Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии выделения и очистки трансэлиминаз Bacillus macerans и изучение их свойств

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии выделения и очистки трансэлиминаз Bacillus macerans и изучение их свойств"

Актуальность темы. Среди множества направлений биотехнологии в настоящее время интенсивно развивается производство микробных ферментов, которые находят широкое применение во многих отраслях народного хозяйства, медицине и научно-исследовательской практике.

Немаловажная роль среди ферментов, пользующихся большим спросом в отраслях, перерабатывающих растительное сырье, принадлежит препаратам, содержащим комплекс пектолитических ферментов: пектинэстеразу, эндо- и эк-зо-полигалактуроназу (51, 55, 115). Они используются в производстве соков и вина. Указанные ферменты относятся к классу гидролаз. Под их действием пектины растительного сырья гидролизуются до низкомолекулярных соединений, что способствует снижению вязкости субстратов и тем самым позволяет увеличить выход целевого продукта при переработке растительного материала. Однако пектингидролазы разрушают в основном пектины растительного сырья, не затрагивая при этом межклеточные вещества и протопектин. Глубокое изучение вопроса переработки растительных субстратов позволило ученым установить, что в процессе его деградации принимают участие другие ферменты, такие как пектинлиазы и пектатлиазы, получившие название трансэлиминаз, или лиаз (66, 127). Эти ферменты катализируют разрыв а-1,4-гликозидных связей по механизму ß-элиминирования. При этом происходит негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между 4 и 5 углеродными атомами.

Такие ферментные препараты обладают мацерирующим действием и могут быть использованы в пищевой промышленности при производстве фруктовых и овощных соков с мякотью, так называемых «жидких фруктов», продуктов для диетического и детского питания, при экстракции лекарственных веществ из растительного сырья, в процессе мочки льна в текстильной промышленности, а также в составе мульгиэнзимных композиций при производстве комбикормов.

Однако, несмотря на очевидную перспективность применения, технология получения очищенных бактериальных трансэлиминаз для нужд пищевой промышленности в настоящее время отсутствует. Количество зарубежных препаратов, содержащих пектинлиазу и пектатлиазу, очень ограничено, и на рынке присутствуют лишь три препарата, где эти ферменты указаны, как сопутствующие. Стоимомть препаратов аналогичной степени очистки, предлагаемых фирмой «Новозаймс» составляет 25 долларов за киллограмм. Следовательно, разработка технологии производства очищенных препаратов пектинтранэлиминазы является важной экономической задачей. В свете изложенного, научные исследования, связанные с получением препаратов мацерирующего действия из доступного сырья, разработкой экономичных методов их очистки, изучением свойств этих препаратов представляются весьма актуальными.

Необходимо подчеркнуть, что ведущая роль в разработке технологии и получения мацерирующих ферментов в России принадлежит Г.Б. Бравовой (5, 9, 11) и М.В. Самойловой (9, 11, 50).

Цель данного исследования состояла в разработке технологии получения комплексного пектолитического ферментного препарата, обладающего высокой каталитической активностью, предназначенного для промышленного использования, а также в изучении физико-химических и каталитических свойств выделенных трансэлиминаз.

Для достижения указанной цели решали следующие задачи: разработка технологии получения пектолитического ферментного препарата из культуральной жидкости В.тасегат; разработка способа разделения и очистки ферментов, присутствующих в полученном ферментном препарате и получение их в гомогенном виде; исследование степени чистоты выделенных ферментов и изучение их основных физико-химических и каталитических свойств; изучение специфичности действия и мацерирующего эффекта выделенных ферментов в процессе разрушения растительных субстратов.

Научная новизна работы заключается в следующем: впервые разработана технология получения ферментного препарата, обладающего трансэлиминазной активностью из культуральной жидкости B.macerans; впервые показано, что культура B.macerans способна синтезировать два типа трансэлиминаз: пектинлиазу и пектатлиазу и разработан способ получения этих ферментов в гомогенном состоянии, основанный на хроматографическом разделении ферментативного комплекса; изучены физико-химические и биохимические свойства выделенных ферментов, в частности, молекулярная масса, изоэлектрическая точка, изучено влияние pH и температуры, а также активаторов и ингибиторов на активность и стабильность ферментов; изучена субстратная специфичность и кинетика гидролиза ряда субстратов, позволяющая идентифицировать выделенные ферменты.

Практическая ценность работы: Разработана эффективная технология получения пектолитического ферментного препарата «Фитолиаза» из культуральной жидкости Bacillus macerans для создания новых технологий переработки растительного сырья. Короткое время культивирования, использование дешевого, недефицитного сырья и высокая продуктивность штамма обеспечили низкую себестоимость препарата «Фитолиаза», которая по предварительным расчетам не будет превышать 500-550 рублей за киллограмм. Получено санитарно-эпидемиологическое заключение на применение препарата в пищевой промышленности, утвержденное Государственной санитарно-эпидемиологической службой РФ Минздрава РФ 8 77.99.02.916.Д.003475.06.01 от 25.06.2001).

Разработана нормативно-техническая документация, включающая опытно-промышленный регламент и технические условия на производство очищенного препарата «Фитолиаза».

Совместно с сотрудниками Института консервной промышленности разработаны рекомендации по применению препарата «Фитолиаза» при получении фруктовых и овощных соков с мякотью. Применение препарата «Фитолиаза» при обработке плодоовощного сырья позволяет увеличивать выход продукта на 7-15% по сравнению с традиционной технологией, улучшает качество готового продукта, повышая содержание красящих и экстрактивных веществ, в том числе углеводов на 10-25%, увеличивает жидкую часть на 8-20%, придает продукту гомогенность и текучесть.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ежова, Анна Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ выделения трансэлиминазных ферментов из культуральной жидкости Bacillus macerans с использованием микрофильтрации и ультрафильтрации.

2. Впервые разработана и проверена в опытно-промышленных условиях технология получения нового ферментного препарата «Фитолиаза», обладающего высокой трансэлиминазной активностью. Разработана научно-техническая документация на производство препарата «Фитолиаза» и применение его в пищевой промышленности.

3. Изучен состав полученного препарата и показано, что он содержит комплекс пектол итических ферментов.

4. Впервые разработана схема получения гомогенных трансэлиминаз, включающая в качестве основных стадий: осаждение этиловым спиртом, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию, и впервые показано, что культура Bacillus macerans синтезирует два пектинтрансэлиминазных фермента.

5. С использованием современных методов исследований (диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирование и высокоэффективная жидкостная хроматография) установлена гомогенность выделенных ферментов.

6. Изучение субстратной специфичности и использование специфических реагентов позволило классифицировать трансэлиминазы данного продуцента как пектинлиазу (КФ 4.2.2.10) поли(метоксигалактуронид)лиазу и пектатлиазу (КФ 4.2.2.2) - поли(1,4-а-0-галактуронид)лиазу.

7. Изучены основные физико-химические и каталитические свойства выделенных ферментов:

- определен аминокислотный состав гомогенных ферментов;

- установлены разными методами величины молекулярной массы пектинлиазы (48000-48800 Д) и пектатлиазы (41000-42500 Д);

- установлены значения изоэлектрических точек ферментов: для пектинлиазы pl 8,4; для пектатлиазы pl 9,8;

- определены оптимальные условия действия ферментов: пектинлиазы -pH 7,5, Т = 45 °С; пектатлиазы - pH 8,4, Т = 50 °С;

- зона стабильности пектинлиазы и пектатлиазы — pH в пределах 6,0-9,0, температура 20-40 °С.

8. Определены кинетические параметры действия пектинлиазы и пектатлиазы.

9. Показана способность пектинлиазы и пектатлиазы мацерировать межклеточные перегородки растительного сырья. Установлен синергетический эффект действия ферментов в процессе мацерации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Участие трансэлиминазных ферментов, к которым относятся пектинлиаза и пектатлиаза в процессе деградации растительного сырья установлено рядом исследователей (8, 10, 16, 33, 46, 51, 118). Однако до настоящего времени на рынке ферментов отсутствуют препараты, обладающие активностью трансэли-миназы.

Из литературы известно, что большинство бактерий синтезируют в основном фермент пектатлиазу (4), а микроскопические грибы - пектинлиазу (33). Однако, в последнее время, исследователями было установлено, что некоторые бактерии (118) и некоторые грибы (113) способны продуцировать и пектатлиазу, и пектинлиазу.

В связи с этим цель проведенного исследования заключалась в разработке технологии нового очищенного ферментного препарата из культуры Bacillus macerans, обладающего высокой трансэлиминазной активностью для нужд пищевой промышленности, а также в разработке способа разделения и очистки трансэлиминаз, содержащихся в препарате, и в изучении их физико-химических и каталитических свойств.

Разработка промышленной технологии получения нового ферментного препарата представляет практический интерес, а проведенные научные исследования позволили расширить наши знания о культурах, продуцирующих тран-сэлиминазные ферменты и обеспечить научный подход к их получению и использованию в различных отраслях промышленности.

Для осуществления поставленной цели были решены следующие задачи: • разработка технологии получения очищенного препарата из глубинной культуры Bacillus macerans;

• разработка способа разделения и очистки ферментов, присутствующих в ферментном препарате и получение их в гомогенном виде;

• изучение физико-химических и каталитических свойств выделенных ферментов.

С одной стороны, это вызвано тем, что получение очищенного ферментного препарата необходимо для ряда отраслей промышленности: пищевой, консервной и винодельческой. С другой стороны очищенный ферментный препарат представляет собой субстанцию для получения высокоочищенных и гомогенных ферментов. Получение высокоочищенных и гомогенных препаратов отвечает интересам медицины, фармацевтической промышленности и научным целям.

Как известно, Bacillus macerans является важной высокопродуктивной промышленной культурой, способной синтезировать комплекс пектолитических ферментов, состав которого зависит от свойств штамма-продуцента, состава питательной среды и условий культивирования.

В связи с поставленной задачей была разработана технологическая схема получения комплексного ферментного препарата пектолитического действия, включающая в себя современные методы выделения: процесс ультрафильтрации и микрофильтрации культуральной жидкости.

Была изучена селективность и удельная производительность различных ультрафильтрационых мембран, а также влияние предочистки, кратности концентрирования и pH раствора на этот процесс.

Исследование влияния предочистки ферментных растворов на процесс ультрафильтрации показало, что использование микрофильтрации позволяет увеличить удельную производительность процесса в 1,5 раза.

Кратность концентрирования имеет существенное значение, так как чем она больше, тем меньше энергозатраты при дальнейшем высушивании концентрата. Для изучаемого процесса была установлена оптимальная кратность концентрирования - 10 раз, так как при дальнейшем её увеличении начинает падать производительность процесса, увеличивается его длительность, что в целом вызывает инактивацию ферментов.

Изучение влияния рН на процесс ультрафильтрации позволило выбрать зону, где наблюдается наибольшая стабильность ферментов и достаточно высокая производительность процесса. у

Установлено, что внесение ионов кальция в концентрации 1(Г М в процессе сушки концентратов позволило сократить потери ферментов при сушке на 6 %.

При получении ферментного препарата по разработанной технологической схеме выход по активности составляет - 66,4%. Активность препарата - 600000 ед/г.

Таким образом, проведенные исследования позволили разработать оптимальные условия процесса, которые включают:

- предочистку ферментного раствора на мембране МФАС- 0,22 мкм;

- ультрафильтрацию на мембране УПМ-50, рН-7,0-8,0, степень концентрирования - 10;

- стабилизацию концентратов хлористым кальцием (10"2 М);

- сушку концентрата при температуре на входе 130-135 °С и на выходе 65-70 °С.

На основании проведенных исследований был разработан опытно-промышленный технологический регламент на производство ферментного препарата с товарным названием «Фитолиаза» и разработаны технические условия. На препарат «Фитолиаза» получено санитарно-эпидимиологическое заключение и разрешение на его применение в пищевой промышленности. Технология получения препарата «Фитолиаза» отработана в опытно-промышленных условиях, где были подтверждены полученные экспериментальные данные. Опытные партии препарата были переданы во ВНИИКОП для испытания в производстве соков. На основании проведенных испытаний были разработаны рекомендации по применению препарата «Фитолиаза» в консервной промышленности.

Исследование ферментативного комплекса полученного препарата показало, что он обладает не только пектинтрансэлиминазной активностью, но содержит в незначительном количестве полигалактуроназы и пектинэстеразу. Так как для изучения свойств того или иного фермента необходимо иметь его в высоочищенном или гомогенном состоянии, задача следующих наших исследований состояла в разработке способов разделения и очистки ферментов трансэлиминазного действия, входящих в состав препарата.

С целью разделения и очистки ферментов использовались современные методы, применяемые в биохимической практике: гель-фильтрация, ионообменная хроматогроафия, высокоэффективная ионообменная жидкостная хроматография.

Особое внимание уделялось разработке условий проведения ионообменной хроматографии, в результате которой необходимо было получить ферменты с максимально возможным выходом и наибольшей чистотой. Для повышения эффективности процесса хроматографии исследовалось влияние таких факторов, как способ предварительного обессоливания, состав буферных смесей, их ионная сила и рН. Изучение указанных факторов позволило разработать оптимальные условия проведения ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе:

- установлено, что предварительное обессоливание ферментного раствора следует проводить методом гель-фильтрации на сефадексе С-25 в среде 10"3 М фосфатного буфера рН 6,4 с 10"2 М Са(СН3СОО)2;

- сорбцию ферментов на КМ-целлюлозу осуществлять в среде 5x10"2 М фосфатного буфера рН 6,0-6,4;

- для элюции использовать 0,6 M раствор хлористого натрия в 5х10~2М фосфатном буфере pH 7,8.

Проведение ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе в оптимальном режиме позволило почти полностью отделить сопутствующие ферменты (пектинэстеразу и эндо-полигалактуроназу), значительную часть низкомолекулярных веществ и пигмент. В результате хроматографического разделения ферментативного комплекса Bacillus macerans удалось получить несимметричную белковую фракцию с двумя до конца не разделенными пиками, каждый из которых обладал активностью трансэлиминазы.

Однако профиль элюции свидетельствовал о неоднородности выделенной фракции. В связи с этим для дальнейшего разделения ферментативного комплекса нами был использован метод гель-фильтрации на сефадексе G-100.

Для проведения гель-фильтрации использовали элюат, полученный при хроматографии на КМ-целлюлозе, который предварительно концентрировали методом ультрафильтрации.

Изучение условий концентрирования разбавленного ферментного раствора, полученного на стадии ионообменной хроматографии, показало возможность использования мембран фирмы «Диафло» UM-10 и УПМ-10 («Владипор»). При кратности концентрирования 20 раз при pH 7,5 выход фермента в концентрате составляет 85-90 %.

Проведенные исследования показали, что использование гель-фильтрации на сефадексе G-100 в среде 5x10"3 M фосфатного буфера pH 7,0 позволяет разделить ферменты и получить две белковые фракции: трансэлиминазу I и трансэлиминазу II.

Гомогенность указанных ферментов была доказана методами гель-фильтрации, диск-электрофореза в полиакриамидном геле, изоэлектрофокусирования и рехроматографией на колонке MonoS в системе FPLC.

В результате проведенных исследований была разработана схема разделения и очистки ферментов Bacillus macercms и получения гомогенных ферментов, обладающих трансэлиминазной активностью. В процессе очистки удельная активность выделенных ферментов была увеличена в 15 и 13 раз соответственно. При этом трансэлиминаза I содержит 10%, а трансэлиминаза II - 41% от исходной активности.

Наличие гомогенных ферментов, дальнейшее изучение их свойств дает возможность классифицировать выделенные ферменты, а также сопоставить их с литературными аналогами и выявить сходства и различия.

Первой задачей при исследовании полученных в результате очистки ферментов была их идентификация.

Проведенные исследования показали, что трансэлиминаза I проявляет максимальную активность при гидролизе высокоэтерифицированного (70%) цитрусового пектина и минимальную при действии на низкоэтерифицрованный (35 %) свкловичный пектин. Трансэлиминаза II гидролизует пектовую кислоту и низкоэтерифицированный свекловичный пектин и обнаруживает минимальную активность при гидролизе высокоэтерифицированного цитрусового пектина.

Для подтверждения полученных данных было изучено влияние ионов кальция и ЭДТА на активность выделенных ферментов. Было показано, что активность первого фермента не активируется ионами кальция и не ингибируется ЭДТА, в то время как активность второго фермента активировалась ионами кальция и ингибировалась ЭДТА. Сравнение полученных результатов с литературными данными позволяет считать, что трансэлиминаза I относится к пектинлиазам (КФ.4.2.2.10), трансэлиминазу II можно классифицировать как пектатлиазу (КФ.4.2.2.2).

Таким образом, проведенные исследования показали, что культура Bacillus macerans, подобно культуре Bacillus subtilis способна продуцировать две трансэлиминзы, обладающие разной субстратной специфичностью, которые можно идентифицировать, как пектинлиазу и пектатлиазу.

Далее были изучены физико-химические и каталитические свойства выделенных ферментов. Величина молекулярной массы пектинлиазы, определенная с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-100 и диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, равна 48000 Д и 48800 Д, а пектатлиазы 41000 Д и 42500 Д соответственно.

Исследование аминокислотного состава пектинлиазы показало, что молекула фермента состоит из 84 аминокислотных остатков, пектатлиазы — из 80.

Изоэлектрическая точка пектинлиазы равна 8,4, пектатлиазы - 9,8.

Гомогенная пектинлиаза проявляет максимальную активность при температуре 45 °С и pH 7,5. Фермент наиболее стабилен в растворе при pH 6,09,0 и температуре не выше 40 °С.

Гомогенная пектатлиаза проявляет максимальную активность при температуре 50 °С и pH 8,4. Фермент наиболее стабилен в растворе при pH 6,09,0 и температуре не выше 40 °С.

Методом двойных обратных величин Ла й ну и вера-Бе р ка графически были найдены значения константы Михаэлиса (Km) и максимальной скорости гидролиза (Умах) пектинлиазой цитрусового пектина (70%): Km = 1,925x1g-4 М, Умах = 7,4х10"6 М/с и свекловичного пектина (35%): Km =4,8x10"4 М, Умах = 1,8x10"6 М/с, что свидетельствует о сродстве фермента к высоэтерифицированным пектинам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Ежова, Анна Юрьевна, Москва

1. Алиева Дж., Родионова Н.А., Аймухамедова Г.Б. и др. Очистка эндо-полигалактуроназы Geotriehum candidum, хроматографией на поперечно-сшитом пектине. Прикл. биохим. и микробиол., 1978, т. 14, вып. 2, с. 232-234.

2. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976, с. 320.

3. Билай Г.И., Васильев В.Н., Сырчин С.А., Айзенберг B.J1. Очистка и свойства препарата пектинэстеразы из P.fellutahum biourge. Прикл. биохим. и микробиол., 1986, т. 22, в. 5, с. 642-646.

4. Богуш В.Г., Гайда Г.З., Великодворская Т.В. и др. Разделение и анализ внеклеточных форм пектатлиазы Erwinia chrysanthemi ENA 49. -1986,т. 51, вып. 2, с. 260-267.

5. Бравова Г.Б. Биосинтез пектолитических ферментов анаэробными бактериями рода Clostridium.// Дис. канд. биол. наук. М., 1972.

6. Бравова Г.Б., Бражникова О.В. и др. Питательная среда для культивирования Bacillus macerans продуцента мацерирующих фермен-тов.//Авт. свид. СССР №1162224, 1985.

7. Бравова Г.Б., Дуда В.И. и др. Штамм В.шасегаш Щ1ПМ В-2692 продуцент пектолитических ферментов. - Авт. свид. СССР № 1162224, 1985.

8. Бравова Г.Б., Калунянц К.А., Гребешова Р.Н. Применение ферментных препаратов при производстве льноволокна. М.: ОНТИТЭИмикробио-пром, 1974, в. 2, с. 177-200.

9. Бравова Г.Б., Калунянц К.А., Самойлова М.В. Получение технических и очищенных ферментных препаратов из концентратов глубиннойкультуры Clostridium pectinofermentari 15. Микробиол. пром-ть, 1980, №4, с 12-15.

10. Ю.Бравова Г.Б., Калунянц К.А., Самойлова М.В. Характеристика пекто-литических ферментных препаратов из Clostridium pectinofermentas 15. -Прикл. биохим. и микробиол., 1984, т. XX, вып. 1, с. 69-73.

11. П.Бравова Г.Б., Самойлова М.В. Мацерирующие ферменты. М.: ОН-ТИТЭИмикробиопром, 1982, с 9-12.

12. Возняковская Ю.М., Попова Ж.П. Экологические особенности культур вида С/, gurfelii. Микробиол., 1977, т. 46, № 2, с. 311-317.

13. Гладких М.А., Васильева К.В., Метлицкий JI.B. Множественность форм пектинтрансэлиминазы Verticillium dahhiae Klebahn возбудитель вилта хлопчатника. - Прикл. биохим. и микробиол., 1978, т. 14, вып. 6, с. 833-847.

14. Н.Головнева H.A., Астапович Н.И., Кондратьева JI.B. Выделение и некоторые свойства внеклеточной полигалактуроназы Asp. carbonarius. -Прикл. биохим. и микробиол., 1990, т. 26, вып. 4, с. 462-466.

15. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар, 2000.

16. П.Гулый И.С., Донченко JI.B., Карпович Н.С. Пектин, его свойства и производство. АгроНИИТЭШИ1, 1992, вып. 6.

17. Донченко JI.B. Технология пектина и пектинпродуктов. М.: Де Ли, 2000, с. 11-50.

18. Дытнерский Ю.И. Обратный осмос и ультрафильтрация. М.: Химия, 1978, с. 352.

19. Евтушенков А.Н., Шевчик В.Ц., Попова А.Б., Фомичев Ю.К. Очистка и свойства двух внеклеточных эндопектатлиаз штамма Erwinia chrysanthemi епа 49. -Прикп. биохим. и микробиол., 1986, т.22, в.2, с. 187-191.

20. Ежов В.Н., Панахов Ч.М., Остроухова Е.В. Комплексный ферментный препарат культуры Botrytis cinerya для виноделия.//В сб. научн. тр. «Научно-технический прогресс в агроиндустрии». Ялта, 1997.

21. Калайциди Л.Ю. Биохимическое обоснование и разработка технологии пектиновых веществ с заданными комплексообразующими свойствами из различных видов сырья. // Дис. к.т.н. Краснодар, 1998. - 136 с.

22. Калунянц К.А., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты. М.: Пищ.пром-сть, 1979, с. 84-87.

23. Капитонова Л.С., Родионова Н.А. Очистка и свойства пектат-трансэлиминазы Clostridium felsineum. Биохимия, 1973, т. 38, №5, с. 1054-1061.

24. Карпович Н.С., Донченко Л.В., Нелина В.В. Пектин. Производство и применение. К.: Урожай, 1989, с. 10-15.

25. Костенко Т.Н., Нелина В.В., Донченко Л.В., Карпович Н.С. Пектин. Применение пектина. К.: Ассоциация «Пектин», 1992, с. 50-55.

26. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974, с. 957.

27. Макарова Н.М., Бравова Г.Б. Влияние источника углерода на образование внеклеточной пектат-трансэлиминазы. Bacillus circulans. Биотехнология, 1988, т. 4, № 3, с. 346-349.

28. Манаков М.Н., Кузнецов А.р., Марквичев Н.С., Свитцов А.А. Мембранные биореакторы в биотехнологии. Биотехнология, 1988, т. 4, № 2, с. 165-175.

29. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.: Мир, 1971, с. 247.

30. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Фоменко Т.И. и др. Свойства пектин-деполимераз Pénicillium digitatum и использование препаратов различного состава для мацерации тканей картофеля. Прикл. биохим. и микробиол., 1982, т. 18, в. 3, с. 367-373.

31. Михайлова Р.В., Сапунова А.И., Лобанок А.Г., Рассадина Г.В. Характеристика пектингидролазного ферментного препарата Asp. alhaceus. -Прикл. биохим. и микробиол., 1991, т 27, в. 5, с. 646-650.

32. Михайлова Р.В., Сапунова Л.В., Лобанок А.Г. Влияние источника азота на рост грибов рода Pénicillium и синтез внеклеточных пектинлиаз. -Микол. и фитопатол., 1992, т. 26, № 4, с. 273-278.

33. Патент Великобритании №1375857, 1974.

34. Патент Германии № 274337, 1989.

35. Патент Германии № DD-278818, 1990.

36. Патент ФРГ № 2014472, 1973.

37. Патент ФРГ № DD-229552, 1981.

38. Патент ФРГ, № DD-266665, 1984.

39. Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. М.: Пищевая пром-ть, 1971, с. 370-374.

40. Рохленко С.Г., Калунянц К.А., Гребешова Р.Н., Кишковский З.Н. Получение плодово-ягодных вин с помощью пектолитических ферментных препаратов.//В кн.: «Ферменты. Получение и применение в народном хозяйстве». М., 1972, вып. 1, с. 284-298.

41. Рузанова JI.P., Михалева Н.И., Соловьева И.В. Пектолитические ферменты из Aspergillus heteromorphus. Прикл. биохим. и микро-биол.,1996, т. 32, №2, с. 3-9.

42. Румянцева Г.Н. Получение высокоочищенной (3-глюкозидазы Geotri-chum candidum, изучение ее свойств и условия применения.//Дис. к.т.н. М., с.24.

43. Рухлядева А.П., Горзева М.Г, Метод определения активности амило-литических ферментов. Ферм, и спирт, пром-сть, 1966, № 1, с. 9-11.

44. Самойлова М.В. Разработка условий получения мацерирующего ферментного препарата из Bacillus circulons 31.11 Дис. канд. техн. наук. -М., 1981.

45. Сапожникова Е.В. Пектиновые вещества и пектолитические ферменты. М.: Итоги науки, 1971, с. 8-20.

46. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Т. Изучение свойств пек-тинлиазных препаратов Pénicillium adametzii, P.citrinum и P.janthinellum. Прикл. биохим. и микробиол., 1995, т. 31, № 3, с. 267271.

47. Сейдер А.И. Особенности производства столовых вин с использованием пектолитических ферментов.//Автореф. дис. канд. техн. наук. -Краснодар, 1976. 20 с.

48. Федоренко Б.Н. Разработка технологии ультрафильтрации некоторых гидролитических ферментов.//Дис. канд. техн. наук. М., 1987.

49. Фогарти В.М. Микробные ферменты в биотехнологии. М.: Агро-промиздат, 1986.

50. Хаханова Г.С., Белов Н.И. Исследование инактивации ферментов при ультрафильтрации.//Тез. докл. II Всесоюзн. конф. по мембр. мет. разд. смесей. Владимир, 1977, с. 424-426.

51. Хенглейн Н.Ф. Пектины.//В сб. «Биохимические методы анализа растений». М.: Иностранная литература, 1960, с. 280-323.

52. Шевчик В.Е., Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Зависимость состава пектолитических ферментных комплексов бактерий рода Егмша от химического состава среды культивирования. Прикл. биохим. и мик-робиол., 1992, т. 28, в. 1, с. 87-93.

53. Шелухина Н.П., Ашубаева З.Д., Аймухамедова Г.Б. Пектиновые вещества, их некоторые свойства и производные. Фрунзе: Илим, 1970, с.73.

54. Шишкова Э.А., Орещенко Л.И., Фокина С.С. Использование мембранной технологии в производстве ферментов.//Межд. симпозиум по мембранам и процессам мембранного разделения. ПНР, г. Торун, 1989, с. 1-2.

55. Шишкова Э.А., Орещенко Л.И., Фокина С.С. Технологические особенности концентрирования ферментных растворов.//В сб. «Концентрирование, выделение и очистка продуктов микробиол. синтеза». М., 1985, с. 3-5.

56. Шишкова Э.А., Фокина С.С. Использование мембранной технологии для предочистки ферментных растворов.//Тез. докл. «Современные направления развития биотехнологии». М., 1991, с. 1-2.

57. Шишкова Э.А., Фокина С.С., Орещенко Л.И. Влияние предварительной обработки растворов ферментов на процесс ультрафильтрации. -ПНР, г. Торун, 1989, с.2-3.

58. Эрекаев В.П., Бондарева Э.С., Баранова Л.М. Исследование гидрофильных свойств препаратов свекловичного пектина методом виско-зиметрии.//В сб. «Проблемы качества и хранения продовольственных товаров». -М.: Пищевая промышленность, 1974, с. 257-263.

59. Agrwal G.P., Crysta S. Production of pectic enzymes by Corynespora cas-siicola cansyng fruit rot of papaya. Gur. sci., 1978, v. 47, p. 161-163.

60. Alberscheim P., Neukom H., Denel H. Uber die Bildung von ungesattigen Abbanprodukten clurch ein pectineBauendes Enzym. J.Heiv.Chim Acta, 1960, 43, N 5, S. 1422-1426.

61. Alkerta I., Garbisn G., Leama M. Immobilization of pectin lyase from Penicillium italicum by covalent binding to nylon. Enzym. Microbiol. Technol., 1996, v. 18, N. 2, p. 141-146.

62. Almengol-Hecht M.L., Bull A.T. Bacterial spoilage of vegetables and certein fruit. Microbiol., 1978, v. 119, N. 2, p. 163-166.

63. Andrews P. Estimation of the molecular weights of protein by sephadex gelfiltration. Biochem. J., 1964, v. 91, N 2, p.222-233.

64. Borlin G.P. Philson S.S., Miksche I.P. Teulger cytophotometry of pine nuelli. Stain technol., 1979, v. 54, N. 4, p. 201-204.

65. Boyewal P. Continuous production of microbial enzymes in a membrane bio-reactor. Downstream, Processing in Biotechnol. II, 1989, p. 1.11-1.15.

66. Bruhlmann F. Purification and characterization of an extracellular pectat-lyase from Amycolata sp. Appl. Envir. Microbiol., 1995, v. 61, N. 10, p. 3580-3585.

67. Charm S.E., Kai C.I. Comparison of ultrafiltration systems for concentration of Biological. //Biotechnol. Biolugug. 1971, v. 13, N. l,p. 185-202.

68. Charm S.E., Wann B.K. Enzyme inactivation with spearing. Biotechnol. Biolugug., 1970, v. 12, N. 6, p. 1103-1109.

69. Davis B.J. Disk-electrophoresis II. Method and application to human serum proteins. Ann N.I. Acad. Sci., 1964, v. 121, art. 2, p. 404-411.

70. Demein A.L., Phaff H.J. Recent advances in the enzymatic hydrolysis of pectin substances. Wall.Labs.Com., 1957, v.20, N. 69, p. 119-140.

71. Denis S., Boyaval P. Microbial enzyme production in a membrane bioreac-tor. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1991, v. 34, N. 5, p. 608-612.

72. Denis S., Terre S., Bertheoru Y. Factor affecting pectate-lyase activity during membrane filtration. Biothechnol. Techn., 1990, v. 4, N. 2, p. 127-132.

73. Doesburg J.J. Pectic Substances in Fresh and Preserved Fruits and Vegetables. // I.B.V.T. Communication, 1965, № 25, Wageningen, The Netherlands.

74. Dzurova M., Heinrichova K., Stratilova E. The pectin enzyme complex. -Folia Microbiol., 1997, v. 41, N. 3, p. 279.

75. Durand A., Desgranges C. Effect of CO2 engrowth, condiation and enzyme production in solid-state culture on Aspergillus niger and Trichoderma wiride enzyme. Microb. Technol., 1990, v.12, N. 7, p. 546-551.

76. Gainvords A., Frezia V., Lemarleqwier H., Belordi A. Pectinesterasa from Botrytis cinerea. Microbiol., 1994, N. 12, p. 3249-3250.

77. Goldberg C., Norvan A. Methyl-esterification, de-esterification and gelation of pectins in the primary cell wall// Pectins and Pectinases: Proceedings of an international Symposium. Wageningen, Netherlands, 1996, p. 151-172.

78. Greco G.I., Gianfreda L., Albanesi D. Thermal inactivation and enzyme kinetics in an ultrafiltration membrane reactor. 1981, v. 3, p. 233-245.

79. Hasui J., Fukui V., Kikuchi J. Isolation, characterization Endopoligalakturo-nase. Bioschi: Biotechnol. Biochem., 1998, 62, N. 5, p.852-857.

80. Hatada Y., Koike K., Yoschimatsu T. New Bacillus sp. pectin-acid-lyase. -Patent, 1998.

81. Hatanaka C., Imamura T. Endopolygalactyronase from Coniothyrium diplo-diella. Agric.Biol.Chem., 1974, 38, p. 2267.

82. Hatanaka C., Kegoya J., Imamura T. Extracellular and intracellular exo-polygalacturonase of Erwinia carotovora subsp. carotovova. J. Fac. Appl. Biol. Chem. Hiroshima Univ., 1979, v. 24, N. 9, p. 31-42.

83. Hatanaka C., Ozava J. Exopolygalacturonasa from Erwinia aroideae. Agric.Biol.Chem., 1973, 37, p. 593.

84. Hatanaka C., Ozava J. Exopolygalacturonasa produced by Pseudomonas sp. Agric.Biol.Chem., 1972, 36, p. 2307. •

85. Hatanaka C., Ozawa I. Isolation of a new exopolygalacturonase production digalacturonie acid from pectin acid. Agric. Biol. Chem., 1973, v.37, p. 593.

86. Hennib H., Stam H., Oort M.G. Production, characterization and Application of Rhamnogalacturonase // Pectin and pectinasesi. Proceeding of an International Symposium. Wageningen, Netherlands, 1996. - P. 485-494.

87. Huether I.P., Mclntyre G.A. Pectin enzymes production by two strains of Pseudomonas fluorescens associated with the pinheye desease of potato tubers. Amer. Potato J., 1967, v. 98, N. 3, p. 171-182.

88. Juven B.I., Lindner P.,Weisslowiez H. Pectin degradation in plant material by Eeikonostoc mesenteroides. J.Appl.Bacterid., 1985, v. 58, p.533-538.

89. Kao M., Narsimha, Kembhowi, Asha A. Role of lysine, tryptophan and calcium in the P-elimination activity of a low-molecular-mass pectatlyase from Fusarium moniliformae. Pant. Biochem. J., 1996, v. 319, N. 1, p. 159-164.

90. Kortesz L.I. The pectin substances. New York: Interscience publishers, 1951.-628 p.

91. Kumar S., Palanivelu P. Production and properties of the pectinolytic enzymes from thermophilic fungus Thermomyces languinosus.- J.Microbiol. Biothechnol., 1998, v. 14, N. 5, p. 781-782.

92. Lidman M., Webster D. Isolation of valuable products from fermentation brothes by ultrafiltration.//C6. тез. 3 Симпозиума соц. стран по биотехнол. Братислава, 1983.

93. Lowry О.Н., Rosbrough N.J., Farz A.L., Randall R.J.//J. Biol. Chem. -1951, v. 193, N 1, p. 265-275.

94. Mandels M., Weber I., In: Cellulases and their applications. -Andraces chem. series, 1969, 95, p. 391.

95. McCann M.C., Roberts K. Plant cell wall architecture: the role of pectins // Pectins and Pectinases: Proceedings of an international Symposium. -Wageningen, Netherlands, 1996, p. 91-107.

96. Nikaidon N., Naganuma Т., Kamio Y. Production purification and properties of pectin lyase from Pseudonas marginalis. Biosci. Biotech-nol.Biochem., 1995, v. 59, N. 2, p.323-324.

97. Ornstein L. Disk-electrophoresis I. Background and theory. Ann. N.I. Acad. Sci., 1964, v. 121, art. 2, p. 321-336.

98. Papdiwal P.B., Peshpande K.B. Pectin methylesterase of Xanthomonas campestris pv. malvacearum. Ind. Phytopathol., 1983, v. 36, N. 2, p. 134-135.

99. Patent GB N.9205949 Erwinia chrysanthemi pectatlyase and Erwinia caratovora polygalacturonase gene cloning. 1994.

100. Pericin D., Jarak M., Antov M:, Vuyicic B., Kevresan S. Effect of inorganic phosphate on the secretion of pectinolytic by Aspergilles niger. Lett Appl. Microbiol., 1992, v. 16, N. 6, p. 275-278.

101. Pilnik W, Mohner D., Doong R.L., Liljbjelkek Gell free synthesis of the pectin polysaccharide homogalacturonan //Pectins and Pectinases: Proceedings of an international Symposium. Wageningen, Netherlands, 1996, p. 109-115.

102. Pilnik W., Rombouts F.M. In: Enzymes and Food Processing (G.G.Birch, N. Blakebrough and K.J.Parker, eds). Applied Science Publishers Ltd, London, p. 105.

103. Pilnik W., Voragen A.G.J. (1970) Pectin and pectinases. Biochemistry of Fruits and their Products. -Academic Press, London, 1970, v. I, p. 53-60.

104. Pissowin C., Christine R., Janine B., Cotte P. Biochemical characterization of the pectat-lyase of Erwinia chrysanthemi. Biochim. Biophys. Acta, 1998, N. 2, p. 188-196.

105. Polizeli M., Jorge I., Terenzi H. Pectinase production by Neurospora crassa: purification and biochemical characterization of extracellular polygalacturonase activity. J. Gen. Microbiol, 1991, v. 137, N. 8, p. 18151823.

106. Porwal S., Chakravarti B.P. Degradation of pectin substances by Xan-thomonas. Acta Phytopathologica Academiae Scintiarum Hungarical, 1970, 5, p. 327.

107. Rewhald U. Höhere Reinheit. Lebenemittelenzyme. Enzyme aus gente-chisch veränderten Microorganismen und deren Anwendung in der Getrankeindus trie. Getränke, 1998, T. 52, N. 3,p. 146-151.

108. Sakai T., Okushima M. Microbial production of pectin from citrus peel. -Appl. Environ. Microbiol., 1980, v. 39, N. 4, p. 908-912.

109. Sakai T., Sakamoto T., Hallaert I. Pectin, pectinase and protopectinase production, properties and applications. Adv. Appl. Microbiol., 1993, N.39, p.213-219.

110. Sakamoto T., Hours R., Sakai T. Purification, characterization and production of two pectic-trans-eliminases with protopectinase activity from Bac. subtilis. -Biosci. Biotechnol. Biochem., 1994, v. 58, N. 2, p. 353-358.

111. Sato M., Kaji A. Exopolygalacturonase lyase produced by Streptomyces massasporeus. Agric. Biol. Chem., 1980, v. 44, N. 4, p. 717-722.

112. Scols H.A., Voragen A.G.I. Complex pectins: Structure elucidation using enzymes // Pectins and Pectinases: Proceedings of an international Symposium. Wageningen, Netherlands, 1996,- p. 3-14.

113. Seethaler D., Hartmeier W. Purification and properties of the pectinolytic enzymes of a flocculent strain of Clostridium acetobutylicum. Dechema, Biotechnol. Conf., 1992, 5, Pt. A, p. 213-216.

114. Sheiman M.I., Mcmillan J.D., Miller L., Chase T. Purification and properties of polygalacturonic acid trans-eliminail produced by Clostridium mul-tiformentans. -Europ. J. Biochem., 1976, v. 64, p. 565.

115. Shewehin V.E., Evtushenkov A.N., Fomichev Y.K. Dependence of composition of pectolytic enzyme complexes from Erwinia bacteria on the chemical composition, of the culture medium. Prikl. Biokhim. Microbiol.,1992, T. 28, N. 1, p. 87-93.

116. Silwa D., Altwood M., Tempest D. Partial purification and properties of pectin-lyase from Penicillium expansum.//Departamento de Microbiologia, Universiade Federal de Vicosa, Brasil Word. J. Microbiol. Biotechnol.,1993, v. 9, N. 5, p. 574-578.

117. Somogyi M. Determination vof reducing sugar. J Biol. Chem., 1951, v. 195, N. l,p. 19-28.

118. Stack I.P., Mount M.S., Berman R.M., Hubbard I.P. Pectin enzyme complex from Erwinia carotovora. a model for degradation and assimilation of host pectin fractions. Phytohath., 1980, v. 70, N. 4, p. 267-272.

119. Starr M.P., Moron F. Eliminative split of pectin substances by phytopa-thogenic softrot bacteria. Science, 1962, v. 135, p.920.

120. Tardy F., Nasser W., Robert-Barndoy J., Cotte P. Comparative analysis of the five major Erwinia chrysantemi pectatlyases enzyme characteristics and potential inhibitors. J. Bacteriol., 1997, v. 179, N. 8, p. 2503-2511.

121. Thibault I.F., Mercier C. Aspergillus niger endopolygalacturonatlyase Characterization and some properties. J. Food Biochem., 1980, N. 4, p. 379-393.

122. Titynjian R.S., Scale Consideration for membrane process. Biotechnology, 1984, v. 3, N. 7, p. 623-625.

123. Tore M., Nielsen I., Kreiberg J., Rasmussen P., Mikkelsen I. Pectinmeth-ylesterase from orange fruit. Planta, 1998, 200, N. 4, p. 493-503.

124. Toyama N., Fugii N., Ozawa K. Production of sweet potato starch using a cell separation-enzyme and cellulase. J. Ferment Technol., 1966, v. 44, N. 10, p. 732-735.

125. Wattad C., Kobiler P., Pihoor A. Pectat lyase from Colletotrichum gloesporieides awacado fruits. Physiol. Biol. Plant. Pathol., 1997, v. 50, N. 3, p. 197-212.

126. Weber K., Osborn M. The realility of molecular weight determinations by dodecyl sulphatt-polyacrylamide gel-electrophoresis. J. Biol. Chem., 1969, v. 244, N 16, p. 4406-4412.

127. Yshi S., Jokotsuka T. Maceration of plant tissues by transeliminase. -Argic.Biol.Chem., 1971, v.35, p. 1157-1162.1. ИНСТИТУТ БИОТЕХНОЛОГИИ1. ОКП 92911. УДК1. Группа С05

128. СОГЛАСОВАНО Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности. . Заместитель директора по научной ,- ф работе, д.т.н.,проф. &И(У! Ш!0ЛШ

129. Э.С.Гореньков ^ письмо № 7/360 от 02.10.2001 г

130. УТВЕРЖДАЮ Директор Института -Биртехнрлогии

131. Г.Б. Бравова у у/^адМ 2001 г1. ИНСТИТУТ

132. ПРЕПАРАТ ФЕРМЕНТНЫЙ ФИТОЛИАЗА1. Технические условия1. ТУ 9291-032-34588571-2001

133. СТАНДАРТ РОССИИ в Н И Ист-1 и;; о пгтгигояак катллплныи лист1. Г. /#.0/1. ТА //)%>-#.1. Вводятся впервые

134. Дата введения с "^У'д/К^Ц2001г.

135. Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

136. Л. П. Гульченко Санитарно-эпидемиологическое заключение7799.11.929.Т.000513.06.01 от 27.06.2001 г

137. Завлабораторией БАВ Института биотехнологииэ. д. Шишкова « 0& » /X2001 г

138. Ведущий Лйж. отдел а НТД ^^Га? ¿^""В. М. Лаврухина « Об » // 2001 гво здравоохранения Федерацииние учреждения

139. Коп формы по ОКУД Код учреждения по ОКПО Медицинская документация Форма № 303-00-1/у Утверждено приказом Министерства эдраооохранения Российской Федерации ОТ 27.10. 2000 г. № 381

140. ДАРСТВЕННАЯ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ СЛУЖБА

141. РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ

142. Департамент государственного санитарно-эпидемиологического надзоранаименование территории, ведомства)