Межклеточная коммуникация в популяциях Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 при взаимодействии с растением-хозяином и в условиях голодания

Горшков, Владимир Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Межклеточная коммуникация в популяциях Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 при взаимодействии с растением-хозяином и в условиях голодания
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Межклеточная коммуникация в популяциях Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 при взаимодействии с растением-хозяином и в условиях голодания"

На правах рукописи

Горшков Владимир Юрьевич

□03408 128

МЕЖКЛЕТОЧНАЯ КОММУНИКАЦИЯ В ПОПУЛЯЦИЯХ РЕСТОВА СТЕЯН/МА ТЛОБЕРПСиМ 8СШ1043 ИРП ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С РАСТЕНИЕМ-ХОЗЯИНОМ И В УСЛОВИЯХ ГОЛОДАНИЯ

03.00.12,- физиология и биохимия растении 03.00.07.- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ДЕК 2009

Казань-2009

003488128

Работа выполнена в группе молекулярной биологии Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Гоголев Юрий Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Эль-Регистан Галина Ивановна

доктор биологических наук, Минибаева Фарида Вилевна

Ведущая организация: Казанский государственный университет

им. Ульянова-Ленина

Защита состоится 24 декабря 2009 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан «23» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Формирование растительно-микробных сообществ в естественных экосистемах является сложным и динамичным процессом, в результате которого возникают различные типы взаимоотношений между макро- и микроорганизмами. Важную роль при развитии инфекционных заболеваний растений, установлении симбиотических и ассоциативных взаимоотношений играют процессы передачи информационных сигналов, обеспечивающие формирование адекватного физиологического ответа партнеров друг на друга и на условия окружающей среды. Описанию сигнальных систем бактерий и растений посвящено достаточно много теоретических и экспериментальных работ (Whitehead et al., 2001; Тарчевский, 2002). Однако лишь в последние годы появились предпосылки для изучения способов и механизмов вмешательства растений и бактерий в функционирование сигнальных систем друг друга (Mathesius et al., 2003; Boyer, Wisnievvski-Dye, 2009).

Важную роль на различных этапах формирования растительно-микробных сообществ играют бактериальные сигнальные системы межклеточной коммуникации (McDougald et al., 2007). Ярким примером таких сигнальных систем, обеспечивающих координированное действие микроорганизмов, является система кворума, или «кворум сенсинг» (Fuqua, Winans, 1994). Она позволяет микроорганизмам реализовать коллективный ответ на уровне популяции клеток, результатом чего является проявление различных признаков, в том числе, определяющих особенности взаимодействия с растениями. Функционирование системы кворума основано на синтезе и восприятии аутоиндукторов, в частности ацилгомосерин лактонов (ATJ1). АГЛ накапливаются в бактериальном микроокружении по мере увеличения плотности популяции клеток. При достижении пороговой (функционально значимой) концентрации аутоиндукторов происходит активация экспрессии гена АГЛ-синтазы, что обеспечивает лавинообразное накопление АГЛ, которое, таким образом, регулируется по принципу положительной обратной связи. Растения, в свою очередь, способны воспринимать бактериальные сигналы и адекватно на них реагировать. Более того, растения часто используют систему кворума в качестве мишени для «борьбы с фитопатогенностыо» микроорганизмов (Uroz et al., 2009).

сигналинг, а также модуляции системы кворума внешними сигналами на ключевых этапах формирования взаимоотношений с растением-хозяином являются актуальной темой для исследования. Удобным и интересным объектом для изучения функционирования системы межклеточной коммуникации в условиях, имитирующих природные ситуации, являются системы паразит/расгение-хозяин, включающие фитопатогенную бактерию Pectobacterium atrosepticum. Такие системы отличаются широким спектром наблюдаемых способов взаимодействия. Важным обстоятельством является то, что у P. atrosepticum расшифрована первичная структура генома, а индивидуальные компоненты системы кворума в значительной степени охарактеризованы.

Цель и задачи исследования. Выяснение влияния метаболитов растений на систему межклеточной коммуникации P. atrosepticum SCRI1043 (Ра), а также роли этой системы в распознавании растения-хозяина и адаптации к стрессовым условиям нсвегетационного периода составило цель данного исследования. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить влияние метаболитов растений (Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum) на экспрессию бактериальных генов системы межклеточной коммуникации и накопление ацилгомосерин лакгонов (АГЛ) в культурах Ра.

2. Выяснить участие системы межклеточной коммуникации Ра в распознавании растения в качестве организма-хозяина.

3. Определить влияние метаболитов растений на продукцию факторов вирулентности Ра.

4. Выяснить влияние неблагоприятных для роста условий (ограничение субстрата, длительная инкубация без смены среды культивирования) на жизнеспособность, ультраструкгурные и молекулярно-генетическис особенности клеток Ра.

5. Оценить фитопатогенность клеток Ра, находящихся в различных физиологических состояниях.

6. Выяснить особенности функционирования системы межклеточной коммуникации Ра при неблагоприятных для роста условиях, имитирующих невегетационный период.

Научная новизна. Впервые продемонстрировано участие метаболитов растений, не являющихся функциональными аналогами бактериального аутоиндуктора, в активации системы межклеточной коммуникации фитопатогенных бактерий. Показано, что активация бактериальной межклеточной коммуникации в данной системе паразит/хозяин происходит в результате активации синтеза АГЛ через глобальную регуляторную систему бактерий. Выявлено, что при совместном инкубировании клеток Ра и тканей растений (5. tuberosum и N. tabacum) уровень экспрессии гена АГЛ-синтазы и продукции АГЛ клетками Ра выше, чем в культурах бактерий той же плотности, выращиваемых на полноценных питательных средах. Установлено, что усиление индукции системы кворума бактерий организмом хозяина

происходит при участии водорастворимых термостабильных метаболитов растения с молекулярной массой менее 5 кДа.

Впервые показано, что система кворума Ра является частью сигнальной сети, отвечающей за распознавание растения в качестве организма-хозяина. Экспрессия гена АГЛ-синтазы, синтез АГЛ, а также активность одного из ключевых факторов вирулентности - пектатлиаз, стимулируются в присутствии тканей специфичного растения-хозяина в большей степени, чем неспецифичного.

Впервые показан спонтанный или индуцируемый аутоиндукторами анабиоза (С|2-алкилок"сибензолом) переход клеток Ра в покоящееся состояние, сопряженное с полной потерей колониеобразующей способности и вирулентности. Установлено, что покоящиеся клетки Ра восстанавливают пролиферативную активность и фитопатогенность после смены среды инкубирования. Показано, что переход клеток в покоящееся состояние сопряжен с изменением матричных свойств надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК).

Впервые показано, что в условиях дефицита субстрата в популяциях Ра происходит регуляция численности клеток, поддерживающих пролиферативную активность, при участии систем межклеточной коммуникации. В голодающих культурах с различным титром инокуляции (103 - 109 КОЕ/мл) титр КОЕ/мл стабилизируется в диапазоне величин 106 - 107 в течение трех суток инкубирования. Продемонстрировано, что клетки Ра культур ранней стационарной фазы обладают значительным пролиферэтивным потенциалом в условиях дефицита углерода и фосфора. Данный потенциал реализуется при низкой исходной плотности (менее 106 КОЕ/мл). При этом достижение максимального значения титра КОЕ сопровождается индукцией экспрессии гена АГЛ-синтазы. Увеличение численности клеток ингибируется факторами, содержащимися в культуральной жидкости голодающих культур.

Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание процессов взаимодействия растений-хозяев и фитопатогенных бактерий, а также адаптации микроорганизмов к условиям невегетационного периода. Результаты работы могут служить основой для создания новых способов контроля растительных бактериозов.

Разработаны процедуры количественного анализа бактериальной ДНК, позволяющие выявлять ДНК покоящихся форм бактерий с измененными матричными свойствами Ж ДНК. На этой основе предложены методы детекции Ра и диагностики бактериозов растений, вызываемых данным возбудителем.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования проводились в соответствии с планами НИР КИББ КазНЦ РАН (номер госрегистрации 01.2.007 03823); поддержаны грантом РФФИ № 08-04-01518-а, а также грантом ведущей научной школы академика И.А. Тарчевского.

Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту. ]. Метаболиты специфичного и неспецифичного растения-хозяина (картофель и табак, соответственно) индуцируют экспрессию гена АГЛ-синтазы и синтез АГЛ у Ра, что свидетельствует об участии растения-хозяина в активации системы межклеточной коммуникации (кворум-сенсинг). Индуцирующий эффект при этом оказывают водорастворимые термостабильные метаболиты растений, имеющие молекулярную массу менее 5 кДа.

2. Метаболиты специфичного растения-хозяина оказывают больший эффект на индукцию синтеза АГЛ и пектатлиазную активность Ра, чем неспецифичного.

3. В условиях голодания клетки Ра способны к обратимому переходу в покоящееся состояние, сопряженное с потерей способности к образованию колоний и фитопатогенности, с изменением ультраструктуры клеток, а также матричных свойств надмолекулярных комплексов ДНК.

4. В условиях голодания бактерии Ра используют стратегию регуляции плотности популяции клеток, поддерживающих пролиферативную активность, при участии систем межклеточной коммуникации.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 12-ой международной Путинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», (Москва - Пущино, 2008); 4-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. (Новосибирск, 2008); международной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008); 13-ом симпозиуме студентов и аспирантов «SymBioSE 2009, Biology: Expansion of Borders» (Казань, 2009); Всероссийской научной конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», посвященной памяти М.В. Гусева (Москва, 2009); 34-ом международном конгрессе FEBS «Life's Molecular Interactions» (Прага, 2009); 1-ом Европейском конгрессе по бактериальным биопленкам «Eurobiofilms 2009» (Рим, 2009); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2007,2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ.

Струюура н объем диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы. В работе представлено 2 таблицы и 25 рисунков. Список литературы включает 294 источника; из них 261 иностранных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе был использован штамм Pectobacteríum atrosepíicum SCRI1043 (Pa) (Envinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043) из коллекции микроорганизмов Белорусского гос. университета (г. Минск), любезно предоставленный доц. Е.А. Николайчиком. Штамм Escherichia coli JLD271, а также рекомбинантные плазмиды рАЫОЗ и pAL104 любезно предоставлены проф. И.А. Хмель (Amber, Ahmer, 2005).

Растения табака (Nicotiana tabacum CV «Hawana») и картофеля (Solanum tuberosum сорт «Невский») выращивали в стерильных условиях на среде MS (Murashige, Skoog, 1962). Семена табака, полученные из Белорусского гос. университета, стерилизовали 2% раствором гипохлорида натрия с добавлением 0,5% SDS в течение 10-15 минут. Стерильные растения картофеля, полученные из НПО «Нива Татарстана» (г. Казань), размножали черенкованием в стерильных условиях.

В экспериментах по влиянию метаболитов растений на систему кворума и продукцию факторов вирулентности Ра использовали измельченные (2-3 мм) побеги стерильных растений, а также их водорастворимые экстракты. Бактериальные клетки инкубировали (плотность инокуляции (2-5) х 107) в модифицированной среде D5 (Kado, Heskett, 1970) или в среде IM (Wei et ai, 1992), в том числе в присутствии измельченных тканей растений табака или картофеля (1 г / 20 мл) или их экстрактов, а также с добавлением среды LB (1/10). Культуры инкубировали при 25 °С без перемешивания. Процедура приготовления экстрактов основывалась на протоколе, описанном ранее (Mo et al., 1995). Измельченную растительную массу заливали деионизированной водой (1/2,5, вес/объем) и экстрагировали при 4 °С в течение 2 ч. Экстракт центрифугировали (24000 g), фильтровали через нитроиеллюлозный фильтр (0,45 мкм), подвергали ультрафильтрации через мембранный фильтр Vivaspin 20 (5000 MWCO, Millipore), лиофилизировали и растворяли в денонизованной воде.

Выделение ДНК из клеток бактерий и растений проводили методом фенольной экстракции (Маниатис с соавт., 1984) с дополнительной очисткой (Остерман, 1981; Гловер с соавт., 1988). Выделение тотальной РНК проводили при помощи набора «Yellow Solve» (Силекс, Москва). Для синтеза кДНК использовали 1,5 мкг тотальной РНК, предварительно обработанной ДНКазой (0,1 ед/мкл, Fermentas, Литва). Реакцию обратной транскрипции проводили в амплификаторе DNA Engine thermocycler (BioRad, USA) в реакционной смеси, содержащей 1 мкМ случайных нуклеотидных гексамеров или 0,4 мкМ специфичных праймеров, а также 100 ед. обратной транскриптазы M-MuLV с соответствующим буфером (Силекс, Москва).

Для амплификации участков ДНК Ра конструировали праймеры, комплементарные фрагментам генов expl, rsmB, rpoD, hrpA, hrpL, dspE и области межгенного спейсера 16S-23S рРНК на основе последовательности генома Ра (NC_004547). Праймеры и флуоресцентные зонды синтезировали в НПО «Сшггол» (Москва). Накопление ПЦР продуктов оценивали по эмиссии зонда TaqMan с помощью амплификатора с оптическим модулем ICycler IQ-4 (Bio-Rad).

Определение титра геномных копий Ра проводили относительно калибровочных кривых, построенных по результатам ПЦР PB с ДНК Ра известной концентрации, принимая за одну геномную копию 5,5 фг (5064 т.п.н.) ДНК. В качестве источника мишеней для определения числа геномных копий в ПЦР PB использовали лизаты клеточных суспензий, разведенные в 10к-раз в буфере ТЕ. Лизис клеток проводили кипячением (10 мин) в 2%-ном растворе Triton Х-100.

Дня определения уровня экспрессии генов expl, rsmB, hrpA, hrpL, dspE использовали сравнительный метод (Pfaffi, 2001). Каждый образец анализировали в двух повторностях ПЦР; отсутствие значимых количеств геномной ДНК подтверждали, проводя ПЦР с образцами, приготовленными без этапа обратной траскрипции. Представленные данные рассчитаны по результатам четырех независимых экспериментов с повторяющимися закономерностями. На диаграммах представлены средние значения и стандартные ошибки среднего. Относительный уровень экспрессии expl в голодающих культурах определяли по соотношению количества копий кДНК, соответствующих транскриптам expl и rpoD (стабильно экспрессирующийся ген «домашнего хозяйства» (Sreedharan et al., 2006)).

Экстрагирование АГЛ проводили зтилацетатом, подкисленным ледяной уксусной кислотой из расчета 0,1 мл/л, в течение 4 часов. Фазу растворителя отделяли после центрифугирования (9000 g) и высушивали при помощи роторного испарителя (Pierson et al., 1998). Осадок растворяли в деионизированной воде и использовали для биотесга. Детекцию АГЛ проводили при помощи биосенсорного штамма £1 coli JLD271+ pAL103, согласно опубликованному протоколу (Amber, Ahmer, 2005).

Пекгатлиазную активность определяли по описанной методике (Shevchik et al., 1997). Удельную пекгатлиазную активность выражали в мкмоль ненасыщенного продукта / мин / мг сухого веса клеток Ра.

Для получения покоящихся клеток Ра бактериальные культуры инкубировали в стеклянных флаконах при 28 °С в: 1) свежей среде LB; 2) минеральной безуглеродной среде AB (Ordax et al., 2006); 3) среде AB с 4x10"4 M С12-АОБ (Sigma, США). 4) среде LB с 4x1o-4 M С12-АОБ. Переход клеток в покоящееся состояние оценивали по обратимой потере ими колониеобразующей способности.

Для определения интакгности мембран клеток Ра клеточные суспензии окрашивали красителями из набора BacLight Live/Dead (Mol. Probes, США). Препараты просматривали в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). Проводили дифференцированный учет клеток с красной (543 нм) и зеленой (488 нм) флуоресценцией.

Анализ ультраструктуры клеток Ра проводили на электронном микроскопе Hitachi-125 (Япония). Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III. Материал фиксировали экспозицией в глутаровом альдегиде (2,5%), приготовленном на фосфатном буфере (0,1М, pH 7.2), обезвоживали ацетоном и выдерживали в 0,1% OSO4, приготовленном на том же буфере, с добавлением 25 мг/мл сахарозы.

Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов (расчет среднеквадратичного отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдента). Критерий вероятности /"<0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной 1рупп данных. Сравнение нескольких выборок, полученных в экспериментах, анализировали с помощью метода дисперсионного анализа (АМОУА).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Влияние метаболитов растений на систему межклеточной коммуникации Р. Шпкчрйсит 8СШ1043 (Ра). Анализ имеющихся сведений о регуляторных цепях у Ра и у бактерий таксономмчески близких видов, позволил нам предположить, что факторы растительного происхождения могут активировать систему кворума у этого микроорганизма за счет влияния на образование ключевого аутоинтуктора межклеточного сигналинга - АГЛ. При этом активация экспрессии гена АГЛ-синтазы (ехр!) может осуществляться не только АГЛ, но и продуктами разложения пектиновых веществ растительных клеточных стенок через систему регуляции синтеза вторичных метаболитов (ЯятА/муиВ) бактерий.

В случае справедливости данной гипотезы, в присутствии факторов растительного происхождения должно происходить увеличение уровня экспрессии бактериальных генов гхтВ и ехр1. Действительно, в проведенных нами экспериментах добавление тканей как специфичного (картофель), так и неспецифичного (табак) растения-хозяина в культуры Ра приводило к индукции экспрессии этих генов (рис. 1). Вероятной причиной этого могло послужить появление дополнительного питательного субстрата (компоненты растительных тканей), что, в свою очередь, могло отразиться на численности клеток, участвующих в «кворуме». Однако при добавлении среды ЬВ или использовании среды В5 уровень экспрессии птВ и ехр1 был значительно ниже, чем в присутствии растительных тканей. Кроме того, значения КОЕ/мл, определенные нами для всех вариантов опыта, существенно не

Рис. 1. Экспрессия гена ехр1 Ра при культивировании клеток на индукционной среде 1М (1), на среде 1М в присутствии тканей

картофеля (2) и табака (3), а также при культивировании бактерий на среде 1М, обогащенной ЪВ-бульоном (4), и синтетической среде Б5 (5), Уровень экспрессии представлен в относительных единицах.

о ш о.

о о.

18 16 14 12 10 8 6 4 2 О

2 3 4 5 6ч

2 3 4 9ч

По нашему мнению, особого внимания заслуживают данные, указывающие на то, что факторы специфичного хозяина оказывали больший индуцирующий эффект на экспрессию гена АГЛ-синтазы по сравнению с факторами неспецифичного хозяина (рис. 1). Это свидетельствует о том, что роль бактериальной системы межклеточной коммуникации в растительно-микробном сигналинге более значима, чем мы предполагали в начале исследования. По всей вероятности, кроме того, что система кворума Ра активируется неспецифичными метаболитами растения, она также интегрирована в другие сигнальные системы, сопряженные с видовым распознаванием растения в качестве организма-хозяина и выбором стратегии, соответствующей характеру взаимодействия.

Для доказательства того, что метаболиты растений оказывают влияние на накопление бактериальных аутоиндукторов, мы оценили содержание АГЛ (продукты АГЛ-синтазы) в культуральной жидкости исследуемых культур (рис. 2). Для этого был использован АГЛ-сенсорный штамм Е. coli JLD271 с рекомбинантной плазмидой рАЫОЗ, несущей гены люциферазной системы. Экстракты супернатантов культур Ра, инкубированных на среде IM не приводили к эмиссии флуоресценции АГЛ-

Рис. 2. Биотесг на присутствие АГЛ в супернатантах культур Ра. Определение относительного содержания АГЛ проводили на основе анализа эмиссии флуоресценции у штамма £. coli JLD271, несущего репортерную плазмиду рАЫОЗ. Планшет А: лунки содержали 180 мкл культуры Е. coli JLD271 + pAL103; в лунки в рядах а, б, в добавлена серия разведений JV-(3-оксогексаноил)-Ь-гомосерин лактона; в лунки рядов б ив были также добавлены экстракты тканей картофеля и табака, соответственно; в лунки рядов г, д, е, ж добавлено 20 мкл экстрактов супернатантов культур Ра, инкубируемых в LB-бульоне (г); в среде IM (с)); в среде IM в присутствии тканей растений картофеля (е) и табака (ж). Планшет Б: 180 мкл культуры Е. coli JLD271 + pAL103; ряд а - серия разведений А-(3-оксогексаноил)-Ь-гомосерин лактона (0, 1, 2, 5, 10 мкмоль, соответственно). Ряд б 20 мкл экстрактов супернатантов культур Ра, инкубируемых 24 часа в среде IM (3, б); в среде IM в присутствии низкомолекулярной водорастворимой фракции тканей растений табака (4, б) и картофеля (5, б).

сенсорного штамма (рис. 2А, д).

А 0 1 2 5 10 - -

а ттт -О с;

б ■ ---Щ ш щ о S

в ' - % ■ 5

д :'"-/'о" •/ Ъ о

е г т r я ■J

0 9 18 24 30- —

Б 1 2 3 4 5

ЯШ В а

я KJ б

В культурах Ра на среде IM, обогащенной LB-бульоном, концентрация АГЛ достигала порогового уровня для активации люминесценции у АГЛ-сенсорного штамма после 24 часов инкубирования (рис. 2А, г). Максимальная индукция репортерной системы происходила при добавлении экстрактов супернатантов культур Ра, инкубированных в присутствии тканей картофеля (рис. 2А, е). В таких культурах концентрация АГЛ достигала достаточного уровня для активации флуоресценции уже через 18 часов. В дальнейшем происходило усиление люминесценции, достигавшей максимальной интенсивности по сравнению с другими вариантами опыта. Метаболиты табака оказывали значительно меньший эффект на индукцию синтеза АГЛ (рис. 2А, ж): экстракты супернатантов таких культур активировали репортерную систему позже и с меньшей интенсивностью, чем экстракты культур, инкубированных в присутствии тканей картофеля (рис. 2А, е).

Наблюдаемые эффекты не являются следствием описанной ранее АГЛ-мимикрии (Teplitski et а!., 2000; Degrassi et al., 2007), поскольку экстракты растений табака и картофеля не индуцировали флюоресценцию Е. coli JLD27I + pAL103, а также не влияли на световую продукцию биосенсоров при экзогенном внесении jV-(3-оксогексаноил)-£-гомосерин лактона (рис. 2 б, в). Следовательно, побеги табака и картофеля не содержат функциональных аналогов АГЛ, выступающих в качестве аутоиндукторов системы кворума у Ра. Это позволяет считать, что механизм активации системы кворума Ра за счет метаболитов растения-хозяина определяется не АГЛ-мимикрирующими соединениями, а другими, ранее не описанными, факторами. Таким образом, индукция системы межклеточной коммуникации происходит в результате усиления синтеза бактериального аутоиндуктора (но не его функциональной аналогии) факторами растительного происхождения.

Для первичной характеристики метаболита(ов) растений, обладающих способностью активировать синтез АГЛ Ра, нами были приготовлены и фракционированы экстракты неинфицированных растений табака и картофеля. Основываясь на опубликованных данных (Stachel et al., 1985; Schulte, Bonas, 1992), в первую очередь внимание было уделено низкомолекулярной водорастворимой фракции. Добавление этой фракции в культуры Ра приводило к индукции синтеза АГЛ в той же степени, что и добавление исходного количества ткани растений с учетом разбавления препарата (1 г ткани/20 мл) (рис. 2 А, Б). При этом низкомолекулярные соединения из водорастворимой фракции растений табака приводили к меньшей индукции синтеза АГЛ, чем таковые картофеля. Нагревание растительных экстрактов (100 °С, 10 мин) не влияло на их индуцирующую способность в отношении системы кворума Ра. Таким образом, полученные данные указывают на то, что в тканях табака и картофеля содержатся водорастворимые, термостабильные соединения размером менее 5 кДа, влияющие на систему межклеточной коммуникации Ра. Природа и/или содержание этих соединений, по-видимому, различаются у данных видов растений, что приводит к неодинаковой

степени активации бактериальной системы кворума при различных по характеру взаимодействиях в системе патоген/растение-хозяин. По всей вероятности, активное вмешательство растительного организма в передачу сигнала у фитоассоциированных бактерий во многом обеспечивает пластичность и разнообразие процессов становления растительно-микробных ассоциаций.

2.2. Влияние метаболитов растений на псктатлиазную активность Ра. Транскрипция большинства генов детерминант патогенности (экстраклеточные ферменты, компоненты системы секреции третьего типа) у Ра контролируется кворум-сенсорной системой (Liu et al,, 2008). Обнаруженная нами различная степень влияния метаболитов растений картофеля и табака на систему кворума Ра могла способствовать, по нашему мнению, дифференцированной продукции факторов вирулентности в отношении специфичного и неспецифичного растения-хозяина. Действительно, в присутствии растительных тканей в культурах Ра наблюдали высокий уровень пектатлиазной активности; причем метаболиты специфичного растения-хозяина оказывали более значительный эффект: пектатлиазная активность была в 3 раза выше (/"=0,005), чем в присутствии тканей неспецифичного хозяина (данные приведены в диссертации). В культурах Ра, не содержащих растительных тканей, а также в образцах растительных тканей, инкубированных в стерильных условиях, пектатлиазная активность не детектировалась. Полученные данные подтверждают, что активация системы кворума влияет на пектатлиазную активность (Pirhonen et al., 1993). При этом различная степень активации пектолитических ферментов фитопатогенных бактерий при наличии метаболитов специфичного и неспецифичного растения хозяина до настоящего времени не была продемонстрирована. Ранее были выявлены факторы растительного происхождения, которые активируют продукцию пектатлиаз по независимой от системы кворума регуляторной цепи (Liu et al, 1999); однако эти факторы не являются видоспецифичными. В нашей работе уровень пектатлиазной активности зависел от видовой специфичности хозяина и соответствовал степени активации системы межклеточной коммуникации. По всей вероятности, более существенная индукция пектатлиазной активности в культурах Ра в присутствии тканей специфичного растения-хозяина, чем неспецифичного, связана именно с большей степенью активации системы кворума

23. Влияние метаболитов растений на экспрессию генов системы секреции третьего типа Ра. На ранних этапах взаимодействия с растением-хозяином у многих фитопатогенных бактерий происходит активация системы секреции третьего типа (ССТТ). Этот фактор вирулентности необходим для транспортировки бактериальных эффекторных белков в клетку растения. Функционирование ССТТ оказывает влияние на сигнальные системы растений, а ее активация зависит от сигнальных систем бактерий, что является наглядным примером интерференции сигнальных систем макро- и микроорганизма.

В наших экспериментах относительный уровень экспрессии генов структурного и регуляторного компонентов {ИгрА (рис. ЗА) и ИгрЬ, соответственно) был выше в присутствии тканей как специфичного, так и неспецифичного растения-хозяина, чем в вариантах без растительных тканей. При этом индукция экспрессии этих генов происходила на начальных этапах культивирования (6 ч); через 9 ч уровень экспрессии снижался (рис. ЗА). Экспрессия гена эффекторного компонента ССТТ -белка ВэрН - также активировалась на начальных этапах культивирования Ра в присутствии тканей неспецифичного хозяина (рис. ЗБ). Однако метаболиты специфичного растения-хозяина оказывали ингибирующее действие на экспрессию гена ¿¡ярЕ. Важно отметить, что в присутствии тканей специфичного хозяина наблюдали высокое содержание АГЛ (рис. 2 А, Б) и индукцию экспрессии гена АГЛ-синтазы (рис. 1). Несмотря на это, экспрессия кворум-зависимого гена ЖрЕ репрессировалась (рис. ЗБ).

Таким образом, нами продемонстрировано, что экспрессия кворум-зависимых генов системы секреции третьего типа может регулироваться дифференцированно при наличии факторов специфичного растения-хозяина.

По нашему мнению, избирательный контроль синтеза различных компонентов ССТТ позволяет приурочить экспрессию отдельных детерминант патогенности к определенным этапам взаимодействия с растением-хозяином. Продукция и транспортировка многих эффекторных белков ССТТ происходит на начальных этапах взаимодействия бактерий с растениями. В свою очередь, наблюдаемое нами высокое содержание АГЛ в культурах Ра, инкубируемых в присутствии тканей картофеля, может сигнализировать бактериям о высокой плотности их популяции, характерной для более поздних стадий инфекционного процесса, и способствовать изменению спектра белков, секретируемых через

2 3 4 5 6ч

1 2 3 4 5

9ч

Рис. 3. Экспрессия генов ИгрА (А) и еЬрЕ (Б) Ра при культивировании клеток на индукционной среде 1М (1), на среде 1М в присутствии тканей картофеля (2) и табака (3), а также при культивировании бактерий на среде 1М, обогащенной ЬВ-бульоном (4), и синтетической среде 05 (5), Уровень экспрессии представлен в относительных единицах.

ССТТ. Дифференцированная экспрессия отдельных генов белков ССТТ в случае взаимодействия Ра и специфичного растения-хозяина, вероятно, способствует развитию типичного инфекционного процесса.

2.4. Адаптивные реакции Ра в условиях, имитирующих невегетационный период. Одним из ключевых этапов растительно-микробных взаимодействий является подготовка макро- и микроорганизма к условиям невегетационного периода. Успешная реализация стратегии переживания стрессовых условий фитоассоциированными бактериями благоприятствует сохранению резерва их популяций, а также способствует сохранению устойчивых растительно-микробных ассоциаций в естественных экосистемах. В связи с этим, выяснение способов и механизмов переживания неблагоприятных условий неспорообразующими бактериями необходимо для понимания механизмов формирования растительно-микробных сообществ.

Адаптивные реакции прокариот, как правило, изучаются при высокой концентрации клеток. Однако в естественных условиях микроорганизмы могут быть подвержены стрессовому воздействию при различной плотности популяции, в том числе, при недостаточной для «кворума» численности клеток. В наших экспериментах мы моделировали условия невегетеционного периода, создавая стресс, вызванный голоданием по углероду и затруднением оттока метаболитов. При этом клетки инкубировали в статических условиях при различной плотности популяции (103-109 КОЕ/мл). При этом, независимо от исходного титра инокуляции, концентрация пролиферативно активных клеток стабилизировалась в диапазоне 106107 КОЕ/мл в течение двух-трех суток инкубации (рис. 4).

О)

ш О

1.00Е+09 1.00Е+08 1.00Е+07 1.00Е+06 1.00Е+05 1.00Е+04 1.00Е+03

Рис. 4. Динамика численности КОЕ/мл в культурах Ра, инкубированных в минеральной безуглеродной среде АВ при различной плотности инокуляции: 5х108 (♦). 4х 107 (•), 5х106 (.), 5*105 (о), 6x10" (А), 6x103 (Д) КОЕ/мл.

Время, сут

Наблюдаемые процессы корректировки численности популяции Ра в условиях голодания предполагают возможность плотностно-зависимой регуляции. Мы предположили, что увеличение численности клеток при отсутствии субстрата и низкой исходной численности связано с необходимостью запуска системы межклеточной коммуникации, во многом определяющей способность к адаптации у бактерий. В связи с этим, мы оценили динамику экспрессии гена АГЛ-синтазы в

процессе голодания при разной исходной численности клеток. При высокой плотности популяции в течение суток происходило увеличение относительного уровня экспрессии гена ехр1 в три раза; затем происходило снижение уровня экспрессии (рис. 5). При низкой плотности инокуляции клеток (6х 103 КОЕ/мл), относительный уровень экспрессии этого гена в ходе увеличения тигра клеток оставался на базовом уровне. Через двое суток культуры достигали максимальной плотности клеток (106 КОЕ/мл) и к третьим суткам инкубирования переходили в стационарную фазу роста. При этом происходило увеличение уровня экспрессии гена ехр! в 3 и 6 раз через двое и трое суток, соответственно. Это свидетельствует о сопряженности стабилизации численности популяции и индукции системы кворума.

о>

ш О

Рис. 5. Уровень экспрессии гена АГЛ-синтазы ехр! в клетках Р. Шгозерйсит БСЮ1043 (столбцы) и динамика численности КОЕ/мл в культурах Р. МгощЖсит 8СКП043 (линии), инкубированных в минеральной безуглеродной среде АВ с исходной плотностью ЗхЮ7 (Щ)(в) и 6x103 (И)(А)КОЕ/мл.

О 6

24 48 72 96 Время, ч

Экстракты супернатантов культур Ра, инкубируемых на безуглеродной среде при низкой исходной плотности популяции (8,5x102 КОЕ/мл), после увеличения численности клеток и достижения плотности популяции 106 КОЕ/мл индуцировали биолюминесценцию АГЛ-сенсорного штамма (рис. 6). Вероятно, накопление АГЛ может служить сигналом для прекращения процессов клеточного деления и переходу в состояние покоя. Достижение максимального значения титра КОЕ совпадало по времени с накоплением АГЛ в супернатантах таких культур. При этом концентрация АГЛ была достаточна лишь для слабой индукции флуоресценции у Е.соИ ЛЛ3271 + рАЫОЗ (рис. 6). Однако эта концентрация аутоиндуктора воспринималась голодающими клетками Ра, о чем свидетельствует индукция экспрессии гена АГЛ-синтазы (рис. 5).

При высокой плотности инокуляции в голодающих культурах Ра концентрация АГЛ значительно превышала таковую у культур с низкой плотностью (рис. 6). При этом происходило резкое снижение титра культивируемых клеток (рис. 4). Возможно, АГЛ позволяют клеткам регулировать плотность популяции в зависимости от внешних условий и, в частности, доступности субстрата. Однако экзогенное внесение АГЛ в голодающие при низком титре клеток культуры Ра не оказывало влияния на пролиферативную активность бактерий в исследуемых условиях (рис. 7). Это

свидетельствует о наличии дополнительных, помимо АГЛ, факторов позволяющих бактериям оценивать численность своей популяции.

Рис. 6. Биотест на присутствие АГЛ в супернатантах голодающих культур Ра. Лунки в планшете содержали 180 мкл культуры Е. coli JLD271 + pAL103 с добавлением 20 мкл экстрактов супернатантов культур Ра, инкубируемых в среде AB при различных титрах инокуляции: 1,2хЮ10 (б); 2,0* 10б (в); 2,8*104 (г) SJxIO2 (d). Лунки в ряду (а) содержали серию разведений ^-(З-оксогексаноил)-Ь-гомосерин лаетона.

га

с; 2

ш §

1.00Е+07 -|

1.00Е+06

1.00Е+05

1.00Е+04

1,00Е+03

1.00Е+02

Рис. 7. Динамика численности КОЕ/мл в культурах Ра, инкубированных в минеральной безуглеродной среде АВ (♦), среде АВ с добавлением 50 мкМ

А'-(3-оксогексаноил)-1-гомосерин лактона (■), кондиционированных средах от культуры с исходной плотностью 5><10е (•) и 6x103 (А) КОЕ/мл.

2 3 Время, сут

Для вьшвления предполагаемых факторов межклеточной коммуникации культуральные жидкости опытных культур были протестированы на присутствие в них компонентов, ингибирующих увеличение численности популяции бактерий на безуглеродной среде. Для этого клетки тестируемых культур были удалены фильтрованием через шпроцеллюлозные фильтры (с£=0,2 мкм). После инокуляции кондиционированных сред, полученных от культур низкой исходной плотности клеток (104 КОЕ/мл) после трех суток инкубирования, увеличения численности клеток не происходило (рис. 7). Напротив, супернатанты голодающих культур с титром инокуляции 108 КОЕ/мл не влияли на пролиферацию бактерий в условиях дефицита субстрата (рис. 7). Таким образом, голодание клеток Ра при различной плотности популяции предусматривает различные стратегии их поведения и опосредовано не одинаковым фоном сигнальных экстраклеточных метаболитов. Сигналы, продуцируемые культурами с высокой плотностью популяции, не могут компенсировать действие факторов, останавливающих процесс увеличения численности популяции на безуглеродной среде в культурах с исходно низкой плотностью бактериальных клеток.

2.5. Покоящиеся формы Ра. После достижения пороговой для индукции системы кворума численности или при высокой исходной плотности популяции и длительной инкубации клеток Ра в статических условиях на полноценной или безуглеродной среде происходил их переход в покоящееся состояние (рис. 8). При этом клетки утрачивали способность образовывать колонии на твердых питательных средах. Потеря колониеобразующей способности клетками Ра значительно ускорялась при добавлении в среду 4x10"4 М аутоиндуктора анабиоза алкилоксибензола (С12-АОБ) (рис. 9). АОБ синтезируются микроорганизмами в ответ на стресс, способствуя переходу клеток в состояние покоя, а сходные с АОБ соединения образуются в растениях, что, по-видимому, позволяет им влиять на физиологические процессы ассоциированных микроорганизмов (КогиЬек, Тутап, 1999)

О)

С*

1.00Е+10 1.00Е+08 1,00Е+06 1.00Е+04 1.00Е+02 Т.00Е+00

100 120 140 160| Время, сут

Рис. 8. Динамика численности колониеобразую-щих клеток (титра КОЕ/мл) в культурах Ра, длительно инкубированных в

минеральной среде АВ (о) и ЬВ-бульоне (•). Стрелкой указано время проведения процедуры «оживления».

та

с 5

L-

cf |

1.00Е+10 1.00Е+09 1.00Е+08 1.00Е+07 1.00Е+06 1.00Е+05 1.00Е+04 1.00Е+03 1.00Е+02 1.00Е+01 1.00Е+00

'1234 jl234^ 1234 1

7 169/170 Время, сут

Рис. 9. Динамика

численности клеток, выявляемая по титрам КОЕ (1; 3) и геномных копий (2; 4), в культурах Ра, инкубированных в присутствии Сп-АОБ в концентрации 4x10"4 М в минеральной среде АВ (1; 2) или ЬВ-бульоне (3; 4). Стрелкой указано время проведения процедуры «оживления».

Невыявляемостъ клеток Ра при помощи микробиологических высевов может свидетельствовать либо об их гибели, либо о переходе в покоящееся состояние. Важным аргументом в пользу жизнеспособности клеток является сохранение ими интактности мембран, что было подтверждено при помощи витального окрашивания клеток Ра красителями BacLightTM Bacterial Viability (Invitrogen).

Ультраструктура некультивируемых и вегетативных клеток различалась. Вегетативные клетки характеризовались палочковидной формой, размером 0,7x2,0 мкм, хорошо выявляемыми наружной и цитоплазматической мембранами, электронно-плотной цитоплазмой с мелкогранулярной текстурой, в которой нуклеоид распределен равномерно (рис. 10 А).

Рис. 10. Микрографии срезов клеток Ра: А -вегетативные клетки; Б, В -клетки, инкубированные на безуглеродной среде А В в течение 150 суток; НМ -наружная мембрана; ГШ -периплазматическое пространство; ЦПМ - цито-плазматическая мембрана; Ц - цитоплазма; Н -нуклеоид. Масштабная метка - 200 нм.

В голодающих культурах большинство клеток обладало сферической формой диаметром меньше 0,7 мкм, выявляемым электронно-плотным наружным и нижележащим обширным электронно-прозрачным слоями клеточной оболочки, цитоплазмой с крупногранулярной текстурой, в которой нуклеоид плохо выявлялся (рис. 10 Б, В). Для части клеток характерны признаки плазмолиза (рис. 10 Б), что, по-видимому, связано с их дегидратацией.

Переход клеток Ра в некультивируемое состояние обратим. Воспроизводимый эффект на восстановление колониеобразующей способности (от 0,5% до 10% от исходного титра КОЕ) оказывала отмывка клеток в свежей минеральной среде АВ (рис. 8, 9). При этом увеличение титра КОЕ происходило за счет восстановления способности некультивируемых форм к образованию колоний, а не размножения некой части клеток, поскольку: 1) использовали суспензии с нулевым титром КОЕ, не содержащие культивируемых клеток; 2) процедура «оживления» краткосрочна (30 мин.); 3) для отмывки клеток использовали безуглеродную среду. Следует отметить, что подобранные нами условия, способствующие обратимому переходу Ра в некультивируемое состояние, имитируют возможные ситуации в естественных условиях обитания этих фитопатогенных бактерий.

Неэффективность микробиологических высевов для выявления некультивируемых клеток Ра, обусловила целесообразность проведения количественного ПЦР-анализа. Для суспензий Ра, инкубированных в LB-бульоне или голодной среде АВ с добавлением 4* Iff4 М Сп-АОБ, снижение титра КОЕ сопровождалось уменьшением

титра выявляемых геномных копий (ГК) (рис. 9). После 7 суток инкубирования в лизатах таких клеток нам не удавалось выявить целевую ДНК при помощи ПЦР, хотя сам по себе С/2-АОБ не влиял на эффективность реакции.

При отмывке покоящихся клеток от среды инкубирования, наряду с восстановлением колониеобразующей способности, становилось возможным детектировать их ДНК при помощи ПЦР (рис. 9). Для выявления природы ингибитора(ов) ПЦР, накапливающегося в голодающих клетках, мы использовали последовательную многостадийную очистку ДНК в лизатах клеток Ра. Было показано, что неэффективность количественного выявления покоящихся клеток при помощи ДНК-диагностики связана с наличием в голодающих клетках низкомолекулярных ингибиторов ПЦР, частично удаляемых при помощи диализа и нейтрализующихся при понижении их концентрации. Кроме того, способность ДНК к амплификации определялась белковым фактором(ами) (предположительно, связанным с ДНК), инактивируемым обработкой протеиназой К, а также соединениями, экстрагируемыми органическими растворителями (фенол/хлороформ). Эти соединения, по-видимому, способствуют изменению матричных свойств надмолекулярных комплексов ДНК и приводят к значительным изменениям в транскрипции генов в условиях невегетационного периода.

2.6. Фитопатогенность клеток Ра, находящихся в различных физиологических состояниях. Вопрос о вирулентности покоящихся форм микроорганизмов остается открытым. Микроорганизмы могут сохранять вирулентность в покоящемся состоянии (Ballone et al., 2006), полностью терять вирулентность (Maalej et al., 2004), сохранять способность к реверсии в вегетативные формы в организме хозяина, не вызывая симптомов заболевания (Du et al., 2007b), либо требовать факторов растения-хозяина для возобновления пролиферативной активности и проявления вирулентности (Grey, Steck, 2001). Вегетативные клетки Ра проявляли вирулентность в отношении растения-хозяина (табак) и приводили к его гибели в течение 2-7 дней в зависимости от инфекционной нагрузки (более 1,7x104 клеток). Покоящиеся формы Ра были авирулентны в отношении табака. Микробиологические высевы из растений, инфицированных покоящимися формами, не выявляли бактериальных колоний, что свидетельствовало об отсутствии реверсии покоящихся форм в вегетативные клетки in planta. Отсутствие симптомов заболевания не было связано со сниженной инфекционной нагрузкой: обнаруживаемая численность клеток при их «оживлению) превышала достаточную для развития инфекции в случае вегетативных клеток. «Оживленные» клетки вызывали симптомы заболевания у 10% инфицированных растений. При этом зона некроза была ограничена. Вирулентность «оживленных» клеток полностью восстанавливалась после их пассирования на полноценной питательной среде. Таким образом, обратимый переход в состояние покоя, связанный с изменением ультраструкгурных и молекулярно-гснетических особенностей клеток Ра, сопряжен с

потерей вирулентности в отношении растения-хозяина (табак). Однако при этом сохраняется патогенный потенциал, который реализуется при реверсии клеток в вегетативные формы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в нашей работе результаты демонстрируют более широкий, чем считалось ранее, спектр влияния метаболитов растения-хозяина на межклеточную коммуникацию микроорганизмов. Бактериальная система кворума изначально рассматривалась как относительно автономная, способствующая проявлению различных фенотипов в зависимости от плотности популяции. Однако на нее могут оказывать воздействие также эндогенные и экзогенные сигналы, в том числе, возникающие независимо от плотности популяции. Так, растения могут влиять на поведение ассоциированных с ними бактерий, синтезируя функциональные аналоги сигналов межклеточной коммуникации; такой феномен получил название АГЛ-мимикрии (Лтог е! а1, 2009). В наших исследованиях обнаружено, что воздействие растений на сигнальные системы прокариот может осуществляться не только путем АГЛ-мимикрии, но и за счет активации синтеза бактериального аутоиндукгора метаболитами макроорганизма. Природа и/или содержание этих метаболитов, по-видимому, различается у разных видов растений, вследствие чего система кворума может служить одним из участников процесса распознавания растения в качестве организма хозяина. Различная степень ее активации может приводить к дифференцированной регуляции продукции факторов вирулентности в отношении специфичного и неспецифичного растения-хозяина. Таким образом, особенности функционирования системы кворума могут отражать характер взаимодействия в системе патоген/расгение-хозяин и служить критерием при характеристике взаимоотношений между макро- и микроорганизмом.

Полученные нами результаты расширяют представление о способах переживания невегетационного периода фитоассоциированными бактериями, что обеспечивает сохранение устойчивых растительно-микробных сообществ. Важным этапом при этом является оптимизация плотности популяции клеток при участии системы межклеточной коммуникации.

Обобщая полученные нами результаты и имеющиеся в литературе сведения, мы предлагаем следующую гипотетическую схему функционирования системы межклеточной коммуникации в различных условиях существования микроорганизмов (рис. 11). В стандартных условиях лабораторных культур в отсутствии экзогенных сигналов осуществляется «классическая» схема регуляции по принципу кворума, при которой ее активация определяется плотностью популяции. При стрессе может происходить активация системы кворума при более низкой плотности популяции за счет стресс-специфичных метаболитов и/или изменения компетентности клеток.

На ранних стадиях взаимодействия с растением-хозяином за счет факторов макроорганизма может происходить частичная индукция бактериальной системы кворума (1), которая способствует запуску микробной системы секреции третьего типа (2), репрессирующей защитные реакции растения-хозяина (3), и обеспечивает умеренную продукцию экзоферментов (2*) для получения бактериями ростового субстрата (3*). При достижении высокой плотности популяции (4) наступает острая стадия инфекции, при которой дополнительно активируется система кворума по классическому механизму за счет выработки АГЛ возрастающим количеством клеток (5); происходит «выключение» аппарата секреции третьего типа (6), утратившего эффективность к этому времени, и осуществляется полноценная продукция экзоферментов (7), приводящая к гибели растения.

Популяция микроорганизмов

Рис. 11. Гипотетическая схема активации системы кворума в зависимости от условий обитания' .микроорганизмов. Пояснения к рисунку даны в тексте. Щ. - активация системы кворума

Согласно данной схеме, функционирование системы кворума описывается не только в качественных показателях («индукция/репрессия»), но и в количественных, которые зависят от ряда факторов, в том числе, от присутствия растения-хозяина. При этом подразумевается, что количественная характеристика сигнальной активности системы кворума объясняется тем, что, помимо АГЛ, играющих ключевую роль в ее

запуске, существуют иные факторы регуляции системы межклеточной коммуникации. Эти факторы могут обладать аддитивным эффектом и/или определять восприимчивость клеток к различным концентрациям АГЛ.

Полученные в этой работе результаты расширяют представление о роли системы межклеточной коммуникации у фитопатогенных бактерий и могут служить основой для дальнейшего изучения молекулярных аспектов регуляции системы кворума. Возможность модуляции системы межклеточной коммуникации «неклассическим» способом (факторы хозяина и стресс) способствует ее большей пластичности, обеспечивающей более детальную корректировку поведения микроорганизмов на различных этапах формирования растительно-микробных взаимоотношений в природных экосистемах. Это, в свою очередь, является одним из факторов, обеспечивающих широкое разнообразие типов и характеров взаимодействия между бактериями и растениями.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показана активация бактериальной системы межклеточной коммуникации в результате индукции синтеза бактериального аутоиндукгора (АГЛ) факторами растительного происхождения. Активация системы кворума Р. atrosepticum S CRH 043 происходит при участии водорастворимых термостабильных метаболитов растений (Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum) с молекулярной массой менее 5 кДа.

2. Впервые показано, что система кворума Р. atrosepticum SCRI1043 является частью сигнальной сети, отвечающей за распознавание растения в качестве организма-хозяина. Водорастворимые термостабильные низкомолекулярные (менее 5 кДа) метаболиты специфичного растения-хозяина (S. tuberosum) приводят к большей индукции синтеза АГЛ и пекгатлиазной активности, чем неспецифичного (N. tabacum).

3. Определены особенности экспрессии генов компонентов системы секреции третьего типа Р. atrosepticum SCRI1043 под влиянием метаболитов специфичного и неспецифичного растений-хозяев. Показано, что экспрессия генов кластера hrp может регулироваться дифференцированно. Максимальный уровень экспрессии генов hrpA и hrpL приходится на начальные этапы взаимодействия с тканями растений-хозяев.

4. Впервые показан спонтанный или индуцируемый аутоиндуктором анабиоза С12-алкилоксибензолом переход клеток Р. atrosepticum SCRI1043 в покоящееся состояние, сопряженное с потерей колониеобразующей способности и изменением ультраструктуры. Покоящиеся клетки Р. atrosepticum SCRI1043 восстанавливают пролиферативную активность после смены среды инкубирования.

5. Установлено, что переход клеток Р. atrosepticum SCRII043 в покоящееся состояние сопряжен с изменением матричных свойств надмолекулярных комплексов

ДНК, что приводит к затруднению ее детекции при помощи ПЦР. Восстановление способности ДНК к амплификации в ходе ПЦР происходит при реверсии клеток в вегетативные формы, а также достигается путем очистки ДНК покоящихся клеток.

6. Показано, что покоящиеся клетки P. atrosepticum SCRI1043 авирулентны в отношении N. tabacum. Клетки с восстановленной пролиферативной активностью обладают сниженной фитопатогенностью. Восстановление вирулентности происходит после пассирования «оживленных» клеток на богатой питательной среде.

7. Впервые показано, что при неблагоприятных для роста условиях, имитирующих невегетационный период, в популяциях P. atrosepticum SCRI1043 происходит регуляция концентрации клеток, обладающих пролиферативной активностью. При этом оптимизация плотности популяции осуществляется при участии межклеточной коммуникации.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Регуляция экспрессии генов межклеточной коммуникации бактерий метаболитами растений / В.Ю. Горшков, О.Е. Петрова, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // Материалы конференции / Пущинского НЦ РАН. - Москва-Пущино, 2008. - С. 131-132.

2. Регуляция экспрессии генов межклеточной коммуникации бактерий метаболитами растений / В.Ю. Горшков, О.Е. Петрова, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // Материалы конференции / Научная книга. -Саратов, 2008. - С. 64.

3. Ультраструктура некультивируемых клеток Erwinia carotovora и их вирулентность / А.Г. Даминова, В.Ю. Горшков, О.Е. Петрова, Н.Е. и др. // Сб. тезисов / Пущинского НЦ РАН - Пущино, 2008. - С. 262.

4. Сверхэкспрессия йгр-генов Erwinia carotovora pv. atroseptica, индуцируемая растениями Solarium tuberosum / Ю.В. Гоголев, В.Ю. Горшков, Н.Е. Мухаметшина, О.Е. Петрова // Сб. трудов / Арта. - Новосибирск, 2008. - С. 181.

5. Ультраструктурные и молекулярно-генетические изменения в клетках Erwinia catotovora при переходе в «некультивируемое» состояние / Ю.В. Гоголев, В.Ю. Горшков, О.Е. Петрова, и др. // Материалы конференции / Издательский центр БГУ. - Минск, 2008. - С. 11-13.

6. Plant-dependent régulation of quorum sensing system and virulence factors production in Erwinia carotovora subsp. atroseptica / V. Gorshkov, O. Petrova, N. Mukhametshina, Y. Gogolev //Abstracts / Wiley Blackwell, FEBS. - Prague, 2009. - V. 276.-P. 278.

7. Cross cell density-dependent communication during the initial stages of response to stress in Erwinia carotovora / V.Y. Gorshkov, O.E. Petrova, A.G. Daminova, I.Sh. Khusainov, Y.V. Gogolev // Abstracts / Rome, 2009. - P.48.

8. Участие растения-хозяина в рефляции кворум-сенсинга Erwinia carotovora / В.Ю. Горшков, Н.Е. Мухаметшина, O.E. Петрова, Н.Б. Тарасова, Ю.В. Гоголев // Бюллетень Московского общества испытателей природы / МАКС Пресс. — Москва, 2009. - Т. 114, №2, приложение 1. - С. 43-45.

9. Образование покоящихся форм Erwinia carotovora / Ю.В. Гоголев, В,Ю. Горшков, О.Е.Петрова, Н.Е. Мухаметшина, А.Г. Даминова, М.В. Агеева // Бюллетень Московского общества испытателей природы. / МАКС Пресс. -Москва, 2009.-Т. 114, №2, приложение 1. - С.164—166.

10. Система межклеточной коммуникации при формировании адаптивного ответа на ранних этапах голодания фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora / И.Ш. Хусаинов, В.Ю. Горшков, O.E. Петрова, А.Г. Даминова, Ю.В. Сорокина, Ю.В. Гоголев И Материалы конференции / НЦ PBX ВСНЦ СЩ РАМН, Иркутск. - 2009. -С. 511-514.

11. Диагностика различных физиологических форм Erwinia carotovora / А.Г. Даминова, В.Ю. Горшков, O.E. Петрова, М.В. Агеева, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // Сб. тезисов / Путинского НЦ РАН. -Пущино, 2009. - С. 198.

12. Выявление и характеристика некультивируемых форм энтеробактерий Erwinia carotovora в длительно инкубируемых культурах / Ю.В. Гоголев, В.Ю. Горшков, О.Е.Пегрова, Н.Е. Мухаметшина, М.В. Агеева II С-ИНФО, Лтд. - Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - Т. 4. - С. 77-80.

13. Образование «некультивируемых» покоящихся форм фитопатогенной энтеробактерии Erwinia carotovora / В.Ю Горшков, O.E. Петрова, Н.Е. Мухаметшина, М.В. Агеева, А.Л. Мулюкин, Ю.В. Гоголев // МАИК, Микробиология. - 2009. - Т. 78, №5. - С. 647-655.

14. Система межклеточной коммуникации энтеробактерии Erwinia carotovora при формировании адаптивного ответа к условиям неблагоприятным для роста / В.Ю. Горшков, O.E. Петрова, А.Г. Даминова, Ю.В. Гоголев // МАИК, Доклады Академии наук. - 2009. - Т. 430, №2, в печати.

Подписано в печать 19.11.09г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,75.

Тираж 150. Заказ № 221. Отпечатано с готового оригинал - макета в ООО «Весгфалика» г. Казань, ул. Б. Красная, 67. Тел.: 250-30-42

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горшков, Владимир Юрьевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль системы межклеточной коммуникации бактерий при взаимодействии с растением-хозяином

1.1.1. Феномен «кворум сенсинга» у бактерий

1.1.2. Модуляция межклеточной коммуникации бактерий метаболитами растения-хозяина

1.1.3. Основные факторы вирулентности фитопатогенной бактерии P. atrosepticum и родственных видов

1.1.4. Регуляция продукции факторов вирулентности у Р. atrosepticum и родственных видов

1.2. Адаптация бактерий к неблагоприятным для роста условиям

1.2.1. Образование покоящихся форм микроорганизмов

1.2.2. Роль системы межклеточной коммуникации в формировании адаптивного ответа бактерий

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Культивирование растений и их инфицирование

2.2. Культивирование бактерий

2.3. Оценка титра культивируемых клеток

P. atrosepticum SCR

2.4. Условия экспериментов по влиянию метаболитов растений на систему кворума и продукцию факторов вирулентности

P. atrosepticum SCRI

2.5. Выделение ДНК из бактериальных клеток

2.6. Выделение и очистка ДНК из тканей растений

2.7. Выделение РНК и синтез кДНК при помощи реакции обратной транскрипции

3 2.8. Амплификация участков ДНК i3. atrosepticum SCR с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ)

2.9. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

2.10. Определение титра геномных копий культур

P. atrosepticum SCRI

2.11. Определение уровня экспрессии генов

P. atrosepticum SCRI

2.12. Получение низкомолекулярной водорастворимой фракции растительного экстракта

2.13. Экстракция и детекция ацилгомосерин лактонов

2.14. Определение пектатлиазной активности

P. atrosepticum SCRI

2.15. Получение покоящихся клеток P. atrosepticum SCRI

2.16. «Оживление» покоящихся клеток

P. atrosepticum SCRI

2.17. Окрашивание клеток/*, atrosepticum SCR11043 витальными красителями и их анализ при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии

2.18. Приготовление проб для электронной микроскопии

2.19. Статистическая обработка данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние метаболитов растений на систему межклеточной коммуникации и продукцию факторов вирулентности P. atrosepticum SCRI

3.1.1. Гипотетическая схема активации системы кворума

P. atrosepticum SCRI1043 метаболитами растений

3.1.2. Влияние метаболитов растений на систему межклеточной коммуникации

P. atrosepticum SCRI

3.1.3. Влияние метаболитов растений на пектатлиазную активность P. atrosepticum SCRI

3.1.4. Влияние метаболитов растений на экспрессию генов системы секреции третьего типа

P. atrosepticum SCRI

3.2. Адаптация P. atrosepticum SCRI к неблагоприятным условиям

3.2.1. Образование покоящихся форм

P. atrosepticum SCRI1043 и их «оживление»

3.2.2. Матричные свойства надмолекулярных комплексов ДНК клеток P. atrosepticum SCRI1043, находящихся в различных физиологических состояниях

3.2.3. Фитопатогенность клеток P. atrosepticum SCRI1043, находящихся в различных физиологических состояниях

3.2.4. Особенности адаптивных реакций P. atrosepticum SCRI1043 в зависимости от плотности популяции

3.2.5. Система межклеточной коммуникации P. atrosepticum SCRI 1043 при адаптации к условиям, неблагоприятным для роста

Введение Диссертация по биологии, на тему "Межклеточная коммуникация в популяциях Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 при взаимодействии с растением-хозяином и в условиях голодания"

Формирование растительно-микробных сообществ в естественных экосистемах является сложным и динамичным процессом, в результате которого возникают различные типы взаимоотношений между макро- и микроорганизмами. Важную роль при развитии инфекционных заболеваний растений, установлении симбиотических и ассоциативных взаимоотношений играют процессы передачи информационных сигналов, обеспечивающие формирование адекватного физиологического ответа партнеров друг на друга и на условия окружающей среды. Описанию сигнальных систем бактерий и растений посвящено достаточно много теоретических и экспериментальных работ (Whitehead et al., 2001; Тарчевский, 2002). Однако лишь в последние годы появились предпосылки для изучения способов и механизмов вмешательства растений и бактерий в функционирование сигнальных систем друг друга (Mathesius et al., 2003; Boyer, Wisniewski-Dye, 2009).

Важную роль на различных этапах формирования растительно-микробных сообществ играют бактериальные сигнальные системы межклеточной коммуникации (McDougald et al., 2007). Ярким примером таких сигнальных систем, обеспечивающих координированное действие микроорганизмов, является система кворума, или «кворум сенсинг» (Fuqua, Winans, 1994). Она позволяет микроорганизмам реализовать коллективный ответ на уровне популяции клеток, результатом чего является проявление различных признаков, в том числе, определяющих особенности взаимодействия с растениями. Функционирование системы кворума основано на синтезе и восприятии аутоиндукторов, в частности ацилгомосерин лактонов (АГЛ). АГЛ накапливаются в бактериальном микроокружении по мере увеличения плотности популяции клеток. При достижении пороговой (функционально значимой) концентрации аутоиндукторов происходит активация экспрессии гена АГЛ-синтазы, что обеспечивает лавинообразное накопление АГЛ, которое, таким образом, регулируется по принципу положительной обратной связи. Растения, в свою очередь, способны воспринимать бактериальные сигналы и адекватно на них реагировать. Более того, растения часто используют систему кворума в качестве мишени для «борьбы с фитопатогенностью» микроорганизмов (Uroz et а!., 2009).

В изучении взаимодействия сигнальных систем макро- и микроорганизмов сделаны лишь первые шаги. Однако становится очевидным, что функциональные перестройки этих систем в различных условиях существенным образом отражаются на процессах передачи сигнала, что в значительной степени определяет «поведение» партнеров при взаимодействии. Межклеточная коммуникация необходима также для успешного переживания фитопатогенными бактериями условий невегетационного периода, что обеспечивает сохранение микроорганизмов и начало нового жизненного цикла, сопряженного с формированием взаимоотношений с растением-хозяином. В связи с этим, исследование способов вмешательства растений в бактериальный сигналинг, а также модуляции системы кворума внешними сигналами на ключевых этапах формирования взаимоотношений с растением-хозяином являются актуальной темой для исследования. Удобным и интересным объектом для изучения функционирования системы межклеточной коммуникации в условиях, имитирующих природные ситуации, являются системы паразит/растение-хозяин, включающие фитопатогенную бактерию Pectobacterium atrosepticum. Такие системы отличаются широким спектром наблюдаемых способов взаимодействия. Важным обстоятельством является то, что у P. atrosepticum расшифрована первичная структура генома, а индивидуальные компоненты системы кворума в значительной степени охарактеризованы.

Цель и задачи исследования. Выяснение влияния метаболитов растений на систему межклеточной коммуникации P. atrosepticum SCRI1043, а также роли этой системы в распознавании растения-хозяина и адаптации к стрессовым условиям невегетационного периода составило цель данного исследования.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить влияние метаболитов растений (Solarium tuberosum, Nicotiana tabacum) на экспрессию бактериальных генов системы межклеточной коммуникации и накопление ацилгомосерин лактонов (АГЛ) в культурах P. atrosepticum SCRI1043.

2. Выяснить участие системы межклеточной коммуникации Р. atrosepticum SCRI1043 в распознавании растения в качестве организма-хозяина.

3. Определить влияние метаболитов растений на продукцию факторов вирулентности P. atrosepticum SCRI1043.

4. Выяснить влияние неблагоприятных для роста условий (ограничение субстрата, длительная инкубация без смены среды культивирования) на жизнеспособность, ультраструктурные и молекулярпо-генетические особенности клеток P. atrosepticum SCR11043.

5. Оценить фитопатогенность клеток P. atrosepticum SCRI1043, находящихся в различных физиологических состояниях.

6. Выяснить особенности функционирования системы межклеточной коммуникации P. atrosepticum SCR] 1043 при неблагоприятных для роста условиях, имитирующих невегетационный период.

Научная новизна. Впервые продемонстрировано участие метаболитов растений, не являющихся функциональными аналогами бактериального аутоиндуктора, в активации системы межклеточной коммуникации фитопатогенных бактерий. Показано, что активация бактериальной межклеточной коммуникации в данной системе паразит/хозяин происходит в результате активации синтеза АГЛ через глобальную регуляторную систему бактерий. Выявлено, что при совместном инкубировании клеток Р. atrosepticum SCR11043 и тканей растений (S. tuberosum и N. tabacum) уровень экспрессии гена АГЛ-синтазы и продукции АГЛ клетками P. atrosepticum SCRI1043 выше, чем в культурах бактерий той же плотности, выращиваемых на полноценных питательных средах. Установлено, что усиление индукции системы кворума бактерий организмом хозяина происходит при участии водорастворимых термостабильных метаболитов растения с молекулярной массой менее 5 кДа.

Впервые показано, что система кворума P. atrosepticum SCRI 1043 является частью сигнальной сети, отвечающей за распознавание растения в качестве организма-хозяина. Экспрессия гена АГЛ-синтазы, синтез АГЛ, а также активность одного из ключевых факторов вирулентности — пектатлиаз, стимулируются в присутствии тканей специфичного растения-хозяина в большей степени, чем неспецифичного.

Впервые показан спонтанный или индуцируемый аутоиндуктором анабиоза (С|2-алкилоксибензолом) переход клеток P. atrosepticum SCRI 1043 в покоящееся состояние, сопряженное с полной потерей колониеобразующей способности и вирулентности. Установлено, что покоящиеся клетки Р. atrosepticum SCRI1043 восстанавливают пролиферативную активность и фитопатогенность после смены среды инкубирования. Показано, что переход клеток в покоящееся состояние сопряжен с изменением матричных свойств надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК).

Впервые показано, что в условиях дефицита субстрата в популяциях Р. atrosepticum SCRI 1043 происходит регуляция численности клеток, поддерживающих пролиферативную активность, при участии систем межклеточной коммуникации. В голодающих культурах с различным титром о Q инокуляции (10'3 - 10" КОЕ/мл) титр КОЕ/мл стабилизируется в диапазоне

6 1 величин 10-10' в течение трех суток инкубирования. Продемонстрировано, что клетки P. atrosepticum SCRI 1043 культур ранней стационарной фазы обладают значительным пролиферативным потенциалом в условиях дефицита углерода и фосфора. Данный потенциал реализуется при низкой исходной плотности (менее 106 КОЕ/мл). При этом достижение максимального значения титра КОЕ сопровождается индукцией экспрессии гена АГЛ-сннтазы. Увеличение численности клеток ингибируется факторами, содержащимися в культуральной жидкости голодающих культур.

Показано, что P. atrosepticum SCRI1043 и возможно другие энтеробактерии могут персистировать в условиях, близких к почвам и открытым водоемам в виде некультивируемых форм, выявление которых связано со значительными трудностями. Популяции P. atrosepticum способны значительно повышать свою численность в течение короткого времени и в условиях дефицита питательного субстрата. Выявленные особенности данного микроорганизма могут быть использованы при экологическом мониторинге и фитокарантинных мероприятиях.

Разработаны способы очистки ДНК бактериальных клеток, позволяющие выявлять ДНК покоящихся форм бактерий с измененными матричными свойствами НК ДНК. На этой основе предложены методы детекции P. atrosepticum SCRI1043 и диагностики бактериозов растений, вызываемых данным возбудителем. Предложены также тестовые системы для оценки экспрессии генов факторов вирулентности P. atrosepticum SCRI1043.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в медицинских, сельскохозяйственных, биологических и биотехнологических учреждениях, занимающихся разработкой способов выявления и лечения персистентных инфекций, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по микробиологии, физиологии растений и фитопатологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2006 по 2009 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Роль сигнальных молекул бактерий и растительных метаболитов в формировании специфичных и неспецифичных взаимоотношений бактерий и растений при бактериозах» (гос. регистрационный номер 01200901964). Исследования автора, как исполнителя данной тематики, поддержаны грантом РФФИ № 08-04-01518-а «Индукция генов кластера hrp фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora и Xanthomonas campestris сигналами растительного происхождения», а также фантом ведущей научной школы академика И.А. Тарчевского «Сигнальные системы клеток — медиаторы, протеом» (НШ № 5492.2008.4). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту.

1. Метаболиты специфичного и неспецифичного растения-хозяина (картофель и табак, соответственно) индуцируют экспрессию гена АГЛ-синтазы и синтез АГЛ у P. atrosepticum SCRI1043, что свидетельствует об участии растения-хозяина в активации системы межклеточной коммуникации (кворум-сенсинг). Индуцирующий эффект при этом оказывают водорастворимые термостабильные метаболиты растений, имеющие молекулярную массу менее 5 кДа.

2. Метаболиты специфичного растения-хозяина оказывают больший эффект на индукцию синтеза АГЛ и пектатлиазную активность Р. atrosepticum SCRI1043, чем неспецифичного.

3. В условиях голодания клетки P. atrosepticum SCRI1043 способны к обратимому переходу в покоящееся состояние, сопряженное с потерей способности к образованию колоний и фитопатогенности, с изменением ультраструктуры клеток, а также матричных свойств надмолекулярных комплексов ДНК.

4. В условиях голодания бактерии P. atrosepticum SCRI1043 используют стратегию регуляции плотности популяции клеток, поддерживающих пролиферативную активность, при участии систем межклеточной коммуникации.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 12-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 40-летию государственного исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Гос НИИгенетика) (Москва — Пущино, 2008); 4-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. (Новосибирск, 2008); международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008); 2-ом всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов — биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); 13-ом ежегодном симпозиуме студентов и аспирантов биологов «SymBioSE 2009, Biology: Expansion of Borders». (Казань, 2009); всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», посвященной памяти М.В.Гусева (Москва, 2009); 34-ом международном конгрессе FEBS «Life's Molecular Interactions» (Прага, 2009); 1-ом Европейском конгрессе по бактериальным биопленкам «Eurobiofilms 2009» (Рим, 2009); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2007, 2008 гг.).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Горшков, Владимир Юрьевич

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показана активация бактериальной системы межклеточной коммуникации в результате индукции синтеза бактериального аутоиндуктора (АГЛ) факторами растительного происхождения. Активация системы кворума P. atrosepticum SCRI1043 происходит при участии водорастворимых термостабильных метаболитов растений (Solarium tuberosum, Nicotiana tabacum) с молекулярной массой менее 5 кДа.

2. Впервые показано, что система кворума P. atrosepticum SCRI1043 является частью сигнальной сети, отвечающей за распознавание растения в качестве организма-хозяина. Водорастворимые термостабильные низкомолекулярные (менее 5 кДа) метаболиты специфичного растения-хозяина (S. tuberosum) приводят к большей индукции синтеза АГЛ и пектатлиазной активности, чем неспецифичного (N. tabacum).

3. Определены особенности экспрессии генов компонентов системы секреции третьего типа P. atrosepticum SCRI1043 под влиянием метаболитов специфичного и неспецифичного растений-хозяев. Показано, что экспрессия генов кластера hrp может регулироваться дифференцированно. Максимальный уровень экспрессии генов hrpA и hrpL приходится на начальные этапы взаимодействия с тканями растений-хозяев.

4. Впервые показан спонтанный или индуцируемый аутоиндуктором анабиоза С^-алкилоксибензолом переход клеток Р. atrosepticum SCRI1043 в покоящееся состояние, сопряженное с потерей колониеобразующей способности и изменением ультраструктуры. Покоящиеся клетки P. atrosepticum SCR11043 восстанавливают пролиферативную активность после смены среды инкубирования.

5. Установлено, что переход клеток P. atrosepticum SCRI1043 в покоящееся состояние сопряжен с изменением матричных свойств надмолекулярных комплексов ДНК, что приводит к затруднению ее детекции при помощи ПЦР. Восстановление способности ДНК к амплификации в ходе

ПЦР происходит при реверсии клеток в вегетативные формы, а также достигается путем очистки ДНК покоящихся клеток.

6. Показано, что покоящиеся клетки P. atrosepticum SCRI 1043 авирулентны в отношении N. tabacum. Клетки с восстановленной пролиферативной активностью обладают сниженной фитопатогенностью. Восстановление вирулентности происходит после пассирования «оживленных» клеток на богатой питательной среде.

7. Впервые показано, что при неблагоприятных для роста условиях, имитирующих невегетационный период, в популяциях P. atrosepticum SCRI 1043 происходит регуляция концентрации клеток, обладающих пролиферативной активностью. При этом оптимизация плотности популяции осуществляется при участии межклеточной коммуникации.

149

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в нашей работе результаты демонстрируют более широкий, чем считалось ранее, спектр влияния метаболитов растения-хозяина на межклеточную коммуникацию микроорганизмов. Бактериальная система кворума изначально рассматривалась как относительно автономная, способствующая проявлению различных фенотипов в зависимости от плотности популяции. Однако на нее могут оказывать воздействие также эндогенные и экзогенные сигналы, в том числе, возникающие независимо от плотности популяции. Так, растения могут влиять на поведение ассоциированных с ними бактерий, синтезируя функциональные аналоги сигналов межклеточной коммуникации; такой феномен получил название АГЛ-мимикрии (Uroz et al., 2009). В наших исследованиях обнаружено, что воздействие растений на сигнальные системы прокариот может осуществляться не только путем АГЛ-мимикрии, но и за счет активации синтеза бактериального аутоипдуктора метаболитами макроорганизма. Природа и/или содержание этих метаболитов, по-видимому, различается у разных видов растений, вследствие чего система кворума может служить одним из участников процесса распознавания растения в качестве организма хозяина. Различная степень ее активации может приводить к дифференцированной регуляции продукции факторов вирулентности в отношении специфичного и неспецифичного растения-хозяина. Таким образом, особенности функционирования системы кворума могут отражать характер взаимодействия в системе патоген/растенис-хозяин и служить критерием при характеристике взаимоотношений между макро- и микроорганизмом.

Популяция микроорганизмов

Рис. 25. Гипотетическая схема активации системы кворума в зависимости от условий обитания микроорганизмов. Пояснения к рисунку даны в тексте.

- активация системы кворума

Эти факторы могут обладать аддитивным эффектом и/или определять восприимчивость клеток к различным концентрациям АГЛ.

147

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горшков, Владимир Юрьевич, Казань

1. Аксенов, М.Ю. Использование полимеразной цепной реакции для изучения перехода клеток Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние / М.Ю. Аксенов, Ю.С. Гаворникова, Г.А. Левина и др. // Мол. Генетика. 1994. - № 2. - С. 17-21.

2. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер. М: Мир, 1998. -538 с.

3. Головлев, Е.Л. Другое состояние несопрулирующих бактерий / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1998. - Т. 67. - № 3. - С. 725-735.

4. Головлев, Е.Л. Физиология микробной клетки и метаболическая инженерия / Е.Л. Головлев, Л.А. Головлева // Микробиология. — 2000. — Т. 69.-№2.-С. 149-162.

5. Горшков, В. Ю. Образование «некультивируемых» покоящихся форм фитопатогенной энтеробактерии Erwinia carotovora. / В.Ю. Горшков, О.Е. Петрова, Н.Е. Мухаметшина, М.В. Агеева, А.Л. Мулюкин, Ю.В. Гоголев // Микробиология.- 2009. Т. 78. - № 5. - С. 647-655.

6. Давыдова, O.K. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза / O.K. Давыдова, Д.Г. Дерябин, А.Н. Никиян, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. — 2005. Т. 74.-№ 5.-С. 616-625.

7. Дорошенко, Е.В. Характеристика диссоциантов, штамм 504 / Е.В. Дорошенко, Н.Г. Лойко, О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, И.В. Горнова, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. 2001. - Т. 70. - № 6. - С. 811-819.

8. Дуда, В.И. Образование покоящихся рефрактильных клеток у Bacillius cereus под влиянием ауторегуляторного фактора // В.И. Дуда,

9. С.В. Пронин, Г.И. Эль-Регистан, А.С. Капрельянц, JI.JL Митюшина // Микробиология. 1982.-Т. 51.-№ 1.-С. 77-81.

10. Зигангирова, Н.А. Влияние факторов внешней среды на экспрессию гена Mycoplasma pneumonia, детерминирующего синтез белка Р1 / Н.А. Зигангирова, О.И. Бархатова, И.В.Раковская, A.JI. Гинцбург // ЖМЭИ. -2003.-№4.-С. 17-22.

11. Ильинская, О.Н. Влияние аутоиндукторов анабиоза на геном микробных клеток / О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, П.В. Зеленин, З.Д. Круглова, Б. Чойдаш, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. 20026. - Т. 71. - № 2. - Р. 194-199.

12. Ильинская, О.Н. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе на стрессовые воздействия / О.Н. Ильинская,

13. A.И. Колпаков, М.А. Шмидт, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, Г.И. Эль-Регистан//Микробиология. 2002а,- 71.- № 1.- С. 23-29.

14. Корогодин, В.И. Закономерности размножения дрожжевых клеток при исчезающее малых содержаниях в среде питательных веществ / В.И. Корогодин // Управляемый синтез и биофизика популяций. II Всесоюзное совещание. — Красноярск. — 1969. — С. 286.

15. Литвин, В.Ю. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий /

16. B.Ю. Литвин, Ф.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева // М.: Фармарус-принт. — 1997.-256 с.

17. Лойко, Н.Г. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum / Н.Г. Лойко, B.C. Соина, Д.Ю. Сорокин,

18. JI.JI. Митюшина, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. — 2003. — Т. 72. — № 3.-С. 328-337.

19. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. М.: Мир. - 1984. - 480 с.

20. Мулюкин, А.Л. Образование покоящихся форм Bacillius cereus и Micrococcus luteus II А.Л. Мулюкин, К.А. Луста, М.Н. Грязнова, А.Н. Коздова, М.В. Дужа, В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология — 1996. Т. 65.-№ 6. - С. 782-789.

21. Мулюкин, А.Л. Структурное и физиологическое разнообразие цистоподобных покоящихся клеток бактерий рода Pseudomonas / А.Л. Мулюкин, Н.Е. Сузина, В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. -2008.-Т. 77,-№4.-С. 512-523.

22. Мясник, М.Н. Динамика клеточной популяции бактерий при исчезающее малых количествах питательных веществ в среде / М.Н.

23. Мясник // Управляемый синтез и биофизика популяций. II Всесоюзное совещание. — Красноярск. — 1969. — С. 287.

24. Осипов, Г.А. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava / Г.А. Осипов, Г.И. Эль-Регистан, В.А. Светличный, А.Н. Козлова, В.И. Дуда, А.С. Капрельянц, В.В. Помазанов // Микробиология.- 1985.- Т. 54. №2.- С. 186-190.

25. Остерман, JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование / JI.A. Остерман // М.: Наука. 1981.-288 с.

26. Пушкарева, В.И. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние / В.И. Пушкарева, Е.Н. Емельяненко, В.Ю. Литвин // ЖМЭИ. 1997. - № 3. с. 3-6.

27. Романова, Ю.М. Есть ли сходство в механизмах образования «некультивируемых форм» у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Мол. генетика, микробиол., вирусол. 1993. - № 6. - С. 34-37.

28. Степаненко, И.Ю. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к тепловому шоку / И.Ю. Степаненко, А.Л. Мулюкин, А.Н. Козлова, Ю.А. Николаев, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. — 2005. — Т. 74. № 1.-С. 26-33.

29. Сузина, Н.Е. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий / Н.Е. Сузина, А.Л. Мулюкин, А.Н. Козлова, А.П. Шорохова, В.В. Дмитриев, Е.С, Баринова, О.Н. Мохова,

30. Г.И. Эль-Регистан, В.И. Дуда // Микробиология,- 2004. Т. 73. - № 4. - С. 516-529.

31. Тарчевский, И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А. Тарчевский. М.: Наука, 2002 - 294 с.

32. Эль-Регистан, Г.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов / Г.И. Эль-Регистан, A.J1. Мулюкин, Ю.А. Николаев, Н.Е. Сузина, В.Ф. Гальченко, В.И. Дуда // Микробиология. 2006. - Т. 75. - № 4. - С. 446^56.

33. Albertson, N.H. Functional mRNA half-lives in the marine Vibrio sp. S14 during starvation and recovery / N.H. Albertson, T. Nystrom, S. Kjelleberg / J. Gen Microbiol. 1990. - Vol. 136. - P. 2195-2199.

34. Aldon, D. A bacterial sensor of plant cell contact controls the transcriptional induction of Ralstonia solanacearum pathogenicity genes / D. Aldon, B. Brito, C. Boucher, S. Genin // The EMBO Journal. 2000. - Vol. 19. -N.10.-P. 2304-2314.

35. Almiron, M. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli / M. Almiron, A.J. Link, D. Furlong, R. Kolter // Genes Dev. 1992. - Vol. 6. - P. 2646-2654.

36. Amber, L. Effect of sdiA on biosensor of 7V-acylhomoserine lactones / L. Amber, B.M.M. Ahmer // Journal of Bacteriology. 2005. - Vol. 187. - N.14.-P. 5054-5058.

37. Andersson, R.A. Role of RpoS in virulence and stress tolerance of the plant pathogen Erwinia carotovora subsp. carotovora / R.A. Andersson, V. Koiv, C. Norman-Setterblad, M. Pirhonen // Microbiology. 1999a. - Vol. 145. -P. 3547-3556.

38. Andersson, R.A. The Response Regulator ExpM Is Essential for the Virulence of Erwinia carotovora subsp. carotovora and Acts Negatively on the Sigma Factor RpoS (as) / R.A. Andersson, E.T. Palva, M. Pirhonen // MPMI. -19996.-Vol. 12. -N.7. — P. 575-584.

39. Anetzberger, C. Heterogeneity in quorum sensing-regulated bioluminescence of Vibrio harveyi / C. Anetzberger, T. Pirch, K. Jung // Mol. Microbiol. 2009. - Vol. 73. - N.2. - P. 267-277.

40. Baffone, W. Retention of virulence in viable but non — culturable halophilic Vibrio spp. / W. Baffone, B. Citterio, E. Vittoria, A. Casoroli, R. Campana, L. Falzano, G. Donelli // Int J Food Microbiol. 2003. - Vol. 89. -N.l.-P. 31-39.

41. Baker, C.J. Harpin, An Elicitor of the Hypersensitive Response in Tobacco Caused by Erwinia amylovora, Elicits Active Oxygen Production in Suspension Cells / C.J. Baker, E.W. Orlandi, N.M. Mock // Plant Physiol. -1993.-Vol. 102.-P. 1341-1344.

42. Barnard, A.M.L. Quorum sensing in Erwinia species / A.M.L. Barnard, G.P.C. Salmond // Anal Bioanal Chem. 2007. - Vol. 387. - P. 415-^-23.

43. Barnard, A.M.L. Quorum sensing, virulence and secondary metabolite production in plant soft-rotting bacteria / A.M.L. Barnard, S.D. Bowden, T. Burr, S.J. Coulthurst, R.E. Monson, G.P.C. Salmond // Phil. Trans. R. Soc. B. -2007.-Vol. 362.-P. 1165-1183.

44. Bauer, D.W. Erwinia chrysanthemi hrp genes and their involvement in soft rot pathogenesis and elicitation of hypersensitive response / D.W. Bauer, A.J. Bogdanove, S.V. Beer, A. Collmer // MPMI. 1994. - Vol. 7. - N.5. - P. 573-581.

45. Beaulieu, C. Pathogenic behavior of pectinase-defective Erwinia chrysanthemi mutants on different plants / C. Beaulieu, M. Boccara, F. Van Gijsegem// MPMI. 1993.- Vol. 6.-N.2.-P. 197-202.

46. Bodini, S.F. Quorum sensing inhibition activity of garlic extract and p-coumaric acid / S.F. Bodini, S. Manfredini, M. Epp, S. Valentini, F. Santori // Letters in Applied Microbiology. — 2009. in press.

47. Bogosian, G. A matter of bacterial life and death / G. Bogosian, E.V. Bourneuf//EMBO Rep.-2001. Vol. 2.-N.9.-P. 770-774.

48. Boyer, M. Cell-cell signalling in bacteria: not simply a matter of quorum / M. Boyer, F. Wisniewski-Dye // FEMS Microbiol Ecol. 2009. - Vol. 70. -P. 1-19.

49. Buttner, D. Getting across — bacterial type 3 effector proteins on their way to the plant cell / D. Buttner, U. Bonas // The EMBO Journal. 2002. -Vol. 21. -N.20. - P. 5313-5322.

50. Case, R.J. AHL-driven quorum-sensing circuits: their frequency and function among the Proteobacteria / R.J. Case, M. Labbate, S. Kjelleberg // The ISME Journal. 2008. - Vol. 2.- P. 345-349.

51. Chen, X. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron / X. Chen, S. Schauder, N. Potier, A.V. Dorsselaer, I. Pelczer, B.L. Bassler, F. M. Hughson // Nature. 2002. - Vol. 415. - P. 545-549.

52. Chugani, S.A. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa / S.A. Chugani, M. Whiteley, K.M. Lee, D. D'Argenio, C. Manoil, E.P. Greenberg // Microbiology. 2001. - Vol. 98. -N.5. - P. 2752-2757.

53. Clements, M.O. Starvation recovery of Staphylococcus aureus 8325-4 / M.O. Clements, S.J. Foster // Microbiology. 1998. - Vol. 144. - P. 1755-1763.

54. Collmer, A. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis / A. Collmer, N.T. Keen // Annu. Rev. Phytopathol. 1986. - Vol. 24. - P. 383409.

55. Condemine, G. 2-Keto-3-Deoxygluconate Transport System in Erwinia chrysanthemi / G. Condemine, J. Robert-Baodouy // Journal of Bacteriology. — 1987.-Vol. 169.-N.5.-P. 1972-1978.

56. Condon, C. Control of rRNA transcription in Escherichia coli / C. Condon, C. Squires, C.L. Squires // Microbiological Reviews. — 1995. — Vol. 59.-N.4.-P. 623-645.

57. Coulthurst, S. Genetic and proteomic analysis of the role of luxS in the enteric phytopathogen, Erwinia carotovora / S. Coulthurst, K. Lilley, G. Salmond // Molecular plant pathology. 2006. - Vol. 7. - N.l. - P. 31-45.

58. Daca-DeLancey, R.R. Escherichia coli. genes regulated by cell-to-cell signaling / R.R. Daca-DeLancey, M.M.T. South, X. Ding, P.N. Rather // Microbiology. 1999. - Vol. 96. - N.8. - P. 4610-4614.

59. Day, A.P. Changes in membrane fatty acid composition during entry of Vibrio vulnificus into the viable but nonculturable state / A.P. Day, J.O. Oliver // The Journal of Microbiology. 2004. - Vol. 42. - N.2. - P. 69-73.

60. Day, W.A. Shigella flexneri LuxS quorum-sensing system modulates virB expression but is not essential for virulence / W.A. Day, JR, A.T. Maurelli // Infection and Immunity. 2001. - Vol. 69. - N.l. - P. 15-23.

61. Delden, C.V. Starvation Selection Restores Elastase and Rhamnolipid Production in a Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Mutant / C.V. Delden, E.C. Pesci, J.P. Pearson, B.H. Iglewski // Infection and Immunity. — 1998. Vol. 66. - N.9. - P. 4499-4502.

62. Delden, C.V. Stringent Response Activates Quorum Sensing and Modulates Cell Density-Dependent Gene Expression in Pseudomonas aeruginosa / C.V. Delden, R. Comte, M. Bally // Journal of Bacteriology. — 2001. Vol. 183. — N.18. — P. 5376-5384.

63. DeLisa, M.P. Mapping Stress-Induced Changes in Autoinducer AI-2 Production in Chemostat-Cultivated Escherichia coli K-12 / M.P. DeLisa, J.J. Valdes, W.E. Bentley // Journal of Bacteriology. 2001. - Vol. 183. - N.9. -P. 2918-2928.

64. Doherty, N. Functional Analysis of luxS in Staphylococcus aureus Reveals a Role in Metabolism but Not Quorum Sensing / N. Doherty, M.T.G.

65. Holden, S.N. Qazi, P. Williams, K. Winzer // Journal of Bacteriology. 2006. -Vol. 188. - N.8. - P. 2885-2897.

66. Dong, Y-H. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora II Y-H. Dong, J-L. Xu, X-Z. Li, L-H. Zhang // Microbiology. 2000. - Vol. 97. -N.7. - P. 3526-3531.

67. Dong, Y-H. Quenching quorum-sensing dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase / Y-H. Dong, L.-H. Wang, J-L. Xu, H-B. Zhang, X-F.Zhang, L-H. Zhang // Nature. 2001. - Vol. 411. - P. 813-817.

68. Downard, J. Branched-chain fatty acids: the case for a novel form of cell-cell signalling during Myxococcus xanthus development / J. Downard, D. Toal. //Molecular Microbiology. 1995.-Vol. 16.-N.2.-P. 171-175.

69. Du, M. Characterization and resuscitation of viable but nonculturable Vibrio alginolyticus VIB283 / M. Du, J. Chen, X. Zhang, A. Li, Y. Li // Arch Microbiol. 2007a. - Vol. 188. - P. 283-288.

70. Du, M. Retention of Virulence in a Viable but Nonculturable Edwardsiella tarda Isolate / M. Du, J. Chen, X. Zhang, A. Li, Y. Li, Y. Wang // Applied and Environmental Microbiology. 2007. - Vol. 73. - N.4. - P. 13491354.

71. Dulla, G. Quorum size of Pseudomonas syringae is small and dictated by water availability on the leaf surface / G. Dulla, S.E. Lindow // Microbiology. -2008.-Vol. 105.-N.8.-P. 3082-3087.

72. Elvers, K.T. Quorum sensing in Campylobacter jejuni: detection of a luxS encoded signalling molecule / K.T. Elvers, S.F. Park // Microbiology. -2002.-Vol. 148.-P. 1475-1481.

73. Engebrecht, J. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri / J. Engebrecht, K. Nealson, M. Silverman // Cell. 1983. - Vol. 32. - N.3. -P. 773-781.

74. Engebrecht, J. Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence / Engebrecht, J. and Silverman, M. // PNAS. 1984. -Vol. 81.-P. 4154-4158.

75. Eriksson, A.R.B. Two-Component Regulators Involved in the Global Control of Virulence in Erwinia carotovora subsp. carotovora / A.R.B. Eriksson, R.A. Andersson, M. Pirhonen, E.T. Palva // MPMI. 1998. - Vol. 11.-N.8.-P. 743-752.

76. Feldman, M. Interference of Cranberry Constituents in Cell-Cell Signaling System of Vibrio harveyi / M. Feldman, E.I. Weiss, I. Ofek, D. Steinberg // Curr Microbiol. 2009. - Vol. 59. - N.4. - P. 469-474.

77. Flavier, A.B. An RpoS (as) homologue regulates acylhomoserine lactone-dependent autoinduction in Ralstonia solanacearum / A.B. Flavier, M.A. Schell, T.P. Denny // Molecular Microbiology. 1998. - Vol. 28. - N.3. - P. 475-486.

78. Fray, R.G. Altering plant-microbe interaction through artificially manipulating bacterial quorum sensing / R.G. Fray // Annals of Botany. — 2002. -Vol. 89.-P. 245-253.

79. Fuqua, W.C. A LuxR-LuxI type regulatory system activates Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant tumor metabolite / W.C. Fuqua, S.C. Winans // Journal of Bacteriology. — 1994. -Vol. 176. N. 10. - P. 2796-2806.

80. Fuqua, W.C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators / W.C. Fuqua, S.C. Winans, E.P. Greenberg // Journal of Bacteriology. 1994. - Vol. 176. - N.2. - P. 269-275.

81. Gao, M. Production of Substances by Medicago truncatula that Affect Bacterial Quorum Sensing / M. Gao, M. Teplitski, J.B. Robinson, W.D. Bauer // MPMI. 2003. - Vol. 16. - N.9. - P. 827-834.

82. Gao, Y. The luxS Gene Is Involved in AI-2 Production, Pathogenicity, and Some Phenotypes in Erwinia amylovora / Y. Gao, J. Song, B. Hu, L. Zhang, Q. Liu, F. Liu // Curr Microbiol. 2009. - Vol. 58. - P. 1-10.

83. Gaudriault, S. HrpW of Erwinia amylovora, a new Hrp-secreted protein / S. Gaudriault, M-N. Brisset, M-A. Barny // FEBS Letters. 1998. - Vol. 428. -P. 224-228.

84. Ghezzi, J.I. Induction of the viable but non-culturable condition in Xanthomonas campestris pv. campestris in liquid microcosms and' sterile soil / J.I. Ghezzi, T.R. Steck // FEMS Microbiology Ecology. 1999. - Vol. 30. - P. 203-208.

85. Gibson, K.E. The LysR homolog LrhA promotes RpoS degradation by modulating activity of the response regulator SprE / K.E. Gibson, T.J. Silhavy //Journal of Bacteriology. 1999. - Vol. 181. -N.2. - P. 563-571.

86. Grey, B.E. The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may be involved in long — term survival and plant infection / B.E. Grey, T.R. Steck // Applied and Environmental Microbiology. — 2001. — Vol. 7. N.9. -P. 3866-3872.

87. Grossman, A.D. Extracellular control of spore formation in Bacillus subtilis / A. D. Grossman, R. Losick // Developmental Biology. — 1988. Vol. 85.-P. 4369-^1373.

88. Harris, B.Z. The guanosine nucleotide (p)ppGpp initiates development and A-factor production in Myxococcus xanthus / B.Z. Harris, D. Kaiser, M. Singer // Genes & Development. 1998. - Vol. 12. - P. 1022-1035.

89. Harrison, A.P. The response of Bacterium lactis aerogenes when held at growth temperatures in the absence of nutriment: an analysis of survival curves / A.P. Harrison // Proc. R. Soc. London Ser. B. 1960. - Vol. 152. - P. 418428.

90. Heeb, S. Regulatory Roles of the GacS/GacA Two-Component System in Plant-Associated and Other Gram-Negative Bacteria / S. Heeb, D. Haas // MPMI.-2001.-Vol. 14.-N.12.-P. 1351-1363.

91. Helias, V. Internal colonization pathways of potato plants by Erwinia carotovora ssp. atroseptica / V. Helias, D. Andrivon, B. Jouan // Plant Pathology. 2000. - Vol. 49. - P. 33-42.

92. Hengge-Aronis, R. Back to log phase: ст as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli II Molecular Microbiology. 1996. - Vol. 21. -N.5. - P. 887-893.

93. Hense, B.A. Opinion: Does efficiency sensing unify diffusion and quorum sensing? / B.A. Hense, C. Kuttler, J. Miiller, M. Rothballer, A. Hartmann, J-U. Kreft // Nature Reviews Microbiology. 2007. - Vol. 5. - P. 230-239.

94. Hirsch, M. Role of ppGpp in rpoS stationary-phase regulation in Escherichia coli / M. Hirsch, T. Elliott // Journal of Bacteriology. 2002. -Vol. 184. - N. 18. - P. 5077-5087.

95. Houdt, R.V. iV-acyl-L-homoserine lactone signal interception by Escherichia coli / R.V. Houdt, A. Aertsen, P. Moons, K. Vanoirbeek, C.W. Michiels // FEMS Microbiol Lett. 2006. - Vol. 256. - P. 83-89.

96. Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. Regulation of pectinolysis in Erwinia chrysantherni / N. Hugouvieux-Cotte-Pattat, G. Condemine, W. Nasser, S. Reverchon // Annual Review of Microbiology. 1996. — Vol. 50. - P. 213-257.

97. Huisman, G.W. Sensing Starvation: A Homoserine Lactone-Dependent Signaling Pathway in Escherichia coli / G.W. Huisman, R. Kolter // Science. — 1994. Vol. 265. ~ P. 537 - 539.

98. Hussong, D. Viable Legionella pneumophila not detectable by culture on agar medium / R.R. Colwell, M. O'Brien, E. Weiss, A.D. Pearson, R.M. Weiner, W.D. Burge // BioTecnology. 1987. - Vol. 5. - P. 947-950.

99. Huynh, T.V. Bacterial blight of soybean: Regulation of a pathogen gene determining host cultivar specificity / T.V. Huynh, D. Dahlbeck, B.J. Staskawicz// Science. 1989. - Vol. 245. - P. 1374-1377.

100. Ito, K. DNA structure of pectate lyase I gene cloned from Erwinia carotovora / K. Ito, R. Kobayashi, N. Nikaido, K. Izaki // Agric Biol Chem. — 1988. Vol. 52. - N.2. - P. 479^187.

101. Joint, I. Cell-to-Cell Communication Across the Prokaryote-Eukaryote Boundary /1. Joint, K. Tait, M.E. Callow, J.A. Callow, D. Milton, P. Williams, M. Camara // Science. 2002 - Vol. 298. - P. 1207.

102. Joyce, E.A. Evidence for a signaling system in Helicobacter pylori: detection of a /mrS-encoded autoinducer / E.A. Joyce, B.L. Bassler, A. Wright // Journal of Bacteriology. -2000. Vol. 182. -N. 13. - P. 3638-3643.

103. Kado, C.I. Selective media isolation of Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas, and Xanthomonas / C.I. Kado, M.G. Heskett // Phytopathology. 1970. - Vol. 60. - P. 969-976.

104. Kaplan, H.B. A Myxococcus xanthus cell density-sensing system required for multicellular development / H.B. Kaplan, L. Plamann // FEMS Microbiol Lett. 1996. - Vol. 139. - P. 89-95.

105. Kaprelyants, A.S. Do bacteria need to communicate with each other for growth? / A.S. Kaprelyants, D.B. Kell // Trends Microbiol. 1996. - Vol. 4. -P. 237-241.

106. Kayama, S. The role of rpoS gene and quorum-sensing system in ofloxacin tolerance in Pseudomonas aeruginosa / S. Kayama, K. Murakami, T. Ono, M. Ushimaru, A. Yamamoto, K. Hirota, Y. Miyake // FEMS Microbiol Lett. 2009. - Vol. 298. - N.2. - P. 184-192.

107. Kazemi-Pour, N. The secretome of the plant pathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi / N. Kazemi-Pour, G. Condemine, N. Hugouvieux-Cotte-Pattat // Proteomics. 2004. - Vol. 4. - N. 10. - P. 3177-3186.

108. Kelemu, S. Ei'winia chrysanthemi EC 16 produces a second set of plant-inducible pectate lyase isozymes / S. Kelemu, A. Collmer // Applied and Environmental Microbiology. 1993.-Vol. 59.-N.6.-P. 1756-1761.

109. Kell, D.G. Pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria / D.G. Kell, A.S. Kaprelyants, A. Grafen // Tree. 1995. -Vol. 10.-P. 126-129.

110. Kjelleberg, S. Initial Phases of starvation and activity of bacteria at surfaces / S. Kjelleberg, B.A. Humphrey, K. Marshall // Applied and Environmental Microbiology. 1983. - Vol. 46. - N.5. - P. 978-984.

111. Kjelleberg, S. Do marine natural products interfere with prokaryotic AHL regulatory systems? / S. Kjelleberg, P. Steinberg, M. Givskov, L. Gram, M. Manefield, R. de Nys // Aquatic Microbial Ecology. 1997.- Vol. 13. - P. 85-93.

112. Kolling, G.L. Influence of enteric bacteria conditioned media on recovery of Escherichia coli 0157:H7 exposed to starvation and sodium hypochlorite / G.L. Kolling, K.R. Matthews // Journal of Applied Microbiology. 2007. -Vol. 103.-N.5.-P. 1435-1441.

113. Kondo, K. Morphology of the viable but nonculturable Vibrio cholerae as determined by the freeze fixation technique / K. Kondo, A. Takade, K. Amako // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 123. - P. 179-184.

114. Kozubek, A. Resorciolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity / A. Kozubek, J.H.P. Tyman // Chem. Rev. 1999.-Vol. 99.-N.1.-P. 1-31.

115. Lazazzera, B.A. Quorum sensing and starvation: signals for entry into stationary phase / B.A. Lazazzera // Current Opinion in Microbiology. 2000. -Vol. 3.-N.2.-P. 177-182.

116. Lee, J.L. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction / J.L. Lee, R.E. Levin // J. Microbiol. Methods. 2006. - Vol. 67. - N.3. - P. 456—462.

117. Lee, J-H. Activity of purified QscR, a Pseudomonas aeruginosa orphan quorum-sensing transcription factor / J-H. Lee, Y. Lequette, E.P. Greenberg // Molecular Microbiology. Vol. 59. - N.2. - P. 602-609.

118. Lentimaki, S. Characterization of the hrp pathogenicity cluster of Erwinia carotovora subsp. carotovora : high basal level expression in a mutant is associated with reduced virulence / S. Lehtimaki, A. Rantakari, J. Routtu,

119. A. Tuikkala, J. Li, О. Virtaharju, E.T. Palva, M. Romantschuk, H.T. Saarilahti // Mol Gen Genomics. 2003. - Vol. 270. - P. 263-272.

120. Lequette, Y. A Distinct QscR Regulon in the Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Circuit / Y. Lequette, J-H. Lee, F. Ledgham, A. Lazdunski, E.P. Greenberg // Journal of Bacteriology. 2006. - Vol. 188. - N.9. - P: 3365-3370.

121. Li, Y-H. Cell Density Modulates Acid Adaptation in Streptococcus mutans: Implications for Survival in Biofilms / Y-H. Li, M.N. Hanna, G. Svensater, R.P. Ellen, D.G. Cvitkovitch // Journal of Bacteriology. 2001. -Vol. 183. - N.23. - P. 6875-6884.

122. Linder, K. Membrane fatty acid and virulence changes in the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus / K. Linder, J.D. Oliver // Applied and Environmental Microbiology. 1989. - Vol. 55. -N.l 1. - P. 2837-2842.

123. Lombardia, E. A LuxS-Dependent Cell-to-Cell Language Regulates Social Behavior and Development in Bacillus subtilis / E. Lombardia, A.J. Rovetto, A.L. Arabolaza, R.R. Grau // Journal of Bacteriology. — 2006. — Vol. 188. N. 12. - P. 4442-4452.

124. Lomovskaya, O.L. Characterization of the sigma 38-dependent expression of a core Escherichia coli starvation gene, pexB / O.L. Lomovskaya, J.P. Kidwell, A. Matin // Journal of Bacteriology. 1994. - Vol. 176. - N.13. -P. 3928-3935.

125. Lory, S. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles: shared pathways of extracellular protein targeting / S. Lory // Current Opinion in Microbiology. 1998. - Vol. 1. -N.l. - P. 27-35.

126. Lupp, C. Vibrio fischeri Uses Two Quorum-Sensing Systems for the Regulation of Early and Late Colonization Factors / C. Lupp, E.G. Ruby // Journal of Bacteriology. 2005. - Vol. 187. - N.l 1. - P. 3620-3629.

127. Lyon, W.R. Mutation of luxS affects growth and virulence factor expression in Streptococcus pyogenes / W.R. Lyon, J.C. Madden, J.C. Levin, J.L. Stein, M.G. Caparon // Molecular Microbiology. 2001. - Vol. 42. - N.l. -P. 145-157.

128. Maalej, S. Maintenance of pathogenicity during entry into and resuscitation from viable but nonculturable state in Aeromonas hydrophila exposed to natural seawater at low temperature / S. Maalej, R. Gdoura, S.

129. Dukan, A. Hammami, A. Bouain // Journal of Applied Microbiology. 2004. -Vol. 97.-P. 557-565.

130. Mae, A. Transgenic Plants Producing the Bacterial Pheromone 7V-Acyl-Homoserine Lactone Exhibit Enhanced Resistance to the Bacterial Phytopathogen Erwinia carotovora / A. Mae, M. Montesano, V. Koiv, E.T. Palva//MPMI.-2001.-Vol. 14.-N.9.-P. 1035-1042.

131. Manefield, M. Halogenated fiiranones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover / M. Manefield, T.B. Rasmussen, M. Henzter, J.B. Andersen, P. Steinberg, S. Kjelleberg, M. Givskov // Microbiology. 2002. -Vol. 148.-P. 1119-1127.

132. Marouga, R. Synthesis of immediate upshift (Iup) proteins during recovery of marine Vibrio sp. strain S14 subjected to long-term carbon starvation / R. Marouga, S. Kjelleberg // Journal of Bacteriology. 1996. -Vol. 178.-N.3.-P. 817-822.

133. Mathesius, U. Extensive and specific responses of a eukaryote to bacterial quorum-sensing signals / U. Mathesius, S. Mulders, M. Gao, M. Teplitski, G. Caetano-Anolles, B.G. Rolfe, W.D. Bauer // Plant Biology. -2003.-Vol. 100.-N.3.-P. 1444-1449.

134. McDougald, D. Bacterial quorum sensing and interference by naturally occurring biomimics / D. McDougald, S.A. Rice, S. Kjelleberg // Anal Bioanal Chem. 2007. - Vol. 387. - P. 445^153.

135. McDougald, D. Defences against oxidative stress during starvation in bacteria / D. McDougald, L. Gong, S. Srinivasan, E. Hild, L. Thompson, K. Takayama, S.A. Rice, S. Kjelleberg // Antonie van Leeuwenhoek. — 2002. — Vol. 81. -P. 3-13.

136. McDougald, D. Nonculturability: adaptation or debilitation? / D. McDougald, S.A. Rice, D. Weichart, S. Kjelleberg // FEMS Microbioplogy Ecology.- 1998.-Vol. 25.-P. 1-9.

137. McDougald, D. Signal-mediated cross-talk regulates stress adaptation in Vibrio species / D. McDougald, S. Srinivasan, S.A. Rice, S. Kjelleberg // Microbiology. 2003. - Vol. 149. - P. 1923-1933.

138. Medina, G. Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR Transcriptional Regulation of the rhlAB Promoter / G. Medina, K. Juarez, B. Valderrama, G. Soberon-Chavez // Journal of Bacteriology. 2003. - Vol. 185. -N.20. - P. 5976-5983.

139. Mukamolova, G.V. A bacterial cytokine / G.V. Mukamolova, A.S. Kaprelyants, D.I. Young, D.B. Kell // Microbiology. 1998. - Vol. 95. - P. 8916-8892.

140. Mukamolova, G.V. Biochemical changes accompanying the long-term starvation of Micrococcus luteus cells in spent growth medium / G.V.

141. Mukamolova, N.D.Yanopolskaya, T.V. Votyakova, V.I. Popov, A.S. Kaprelyants , D.B. Kell // Arch. Microbiol. 1995. - Vol. 163. - P. 373-379.

142. Mukamolova, G.V. Properties of dormant cells in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus during prolonged incubation / G.V. Mukamolova, S.S. Kormer, N.D. Yanopolskaya, A.S. Kaprelyants // Microbiology. 1995. - Vol. 64. - P. 284-288.

143. Mukherjee, A. Molecular Characterization and Expression of the Erwinia carotovora hrpNEcc Gene, Which Encodes an Elicitor of the Hypersensitive Reaction / A. Mukherjee, Y. Cui, Y.Liu, A.K. Chatterjee // MPMI. 1997. -Vol. 10.-N.4.-P. 462-471.

144. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. -Vol. 15.-P. 473-497.

145. Nachin, L. External pH: An Environmental Signal That Helps to Rationalize pel Gene Duplication in Erwinia chrysanthemi / L. Nachin, F. Barras // MPMI. 2000. - Vol. 13. - N.8. - P. 882-886.

146. Nissan, G. Analysis of Promoters Recognized by HrpL, an Alternative o-Factor Protein from Pantoea agglomerans pv. gypsophilae / G. Nissan, S. Manulis, D.M. Weinthal, G. Sessa, I. Barash // MPMI. 2005. - Vol. 18. -N.7.-P. 634-643.

147. Nizan-Koren, R. The Regulatory Cascade That Activates the Hrp Regulon in Erwinia herbicola pv. gypsophilae / R. Nizan-Koren, S. Manulis, H. Мог, N.M. Iraki, I. Barash // MPMI. 2003. - Vol. 16. - N.3. - P. 249-260.

148. Novitsky, J.A. Morphological characterization of small cells resulting from nutrient starvation of a psychrophilic marine vibrio / J.A. Novitsky, R.Y. Morita // Applied and Environmental Microbiology. 1976. - Vol. 32. - N.4. -P. 617-622.

149. Novitsky, J.A. Survival of a Psychrophilic Marine Vibrio Under Long-Term Nutrient Starvation / J.A. Novitsky, R.Y. Morita // Applied and Environmental Microbiology. 1977. - Vol. 33. - N.3. - P. 635-641.

150. Nunnet, D.N. Cleavage, methylation, and localization of the Pseudomonas aeruginosa export proteins XcpT, -U, -V, and —W / D.N. Nunn, S. Lory//Journal of Bacteriology. 1993. - Vol. 175.-N.14.-P. 4375-4382.

151. Oliver, J.D. The viable but non — culturable state in the human pathogen Vibrio vulnificus / J.D. Oliver // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol. 133. - P. 203-208.

152. Ordax, M. Survival Strategy of Erwinia amylovora against Copper: Induction of the Viable-but-Nonculturable State / M. Ordax, E. Marco-Noales, M.M. Lo'pez, E.G. Biosca // Applied and environmental microbiology. — 2006. Vol. 72. - N.5. - P. 3482-3488.

153. Patankar, A.V. An orphan LuxR homolog of Sinorhizobium meliloti affects stress adaptation and competition for nodulation / A.V. Patankar, J.E. Gonzalez // Applied and Environmental Microbiology. 2009. - Vol. 75. -N.4. - P. 946-955.

154. Peng, Q. Population Behavior Analysis of dspE and pelD Regulation in Erwinia chrysanthemi 3937 / Q. Peng, S. Yang, A.O. Charkowski, M-N. Yap, D.A. Steeber, N.T. Keen, C-H. Yang // MPMI. 2006. - Vol. 19. - N.4. - P. 451-457.

155. Perego, M. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay / M. Perego // Developmental Biology. 1997. - Vol. 94. - N.l6. - P. 8612-8617.

156. Perombelon, M.C.M. Potato diseases caused by soft rot erwinias: an overview of pathogenesis / M.C.M. Perombelon // Plant Pathology. — 2002. -Vol. 51.-N.l.-P. 1-12.

157. Pesci, E.C. Regulation of las and rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa I E.C. Pesci, J.P. Pearson, P.C. Seed, B.H. Iglewski // Journal of Bacteriology. 1997a. - Vol. 179. - N.10. - P. 3127-3132.

158. Pesci, E.C. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing / E.C. Pesci, B.H. Iglewski // Trends in Microbiology. 19976. - Vol. 5. - N.4. -P. 132-135.

159. Pfaffl, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR / M.W. Pfaffl // Nucleic Acids Res. 2001. - Vol. 29. - P. 2001-2007.

160. Pierson, E.A. Interpopulation signalling via 7V-acyl-homoserine lactones among bacteria in the wheat rhizospere / E.A. Pierson, D.W. Wood, J.A. Cannon, F.M. Blachere, L.S. Pierson // MPMI. 1998. - Vol. 11. - N.l 1. - P. 1078-1084.

161. Postgate J.R. The survival of starved bacteria / J.R. Postgate, J.R. Hunter // J. Appl. Bacteriol. 1963. - Vol. 26. - P. 295-306.

162. Rad von, U. Response of Arabidopsis thaliana to 7V-hexanoyl-DL-homoserinelactone, a bacterial quorum sensing molecule produced in the rhizosphere / U. von Rad, I. Klein, P.I. Dobrev, J. Kottova, E. Zazimalova, A.

163. Fekete, A. Hartmann, P. Schmitt-Kopplin, J. Durner // Planta. 2008. - Vol. 229.-P. 73-85.

164. Rahman, I. Methionine uptake and cytopathogenicity of viable but nonculturable Shigella dysenteriae type 1 / I. Rahman, M. Shahamat, P.A. Kirchman et al. // Applied and Environmental Microbiology. — 1994. — Vol. 60. -N.10.-P. 3573-3578.

165. Rahman, I. Potential virulence of viable but nonculturable Shigella dysenteriae type I / I. Rahman, M. Shahamat, M. Chowdhury, R. Col well // Applied and Environmental microbiology. — 1996. — Vol. 62. — N.l. — P. 4621— 4626.

166. Redfield, RJ. Is Quorum sensing a side effect of diffusion sensing? / R.J. Redfield // Trends in Microbiology 2002. - Vol. 10. - N.8. - P. 365-370.

167. Reynolds, E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy / E.S. Reynolds // J. Cell. Biol. 1963. — Vol. 17. — N.l.-P. 208-212.

168. Rosen, R. Two-dimensional reference map of Agrobacterium tumefaciens proteins / R. Rosen, A. Sacher, N. Shechter, D. Becher, K. Biittner, D. Biran, M. Hecker, E.Z. Ron // Proteomics. 2004. - Vol. 4. - N.4. - P. 1061-1073.

169. Roszak, D.B. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems / D.B. Roszak, D.J. Grimes, R.R. Colwell // Can. J. Microbiol. 1984. - Vol. 30. - P. 334 - 338.

170. Rumbaugh, K.P. Convergence of hormones and auto inducers at the host/pathogen interface / K.P. Rumbaugh // Anal Bioanal Chem. — 2007. — Vol. 387.-P. 425-435.

171. Salmond, G.P.C. Secretion of extracellular virulence factors by plant-pathogenic bacteria / G.P.C. Salmond // Annual Review of Phytopathology. -1994.-Vol. 32.-P. 181-200.

172. Sambrook, J. Molecular cloning: a Laboratory Manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press. 1989. - 1659 p.

173. Schuster, M. The Pseudomonas aeruginosa RpoS regulon and its relationship to quorum sensing / M. Schuster, A.C. Hawkins, C.S. Harwood, E.P. Greenberg // Molecular Microbiology. 2004. - Vol. 51. - N.4. - P. 973-985.

174. Shevchik, V.E. Pectate lyase Pell of Erwinia chrysanthemi 3937 belongs to a new family / V.E. Shevchik, J. Robert-Baudouy, N. Hugouvieux-Cotte-Pattat // Journal of Bacteriology. 1997. - Vol. 179. - P. 7321-7330.

175. Sjoblom, S. A Novel Plant Ferredoxin-Like Protein and the Regulator Hor Are Quorum-Sensing Targets in the Plant Pathogen Erwinia carotovora / S. Sjoblom, H. Harjunpaa, G. Brader, E. T. Palva // MPMI. 2008. - Vol. 21. - N.7. - P. 967-978.

176. Sreedharan, A. CorR regulates multiple components of virulence in Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 / A. Sreedharan, A. Penaloza-Vazquez, B.N. Kunkel, C.L. Bender // Mol. Plant-Microbe Interact. 2006. -Vol. 19. - P. 768-779.

177. Stachel, S.E. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens / S.E. Stachel, E. Messens, M. Van Montagu, P. Zambryski // Nature. 1985. - Vol. 318.-P. 624-629.

178. Stromet, M.S. A single bifunctional enzyme, PilD, catalyzes cleavage and 7V-methylation of proteins belonging to the type IV pilin family / M.S. Strom, D.N. Nunn, S. Lory // Biochemistry. 1993. - Vol. 90. - P. 2404-2408.

179. Surette, M.G. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: A new family of genes responsible for autoinducer production / M.G. Surette, M.B. Miller, B.L. Bassler // Microbiology. 1999. - Vol. 96.- P. 1639-1644.

180. Tait, K. Turnover of quorum sensing signal molecules modulates cross-kingdom signaling / K. Tait, H. Williamson, S. Atkinson, P. Williams, M. Camara, I. Joint // Environmental Microbiology. 2009. - Vol. 11.- N.7. - P. 1792-1802.

181. Takayama, K. The role of RNA stability during bacterial stress responses and starvation / K. Takayama, S. Kjelleberg // Environmental Microbiology. — 2000. Vol. 2. - N.4. - P. 355-365.

182. Tandler, B. Improved uranyl acetate staining for electron microscopy / B. Tandler//J. Electron. Microsc. Thechn. 1990. - Vol. 16.-P. 1505 - 1517.

183. Tian, Y. Role of RpoS in stress survival, synthesis of extracellular autoinducer 2, and virulence in Vibrio alginolyticus / Y. Tian, Q. Wang, Q. Liu, Y. Ma, X. Cao, Y. Zhang // Arch Microbiol. 2008. - Vol. 190. - P. 585-594.

184. Toth, I.K. Soft rot erwiniae: from genes to genomes / I.K. Toth, K.S. Bell, M.C. Holeva, P.R.J. Birch // Molecular Plant Pathology. 2003. - Vol. 4. -N.l.-P. 17-30.

185. Uroz, S. Quorum Sensing and Quorum Quenching: The Yin and Yang of Bacterial Communication / S. Uroz, Y. Dessaux, P. Oger // ChemBioChem. — 2009. Vol. 10. - P. 205-216.

186. Wang, C. Succinic semialdehyde couples stress response to quorum-sensing signal decay in Agrobacterium tumefaciens / C. Wang, H-B. Zhang, L-H. Wang, L-H. Zhang // Molecular Microbiology. 2006. - Vol. 62. - N.l. -P. 45-56.

187. Wang, J. RelA-Dependent (p)ppGpp Production Controls Exoenzyme Synthesis in Erwinia carotovora subsp. atroseptica / J. Wang, N. Gardio,^| T. Burr, G.P.C. Salmond, M. Welch // Journal of Bacteriology. 2007. - Vol. 189. - N.21. - P. 7643-7652.

188. Warner, J.M. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of starved and viable but nonculturable Vibrio vulnificus cells / J.M. Warner, J.D. Oliver // Applied and Environmental Microbiology. 1998. — Vol. 64. - N.8. - P. 3025-3028.

189. Watson, S.P. Isolation and characterisation of Staphylococcus aureus starvation induced, stationary phase mutants defective in survival or recovery / S.P. Watson, M. Antonio, S.J. Foster // Microbiolgy. - 1998. - Vol. 144. - P. 3159-3169.

190. Weber, E. Domain Structure of HrpE, the Hrp Pilus Subinit of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria / E. Weber, R. Koebnik // Journal of Bacteriology. 2005. - Vol. 187. - N.17. - P. 6175-6186.

191. Weber, E. Positive Selection of the Hrp Pilin HrpE of the Plant Pathogen Xanthomonas I E. Weber, R. Koebnik // Journal of Bacteriology. — 2006. — Vol. 188.-N.4.-P. 1405-1410.

192. Wei, Z-M Regulation of hrp Genes and Type III Protein Secretion in Erwinia amylovora by HrpX/HrpY, a Novel Two-Component System, and HrpS / Z. Wei, J.F. Kim, S.V. Beer // MPMI. 2000. - Vol. 13. - N.ll. - P. 1251-1262.

193. Wei, Z-M. Expression of Erwinia amylovora hip Genes in Response to Environmental Stimuli / Z-M. Wei, B.J. Sneath, S.V. Beer // Journal of Bacteriology. 1992,-Vol. 174.-N.6.-P. 1875-1882.

194. Wei, Z-M. hrpL Activates Erwinia amylovora hrp Gene Transcription and Is a Member of the ECF Subfamily of s Factors / Z-M. Wei, S.V. Beer // Journal of Bacteriology. 1995.- Vol. 177. - N.21. - P. 6201-6210.

195. Weichart, D. Stress resistance and recovery potential of culturable and viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus / D. Weichart, S. Kyelleberg // Microbiology. 1996. - Vol. 142. -N.4. - P. 845-853.

196. Whitehead, N.A. Quorum-sensing in Gram-negative bacteria / N.A. Whitehead, A.M.L. Barnard, H. Slater, N.J.L. Simpson, G.P.C. Salmond // FEMS Microbiology Reviews. 2001. - Vol. 25. - P. 365-404.

197. Winzer, K. Bacterial cell-to-cell communication: sorry, can't talk now — gone to lunch! / K. Winzer, K.R. Hardie, P. Williams // Current Opinion in Microbiology. 2002. - Vol. 5. -N.2. - P. 216-222.

198. Withers, H.L. Quorum-sensing acts at initiation of chromosomal replication in Escherichia coli / H.L. Withers, K. Nordstrom // Microbiology. — 1998. Vol. 95. - P. 15694-15699.

199. Yang, C-H. hrp genes of Erwinia chrysanthemi 3937 are important virulence factors / C-H. Yang, M. Gavilanes-Ruiz, Y. Okinaka, R. Vedel, I. Berthuy, M. Boccara, J.W-T. Chen, N.T. Perna, N.T. Keen // MPMI. 2002. -Vol. 15.-N.5.-P. 472-480.

200. Yildiz, F.H. Role of RpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae / F.H. Yildiz, G.K. Schoolnik // Journal of Bacteriology. 1998. -Vol. 180. -N.4. - P. 773-784.

201. You, Z. Induction of. entry into the stationary growth phase in Pseudomonas by /V-acylhomoserine lactone / Z. You, J. Fukushima, K. Tanaka,

202. S. Kawamoto, К. Okuda // FEMS Microbiol Lett. 1998. - Vol. 164. - P. 99-106.

203. Zhang, H.B. The quormone degradation system of Agrobacterium tumefaciens is regulated by starvation signal and stress alarmone (p)ppGpp / H.B. Zhang, C. Wang, L.H. Zhang // Molecular Microbiology. 2004. - Vol. 52.-N.5.-P. 1389-1401.

204. Zhang, H-B. Genetic control of quorum-sensing signal turnover in Agrobacterium tumefaciens / H-B. Zhang, L-H. Wang, L-H. Zhang // Microbiology. 2002. - Vol. 99. - N.7. - P. 4638-4643.

205. Zhao, Y. Identification of Erwinia amylovora Genes Induced during Infection of Immature Pear Tissue / Y. Zhao, S.E. Blumer, G.W. Sundin // Journal of Bacteriology. 2005. - Vol. 187. - N.23. - P. 8088-8103.

Информация о работе

Горшков, Владимир Юрьевич
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Межклеточная коммуникация в популяциях Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 при взаимодействии с растением-хозяином и в условиях голодания - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы