,5% гомологии с ptsl геном Е. coli. Первичный анализ организации генов ФТС (ptsl, ptsH) у Е. chrysanthemi ENA49 выявил их раздельное

расположение п хромосоме, а не оперонную организацию как у бактерий Е. coli и Salmonella typhimurium.

Глюкоза репрессировала на 80% синтез пектатлиаз и на 65% синтез ß-галактозидазы в клетках бактерий дикого типа. Мутации ptsl69(ptsl) и pts02 (ptsH) обеспечивали клеткам Е. Chrysanthemi практически полную резистентность синтеза пектатлиаз и ß-галактозидазы к катаболитной репрессии глюкозой (табл. 7).

У бактерий Е. chrysanthemi ENA49 на среде с глюкозой в препаратах пектатлиаз возрастает доля нзофермента Ech4 и уменьшается Ech2 и Ech5. Спектр изоферментов у мутантных бактерий Е. chrysanthemi ptsl69 и Е. chrysanthemi pts02 отличался от других проанализированных препаратов весьма существенным увеличением доли пектатлиаз Echl и Ech2.

В процессе исследования было изолировано несколько мутантов штаммов E.atroseptica 36А и Е. atroseptica 3-2 с повышенной продукцией

Таблица 7

Катаболитная репрессия глюкозой синтеза пектатлиазы бактериями Е. _chrysanthemi_

Штаммы Е. chrysanthemi Активность пектатлназы (Е/мг белка) на средах: Репрессия (%)

полипектат полипектат + глюкоза

pts02 24,0 40,0 0

VY1449 55,0 12,0 78

pts 01 64,0 51,0 20

ptsl69 (pts 1) 50,4 44,0 13

pts052 6,4 2,6 59

пектатлиаз. Мутантные бактерии Е. аитеериса 3310, полученные из штамма Е. апгозерйса 3-2, характеризовались высоким уровнем конститутивного синтеза экзоферментов (пектатлиаз, целлюлазы и протеазы), нечувствительного к репрессии глюкозой. В отличие от бактерии родительского штамма, мутантные клетки продуцировали значительно большие количества изофермента Еса4, на долю которого приходилось до 90% внеклеточной активности при культивировании бактерий как в условиях конститутивного синтеза, так и при индукции пектатом натрия и репрессии глюкозой. Данная мутация не влияла на синтез Р-галактозидазы у бактерий Е. аПтаерНса 3310. Последнее свидетельствует в пользу того, что мугантный фенотип не обусловлен нарушением общей регуляции

катаболитпых оперонов, а, по-видимому, является следствием изменения в регуляторных механизмах, определяющих синтез экзоферментов.

В главе 6 представлены результаты по получению штаммов -продуцентов пектатлиаз, и разработке способов применения нектолитических препаратов. Из 98 проверенных на мацернрующую активность (на лыюсоломке) культур бактерий рода Erwinia клетки лини, одного штамма Е. carotovora полностью мацерировали льносоломку в течение 20 часов, тогда как у бактерий 68 штаммов мацернрующую активность выявить не удалось, хотя все исследованные штаммы обладали способностью разжижать полипектатный гель и синтезировать пектатлиазы. Не наблюдалось четкой зависимости степени мацерации льносоломкн от ферментативной активности культур. Например, бактерии Ii. Chrysanthemi обладающие наиболее высокой активностью пектатлиаз, полностью не мацерировали стебли льна даже в течение 40 часов, в то время как клетки одного штамма Е. carotovora, продуцирующие значительно меньшие количества ферментов, завершали мацерацию за 20 часов. Среди представителей одного и того же вида Е. carotovora также не выявлено зависимости степени мацерации льносоломкн от активности их пектатлиаз. Однако клетки мутанта Out" Е. Chrysanthemi ENA49, не секретирующне пектатлиазы, утратили и мацернрующую активность.

Путем мутагенеза и селекции получены штаммы Е. Chrysanthemi с высокой продукцией пектатлиаз и мацерирующей активностью, которые использовали в разработанном способе получения льноволокна методом твердофазной ферментации (A.c. N 1171578). При данном способе обработки льносоломку предварительно замачивали в воде до влажности 200-240% (в течение 2 часов). Получаемый экстракт использовали в качестве основы питательной среды для выращивания клеток Erwinia. Влажную солому после экстракции погружали в культуру бактерий рода Erwinia (плотность культуры не ниже 5107 клеток/мл), выращенных в "льняной" среде, затем для. осуществления процесса твердофазной ферментации льносолому переносили во влажную камеру и выдерживали при температуре 30° в течение 16-20 часов (до готовности). Достоинствами данного способа получения льнотресты из льносоломкн являются уменьшение времени мацерации, проведение процесса в твердой фазе, контролируемость процесса, использование доступных компонентов.

В опытах по получению протопластов растительных клеток использовали препараты пектатлиаз бактерий Е. carotovora subsp. atroseptica 36А (мацераза А) и Е. chrysanthemi ENA49 (мацераза С). В качестве целлюлазы применяли препарат целловиридин ГЗх. Показано, что пектолнтические ферментные препараты бактерий рода Erwinia эффективны для получения протопластов растений и изолированных клеток растении. На

методики получения растительных протопластов и изолированных клеток растений картофеля путем ферментативной обработки препаратами пектатлиаз получены патенты Российской федерации.

В заключительной части работы проанализированы и обобщены результаты исследований.

ВЫВОДЫ

1. Изучение нектатлиаз бактерий рода Envinia позволило обнаружить наличие различных молекулярных форм (изоферментов), которые по совокупности физико-химических свойств отнесены к двенадцати группам: Ecal-Ecaö - у Е. carotovora и Ech0-Ech2, Ech4-Ech6 - у Е. chrysanthemi. Бактериям Е. carotovora свойственен постоянный нзоферментный состав нектатлиаз, что может быть использовано в качестве дополнительного критерия вида. Для представителей вида Е. chrysanthemi выявлены существенные штаммовьге различия в количестве изоферментов и их свойствах, что отражает гетерогенность данного вида бактерий. Обязательным компонентом пектолитического полиферментного комплекса бактерий Е. carotovora является эндополигалактуроназа, а полиферментный комплекс Е. chrysanthemi включает пектинметилэстеразу. Изоферменты пектатлиаз (за исключением Ech4) более активны на низкометилированном пектине, чем полипектате и относятся к эндотипу, их реакционная способность абсолютно зависит от присутствия ионов Са2+, оптимум pH находится в щелочной либо слабощелочной области. Активный синтез пектатлиаз происходит в конце логарифмической фазы роста.

2. Посредством молекулярного клонирования выявлены структурные гены для отдельных изоферментов пектатлиаз и определена их экспрессия в гомологичных и гетеролошчных бактериях. Обнаружено, что гены нейтральных пектатлиаз (pelB, pelC) Е. chrysanthemi экспрессировались в клетках Е. coli более эффективно, нежели в бактериях рода Erwinia. Экспрессия гена щелочной пектатлиазы (pelD) была выше в клетках Е. chrysanthemi, что указывает на наличие у бактерий рода Erwinia дополнительных регуляторных механизмов, снижающих экспрессию одних генов и активирующих выражение других. Существование подобных механизмов доказано получением мутантов с повышенной продукцией внеклеточных пектатлиаз, а также мутантов, у которых синтез пектатлиаз не зависит от концентрации цАМФ в клетке.

3. Регуляция синтеза внеклеточных пектатлиаз у бактерии рода Егиаша осуществляется механизмами индукции и катаболитной репрессии, причем эти эффекты более выражены у Е. сЬгуБапШегш. Впервые показано, что синтез отдельных изоферментов регулируется независимо и характеризуется различной чувствительностью, к индукции и репрессии. Выявлено, что эффективно индуцируются нзоферменты ЕсаЗ и Еса4 Е. сагоюуога и ЕсЬ4 и ЕсЬ5 Е. сЬгуБатЬепп, в то время как для фермента Еса5 Е. сагоюуога характерен относительно высокий уровень конститутивного синтеза. Наличие сложной системы контроля обеспечивает последовательное образование различных пектатлиаз - первоначально в результате конститутивного синтеза образуются нейтральные пектатлиазы, а затем, при накоплении индуктора в среде, появляются щелочные формы фермента, что способствует эффективному разрушению растительной ткани.

4. Пектатлиазы бактерий рода Еплчша, обнаруживаемые внугри клеток, по основным характеристикам не отличаются от ферментов, секретируемых во внешнюю среду, то есть не обнаружено каких-либо "специфических" внутриклеточных пектатлиаз. При этом изоферментнын состав внутриклеточных и внеклеточных пектатлиаз у бактерий Е. сагоКп-ога совпадает, тогда как у Е. сИгузапШегш существенно различается: в клетках преобладают "нейтральные", а во внешней среде - "шелочные" пектатлиазы. Последнее может быть обусловлено специфичностью системы секреции пектатлиаз по отношению к различным изоферментам. Экспериментально доказано, что секреция пектатлиаз клетками бактерий рода Ег\уша осуществляется в два этапа: синтез ферментов и их транслокация в периплазматическое пространство и секреция пектатлиаз из периплазмы во внешнюю среду.

5. Впервые обнаружена высокая специфичность систем секреции пектолитических ферментов у бактерий рода Егулгна, принадлежащих не только к разным видам, но и подвидам. Характер секреции пектатлиаз, детерминированных клонированными генами бактерий Е. сЬгуяатЬеггп, Е. сагогоуога виЬзр. сагоюуога н Е. сагоюуога БиЬэр. аиояергюа, из клеток других штаммов бактерий рода Ег\у1ша свидетельствует о низкой эффективности гетерологичных систем секреции. В то же время интродуцирование в клетки Е. сагоШуога БиЬвр. ацоэерпса с помощью векторных плазмид генов пектатлиаз бактерии других видов (или подвидов) этого же рода не влияет на синтез и секрецию собственных ферментов, детерминируемых резидентными хромосомными генами. В условиях индукции скорость секреции пектатлиаз бактериальными клетками возрастает в 6-8 раз, но сравнению с ростом клеток на среде без индуктора.

6. Впервые установлено участие фосфоенолпируватзависимой глюкозофосфогрансферазной системы (ФТС) бактерий Е. сЬгухап^еин

ENA49 в транспорте в клетку глюкозы и некоторых других углеводов, а также рефляции синтеза внеклеточных пектатлназ. Получены мутанты с измененными функциями общих компонентов ФТС - фермента 1 (ptsl, мутация pts 169) и белка Hpr (ptsH, мутация р^02), которые характеризовались пониженной пектатлназной активностью, при этом синтез пектатлназ был нечувствителен к катаболитной репрессии глюкозой. Указанные мутации неодинаково влияли на синтез отдельных изофермеитов пектатлназ: мутации но генам ptsl и ptsH приводили к повышенной экспресии генов pelB, pelC. Секвеннрование ДНК фрагмента ptsl-гена бактерий Е. Chrysanthemi ENA49 выявило высокую степень его гомологии с ДНК ptsl-генов бактерий Е. coli и Salmonella typhimurium.

7. На основании изучения механизмов регуляции синтеза и секреции пектатлназ разработаны эффективные методы селекции штаммов-продуцентов, что позволило изолировать мугантные бактерии Е. Chrysanthemi ENA49 и Е. carotovora subsp. atroseptica, характеризующиеся повышенной продукцией некоторых экзофермептов (пектатлиазы, целлюлазы, протеазы) и нечувствительностью их синтеза к катаболитной репрессии глюкозой. Продуценты могут быть использованы для промышленного производства ферментных препаратов мацерирующего действия или создания на их основе штаммов-сверхпродуцентов. Установлено, что повышение пектатлиазнон активности у мутанта Е. atroseptica 3-2 является следствием усиленного синтеза изофермента Еса4. Фенотипические свойства бактерий Е. atroseptica 3310 могут свидетельствовать о наличии у клеток специфического регулятора генов, ответственных за синтез экзофермептов. На три штамма-продуцента получены авторские свидетельства.

8. Разработан новый способ приготовления льнотресты с помощью пектолитнческих бактерий рода Erwinia, полученных путем селекции наиболее активных продуцентов пектатлназ, синтез которых был устойчивым к катаболитной репрессии глюкозой. Предложена дешевая питательная, среда для выращивания бактерий рода Erwinia. Способ получения льнотресты и питательная среда защищены авторскими свидетельствами. Разработаны оригинальные методики получения растительных протопластов и изолированных клеток растений картофеля путем ферментативной обработки их препаратами пектатлназ бактерий рода Erwinia, на которые получены патенты Российской федерации.

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А. с. 751101 СССР, МКИ4 С 12 К 1/02. Штамм Erwinia Chrysanthemi ENA

49-5 - продуцент внеклеточной пектатлиазы/ А.Н. Евтушенков, Ю.К.

Фомичев. (СССР). - N 2754096/28-13; Заявлено 16.04.79; 0публ.-1980; Бюл. № 6. - 2 с.

2. Мутанты Erwinia chrysanthemi, дефектные по секреции внеклеточных пектатлиаз / А.Н. Евтушенков, В.А. Прокулевич, Н.А. Белясова, Л.Б. Попова, Ю.К. Фомичев. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1984,- № 5. - С. 11-15 .

3. Прокулевич В.А., Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Регуляция синтеза внеклеточной эндопектатлиазы бактериями Erwinia chrysanthemi ENA 49 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1984. -№ 8. -

" С. 26-30.

4. А. с. 1172266 СССР, МКИ4 С12 N 9/88, 1/20, 15/00, С12 R 1/18. Штамм

Erwinia chrysanthemi ENA49-11 - продуцент внеклеточной пектатлиазы/ А.Н. Евтушенков, Л.Б. Попова, В.А. Прокулевич, Н.А. Белясова, Ю.К. Фомичев. (СССР). - N3723664/28-13; Заявлено 19.01.84; Опубл. -1985; Бюл. №8.-2 с.

5. А. с. 1171578 СССР, МКИ4 D 01 С 1/04. Способ приготовления тресты из

льняной соломы / Э.В. Калугина, Е.М. Коган, Л.Г. Воскресенская, В.А. Криворучко, Ю.К. Фомичев, А.Н. Евтушенков, Л.Б. Попова. (СССР). -N 3708131/28-05; Заявлено 11.05.84; Опубл. 1985; Бюл. № 29. - 2 с.

6. Клонирование и изучение гена пектатлиазы Erwinia carotovora / Н.О. Буканов, М.Ю. Фонштейн, А.Н. Евтушенков, М.А. Сваринский, Т.П. Стрельченко, Н.К. Янковский, С.С. Алиханян, Ю.К. Фомичев, В.Г. Дебабов // Генетика. - 1985. - Т. 21, № 10. - С. 1601-1607.

7. Разделение и анализ внеклеточных форм пектатлиазы Erwinia chrysanthemi ENA49 / В.Г. Богуш, Г.З. Гайда, Т.В. Великодворская, А.А. Мусатова, В.Б. Баев, А.Я. Стронгин, А.Н. Евтушенков, Ю.К. Фомичев // Биохимия. - 1986. - Т. 51, В. 2. -С. 260-266.

8. Очистка и свойства двух внеклеточных пектатлиаз штамма Erwinia chrysanthemi ENA49 / А.Н. Евтушенков, В.Е. Шевчнк, Л.Б. Попова, Ю.К. Фомичев // Прикладная биохимия и микробиология. - 1986. - Т. 22, В. 2,-С. 187-192.

9. Евтушенков А.Н., Шевчик В.Е., Фомичев Ю.К. Клонирование генов пектатлиаз Erwinia chrysanthemi в клетках Escherichia coli II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1986. - № 4, -С. 19-24 .

10. А. с. 1342025 СССР, МКИ4 С12 N 9/88, 1/20. Штамм бактерий Erwinia chrysanthemi ВКПМ В-2946 - продуцент внеклеточной пектатлиазы / А.Н. Евтушенков, Л.Б. Попова, В.А. Прокулевич, Н.А. Белясова, Ю.К. Фомичев. (СССР). - N3694886/31-13; Заявлено 27.01.84; Опубл. -1987; Бюл. № 9. - 3 с.

11. А. с. 1307845 СССР, МКИ4 С12 N 1/20. Способ культивирования бактерий рода Erwinia / Э. В. Калугина, Е.Н. Коган, А. Н. Евтушенков, Л. Б. Попова, Ю.К. Фомичев (СССР). - N 3785820/28-13; Заявлено 29.06.84; Опубл. -1987; Бюл. №4.-2 с.

12. Евтушенков А.Н., Шевчик В.Е., Фомичев Ю.К. Экспрессия гена пектатлиазы Erwinia chrysanthemi ENA49 в клетках других представителей рода Erwinia // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1987. - № 5. - С. 22-25 .

13. Шевчик В.Е., Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Изоферменты внеклеточных пектатлназ бактерий рода Erwinia // Биохимия. - 1988. -Т.53, В. 10. - С. 1628-1638.

14. Шевчик В.Е., Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Секреция пектатлиаз и состав белков наружной мембраны клеток Erwinia chrysanthemi ENA49 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1989. -№ 8. - С. 23-27.

15. Мацерирующая активность пектолнтическнх бактерий рода Erwinia / А.Н. Евтушенков, С.П. Чернов, В.Е. Шевчик, Ю.К Фомичев. // Биотехнология. - 1989. - Т.5, № 2. - С. 226-228.

16. Cloning and analysis of structural and regulatory pectate lyase genes of Erwinia chrysanthemi ENA49 / N.K. Yankovsky, N.O. Bukanov, V.V. Gritzenko, A.N. Evtushenkov, M.Yu. Fonstein, V.G. Debabov // Gene. -1989. -V. 81. - P. 211-218.

17. Ли Мен Чан, Шока А.Ю., Евтушенков А.Н. Клонирование генов пектатлиаз бактерий Erwinia atroseptica в клетках Escherichia coli // Вестн. Белорус, ун-та. Сер. 2, Хим. Биол. Геогр. -1990. - № 2 . - С. 3941.

18. Умеренный фаг SM Pseudomonas aeruginosa как вектор для клонирования генетической информации / A.M. Кулъба, А.С. Горелышев, А.Н. Евтушенков, Ю.К. Фомичев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1991. - № 12. - С. 26 - 29.

19. Титок М.А., Олехнович И.Н., Евтушенков А.Н.. Клонирование Rep-области плазмиды широкого круга хозяев рМЗ ( Inc Р-9) // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1991. -№ 8. - С. 16-20.

20. Чернов С.П., Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Мацерация тканей клубней картофеля пектолнтнческими бактериями рода Erwinia // Прикладная биохимия и микробиология. - 1991. - Т. 21, В. 6. - С. 885889.

21. Production of pectolytic enzymes from Erwinia grown on different carbon sources /V.E. Shevchick, A.N. Evtushenkov, E.V. Babitskaya, Yu.K.

Fomichev // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1992. -Vol. 8. - P. 115-120.

22. Шевчик B.E., Евтушенков A.H., Фомичев Ю.К. Зависимость состава пектолитических ферментных комплексов бактерий рода Erwinia от химического состава среды, культивирования // Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. -Т. 28, В. 1. - С. 87-93.

23. Продукция пектатлиаз бактериями Erwinia carotovora var. atroseptica 36А/ E.B. Бабицкая, Шевчик B.E., Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. // Микробиология. - 1993. - Т. 62, В. 2. - С. 253-259.

24. Экспрессия pel -генов Erwinia Chrysanthemi в клетках Erwinia carotovora var. atroseptica 36A / E.B. Бабицкая, A.H. Евтушенков, B.E. Шевчик, P.A. Желдакова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -1993. - № 4. - С. 12-15.

25. Использование пектиназ бактерий Erwinia для выделения протопластов и клеток из листьев табака / P.A. Желдакова, A.B. Таманькова, В.Е. Шевчик, А.Н. Евтушенков // Вестн. Белорус, ун-та. Сер. 2, Хим. Биол. Геогр. -1993. - № 2. - С. 45-47.

26. Бабицкая Е.В., Евтушенков А.Н., Шевчик В.Е. Экспрессия генов пектатлиаз Erwinia carotovora subsp.carotovora 17А и Erwinia carotovora subsp. atroseptica 36A в клетках Erwinia carotovora subsp. atroseptica 36A // Молекулярная генетика, микробиология' и вирусология. - 1994. - № 6. -

27. Пат. 2032740 Росийской Федерации, МКИ С 12 N 5/00, 5/00. Способ получения протопластов растений / P.A. Желдакова, В.Е. Шевчик, А.Н. Евтушенков, A.B. Таманькова, В.А. Прокулевич, Ю.К. Фомичев (Беларусь) ; БГУ - N 5016755/13 ; Заявл. 08.07.91; Опубл. 10.04.95, Бюл. № 10. - 2 с.

28. Пат. 2032741 Росийской Федерации, МКИ С 12 N 5/04, 5/00. Способ получения изолированных клеток картофеля / P.A. Желдакова, В.Е. Шевчик, А.Н. Евтушенков, A.B. Таманькова, Ю.К. Фомичев (Беларусь) ; БГУ - N 5014964/13 ; Заявл. 04.07.91; Опубл. 10.04.95, Бюл. № 10. - 2 с.

29. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Секреция пектатлиаз клетками Erwinia chrysanthemi и Erwinia carotovora var. atroseptica // Микробиология. -1996. - Т. 65, В. 3. - С. 333-338.

22 тезиса республиканских, всесоюзных, международных конференций, симпозиумов и съездов.

С. 23-27,

РЭЗЮМЭ

дысертацыннап працы ЕУТУШЭНКЛВА Апатгпя МжапаеЕпча "Пазаклетачныя пектатл!язы бактэрый роду Erwinia"

Ключавыя словы: фггапатагенныя бактэрьн, пектаттпяза, прадуцэнт, ¡за-ферменты, сштэз, сакрэцыя, ген, мутацыя, клашраванне, катабагйтная рэпрэая, ¡льновалакно, мацэрацыя, в1рулентнасць

Вывучаны ¡заферментны склад пектаппяз - фактарау вфулентнасщ бактэрый Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora i E. carotovora subsp. atroseptica у залежнасш ац складу асяроддзя культывавання. Выяулены асноунмя заканамернасщ фарм1равання ¡заферментнага складу гтектатл!яз, што дазваляе атрымоуваць ферментныя прэпараты з зададзеным1 уласщвасцямь Вывучана рэгуляцыя С1»тэзу асобных ¡заферментау з дапамогай шдукцьн i катабалггнай рэпрэсй глюкозай. Распрацаваны метад прэпаратыунага электрафарэзу пектатлшз, з дапамогай якога асобныя ¡заферменты ачышчаны да гамагеннага стану i вывучаны ix асноуныя ф1зка-xiMi4Hbw уласшвасщ, што дазволша выдзелщь 12 груп {заферментау. Кпа1ираваны структурныя гены для асобных ¡заферментау i вывучана ix экспрэая у клетках Е. coli i Erwinia. Знойдзена, што гены для "нейтральных" ¡заферментау E.chrysanthemi лепш экспрэаравалкя у клетках Е. coli, чым Erwinia, на аснове чаго мяркуецца прысутнасць у клетках Erwinia спецыф1чных рэгулятарау, узмацняючых экспрэсно адных генау i падауляючых шшыя. Вывучаны мутацьп, спецыф!чна уплываючыя на экспрэсно пектатшязных генау. Упершыню выкарыстаны клашраваныя гены пектатл1яз для вывучэння сакрэторнай астэмы клетак Erwinia, што дазволша вызначынь хуткасш сакрэцьп пектатлгяз клеткам! Erwinia. Знойдзена спецьи|лчнасць астэм сакрэцьп пектатл1яз вызначанага вщу бактэрый i дзвюхстадыйнасць працэса сакрэцьп: спачатку транслакацыя пектатл^яз у перыплазму, а потым сакрэцыя у асяроддзе. Упершыню атрыманы мутацьп па генам фосфатрансферазнай астэмы у бактэрый E.chrysanthemi i вывучаны ix уплыу на сштэз i сакрэцыю ¡заферментау пектатлшзы. Праведзена малекулярнае клашраванне i секветраванне часты ptsl-гена i выяулена яго высокая гамалопя з ptsl-генам E.coli.

Шляхам селекцьп на устойл1васць да катабалггнай рэпрэсй птюкозай атрыманы штамы Erwinia, прадуцэнты пектатл1яз. Распрацаваны спосаб цвердафазнан мацэрацьн ¡лыгасаломю з выкарыстаннем мутантных бактэрый роду Erwinia. Атрыманы пектагнтычныя ферментныя прэпараты бактэрый роду Erwinia, як1я эфектыуны для атрымання пратапластау раслш.

РЕЗЮМЕ

диссертационной работы ЕВТУШЕНКОВА Анатолия Николаевича "Внеклеточные пектатлиазы бактерий рода Erwinia"

Ключевые слова: фитопатогенные бактерии, пектатлиаза, продуцент, изоферменты, синтез, секреция, ген, мутация, клонирование, катаболитная репрессия, льноволокно, мацерация, вирулентность

Изучен изоферментный состав пектатлиаз - факторов вирулентности фито-патогенных бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. са-rotovora subsp. atroseptica в зависимости от состава среды культивирования. Выявлены основные закономерности формирования изоферментного состава пектатлиаз, что позволяет получать ферментные препараты с заданными свойствами. Изучена регуляция синтеза отдельных изоферментов посредством индукции и катаболитной репрессии глюкозой. Разработан метод препаративного электрофореза пектатлиаз, с помощью которого отдельные изоферменты очищены дс гомогенного состояния и изучены их основные физико-химические свойства, ш основании которых выделено 12 групп изоферментов. Клонированы структурные гены для отдельных изоферментов и изучена их экспрессия в клетках Е. coli i Erwinia. Обнаружено, что гены для нейтральных изоферментов Е. chrysanthem лучше экспрессировались в клетках Е. coli, чем Erwinia, на основании чеп предполагается наличие в клетках Erwinia специфических регуляторов усиливающих экспрессию одних генов и подавляющих другие. Изучены мутации специфически влияющие на экспрессию пектатлиазных генов. Впервьи использованы клонированные гены пектатлиаз для изучения секреторно1 системы клеток Erwinia, что позволило определить скорости секрецш пектатлиаз клетками Erwinia. Обнаружена специфичность систем секреци: пектатлиаз определенного вида бактерий и двухстадийность процесса секреции вначале транслокация пектатлиаз в периплазму, а затем секреция в сред] Впервые получены мутации по генам фосфотрансферазной системы у бактери E.chrysanthemi и изучен их эффект на синтез и секрецию изоферменто пектатлиазы. Проведено молекулярное клонирование и секвенирование част ptsl-гена и выявлена его высокая гомология с ptsl -геном E.coli.

Путем селекции на резистентность к катаболитной репрессии ппокозо получены штаммы Erwinia, продуценты пектатлиаз. Разработан спосо твердофазной мацерации льносоломки с использованием мутантных бактери рода Erwinia. Получены пекголитические ферментные препараты бактерий poj Erwinia, эффективные для получения протопластов растений.

SUMMARY

of the Dissertation Work "Extracellular Pectate Lyases of Bacteria of

the Genus Erwinia" by Anatoly Nikolaevich Evtushenkov

Keywords: phytopathogenic . bacteria, pectate lyase, - isoenzymes, synthesis, secretion, gene, mutation, cloning, catabolite repression, flax, maceration, virulence

The isoenzyme spectrum of pectate lyases which are the virulence factors of phytopathogenic bacteria E. chrysanthemi, E. carotovora- subsp. carotovora and E. carotovora subsp. atroseptica was studied in different culture media. The main trends in the formation of the pectate lyase isoenzyme spectrum were determined. The regulation of the isoenzymes through induction and catabolite repression was studied. A method of preparative electrophoresis of pectate lyases was developed. With this method separate isoenzymes were purified to homogeneity, their physical and chemical properties were studied. Based on these properties isoenzymes were grouped into twelve families. The genes coding for several isoenzymes were cloned and expression of their products was studied in E. coli and Erwinia. The genes of the neutral pectate lyases of E. chrysanthemi were shown to be better expressed in E.coli than in Erwinia, which allows to suggest the presence of specific regulators in Erwinia capable of increasing expression of several genes and decreasing expression of the others." Mutations specifically affecting expression of pectate lyase genes were studied. For the first time cloned pectate lyase genes were used for the study of the secretory system of Erwinia. This approach allowed us to determine the rates of pectate lyase secretion. The specificity of the secretory apparatus was discovered as well as two stages in the secretion process: translocation of pectate lyases to the periplasm followed by their excretion into the media. For the first time mutants defective in the phosphotranspherase system of E.chrysanthemi were obtained. The effect of these mutations on the secretion of pectate lyases was studied. The ptsl gene was cloned, part of it was sequenced and it's high homology with the ptsl gene of E.coli was determined.

Selection for catabolite repression resistant mutants has allowed us to constmct Erwinia strains overproducing pectate lyases. The method for the solidphase maceration of flax straw with the mutant Erwinia strains was developed. The pectate lyase preparations from Erwinia suitable for the plant protoplasts preparation were developed.