Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактериальные паразиты водных экосистем (BDELLOVIBRIO и MICAVIBRIO)
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Бактериальные паразиты водных экосистем (BDELLOVIBRIO и MICAVIBRIO)"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ
АФИНОГЕНОВА Альбина Владимировна
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПАРАЗИТЫ ВОДНЫХ ЯК СИСТЕМ ( ВЦЕШЖВЫО И М1САУ1ВШО )
03. 00.07 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
На правах рукописи
УДК 579. 835. 91
Москва - 1992
Работа выполнена в Институте биохимии и физиологи* микроорганизмов РАН.
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАН, профессор Б.В.Громов доктор биологических наук, профессор Д.Г.Звягинцев доктор биологических наук Д.И.Никитин
Ведущая организация - Институт биофизики СО РАН.
Защита состоится "2 V' 6ЬЛ 1992г. в /Ч час. (¿-Один, на заседании Специализированного Совета Д 002.6-4.01 при Институт микробиологии РАН (Москва, 117811, проспект 60-летия Октября, 7 корп.2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт^ микробиологии РАН.
Автореферат разослан " ¿' У" ри^л^!^1992г.
Ученый секретарь Специализированного Совета,
кандидат биологических наук Л.Е.Никитин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблейы. Bdellovibrio - первый из описанных и о недавнего времени единственный-известный род бактерий,облада-щих способностью паразитировать на других бактериях (Stolp .starr,1963). Уникальной особенностью представителей этого рода вляется двухфазный цикл развития, одна из стадий которого -епродуктивная, осуществляется в периплазме грамотрицательных актерий. Облигатная зависимость от хозяина, своеобразие микро-реды обитания наложили отпечаток на формирование определенного орфотипа паразитических бактерий:бделловибрионы - подвижные ис-ривленные палочки, размеры которых в несколько раз меньше раз-еров клеток инфицируемых бактерий. Бделловибрионы обнаруживают яд специфических особенностей метаболизма и структурной органи-ации.не характерных для большинства сапрофитных прокариот.Вмес-е с тем, разнообразие физиологических и молекулярно-биологичес-ш свойств свидетельствуют о видовой, а возможно и родовой етерогенности периплазматических паразитов. В последние годы начительно расширились представления об ареалах распространения типах межмикробных взаимоотношений в связи с выделением и опи-анием новых родов и видов паразитических бактерий с различными орфофизиологическими свойствами и специфичностью, неодинаковой тепеныо зависимости от бактерий-хозяев.
Двухкомпонэнтные бактериальные системы антагонистического ипа привлекают внимание прежде всего как модели изучения раз-ичшх аспектов взаимоотношений микроорганизмов разных трофичес-их уровней и роли паразитических бактерий в механизмах саморе-уляции природных экосистем. Широкий спектр литического действия делловибрионов определяет области возможной практической реали-ации его биологического потенциала - медицина, сельское хозяйс-во, охрана окружающей среды на базе создания эффективных и эко-огически безопасных . биотехнологий обеззараживания загрязненных од. Известны положительные результаты применения живых культур dellovibrio для лечения ряда заболеваний человека(Plissier,1976) растений (Scherif,1973).#Заметный интерес к проблемам бактери-льного паразитизму,особенно после описания новых родов и видов, тмечен в области развития эволюционных представлений о проис-окдении эукариот путем симбиогенеза бактерий (Margulis a.Guer-ero,1986; Margulis, 1986).
Все сказанное свидетельствует об актуальности всестороннего сследования этой специфической группы бактерий, в том числе на рганизменном, популяционном и экосистемном уровнях.
Состояние вопроса, цель и задачи исследования. К началу наши исследований (1970г.) был известен только один род и вид паразити ческих бактерий - Bdellovibrio bacteriovorus. К 1972Г. оформилос представление о видовой гетерогенности рода, были предложены опи сания двух новых видов B.stolpii и B.starrii, а также критерии ви довой дифференциации, базирующиеся на комбинации признаков дики штаммов и их сапрофитных производных (Seidler et al.,1972). Однак ни схема классификации, предложенная Зайдлером с коллегами, ни е модифицированный вариант,вошедший в Берги-9, не позволяют одиозна чно идентифицировать изоляты паразитических бактерий. Отражение состояния таксономии Bdellovibrio вплоть до сегодняшнего времен является рекомендация воздерживаться от видовых наименовани вновь выделенных штаммов бделловибрионов (Bergey's manual,1984) К числу причин несовершенства предложенных систем видовой клас сификации можно отнести: неполноту знаний об этой группе бактерий неприемлемость большинства классических методов таксономии дл облигатных паразитов, отсутствие оценок таксономической значимост используемых признаков,, экстраполяцию свойств сапрофитных произво дных на родительские дикие штаммы, основанную на представлении о их абсолютной идентичности. В связи с этим использование нетради ционных подходов, в частности, хемотаксономических, для анализ возможных таксономических связей видового уровня являлось весьм актуальным.
Следует отметить что при выделении Bdellovibrio был описан как экзопаразит бактерий (Stolp a.Petzold.1962), и только спустя четыре года двумя независимыми группами исследователей (Scherff et al.,1966; starr a.Baigent,1966) установлен внутриклеточный характер его паразитизма. Это открытие на много лет определило внимание различных лабораторий, в том числе и нашей, к изучению особенностей процесса взаимодействия паразита с хозяином на клеточном уровне.
Немногочисленные исследования динамики взаимодействия в двухкомпонентной системе на популяционном уровне, выполненные к началу 70-х годов, носили преимущественно феноменологический характер. Практически отсутствовала информация, позволяющая прогнозировать развитие смешанных культур и управлять их составом. Взаимодействие бактерий рассматривалось как процесс, приводящий к полному замещению популяции хозяина популяцией паразита, исключающий возможность их длительного сосуществования в периодической культуре. Результатом такого представления было использование для биохимических исследований совокупной клеточной биомассы, что служило причиной неадекватности получаемых данных и их интерпре-
ции. Таким образом, к началу наших исследований потребность в тальном количественном анализе межпопуляционных взаимоотношений двухкомпонентной системе была особенно злободневной.
Работы экологического'направления, получившие развитие уже на нних этапах изучения Bdellovibrio, констатировали широкое расп-странение паразитических бактерий в почве и пресных водоемах. В же время доказательство значимости и рож этой группы бактерий почвенных и водных микро<Йценозах оказалось весьма затруднитель-м в связи с недостаточной разработанностью критериев и методов енки их активности непосредственно in situ. Не способствовала ниманию роли паразитических бактерий в природных экосистемах и абая изученность их физиологических свойств.
В связи с вышесказанным целью данной работы являлось всесто-ннее изучение паразитических бактерий, в том числе закономернос-й и типов клеточных и межпопуляционных взаимодействий,таксономи-ских свойств,особенностей метаболизма и физиологии,распростране-я и специфики проявления жизнедеятельности в водных экосистемах.
Достижение поставленной цели потребовало решения следующих нкретных задач:
- создать коллекцию паразитических бактерий и изучить на базе эй коллекции морфологические, физиологические, геносистематичес-э и хемотаксономические свойства бактериальных паразитов, оце-гь таксономическую значимость признаков и предложить приемле-э подходы их дифференциации;
- изучить с использованием цейтраферной микрокиносъемки, све-вой и электронной микроскопии последовательность и продолжитель-сть стадий жизненных циклов паразитических бактерий, а также рактер морфодинамики взаимодействующих особей;
- оценить значение поверхностных структур клеток паразитов и хозяев на начальных этапах взаимодействия;
- определить основные закономерности межпопуляционных взаи-цействий, а также характер влияния абиогенных факторов и собс-знных параметров двухкомпонентной системы на кинетические харак-ристики популяций;
- разработать надежный метод получения биомассы паразитичес-s бактерий, очищенной от клеток и мембран бактерии-хозяина в пичествах, достаточных для биохимических исследований;
- исследовать роль трофического фактора в реализации Секционного цикла Bdellovibrio и особенности метаболизма /триклеточных паразитов;
- изучить количественные закономерности распространения пара-гических бактерий в водных экосистемах и предложить на основе
их анализа концепцию жизнедеятельности бактериальных паразитов естественной среде обитания, разработать на -основе этой концепщ адекватные экспериментальные модели.
Научная новизна.В результате проведенных исследований впервь
- описан новый род экзопаразитических бактерий - Micavibrio два его вида M.admirandus И M.aeruginosavorus;
- показана приемлемость для анализа связей видового уров! внутри рода Bdellovibrio такого хемотаксономического подход; как определение белкового состава мембран паразитических бактери!
- выявлена модификация спектров литического действ! бделловибрионов в зависимости от хозяина;
- обнаружены различия в белковых спектрах мембран хозяина j и после взаимодействия с Bdellovibrio, указывающие на деградащ структурных компонентов мембран инфицированных клеток в процесс внутриклеточного роста паразита;
- получены свидетельства участия углеводов и белков в первде ном узнавании взаимодействующих клеток;
- показана важная роль структурного (целостность пептиде гликана клетки хозяина) и трофического (физиологическое состоят клетки хозяина) факторов в реализации инфекционного цикла Bdellt vibrio;
- в клетках Bdellovibrio обнаружены неорганические полифо< фаты, а также ферменты, участвующие как в биосинтезе, так и по-реблении полифосфагов разной степени полимерности;
- показано обратимое блокирование терминальных стадий инфе] ционного цикла Bdellovibrio и нарушение агрегатной устойчивое двухкомпонентной системы за счет когезии бделлопластов п] лимитировании концентрацией бактерии-хозяина;
- доказана возможность взаимодействия в двухкомпонентн« бактериальной системе в анаэробных условиях;
- установлен колебательный характер изменения численнос взаимодействующих популяций в системе Bdellovibrio - бактерия-х< зяин, показана прилогамость к анализу взаимодействий такого тш принципа столкновений, частота которых пропорциональна концентр; циям паразита и хозяина;
- на основе анализа закономерностей межпопуляционны: взаимодействий и данных по количественному распространен!! Bdellovibrio в водных экосистемах предложена концепци существования и жизнедеятельности паразитов в иммобилизован ном состоянии: разработаны методические подходы коиммоби лизации паразита и хозяина в матриксе и на по
рхности различных носителей, доказана реализуемость в этих ловиях процессса взаимодействия.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.Среди облигатных паразитов,выделенных из водных источников, наружены бактерии,принципиально различающиеся по типу взаимоде-твия с клетками бактерий-хозяев. Наряду с внутриклеточными па-зитами рода Вйе11оу1Ьг1о описаны морфологически сходные с ними оляты, которые по способу роста и размножения классифицированы к экзопаразиты и отнесены к роду Ы1сау1Ьг1о и двум видам М.ай-гапапз и м.аегиеиювауогив. ЭпиСионтный рост, бинарное деление, носпецифичность при выделении, особенности ультраструктурной ганизацки, некоторые физиологические свойства и нуклеотидный став ДНК определяют характерный перечень признаков, отличающих зопаразитов от Вйе11оу1Ъг1о. Вместе с тем анализ процесса аимодействия экзо- и эндопаразитов с хозяином .на клеточном популяционном уровнях выявляет ряд общих закономерностей: уча-ие углеводных рецепторов в специфическом связывании клеток, обратимость изме1 яй и гибель клеток хозяина на ранних этапах аимодействия. К числу ферментов, обеспечивающих деградацию клеи хозяина, отноцится сериновая протеиназа М1сау1Ьг:ю (Мг390ОО), ладающая ли'тическими свойствами. Для М1сауз.Ъг1о и Вйе11оУ1.Ъг1о рактерны некоторые специфические черты углеводного (отсутствие рментов окислительной части пентозофосфатного цикла, низкие тивности ферментов гликолиза) и липидного (копирование жирноки-отного состава мембран хозяина) метаболизма.
2. Система видовой дифференциации Вс1е11оу1Ъг1о, базирующаяся комбинации признаков паразитических бактерий и их сапрофитных
оизводных, ограничена и требует как применения нетрадиционных дходов, так и изменения принципов построения самой системы, уппирование штаммов на основе нумерического анализа белковых зктров обнаруживает ряд корреляций с другими признаками и, пре-э всего, с нуклеотидным составом ДНК. Особенности белкового со-ава внешних мембран паразитических бактерий могут быть исполь-ваны для анализа возможных связей видового уровня внутри рода э11оу1Ьгл.о.
3. Реализация инфекционного цикла Вс1е11оу1Ьг1о детерминиро-яа рядом факторов, специфичных для каждой стадии инфекционного кла. В механизме первичного узнавания взаимодействующих клеток аствуют углеводные рецепторы клеточной стенки хозяина, носите-л белкового компонента (лектина) является паразит. Вовлечение образование специфической связи с белками наиболее типичных
компонентов внешнего слоя липополисахаридов (глюкозы, маннозы, галактозы, рамнозы) объясняет природу широкой специфичност! Bdellovibrio в отношении грамотрицательных бактерий. В то же время индивидуальность спектров ингибирующих Сахаров для разных дву-хкомпонентных систем указывает на избирательную и неодинакову! углеводсвязывающую активность бежовых компонентов паразита, что подтверждается варьированием в пределах нескольких порядкоз показателя инфекционной активности Bdellovibrio в отношении чувствительных бактерий. Необходимым условием внедрения паразит; в атакованную клетку является интактность пептидогликановогс слоя хозяина. Внедрившийся внутрь клетки хозяина паразит боле( резистентен к физико-химическим факторам, чем бделловибрион в< внеклеточной стадии. Реализация инфекционного цикла Bdellovibrit в полном объеме зависит от концентрации клеток бактерии-хозяина i среде инкубации. При концентрации бактерии-хозяина ниже I07 кл/м. происходит обратимое блокирование терминальных стадий внутриклеточного развития Bdellovibrio.
4. Зависимость Bdellovibrio от хозяина в значительно! степени определяется трофическим фактором - прирост популяцш паразита максимален при взаимодействии с клетками хозяина, находящимися в состоянии усиленной метаболической активност] (лаг-фаза). Клетки хозяина, подвергнутые длительному голоданию, но не утратившие своей жизнеспособности, не поддерживают размножения бделловибрионов. Bdellovibrio располагает достаточно полным набором ферментов .цикла трикарбоновых кислот, вместе с тем активности ферментов гликолиза незначительны, а окислительная часть пентозофосфатного цикла редуцирована. О важной физиологической роли в жизнедеятельности Bdellovibrio свидетельствуют обнаружение в их клетках значительных количеств полифосфатов, а также ферментов, участвующих в их биосинтезе и потреблении.
5. Изменение численности взаимодействующих популяций ] системе Bdellovibrio-бактерия-хозяин осуществляется в режим! устойчивых во времени периодических колебаний, определяемых частотой эффективных столкновений, пропорциональной концентрация] паразита и хозяина. Образование и продолжительное существовашп бделлопластов - важнейшая особенность взаимодействия внутриклеточного паразита с хозяином, определяющая специфику динамию популяций. С учетом этого фактора в развитии типичного процесс! взаимодействия выделены три периода - латентный, равновесия ] преимущественного лизиса, ростовые параметры которых позволяю1 адекватно характеризовать и прогнозировать состояние двухкомго-нентной системы в зависимости от биотических и абиотических фак-6
эров. Сопряженность' процессов лизиса клеток хозяина и эзмножения паразита в период преимущественного лизиса нарушается ри когезии бделлопластов. Потенциальная предрасположенность целлопластов к когезии обусловлена повышенной, по сравнению с нтактными клетками, гидрофобностью клеточных стенок. Агрегатную стойчивость двухкомпонентной системы повышают одно- и вухвалентные катионы, высокомолекулярные полиэлектролиты.
6. Паразитические бактерии в количестве от единичных клеток о I03 кл/мл постоянно обнаруживаются в пресных и морских одоемах, сточных водах. Их доля в общем пуле микроорганизмов не ревышает 0,002-0,004%. Максимальные концентрации бактериальных аразитов, как правило, выявляются в местах наибольшей антропо-енной нагрузки и коррелируют с численностью E.coli. Однако ис-одя из анализа закономерностей меклопуляционных взаимодействий и изиологических свойств Bdellovibrio, интерпретация такой корре-яции как причинно-следственной обусловленности не имеет доста-очных оснований. Наиболее адекватной моделью жизнедеятельности dellovibrio в водных экосистемах являются иммобилизованные двух-омпонентные ( в общем виде многокомпонентные) системы.
На нескольких модельных системах показана реализация взаи-одействия паразита с хозяином в матриксе, и на поверхности но-ителей, возможность регуляции этого процесса и пролонгированное охранение популяциями жизнеспособности. Уровень свободной мигра-ии в жидкую фазу определяется интенсивностью размножения бдел-овибрионов в иммобилизованном состоянии. Условия анаэробиоза нгибируют (увеличение продолжительности латентного периода и ериода равновесия, уменьшение доли лизированных клеток в популя-ии хозяина),но не предотвращают процесс взаимодействия в дву-компонентной системе. Таким образом, приведенные данные позволят считать, что границы раздела фаз, в том числе донные осадки, ктивный ил в водных экосистемах служат не просто ' аккумулятора-и, а являются местообитанием паразитических бактерий, где осу-ествляются процессы их жизнедеятельности.
Научно-практическое значение. Научные положения, содержащи-ся в работе, создают основу для оценки соотношения потенциальных озможностей паразитических бактерий и границ их фактического спользования в практических целях. Метод сравнительной оценки ффективности взаимодействия бделловибрионов на основе показателя нфекционной активности позволяет проводить направленный отбор таммов с заданной специфичностью к грамотрицательным бактериям, езультаты модельных экспериментов по искусственной интродукции в
7
сточные воды свидетельствуют о возможности и перспективности использования Bdellovibrio в биоочистных сооружениях. Выделенный нами экзопаразит M.aeruginosavorus, специфичный к большинству исследованных штаммов P.aeruginosa, может представлять интерес для решения медико-биологических проблем синегнойной инфекции.Выводы, экспериментальные данные и методические разработки диссертации использованы в цикле лекций, прочитанных автором на биологическом факультете Нижегородского государственного университета.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на съездах Всесоюзного микробиологического общества (Минск,1971; Ереван,1975; Алма-Ата,1985), на Всесоюзных конференциях по дезинтеграции микроорганизмов (Пущиной972), управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск,1973), "Биология и научно-технический прогресс" (Пущино,1974), "Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды "(Пущи-но,1975;1979), "Биосинтез и метаболизм липидов у микроорганизмов" (Москва,1979), "Биосинтез ферментов микроорганизмами "(Кобу-лети,1986), "Биотехнология и биофизика популяций"(Алма-Ата, 1991), на Международном конгрессе микробиологических обществ (Токио, 1974), Международном гидромикробиологическом симпозиуме (Смолени-це,1980), Международной конференции по коллекциям культур ( Брно, 1981), Международном симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" (Пущино,1983), Международном симпозиуме "Бактерии и хозяин" (Прага,1985), Международном симпозиуме по экологии микроорганизмов (Киото,1989).
Публикации.По материалам диссертации опубликовано 57 работ.
Структура и объел работы. Диссертация изложена на 489 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (6 глав).заключения, выводов.и списка литературы. Диссертация включает 53 таблицы и 67 рисунков. Список литературы содержит 474 источника, в том числе 345 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность коллегам, принимавшим непосредственное участие в выполнении различных этапов этой работы: к.б.н.С.М.Коноваловой, А.П.Шороховой; Л.В. Андрееву, к.б.н. А.И.Северину, к.б.н. Н.Ю.Маркеловой, к.б.н. Н.А. Чувильской, Н.А.Чемерис, к.б.н.С.Ромай Пенабад, Е.Н.Ратнеру, к.б. н.А.Н. Шкидченко, Л.А. Ледовой, Л.Г. Чуркиной, к.б.н.Н.Е.Сузиной,
с.б.н.В.А.Самойленко.а также к.б.н.Л.П.Личко, к.б.н.В.М.Грищенко, б.н.Л.М.Барышниковой, к.б.н.Р.Х.Беляевой и Н.В.Ерошиной за цен-ше советы и методическую помощь. Светлая память и чувство не-[зменной благодарности осталось от сотрудничества с к.б.н. М.А. Зобыком и Н.В.Печниковым.
Особую благодарность автор приносит к.б.н. В.А.Ламбиной -:воему руководителю с 1970 по 1985гг., за постоянную поддержку гроводимых исследований.
Автор считает своим долгом с большой благодарностью вспом-шть академика Г.К.Скрябина, по инициативе и при постоянном влиянии которого в Институте проводились исследования по бактерийному паразитизму.
Автор искренне признателен члену-корреспонденту РАН И.С. ¿улаеву и профессору Б.А.Фихте за полезные советы и плодотворное »Осуждение результатов исследований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава I. Обзор литературы
Рассматриваются вопросы физиологии, метаболизма, таксономии и 'кологии Вс1е11оуз.Ьг:_о, особенности инфекционного цикла внутрикле-'очных паразитов и межпопуляционных взаимоотношений в двухкомпоне-:тной системе, представлены сведения о морфологии и биологичес-:их свойствах паразитических бактерий, отличных от Вйе11оу1Ьгл.о :о характеру взаимодействия с бактериями-хозяевами.
Глава и. Объекты и метода исследования
Приводятся подробные методики выделения,культивирования,хра-ения и изучения свойств паразитических бактерий, отделения па-азитов от клеток и мембран бактерий-хозяев с целью получения би-массы в количествах, достаточных для проведения биохимических сследований, методики, использованные при проведении полевых ис-ледований, приемы и особенности техники иммобилизации Вйе11оу1-рхо на различных носителях.
Глава ш. Изучение таксономических свойств вае11оу1Ьг1о
Сформированная нами коллекция паразитических бактерий включа-а 18 штаммов, выделенных из водных источников, и а штаммов в<1е1-оу1Ьг±о, включая в.з"Ьо1рз.1 1Ш2 и В^аггН АЗ.12, полученных от арубежных коллег.Коллекцию поддерживали путем пересевов не реже дного раза в 3 месяца на свежую питательную среду или воду с озяином. Проведено исследование выживаемости паразитических
бактерий при лиофилизации и хранении в лиофилизированном состоя нии. Как показали результаты проверки, высушивание в замороженно состоянии смешанных культур со снятым молоком в качестве протек тора на 2- 3 порядка снижает число жизнеспособных клеток парази тов. При хранении лиофилизированных культур в течение 3 лет числ жизнеспособных клеток уменьшалось еще на 1-3 порядка. Экспери ментально показано, что для большинства штаммов гарантированны срок сохранения жизнеспособности - 5 лет, после чего культур: требуют повторной лиофилизации.
Выделенные штаммы, за исключением трех (глава VII), характе ризовались типичным для рода Бйе11оу1Ьг1о инфекционным цикла развития со следующей последовательностью стадий: прикрепление клеточной стенке бактерии-хозяина, внедрение в периплазму, рост : развитие внутри инфицированной клетки, деление и выход дочерни бделловибрионов, сопровождающийся лизисом клетки хозяина. Иссле^ дованные штаммы довольно однообразны по морфологии и представлены искривленными палочками с одним полярным очехленным жгутиком Исключение составляли: в.в1;о1р:и Ш12.клетки которого имели Б-оО-разную форму с шириной, увеличивающейся к апикальному полюсу, и Вйе11оу1Ьг1о 6-5-3, в культуре которого значительная часть популяции была представлена спиралевидными клетками.
Анализ спектров литического действия, в отношении достаточно репрезентативной выборки тест-бактерий (55 штаммов) не выявил ни идентичных по специфичности бделловибрионов, ни таксономической близости чувствительных бактерий. Более того, оказалось, что специфичность паразитов в значительной степёни определяется родовой принадлежностью инфицируемого хозяина и модифицируется при его замене (табл.1). Кроме того, специфичность вае11о7з.Ъг1о варьировала в отношении разных штаммов одного и того же вида бактерий. Последнее обстоятельство значительно ограничивает возможности применения признака в качестве диагностического (это потребовало бы унификации тест-бактерий, используемых разными исследователями), а сама вариабельность признака не свидетельствует в пользу его таксономической значимости.
С помощью модифицированного наш в применении к паразитическим бактериям теста определена чувствительность к вибриоста-тическому птеридину 0/129. Все штаммы, включая в^аггИ АЗ-12, ранее описанный как птеридин-резистентный вид, оказались чувствительными к птеридину, хотя степень чувствительности варьировала довольно существенно.
По нуклеотидному составу ДНК исследованные штаммы обнаруживали значительную гетерогенность(табл.2).Более низким,чем у друг-10
Таблица 1. Зависимость спектра литического действия Вйе11оу±Ьг1о АРЛ-12 от родовой принадлежности бактерии-хозяина (фрагмент)
Тест-бактерии
Бактерия-хозяин
A.faeoalis E.ooli K-12 ИБФМ B-78 P.fluoresoens
E.coli К-12 ИБ<Ш В-78 + + +
E.ooli В ИБФМ В-102 - + +
Aeromonas sp. - - +
P.fluoresoens + + +
P.aurantiaoa - * + -
P.diminuta - + +
P.1ragi - + +
A.faeoalis + + +
A.paradoxus + - +
?аблица 2. Нуклеотидный состав ДНК Bdellovibrio
Зтаммы
Литературшше данные
Собственные исследования
' Содержа- Метод Содержа- Метод ние ГЦ, ние ГЦ,
Источник
УРЛ-1 1РЛ-2 И>Л-3 1РЛ-4 1РЛ-5 1РЛ-6 1РЛ-7 1РЛ-8 1РЛ-9 1РЛ-10 1РЛ-Н 1РЛ-12 ¡-608 ¡-610 00
:09D
:09j '-35 i-5-S i.starrii
l 3.12
i.stolpii
IKi2
IKi1
49.0
49.4+0.7
48.2+0.9
51.2+0.5
50.4+0.7
49.4+0.7
53.4+0.3
51.7+0.3
48.1+0.6
51.4+0.7
49.1+0.9
53.4+0.4
53.8+0.3
49.5
50.2
50.8+1
50.9"
50.4+0.5
47.8+0.2
50.7"
43.2+0.1
41.5 27.8
0
1
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 I
1
2
1
2 2
1
2
I I;2
50.4 50.7
49.5 50.5 51.5 50.0
Bogdarina,Lamb ina,1976 Seidler et al., 1969
49.0 не указано 42.7 3
43.5 41.8
Rittenberg, 1972
Gloor et al., 1974 . Seidler et al.,.1969
Seidler et al.,1972
: - метод аналитического ультрацентрифугирования в градиенте плот-юсти хлористого цезия; 2 - метод хроматографии на бумаге; 3 -ютод тепловой денатурации.
их штампов паразита,отличалось содержание ГЦ в ДНК B.stolpii UKi2 (41.5 U%). Что касается остальных штаммов, включая B.starrii A3.12, то вариации в нуклеотидном составе ДНК составляли порядка 6 Ш, что, учитывая известные правила, оценивающие полезность и границы применения методов определения нуклеотидного состава (De Ъеу,1970), может рассматриваться как показатель видовой гетерогенности группы. Обращает внимание существенное различие в нуклеотидном составе ДНК B.stolpii UKi2 и производного от него сапрофита Bdellovibrio UK11 (27.8 М%), что явно указывает на отсутствие между ними генетического родства.
Для исследованных штаммов паразитических бактерий было показано существование зависимости жирнокислотных спектров их мембран от состава липидов инфицируемых бактерий. Это отражалось как в качественном копировании бделловибрионами особенностей жирнокис-лотного состава хозяина, так и в воспроизведении количественных закономерностей между отдельными компонентами его жирнокислотного пула. Так, содержание оксимиристиновой кислоты, характерной для энтеробактерий и практически отсутствующей у псевдомонад, было в 3-40 раз выше у бделловибрионов, выращенных на E.ooli, чем у штаммов, хозяевами которых был P.fluorescens. Характерный для псевдомонад тип корреляции между содержанием мононенасыщешш (1б:1о>7,18:1«7) и циклопропановых кислот (717:0, v 19:0), наблюдается и у бделловибрионов, выращенных в их клетках,и не выявляется у паразитов, выращенных на E.ooli. Таким образом, группирование штаммов Bdellovibrio на основе анализа их жирнокислотных спектров по сути отражает дифференциацию бактерий, в клетках которых происходит их развитие.
wo
/ г J« з 11 i пои пин nun
Рис 1.Дендрограмма сходства Bdellovibrio по белковому составу мембран. 1- UKi2, 2- 109J, 3-APJI-3, 4- АРЛ-2, 5- АРЛ-8, 6-АРЛ-7, 7- АРЛ-4, 8- АРЛ-Ю, 9-В-610, 10- A3.12,11- АРЛ-6, 12-109D, 13- АРЛ-9, 14- АРЛ-11,15-В-608, 16- 6-5-S, 17- Т-35.
!
5 ео
<3 I
«5-
U
т
У
Определение белкового состава мембран бделловибрионов с последующей обработкой результатов методом нумерического анализа ( рис.1 ) выявило ряд корреляций с другими признаками и, прежде всего, с нуклеотидным составом ДНК.Вид в.Бго1р11 имеет наиболее низкий коэффициент сходства( 52% ) с другими штаммами. Большинс-
гво штаммов составляют грушу с небольшими вариациями в нуклео-гидном составе ДНК - 3,5 Ш. Четыре штамма с низкими коэффициентами сходства как между собой (50-60% ), так и с большинством птаммов ( 50-51% ), обнаруживают отличия и по другим признакам: содержанию ГЦ в ДНК, чувствительности к птеридину (Вйе11от1Ъг1о 1РЛ-11 и В-608) и морфологии (Вйе11оу1Ьг1о 6-5-3). Таким обра-эбразом, определение белкового состава мембран представляется зесьма перспективным подходом для анализа возможных связей видового уровня внутри рода Вйе11оу1Ъг1о.
Глава IV. Морфофизиологические особенности инфекционного цикла Вс1е11с^1Ьг1о
Кинетика прикрепления вае11оу:.Ьг1о к бактериям при избытке юследних в системе (множественность инфекции 0.1) описывается сривой, имеющей максимум насыщения 73% от исходной популяции [рис.2А). По способности связываться с клеточной стенкой хозяина гопуляция паразита проявляет гетерогенность: около 30% клеток фактически мгновенно прикрепляются к поверхности хозяина. Про-{олжительность этой стадии инфекционного цикла - 20-30 мин. Вне-фение прикрепившихся паразитов завершается к 1 часу взаимодейс-?вия <рис.2Б). Из сопоставления представленных на рис.2 данных ¡ледует, что только 10% внесенной в систему популяции ваеИо-г1Ьг1о осуществляет инфицирование атакованных клеток.
■ нА
1га6
О 5 10 15 20 Время, ига
ID5
0 12 Врет, чао
Рис.2 Кинетика прикрепления (А) и внедрения (Б) Bdellovibrio в-610 при взаимодействии с клетками E.coli к-12. Множественность инфекции 0,1.
При изучении роли поверхностных структур клеток в процессе юрвичного узнавания было показано,что введение в систему саха-юв в концентрации 0.001-0.01 М ингибировало прикрепление Вйе1-.оуГЬг1.о к клеткам бактерий-хозяев. Спектра Сахаров были яецифичны для каждой системы, что указывало на вовлечение в роцесс узнавания углеводных рецепторов. Для системы В1е11оу1Ьг1о 1-610 - Е.саго-Ьоуога этими сахарами были манноза, глюкоза, ара-¡иноза, лактоза, сахароза и рамноза. Спектр Сахаров, ингиби-
рующих процесс прикрепления в.ЬаЫег1оуогиз Ю9Т> к клеткам Е.оо11 В, был уже и включал маннозу, глюкозу, галактозу. После удаления Сахаров из суспензий путем диализа взаимодействие возобновлялось и проходило все обычные стадии. Блокирующий эффект глюкозо-'И маннозоспецифичного лектина - конканавалина А, проявлялся только при обработке клеток хозяина, но не паразита. Модификация полисахаридов внешней мембраны хозяина путем кратковременной обработки периодатом натрия вызывала существенное замедление процесса взаимодействия в двухкомпонентной системе. Полученные результаты позволяют считать, что углеводы, определяющие специфичность первого этапа взаимодействия, локализованы б клеточной стенке бактерии-хозяина, тогда как носителем комплиментарного белка (лектина) является паразит. Это заключение подтверждено последующими исследованиями Н.А.Чемерис и Н.П.Королева, которым удалось выявить присутствие в клеточной стенке паразита полипептидов (40000 и 41000 Да) с лектиновой активностью.
Метод цейтраферной микрокиносъемки с последующей дешифровкой данных на основе ) покадрового анализа позволил показать, что образование бделлопласта является двухступенчатым процессом (рис.3). Морфологически это выражается в "набухании" клетки, происходящем после латентного периода продолжительностью 3.5-10.5 мин., и образовании собственно сферического тела. Внедрение Вйе1-1оу1Ьг1о начинается в морфологически измененную "набухшую" клетку и заканчивается, одновременно с образованием бделлопласта. Объем бделлопласта в 2-3 раза превышает объем неинфицирован-ной палочковидной клетки хозяина.
5 10 15 го
Время, мин.
Рис.3.Динамика изменения объема клеток Р.ПиогезоепБ (а-в) в процессе взаимодействия с Вйе11оу1Ьгз.о В-609. 1-латентный период, и-период "набухания", ш-образование сферического тела. Стрелки показывают начало и конец проникновения паразита внутрь клетки хозяина.
При изучении взаимодействия с клетками бактерий-хозяев, обработанными пенициллином и лизоцимом было показано уменьшение коэффициента размножения (отношение урожая к исходной
Таблица 3. Коэффициент размножения Вйе11оУ1Ьгю при взаимодействии с клетками бактерий, обработанных пенициллином и лизоцимом.
Двухкомпонентная система Фактор, концентрация Сфэро-пласты, Коэффициент размножения Вйе11оУ1Ьгю ¡Кратность со-!отношения ко-!зффициентов
V /о опыт ! контроль ■ * I * ! размножения 1 опыт/контроль
Вс1е11оУ1Ьгю В-610 - Е. соП К-12 Лизоцим, 20 мкг/мл 90 0,1 10,6 0,01
В. ЬасЛеПоуогиз 109J - Е. соП К-12 Лизоцим, 20 ыкг/мл 90 0,3 6,6 0,04
В. ЬасйеПоуогиз 109] - Е. со11 к-12 Пенициллин, 500 ед/мл 50 8,9 269,0 0,03
В. ЬасЛеПоуогиз 109] - Е. соП К-12 Пенициллин, 100 ед/мл 30 '11,5 269,0 0,04
В. Ьасйепоуогиз 109] - Е. сои К-12 Бэницшшш, 50 ед/ш . 7 49,0 65,0 0,75
в: Ьас^епоуогиз 109] - Е.С011 К-12 Пенициллин, 1 ед/мл 0 28,1 38,6 0,68
В. bacteгiovoruз 109] - Е.соИ К-12 Пенициллин, 0,1 ед/мл 0 46,6 38,6 1,21
В. Ьас^епоуогиз 109] - Е.С011 К-12 Пенициллин, 0,01 ед/мл 0 37,5 - 38,6 0,97
В. Ьаслегюуогиз 109] - Е. соН К-12 Пенициллин, 0,001 ед/мл 0 43,2 28,6 1,12
концентрации) бделловиорионов,причем в экспериментах с антибиотиком ингибирующий эффект прогрессировал по мере увеличения его дозы (табл.3). Методами микрокиносъемки удалось установить, что структурная целостность пептидогликана хозяина является функционально значимым фактором реализации инфекционного цикла паразита: процесс взаимодействия блокировался на стадии внедрения и восстанавливался при реверсии сферопластов к исходному морфотипу.
В процессе внутриклеточного роста, при котором увеличение
§сЗ е<
К га
Я И
£ в
tsj Н
0 (D
1 g
Рис.4. Кинетика роста Bdellovibrio В-610 В периплазме E.ooli к-12.
Время, чао
размеров клетки после латентного периода продолжительностью 0,51,5 часа происходит линейно (рис.4), Bdellovibrio вызывает деградацию не только цитоплазматического содержимого хозяина, но и структурных компонентов его мембран. На электрофореграм-мах мембранных фракций е.coli к-12 выявлено исчезновение высокомолекулярных (85000, 87000 и 89000 Да) и увеличение количества низкомолекулярных (16000 и 18000 Да) компонентов,что может расцениваться как результат действия протеиназ паразита. В среднем время роста и развития Bdellovibrio В-610 в периплазме Е. coli К-12 составляло 4 часа. При увеличении бделловибриона в длину в 3,6 раза, выход из одной инфицированной клетки - 6-8 особей.
Глава V. Особенности метаболизма ваеИоу1Ьг1о.
Одна из наиболее серьезных проблем.возникающих при изучении метаболизма облигатных паразитов,связана с гарантией чистоты используемой биомассы клеток. Известные методы разделения клеток были предназначены преимущественно для концентрирования Bdelloviъ-г1о из природных образцов и не позволяли получать достаточные для проведения биохимических исследований количества биомассы паразита. Разработанный нами метод включал серию последовательных циклов низкоскоростного и высокоскоростного центрифугирования, а также центрифугирование в градиенте плотности фикола. Полученная таким образом биомасса Bdellovibгio была в значительной степени очищена не только от клеток бактерии-хозяина (I клетка хозяина на 106-107клеток паразита), но и от мембран, образующихся в результате их лизиса. Разработанный метод использовался на всех этапах работы - при определении нуклеотидного состава ДНК, бежового и 16
яипидного состава мембран (глава III), изучении особенностей метаболизма внутриклеточных паразитов.
В бесклеточных экстрактах B.bacteriovorus 109с были определены активности ферментов,осуществляющих превращения углеводов по гликолитическому и пентозофосфатному путям,а также цикла грикарбоновых кислот.У паразита отмечен низкий,но достоверно выявляемый уровень активности начального фермента гликолиза №Ф-зависимой гексокиназы - 4,5 нмол/мин/мг белка.Активности двух других ферментов - альдолазы и 3-фосфоглицеральдегиддегидрогена-зы, были того же порядка. У бделловибрионов не обнаружены ключевые ферменты другого пути катаболизма гексоз - пентозофосфатного цикла: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа. Полученные результаты согласуются с данными, приводимыми в отношении других штаммов Bdellovibrio (Simpson a. Robinson,1968;ГершаН0ВИЧ С соавт.,1974; Hespell,1976), и позволяют заключить, что углеводы, ю-видимому, не играют значительной роли в метаболизме внутриклеточных паразитов, что представляется вполне логичным в звязи с низким внутриклеточным фондом углеводов в клетках бактерий (Koch,1964). Несмотря на отмеченные особенности в углеводном эбмене, Bdellovibrio располагает большей частью ферментов цикла грикарбоновых кислот - цитратсинтазой, аконитазой, фумаразой, изоцитрат-,а-кетоглутарат- и малатдегидрогеназами.
Уникальность бактерий рода Bdellovibrio заключается в том, что их метаболический потенциал реализуется, в специфической шкросреде обитания - клетках других бактерий, за счет деградации клеточных компонентов.Вместе с тем остаются мало понятными вопросы 20 источниках энергии бделловибрионов во внеклеточной стадии, когда паразит обладает высокой подвижностью и осуществляет процессы обновления пептидогликана клеточной стенки, новообразования кгутика. Учитывая роль неорганических полифосфатов в биоэнергетике микроорганизмов как резервов активированного фосфата (Кула-зв, 1975), а также данные о выявлении электронномикроскопическими методами в клетках Bdellovibrio включений, идентифицированных как [голифосфатные гранулы (Ламбина с соавт.,1973), нами было исследовано содержание различных фракций полифосфатов, равно как и ферментов полифосфатного обмена в бесклеточных экстрактах Bdellovibrio В-610 (Табл.4).
Общее содержание неорганических полифосфатов у паразита в 2,6 раза превосходило количество АТФ,тогда как у бактерии-хозяина эти количества были соизмеримы - 1630 и 1800 мкг Pi/r сухого веса. Зодержание наиболее полимерной фракции - кислотонерастворимой, составляло 55% от общего пула неорганических полифосфагов. Остальное
17
количество полифосфатов распределялось примерно поровну между солерастворимой (23%) и кислоторастворимой (20%) фракциями,тогде как уровень ортофосфата был экстремально низким (1,6%). рз сравнению с E.ooli (12%).
Таблица д. Активности ферментов фосфорного обмена в бесклеточных экстрактах fidellovibrio В-610 и E.ooli К-12.
нмол/мин/мг белка
Ферментные активности _
. паразит хозяин
Полифосфатаза 30,0 - 4,0 10,0 + 1,3
Полифосфатглюкокиназа следы 0
1,3-дифосфоглицерат: поли- ' л.
фосфатфосфотрансфераза 2,8 1 0,1 0,02 Т 0,001
Триполифосфатаза 119,0 - 9,3 29,0 ± 3,1
Пирофосфатаза 91,0 ± 8,7 235,0 + 16,6
Щелочная фосфатаза 20,2 - 2,6 25,6 + 2,8
Кислая фосфатаза 5,1 ± 0,7 5,2 + 0,7
У бделловибрионов обнаружены различные группы фосфогидро-лаз, расщепляющие конденсированные неорганические полифосфать разной степени полимерности: полифосфатаза, триполифосфатаза и пирофосфатаза (табл.4), участвующие по-видимому в обеспечении клетки как эндогенным, так и экзогенным (полифосфаты периплазмы хозяина) фосфором. Выявление двух ферментных активностей - поли-фосфатглюкокиназы, катализирующей фосфорилирование глюкозы за счет деградации полифосфатов,и полифосфатсинтезирующей 1,3-ди-фосфоглицерат:полифосфатфосфотрансферазы, свидетельствует о связи полифосфатного обмена с другими метаболическими процессами, в частности, с гликолизом. Таким образом, приведенные данные дают основание считать, что полифосфаты, в силу своей полифункциональности, играют важную роль в жизнедеятельности Вйе11о71Ьг1о.
Глава VI.Межпопуляционные взаимоотношения в двухкоыпонентной бактериальной систеие паразит-хозяин.
В развитии типичного процесса взаимодействия на популяцион-ном уровне выделены три периода: 1)латентный, 2)равновесия, когда лизис уравновешивается приростом непораженных клеток хозяина, и 3Неимущественного лизиса, каждый из которых может быть адекватна охарактеризован следующими параметрами: средними удельными скоростями роста и концентрациями паразита и хозяина, а также экономическим коэффициентом паразита (табл.5).
Изучение характера изменения численности Вйе11оу1Ьг1о и
Таблица 5. Характеристики роста в системе паразит-хозяин.
Интервалы Среднее ко- Среднее ко- Среднее Соотноше- Средняя Средняя Средняя
времени, личество личество количе- ние пара- удельная удельная удельная
час. Е. coli Е. coli в ство зит/хозя- скорость скорость скорость Экономический
(контроль) системе па- Bdello- ин роста роста роста коэффициент
кд/мл X 10 разит-хозя- vibrio, Е. coli Е. coli в Bdello-
ин, кл/мл X кл/мл X (контроль) системе vibrio
х 10 7 х 107 паразит-
хозяин
О - 3,0 9,3 5,1 7 1 < i *■ 1,4 0,51 0,10 0,07 0,13
3 - 7,0 42,8 5,4 26,0 4,8 0,25 -0,04 0,44 0,79
7 - 12,5 54,5 2,3 97,0 42,2 0,00 -0,62 0,40 26,00
бактерии-хозяина на протяжении 24 суток показало значительную устойчивость двухкомпонентной системы во времени, в основе которой лежит сосуществование взаимодействующих популяций в режиме периодических колебаний (рис.5). Период колебаний популяции E.ooli увеличивался в 4 раза к концу времени инкубации, размах амплитуды колебаний в течение первых трех суток уменьшался в 2,4 раза и ' далее оставался практически постоянным; изменения численности Bdellovibrio по периоду и амплитуде колебаний имели более сложный, нерегулярный характер. Экспериментальная проверка не подтвердила появления в системе резистентных к паразиту клеток хозяев, что могло бы быть одной из причин продолжительного сосуществования популяций.
Рис.5. Колебания численности Bdellovibrio В-610 И E.ooli К-12 в процессе взаимодействия .I-паразит,2-хозяин (опыт), 3-хозяин (контроль).
Расчет частоты эффективных столкновений . Bdellovibrio .и бактерии-хозяина, пропорциональной произведению их численности, показал качественное совпадение с динамикой числа инфицированных клеток, определенных экспериментально (рис.6,4). Выявленная закономерность указывает на приложимость принципа столкновений Воль-терра к исследуемому типу взаимодействия,исходя из которого колебания численности популяций могут быть объяснены следующим образом. Уменьшение числа клеток хозяина в системе снижает вероятность встреч взаимодействующих особей, что приводит к отмиранию клеток паразита и дает возможность клеткам хозяина раз-
Рис. 6. Характер изменений взаимодействующих популяций в двухкомпонентной бактериальной системе Bdellovibrio В-610 - E.ooli К-12. I - Bdellovibrio , 2 - Е. coli, 3 - бделлопласты (О -расчетные данные, « -данные эксперимента), 4 - расчетная кривая частоты столкновений паразита и хозяина, где с и с - концен-трацш! паразита и хозяина, к = I01S.
«ножаться. Рост популяции бактерии-хозяина за счет компонентов зреды и дополнительного притока субстрата из лизированных клеток зриводит к увеличению частоты эффективных столкновений с паразитом и началу нового цикла взаимодействия.
Врем, час
Рис.7. Кинетика внедрения Bdellovibrio В-6Ю в клетки E.coli К-12 три разных значениях множественности инфекции. Концентрация таразита. 1,2 3L 10 кл/мл._Концентрация Лактвршмозяина, кл/мл: I - Ю9, Б - 10®, В - I07, Г - 10 , Д - 10г.
Для количественной"оценки плотности популяции хозяина, нео-Зходимой для реализации процесса взаимодействия в' системе, изу-1али кинетику внедрения Bdellovibrio В-610 в клетки -E.coli К-12 1ри разных значениях множествености инфекции • (рис.7). При этом сонцентрация паразита была постоянной - 1,2хЮакл/мл, а концентрация бактерии-хозяина варьировала от I05 до I09 кл/мл. Как следует из рис.7, доля инфицированных клеток в популяции хозяина увеличивается с увеличением множественности инфекции. При концен-
с;
?рации бактерии-хозяина 10 кл/мл образование бделлопластов реги-¡трировалось спустя 2 часа после начала взаимодействия, чему, :удя по количеству инфицированных клеток, предшествовало их зазмножение. После первого, относительно синхронного цикла внед-зения в системах с концентрацией бактерии-хозяина ю7 - Ю9 кл/мл :ледовало дальнейшее увеличение числа бделлопластов за счет шфицирования интактных клеток хозяина дочерними бделловибриона-ш. В то же время при концентрации Е.coli к-12: ю5 и Ю6 кл/мл, [исленность бделлопластов оставалась практически постоянной ¡плоть до 8 часов инкубации, что существенно превышало среднюю фодолжительность внутриклеточного развития Bdellovibrio. Таким >бразом, из приведенных данных следует, что концентрация клеток ¡актерии-хозяина является фактором, лимитирующим размножение гаразита в стадии внутриклеточного роста. Минимальная концентра-
ция клеток хозяина, обеспечивающая реализацию полного цикла развития Вс1е11оу1Ъг1о, составляет Ю7 кл/мл.
Аналогичная закономерность прослеживается в .двухкомпонентных системах, в которых сопряженность процессов лизиса клеток хозяина и размножения паразита в период прогрессирующего лизиса нарушается в результате когезии бделлопластов (рис.8).
I,9
н>
н 8
Рис.8.Динамика взаимодействия 7
в двухкомпонентной системе Вс1е11оУ1Ьг1о АРЛ-2 -Р. Пио-гезсепэ при когезии бдел- 6
лопластов. I - паразит, 2 -бактерия-хозяин, 3 - агрегаты бделлопластов. 5
4 0 6 12 18 24
Время, час
Наибольшую пространственную гетерогенность система приобретает в момент снижения численности непораженных клеток хозяина ниже критически значимого для размножения паразита уровня (107кл/ мл). Введение в 15-часовую систему клеток бактерии-хозяина (I09 кл/мл), отмытых от культуральной жидкости, или самой культураль-ной жидкости (соотношение объемов 1:1) несколько задерживало процесс прогрессирующей когезии, но не влияло на кратность снижения концентрации конгломератов вследствие укрупнения. В то
q
же время суточная культура, бактерии-хозяина (10 кл/мл) или клеточный экстракт, полученный ультразвуковой обработкой, инициировали дезагрегацию уже сформировавшихся конгломератов, выражавшуюся в 20-30-кратном увеличении их концентрации через 60 мин. инкубации. Более продолжительная инкубация приводила к лизису бделлопластов и выходу из них потомства.
Показатели гидрофобности клеток Р.tluorescens, зараженных бделловибрионами, определенные по взаимодействию с углеводородной фазой в системе н-гексадекан - буферный раствор, зависели от множественности инфекции и были в 1,5-4,6 раза выше, чем у интактных клеток, что по-видимому, обусловливает их предрасположенность к слипанию. Дисперсность двухкомпонентной системы, оцениваемая характером распределения конгломератов бделлопластов по размерам (5-20, 20-60, 60-100, более 100 мкм ), увеличивалась в присутствии одно- и двухвалентных катионов, полиэтиленгликоля, при кратковременном воздействии цетидилперидиниумхлорида, пирофосфата 22
натрия, диметилсульфоксида, лаурилсульфата натрия и твина-80.А1+3 и Cj-C4 спирты вызывали очетливо выраженное укрупнение конгломератов меньших размеров. Конгломераты бделлопластов устойчивы к механическому растиранию, термообработке (50°,15 мин.) и распадаются до одиночных клеток при воздействии ультразвуком (20 кгц, 30 сек). Полная дезагрегация наиболее крупных конгломератов (>100 мкм) наблюдалась при обработке эндоглюканазой и периодатом натрия, обработка проназой приводила к 90% снижению числа конгломератов средних размеров (20 -60 мкм), а сам характер их распределения по размерам смещался в сторону преобладания одиночных бдэллопластов и мелких (до 20 мкм) скоплений клеток. Химический анализ супернатанта двухкомпонентной системы после комбинированного ферментативного воздействия показал значительное увеличение полисахаридов по сравнению с контролем. Полученные данные по всей видимости свидетельствуют о вовлечении в процесс когезии бделло-пластов полимеров полисахаридной или гликопротеидной природы.
Изучение чувствительности Bdellovibrio к различным физико-химическим воздействиям (термообработка, замораживание и оттаивание, Н\ ЭДТА, фенол, мочевина, NaCl) показало значительно более высокую - в пределах 1-2 порядков, резистентность паразита во внутриклеточной стадии, по сравнению с внеклеточной, к большинству факторов.
Как отмечалось выше, доля инфицированных клеток в системах с разными значениями множественности инфекции является переменной величиной(рис.7), что не может н« отражаться на таких параметрах, как прирост непораженных клеток в период равновесия, скорость процесса взаимодействия и коэффициент размножения Bdellovibrio. Показано,что при условии постоянной концентрации клеток бактерии-хозяина значение множественности инфекции определяет соотношение скоростей их лизиса и размножения в первые два периода развития процесса взаимодействия. Время установления равновесия скоростей лизиса и размножения клеток хозяина, а также продолжительность взаимодействия в первом полупериоде уменьшаются с увеличением множественности инфекции. Коэффициент размножения Bdellovibrio связан с множественностью инфекции обратно пропорциональной зависимостью. Определение коэффициента размножения, характеризующего относительный прирост популяции паразита, позволяет обозначить значения множественности инфекции, при которых происходит лизис хозяина извне, не сопровождающийся репродукцией Bdellovibrio. Для систем Bdellovibrio В-610 - E.coli К-12 И. Bdellovibrio В-609 - P.fluoresoens ВКМ B-I47I эти значения были равны 4.9 и 1.6, соответственно. В двухкомпонентной бактериальной системе В.
baoteriovorus 109J - E.ooli к-12 с диапазоном значений множественности инфекции 0.006-2.7 коэффициент размножения паразита был больше единицы, что свидетельствовало о реализации нормальных внутриклеточных циклов развития.
При постоянной величине инокулума Bdellovibrio В-610 ( 4хЮ7
7 9
кл/мл) и концентрациях E.ooli К-12 5x10 - 5x10 кл/мл не выявлено существенной разницы в величине урожая паразита. В системе с концентрацией бактерии хозяина Ю10кл/мл взаимодействия не наблюдалось.
Из числа собственных параметров двухкомпонентной системы, помимо множественности инфекции, существенное влияние на размножение паразита оказывает физиологическое состояние клеток хозяина. Коэффициент размножения Bdellovibrio максимален при развитии в клетках хозяина, находящихся- в лаг-фазе (рис.9). Выявленная закономерность подтверждена в экспериментах с применением синхронизированной культуры хозяина. Использование культуры
E.ooli к-12, выращенной в режиме пониженной температуры
17
Рис.9.Зависимость размножения BdellovibrioB-610 от физиологического возраста бактерии-хозяина Е.coli К-12.
часа, позволило
уточнить
ВРЕМЯ, ЧАС
с продолжительностью лаг-фазы полученные данные, а именно, показать, что клетки хозяина, инфицированные во второй половине лаг-фазы, обеспечивают максимальный прирост популяции паразита. Коэффициент размножения паразита обнаруживает тенденцию к прогрессирующему снижению вплоть до единицы при взаимодействии с клетками хозяина, подвергнутыми длительному голоданию (Ю суток). Учитывая довольно высокий процент жизнеспособных клеток в голодающей популяции хозяина (до ьо%), можно заключить, что возможность и степень реализации ростовых способностей паразита в значительной мере определяется соотношением анаболических и катаболических процессов в клетке хозяина.
Для оценки влияния температурного фактора проводили сравнение следующих характеристик двухкомпонентной бактериальной сис-24
теш: максимальных значений соотношения паразит-хозяин, времени, в течение которого это соотношение устанавливается, и величины максимального титра Bdellovibrio. Считая время установления максимального соотношения паразит-хозяин показателем скорости процесса взаимодействия, показана четкая зависимость уменьшения скорости взаимодействия паразита с хозяином при снижении температуры инкубации от 37 до 20°.Значения максимального титра Bdellovibrio при 20° в 2-3 раза выше, чем при 30-37°. Эффективность лизиса популяции бактерии-хозяина также в значительной мере определяется температурой инкубации.Так,если при максимальной скорости взаимодействия при 37° численность E.coli к-12 снижалась в 3,7x1 о2 раза по сравнению с исходной, то в режиме температур:
20-30° снижение было более существенным и составляло 3,8 iio4 -с.
2,7 £10 раз. Продолжительность стационарной фазы паразита, а также скорость снижения его численности находились в обратной зависимости от температуры. Таким образом, более высокие значения максимальных титров и меньшая скорость потери инфекционной активности бделловибрионов при более глубоком лизисе популяции бактерии-хозяина в режимах пониженных температур обеспечивают 100-кратное превышение максимальных значений соотношений паразит-хозяин по сравнению с таковыми при 30 и 37°.
Рис.Ю. Динамика взаимодействия Bdellovibrio В-610 и E.coli К-12 в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях. I - паразит, 2 -хозяин, 3 - хозяин (контроль).
В двухкомпонентных бактериальных системах , перенесенных в условия аноксии после инкубации в течение суток в аэробных условиях, не отмечено характерного для популяции паразита быстрого ■снижения числа жизнеспособных клеток на протяжении 5 суток экперимента. Более детально поведение популяций паразита (3 штамма).и хозяина ( Е. coli и P.fluorescens ) изучали в условиях аноксии на протяжении 16-24 суток и в контролируемых условиях
анаэробиоза ( гн2 = ю,з ). Показано, что анаэробные условия инги-бируют (удлинение латентного периода и периода равновесия, уменьшение доли лизированных клеток в популяции хозяина, а следовательно, и экономического коэффициента паразита ), но не предотвращают процесс взаимодействия в двухкомпонентной системе (рис.10).
Глава vii. Экология bdeiiovibrio.
Выбор бактерии-хозяина для адекватного количественного учета Bdeiiovibrio в водных экосистемах осуществляли на основе предложенного нами метода определения показателя инфекционной активности ( 1ША ) паразитических бактерий. Суть метода заключается в преобразовании "+-" символов матрицы, полученной на основе качественного изучения спектров литического действия паразитов, в числовые - "N0", где N - отношение выявляемого на газоне того или иного хозяина числа негативных колоний к максимальному на газоне наиболее чувствительного хозяина, принимаемому за единицу. Таким"образом, величина N является количественной мерой эффективности, взаимодействия Bdeiiovibrio с хозяином ( ГМА ) и, при условии достаточно репрезентативного числа штаммов, позволяет очертить спектр наиболее чувствительных к паразитам бактерий-хозяев.
Определение показателей инфекционной активности 17 штаммов бделловибрионов, выделенных из разных источников в отношении 32 штаммов грамотрицательных бактерий показало, что ряд представителей семейства Enterobaoteriaoeae обнаруживает максимальную чувствительность к большинству штаммов паразитов .(5x1 I). Выбор для оценки размеров природных популяций Bdeiiovibrio наиболее чувствительного к нему хозяина - е.coli, позволяет кроме того упростить анализ трофических связей в экосистеме до элементарной цепочки, одно из звеньев которой - е.coli, является своего рода эталоном аллохтонной популяции, источник поступления в водоемы которой детерминирован.
Изучение закономерностей количественного распространения бделловибрионов проводили на участке среднего течения р.Оки, р.Ашампе ( Краснодарский край), в прибрежной зоне северо-восточной части Черного моря ( Голубая и Геленджикская бухты) и очистных сооружениях ( Северная станция аэрации, г. Санкт- Петербург).Bdeiiovibrio является постоянным компонентом микрофлоры природных и искусственных экосистем. Численность паразитических бактерий в воде пресных водоемов составляет 0,002 - 0,004 %, в воде морских водоемов - 0,0001 - 0,0007 % от общего количества микроорганизмов. Максимальные концентрации бделловибрионов обнаруживаются в местах наибольшей антрЬпогенной нагрузки и коррелируют с содержанием в 26
Д Пирс
□ Пля* пНа^елен-
¡¿Санатории Обуй э Станции по разрезу Bctpilovibrio о 1 мл
□ 0-5 П S-1S
□ 15-10 И ¡0-500
100м
100 и
Рис.11. Характер распространения Bdellovibrio и E.ooli по руслу р. Ашампы (А) и в Голубой бухте Черного моря (Б). А: а - общее количество микроорганизмов, О - E.coli, В - Bdellovibrio.
воде кишечной палочки (Рис.11).- В системе очистных сооружений относительно постоянная на начальных этапах очистки сточных вод концентрация паразитических бактерий ( 4,3 х 10 - 7,0 х 10 кл/мл ), равно как и других груш бактерий, резко уменьшается во вторичном отстойнике за счет 10-кратного концентрирования клеток в активном иле и не превышает на выходе 5 кл/мл. Таким образом, максимальная численность паразитов в местах антропогенной нагрузки не может рассматриваться как следствие их поступления в экосистемы со сточным водами.
Хотя установленный нами тип регуляции численности популяций в двухкомпонентной системе, осуществляющийся по принципу обратной связи, указывает на потенциальную возможность участия паразитов
в сохранении равновесия в микробных сообществах, интерпретация выявленных в полевых исследованиях корреляций как причинно-следственных отношений между популяциями не имеет достаточных оснований. Исходя- из общих закономерностей, присущих двухкомпонентным Юактериальным системам, можно выделить ряд положений, не отвечающих однозначной оценке Bdellovibrio, как одного из факторов самоочищения водоемов. Это, в первую очередь, зависимость размножения паразита от довольно высоких концентраций чувствительных бак-' терий ( 107кл/мл ),.их физиологического состояния и возраста, ин-тактности ригидного слоя. Сочетание этих условий в оптимальном варианте в водных экосистемах маловероятно. Существенным шагом на пути к пониманию специфики жизнедеятельности и, в конечном итоге, микробиологических процессов, протекающих с участием Bdellovib -rio, может быть изменение традиционного, и по существу, априорного представления об облигатных паразитах как части бактериопланк-тона водных экосистем. Действительно, в рамках такого представления по причинам, перечисленным выше, затруднительно не только понимание экологической роли бактериальных паразитов, но и объяснение самого факта их обнаружения в водных экосистемах.
Предлагаемая нами концепция иммобилизованной двухкомпонент-ной ( в общем виде многокомпонентной ) системы опирается на фактические данные о выявлении значительных количеств бделловибрио-нов на поверхностях погруженных в воду предметов ( Williams, 1987; Williams a. Falkler.1989 ), аккумуляции их в сточных водах хлопьями активного ила. Концепция рассматривает Bdellovibrio как составную часть перифитонных или бентосных сообществ микроорганизмов, в которых, благодаря высокой плотности колонизации границ раздела фаз, снижаются энергетические расходы паразита на поиск хозяев, создаются условия для доминирования в жизненном цикле внутриклеточной стадии, в которой бделловибрион более надежно застрахован от недостатка питания и неблагоприятного действия абиотических факторов, чем во внеклеточной стадии. Наиболее нуждающимся в экспериментальной проверке является вопрос о реализации процесса взаимодействия и стабильности двухкомпонентных систем в иммобилизованном состоянии.
Изучение этих вопросов проводили на двухкомпонентных бактериальных системах, иммобилизованных в ПААГ и на поверхности волокнистого носителя. При иммобилизации наиболее эффективным оказался прием, связанный с использованием паразитов во внутриклеточной стадии развития. Эффективность иммобилизации в матрикс ПААГ определялась на два порядка большей выживаемостью внутриклеточных паразитов, по сравнению с внеклеточными, при токсическом действии 28
компонентов полимеризационной смеси (табл.6), тогда как при связывании бделлопластов с поверхностью носителей решающее значение имели повышенные адгезивные свойства инфицированных клеток. Из 10 исследованных носителей наиболее высокая связывающая способность ( 79.7-93.5% прикрепившихся бделлопластов ) отмечена у хромотона и активированных углеродно-волокнистых материалов АУВМ.
Таблица 6. Жизнеспособность клеток В.Ъас^егл.оуогиз юэб и Е.ооН в при разных вариантах иммобилизации в ПААГ
Вариант иммобилизации Количество, кл/мл _
I II III
В.bao t erioovorus до иммобилизации после иммобилизации % жизнеспособных клеток E.coli
до иммобилизации после иммобилизации % жизнеспособных клеток
1,9x10" 2,2X104 0,001
О О О
1 ,7X10 1 ,7X101 0,01
2,8X10" 7,4X107
II
3,0X1 о 3,5X10S 0,1
12
1 ,0X10 3,6x10 3,6
12 10
Обозначения. 1-В.Ьае^егд.оуогие, отделенный от клеток и мембран бактерии-хозяина, и-24-часовая культура B.Ъaoteгiovoгus, III-В.Ьао^еМоуогиБ внутри бделлопластов.
Иммобилизация не исключает свободной миграции бделловибрио-нов в жидкую фазу, уровень которой отражает интенсивность процесса взаимодействия на поверхности или в матриксе носителя (рис.12, табл.7). В присутствии хлорамфеникола, ингибиругацего внедрение и внутриклеточное развитие паразита, количество десорбировавшихся клеток снижалось на два порядка по сравнению с контролем. Подращивание в питательной среде иммобилизованных на волокнистом носителе
и
Рис.12.Влияние хлорамфеникола на динамику выхода вае11от1Ьг1о АРЛ-2 с поверхности волокнистого носителя в водную фазу. 1-опыт, 2-контроль. К-количество клеток.
12
Вртмя, час
Таблица 7. Десорбция паразита и хозяина в жидкую фазу в процессе последовательных реинтродукций волокнистого носителя.
Номер Bdellovibrio АРЛ-2, • P.fluorescens,
интродукции кл кл
До инкубации в М1Ш
1 1,8X1010 2,5X109
2 4.6Х107 1.2Х106
3 1.9Х107 8.4Х104
4 7.5Х107 8.9Х105
5 3,5X107 2,8X105
После инкубации в МПБ
6 2,6хю9 1,7X107 '7 1,6хю10 1.8Х108
клеток хозяина стимулировало примерно 100-кратное увеличение числа
десорбировавшихся с носителя бделловибрионов после интродукции в
жидкую фазу. Тот же прием в случае ПМГ вызывал 10-кратное
увеличение клеток паразита внутри гелевых гранул, соотношение кон-
центраций паразита внутри и вне гранул при интродукции в воду оставалось практически.постоянным и составляло 2.3. Методом сканирующей электронной микроскопии на поверхности волокнистого носителя выявлены типичные для Bdellovibrio стадии взаимодействия с хозяином,одиночные бактерии и клеточные конгломераты. Из табл. 7 следует, что несмотря на миграцию в жидкую фазу, клетки бделловиб-
рионов и хозяина достаточно прочно удерживаются носителем в ходе
7 последовательных интродукций с периодичностью 24 часа. Выживаемость иммобилизованных в ПААГ клеток была выше, чем в свободном состоянии - 30% популяции B.baoteroivorus I09D и 18% популяции Е. coli в сохраняли жизнеспособность через 3 месяца после заключения' в гель.
В модельных экспериментах in situ .выполненных в изолированных диализной мембраной объемах сточных вод , исследована динамика популяции Bdellovibrio в ответ на интродукцию E.coli. Введение в систему Е.coli ( 4.6х108-9.6х108кл/мл ) вызывало прирост популяции паразитов с 3-6.9 до 3х103-8.3х103кл/мл и некоторое изменение видового состава сообщества. Так, в частности,происходило увеличение в пределах 2-3 порядков численности псевдомонад. Сопряженно ' с приростом популяции паразитов наблюдалось снижение на 1.5 - 5.5 lg концентрации искусственно введенной E.coli. При интродукции в модельные системы волокнистого носителя с иммобилизованными клетками Bdellovibrio через сутки их концентрация в сточной воде составляла 6.8х105кл/мл, а снижение численности E.coli, Pseudomonas И быстро-30
растущих грамотрицательных бактерий происходило опережающими темпами по сравнению с контролем. Наибольший эффект интродукции паразитических бактерий отмечен в отношении е.coli, концентрация которой через сутки снижалась с ЗхШ4 до 83 кл/мл, тогда как в контрольном варианте•такая степень обеззараживания достигалась лишь на 4 сутки.
Глава уш. м1сау1Ьг±о - новый род паразитических бактерий.
Из сточных вод выделены 3 штамма паразитических бактерий, морфологически сходных с бделловибрионами, но отличающихся характером взаимодействия с клетками бактерий-хозяев. Паразиты прикреплялись к клетке хозяина концом , противоположным жгутику, локализовались параллельно ее продольной оси , увеличивались в размере и делились бинарно, вызывая пргрессирующие дегенеративные изменения и лизис атакованных клеток.. Неидентичность свойств выделенных экзопаразитов с ранее описанными бактериями служила основанием для выделения их в особый род М1оат-1Ъг1о и два новых вида м.айш.гапйиз и м. аеги^шозауогиз. Принципиальное различие между мicavibгio и Вйе11оу1Ъг1о по характеру взаимодействия с хозяином дополняют признаки, суммированные в табл.8.
Таблица 8. Признаки различия родов вае11оу1Ъг1о и Micavibrio
Признак
Micavibrio
Bdellovibrio
Чехол у жгутика
Фимбрии
"Холдфаст"
Липидная гранула
Чувствительность к птеридину
Чувствительность к ЭДТА
Чувствительность к физико-
химическому воздействию
Специфичность
Плавучая плотность,г/мл Ингибирующие концентрации Сахаров, М ГЦ в ДНК, 4% Протеиназа
класс по результатам инги-биторного анализа
молекулярная масса, Да
лизис автоклавированных клеток хозяина
Умеренная Узкая при выделении -один вид бактерий
1,044-1,051
0,01 53,8; 57,1
сериновая 39000
Высокая во внеклеточной стадии Широкая -различные виды грамотрицательных бактерий
1,018-1,033
0,001-0,01 33,4 - 53,8
сериновая, металлопротеи-наза „ 100000*, 1 юоо
+
*Faokrell а. Robinson, 1973, **Huang а. Starr, 1973b.
Характерно, что бактерии-хозяева микавибрионов - P.maito-philia и P.aeruginosa, были резистентны ко всем исследованным штаммам Bdellovibrio.M.aeruginosavorus и M.admirandus Обнаруживали видовую моноспецифичность при выделении,в процессе поддержания культур экзопаразитов в лабораторных условиях наблюдалась утрата признака и прогрессирующее расширение спектров литического действия за счет других грамотрицательных бактерий.
Манноза, глюкоза, ксилоза и лактоза в концентрации 0,0IM вызывали ингибирование процесса взаимодействия экзопаразита с хозяином. Сравнительное изучение динамики взаимодействия микавибрионов с хозяином в среде с глюкозой (опыт) и без глюкозы (контроль) показало,что разница во времени между началом лизиса клеток хозяина в опыте и контроле четко совпадает со временем утилизации глюкозы хозяином до концентрации,допускающей специфическое связывание взаимодействующих клеток и реализацию собственно процесса взаимодействия.
Качественно динамика процесса взаимодействия Mioavibrio с клетками бактерий-хозяев не отличается от динамики взаимодействия в системе Bdellovibrio - бактерия-хозяин (рис.13). Начало прогрессирующего лизиса популяции хозяина совпадает по времени с окончанием латентного периода экзопаразита. При исходном соотношении паразит/хозяин 0,55 численное снижение концентрации
Рис.13 Динамика взаимодействия в двухкомпонентной бактериальной системе M.admirandus APJI-I4 - Е. coli S. 1-M.admirandus, 2-Е.coli, 3-оптическая плотность двухкомпонентной системы, 4-оптическая плотность Е.coli (контроль).
4 ? Время, ч
клеток бактерии-хозяина совпадает с величиной инокулума М1сау1Ь-г1о;в этот период времени,соответствующий латентному периоду в развитии двухкомпонентной системы регистрируется заметное увеличение (до 50%) в среде инкубации веществ,имеющих максимум поглощения при 260 и 280нм. Приведенные данные, вместе с результатами электронномикроскопических исследований позволяют считать,что необратимые изменения и гибель клеток хозяина происходят на ранних этапах взаимодействия с экзопаразитом.
Исходное соотношение паразит/хозяин оказывает существенное влияние на скорость процесса взаимодействия в двухкомпонентной системе.Продолжительность процесса взаимодействия находится в обратной зависимости от соотношения концентраций паразит/хозяин в 32
начальный момент инкубации.Независимо от исходного соотношения
паразит/хозяин остаточное количество жизнеспособных клеток
4 5
бактерии-хозяина составляет 10 - 10 кл/мл.
Анализ жирнокислотного состава мембран М.аеги§1поБауогиз АРЛ-13,проведенный при использовании биомассы,очищенной от клеток и мембран бактерии-хозяина, показал,что для экзопаразита,также как и для бактерий рода Вс1е11оу1Ьгд.о,характерно существование тесной зависимости от состава липидов бактерий,на которых они паразитируют (табл.9).
Таблица 9. Сравнительный анализ жирнокислотного состава M.aeruginosavorus АРЛ-13 и P.aeruginosa
Жирные кислоты Относительное содержание от общего пула жирных кислот,%
M.aeruginosavorus АРЛ-13 P.aeruginosa (среднее по II коллекционным штаммам) P.aeruginosa АТСС 10145 (типовой штамм)
14:0 2,8 1,7+0,3 2,0
15:0 1.8 0,8+0,2 0,8
16:0 27,5 29,0+0,1 28,6
16:1о>7 9,4 16,8
{19,3+0,8
16:1ь>5 2,5 2,5
'17:0 3.8 1,4+0,2 2,0
17:0 1,2 0,3+0,1 0,5
18:0 3,6 2,2+0,2 2,2
18:1ш9 4,5
{43,7+0,8 41,6
18:1<о7 31,1
719:0 5,2 1,5+0,3 1,1
Также,как и у внутриклеточных паразитов,в бесклеточных экстрактах М1оау1Ъг1о не обнаруживались ферменты окислительной части пентозофосфатного цикла,а активности ферментов гликолиза составляли 1,5 - 3,8 нмол/мин/мг бежа. В то же время у микавибрионов были выявлены достаточно высокие (5,6 - 428,6 нмол/ мин/мг белка) активности значительной части ферментов цикла грикарбоновых кислот, в который вовлекаются, очевидно, продукты деградации бежов, осуществляемой, в частности, литической про-геиназой паразита.
Литическая протеиназа, выделенная нами методами ионообменной хроматографии и гель-хроматографии из бесклеточного экстракта 'Л.айтагапйиз АРЛ-14,является одним из компонентов системы ферментов, участвующих в деградации клетки хозяина.Активность фермента
не изменялась в присутствии ЭДТА,двухвалентных катионов и п-ХМБ, и снижалась на 80% при обработке 8 х Ю-4 М 5МСФ, что позволяло отнести выделенный фермент к классу сериновых протеиназ. Молекулярная масса фермента. составляла 390*00 Да.Выделенная протеиназа обладала высокой термостабильностью,имела оптимум активности при температуре реакции 55° и pH 7,0,гидролизовала автоклавированные клетки Е.соИ.Изоэлектрическая точка фермента 4,3 + 0,5,константа Михаэлиса гидролиза казеина 4,0 мг/мл.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С выделением Bdellovibrio (Stolp a. Petzold, 1962; Stolp a.starr, 1963) был открыт новый,ранее неизвестный тип взаимоотношений между бактериями - облигатный антагонистический эндо-симбиоз (Starr, 1974). Уникальность этого явления выдвинула широкий круг проблем общего характера,от решения которых зависело понимание сущности процессов и механизмов бактериального паразитизма, его места в системе микромира. Вместе с тем, как и при изучении любого нового таксона бактерий,весьма актуальными были проблемы более частного порядка,связанные с изучением условий выделения, культивирования,поддержания культур паразитических бактерий, разработки методических приемов,необходимых для определения их свойств. В последние годы определился повышенный интерес к изучению типов антагонистического симбиоза прокариот. Углубленные исследования в этой области давали все больше подтверждений, что разнообразие типов взаимодействия между бактериями далеко не исчерпывается моделью .Bdellovibrio-хозяин.Было описано большое количество различных морфологических форм бактерий, отношения которых с другими бактериями можно было классифицировать как паразитизм. Однако до недавнего времени эти описания были, как правило, результатами микроскопических наблюдений природных образцов, а не собственно изолятов. В настоящее время перечень выделенных , кроме Bdellovibrio , паразитов бактерий включает: Ensifer (Casida,1982), Cupriavidus (Maooar a. Casida, 1987), Vampirooooous и Daptobaoter (Guerrero et al.,1986).
Сформированная нами коллекция паразитических бактерий включала штаммы,большинство из которых по характерному для них циклу взаимодействия с клетками бактерий-хозяев было отнесено к роду Bdellovibrio.Три морфологически сходных с бделловибрионами штамма, выделенных в новый род Mioavibrio, имели принципиально иной тип взаимодействия с хозяином: они не проникали внутрь атакованной клетки, а локализовавшись на поверхности, увеличивались в размерах и делились бинарно. 34
Микавибрионы обнаруживают отличив от внутриклеточных паразитов в ультраструктурной организации клетки. Жгутики экзопаразитов не имеют чехла, и в этом отношении сходны с У.оЫогеНауогиз. В их клетка/ не выявлена такая специализированная структура, как ¡солдфаст, а также внешние органеллы типа фимбрий.Резистентность к вибриостатическому птеридину и чувствительность к ЭДТА по-видимому отражает структурные особенности клеточных оболочек М1оау1ъг1о, яе характерные для В(1е11оу1Ъгл.о. Весьма существенно, что микавибрионы были выделены на бактериях, резистентных ко всем исследованным штаммам Вс1е11оу1Ьг1о.Вместе с тем, моноспецифичность к хозяину является характеристикой только свежевыделенных изолятов 1Иоау1Ьг1о. В процессе хранения культур в лабораторных условиях юноспецифичность утрачивается, и экзопаразит по спектру чувствительных бактерий не отличается от Вйе11оул.Ъг1о. Динамичность признаков по-видимому вообще характерна для облигатных паразитов.Так, например, о неидентичности свойств одного и того же штамма В.Ьас-1егз.оуоги.з 109, поддерживаемого в разных лабораториях, сообщалось Риттенбергом (Н1иепЬегё,1972). У одного из штаммов бделловибрио-юв отмечена утрата способности включать в собственные мембраны Зелковые компоненты мембран хозяина (Та11еу et а1.,1987).
Однако, несмотря на перечисленные отличия, в процессе взаимодействия экзо- и эндопаразитов с хозяином можно выделить ряд , збщих закономерностей. По-видимому, один и тот же механизм угле-зод-белкового узнавания определяет специфичность первичного контакта взаимодействующих клеток. Необратимые изменения и гибель теток бактерий-хозяев происходят уже на ранних этапах взаимодействия с паразитами.Роль углеводов в метаболизме бактериальных паразитов по-видимому незначительна, что возможно определяется спе-дафикой общего трофического начала, каковым является для них бактериальная клетка, в общем пуле которой доля углеводов крайне мага (Кос1г,19б4). С этих позиций представляется наиболее вероятным, !то основным источником углерода и энергии у М1сау1Ьг1о , как и г Вйе11оу1Ъг1о, являются продукты деградации белков.О наличии не-збходимой для этого ферментной основы свидетельствует выделение 13 экзопаразита литической протеиназы. Возможно также, что обли-патный характер паразитизма м1сауз.Ъг1о свидетельствует о более глубокой, нежели просто трофическая, зависимости от хозяина. Судя ю данным о копировании микавибрионом липидного состава хозяина, тзбирательном характере включения жирных кислот в собственные ли-шды, бактериальная клетка служит для экзопаразита, как и для 5с1е11оу1.Ьг1о, не только набором питательных веществ, но и готовых 5локов, используемых для построения собственных структурных ком-
П0Н8НТ0В.
У микавибрионов отмечено повышенное, по сравнению с Bdello-vibrio, содержание цис-вакценовой кислоты, что обычно коррелирует с лучшей выживаемостью бактерий. Учитывая видовую моноспецифичность Micavibrio, вопрос об их выживаемости в природе приобретает еще большую значимость, чем в случае с Bdellovibrio. В определенной мере ограниченность спектра чувствительных бактерий может компенсироваться повышенной, по сравнению с бделловибрионами (внеклеточная стадия), резистентностью к внешним воздействиям. Существенным также, наряду с этим, представляется факт обнару-ружения в клетках экзопаразита липидной гранулы, никогда не выявляемой у бделловибрионов. Вполне возможно, что в условиях голодания внутриклеточные липиды могут служить для экзопаразита источником углерода и энергии.У бделловибрионов,по всей видимости, важную роль в уменьшении степени зависимости от условий макросреды обитания играют неорганические полифосфаты.
Отмеченный параллелизм признаков Bdellovibrio й Micavibrio удивительно соответствует идее морфофизиологической близости эндопаразита и его гипотетического предшественника - экзопаразита, в известной модели возможных путей эволюции бактериальных паразитов (Rittenberg a.Thomashow.i979). Несмотря на умозрительность сказанного, очевидно,что с выделением новых родов и видов паразитических бактерий существенно расширяются возможности изучения таксономических отношений между ними.
Бактерии, отнесенные к роду Bdellovibrio на основе общности морфологических признаков и характерного цикла взаимодействия с грамотрицательными бактериями, гетерогенны по видовому составу. Об этом свидетельствует достаточно широкий размах колебаний в ну-клеотидном составе ДНК: от 41,2 М % (B.stolpii UKi2) до 47,8-53,8 М % ГЦ.Однако схемы классификации бделловибрионов (Bergey's man-nual.1974, 1984) не позволяют однозначно идентифицировать штаммы до вида. Неудовлетворительность систем видовой диагностики Bdellovibrio в значительной степени обусловлена принципами, заложенными в их основу. Так, в частности, совершенно очевидно, что изучение таксономических признаков сапрофитных производных Bdellovibrio не обеспечивает получение адекватной информации. И дело не только в том, что отдельные сапрофитные штаммы генетически не идентичны родительским вариантам (например, Bdellovibrio UKil). Становится все более ясно, что мутации, приводящие к утрате обли-гатной зависимости паразита от хозяина, затрагивают и такие важные свойства клеток, как химический состав их структур, метаболическая организация, осмотичность и др. (Kuenen а. Rittenberg, 36
1975; Pritohard et al, 1975; Frie'dberg a.Friedberg, 1976; Park a.Mahadevan, 1988). Все вышеперечисленное свидетельствует в пользу обоснованности выбранного нами подхода к изучению таксономических свойств непосредственно у паразитических бактерий дикого типа.
Проведенные нами исследования не подтвердили, что специфичность Bdeliovibrio ограничена таксономически близкими видами и родами бактерий. Более того, показано, что штаммы одного вида бактерий отличаются по чувствительности к паразиту. Кроме того, существенным фактором реализации процесса взаимодействия является физиологический возраст культур чувствительных бактерий. И наконец, что не менее важно, специфичность паразита^ не отвечает основному требованию, предъявляемому к таксономически значимому признаку - стабильности. Спектр литического действия Bdeliovibrio - вариабельная характеристика культуры, зависимая от таксономического статуса бактерий, в клетках которых присходит его развитие. Причиной такой зависимости является по-видимому включение паразитами большей части компонентов бактерий-хозяев в составные структуры клетки, композиция которых не может не отражаться за их специфичности. Это обстоятельство затрудняет использование цля бактериальных .паразитов многих хемотаксономических признаков, с успехом применяемых в качестве критериев дифференциации других груш бактерий. Так, в частности, группирование бделловиб-эионов на основе данных жирнокислотного анализа их мембран по :ути отражает группирование бактерий, которые были использованы 1ля них в качестве хозяев. Таким образом, изучение жирнокислот-юго состава Bdeliovibrio, представляя самостоятельный интерес щя понимания особенностей его липидного обмена, тем не менее, ie вносит вклада в разработку таксономических критериев вида мразитов.
Весьма перспективным для изучения таксономии паразитических-5актерий представляется анализ белкового состава мембран,обнаруживающий ряд корреляций при сопоставлении с другими признаками. 1олученные нами данные подтверждают видовой статус B.stolpii, го не выявляют существенных признаков отличия у Bdeliovibrio l 3.12 (B.srai-rii?) от других штаммов бделловибрионов. Однако та-;сономическая ревизия B.starrii до разработки признанных критери-ib видов Bdeliovibrio вряд ли оправдана. Кроме того, нельзя не гсключить и возможную неаутентичность использованного штамма изо-[яту Bdeliovibrio A3.12. О прецедентах подобного рода неоднокра-'но сообщалось в литературе.
Особое внимание нами было уделено анализу межпопуляционных
взаимоотношений в двухкомпонентной системе, поскольку именно по-пуляционный подход позволяет Еыделить основные закономерности взаимодействия паразита с хозяином, а следовательно, прогнозировать развитие смешанных культур. В результате изучения кинетики взаимодействующих популяций, зависимости ростовых характеристик двухкомпонентной системы от биогенных (множественность инфекции, физиологическое состояние хозяина) и абиогенных (температурный и кислородный режимы, ряд физико-химических воздействий) факторов оказалась возможной разработка методических приемов культивирования и поддержания культур бактериальных паразитов, адекватных характеру решаемых экспериментальных. задач. Такого рода проблемы всегда актуальны, а их решение является необходимым и часто определяющим этапом в исследовании любой физиологической группы микроорганизмов, особенно если она представлена новыми таксонами.
Анализ количественных закономерностей показал, что взаимодействие Вйе11оу1Ьг1о и бактерии-хозяина реализуется на основе положений модели Вольтерра, учитывающей вероятностный характер взаимодействия (пропорциональность числа эффективных столкновений концентрациям паразита и хозяина) и предсказывающей колебательный режим изменения численности взаимодействующих популяций.
Размножение ВйеНоуИзхпо в двухкомпонентной системе осуществляется в довольно узком диапазоне концентраций бактерии-хозяина: от 107до 5хЮ9 кл/мл. Однако даже в пределах допустимых концентраций бактерии-хозяина при избытке клеток паразита происходит лизис извне, не сопровождающийся репродукцией в<1е11оу1Ьг1о. Значения соотношений паразит/хозяин (множественность инфекции), при которых этот процесс имеет место, варьируют для разных двухкомпо-нентных систем. При постоянной концентрации клеток хозяина скорость процесса взаимодействия в системе зависит прямо пропорционально от множественности инфекции, коэффициент размножения паразита связан с множественностью инфекции обратной зависимостью.
Сочетание популяционного и организменного подходов для изучения двухкомпонентной системы позволило выявить условия,определяющие реализацию инфекционного цикла паразита. Выше уже отмечалась роль углеводных и белковых компонентов клеточных стенок в процессе первичного узнавания взаимодействующих клеток. Важное значение для реализации взаимодействия клеток играют структурный (целостность пептидогликана) и трофический (физиологическое состояние хозяина) факторы. При изучении кинетики внедрения Вс1е11оу:.Ьгз.о в клетки хозяина при разных значениях , множественности инфекции было показано, что инфекционный цикл паразита обратимо блокируется на терминальных стадиях при концентрации клеток
хозяина в среде инкубации,меньшей 10 кл/мл.Во внутриклеточной стадии- паразит значительно менее чувствителен к действию неблагоприятных физико-химических факторов, чем во внеклеточной. Еще большую резистентность к внешним воздействиям внутриклеточному паразиту обеспечивает способность бделлопластов образовывать клеточные скопления за счет повышенной гидрофобности клеточных оболочек и вовлечения в процесс когезии внеклеточных полимеров, предположительно гликопротеидной природы. Не исключено , таким образом, что "запечатанный" в бделлопласте паразит является своего рода уникальной формой переживания неблагоприятных условий у штаммов, не способных к образованию бделлоцист.
Регуляция численности популяций в двухкомпонентной бактериальной системе, осуществляемая по принципу обратной связи, позволяет предполагать, что в природных экосистемах Bdellovibrio может выполнять роль фактора, ответственного за сохранение популяцион-ного равновесия. Наиболее распространенным подходом к оценке экологической роли Bdellovibrio был и до настоящего времени остается в работах многих исследователей поиск корреляционных закономерностей в распространении паразитов и их потенциальных бактерий-хозяев. Этот подход, дополненный выбором наиболее чувствительного хозяина, был применен и в наших исследованиях. Было показано, что максимальные концентрации бактериальных паразитов, как правило, обнаруживаются в местах наибольшей антропогенной нагрузки и коррелируют с концентрацией е.coli. Однако интерпретация такой зависимости как причинно-следственной обусловленности не имеет достаточных оснований. Маловероятным представляется сочетание в оптимальном варианте факторов, обеспечивающих реализацию процесса взаимодействия, равно как наличие достаточных для размножения плотностей потенциальных бактерий-хозяев (не ниже Ю7кл/мл), находящихся в состоянии активного метаболизма. На основе анализа закономерностей взаимодействия популяций паразита и хозяина нами сформулирована концепция функционирования двухкомпонентной системы в иммобилизованном состоянии, как наиболее соответствующем физиологическим свойствам Bdellovibrio и обеспечивающем ряд экологически значимых преимуществ. Коиммобилизация бделловибрионов с бактериями-хозяевами не только удовлетворяет трофические потребности паразита, но и создает оптимальные условия для сокращения продолжительности внеклеточной стадии, в которой Bdellovibrio наиболее уязвим к действию неблагоприятных внешних факторов. Находясь внутри бделлопласта, паразит имеет механизмы адекватной реакции на экстремальные изменения в макросреде (например, недостаток клеток хозяина). Кроме того,.в силу повышенной гидрофобности
клеточной стецки, Оделлопласт обладает высокими адгезивными свойствами, обеспечивающими паразиту эффективную колонизацию границ раздела фаз в водоеме. Численность паразитов в водной толще отражает интенсивность процессов взаимодействия, происходящих на поверхности или в матриксе природных адсорбентов. Отсутствие растворенного кислорода и условия анаэробиоза водной среды обитания не исключает возможность процесса взаимодействия паразита с хозяином. Наличие в общем пуле бактериопланктонных форм чувствительных к бделловибрионам грамотрицательных бактерий в концентрациях, больших Ю7 кл/мл, допускает реализацию процесса взаимодействия в водной толще, как это следует из модельных экспериментов in situ. Таким образом, иммобилизация представляется наиболее адекватным подходом, открывающим возможности для более полной характеристики жизнедеятельности паразитов в водных экосистемах, изучения особенностей и масштабов процессов,протекающих с их участием. Кроме того, имеются основания рассматривать иммобилизацию как один из путей решения проблемы искусственной интродукции паразитических бактерий в загрязненные водоемы с целью их обеззараживания .
ВЫВОДЫ .
I. Среди облигатных паразитов водных экосистем обнаружены бактерии с принципиально различающимися типами взаимодействия с клетками бактерий-хозяев.Наряду с внутриклеточными паразитами рода Bdellovibrio,выделены и описаны экзопаразиты,отнесенные к новому РОДУ Micavibrio И ДЕУМ видам M.admirandus И M.aeruginosavorus.
2. Отличительными признаками Micavibrio .являются эпибионтный рост и бинарное деление,видовая моноспецифичность,отсутствие чехла у жгутика. Вместе с тем, экзопаразит обнаруживает ряд свойств, демонстрирующих морфологическое и физиолого-биохимическое сходство с Bdellovibrio: размеры и форма клеток, неспособность к сапрофитному росту, характер цитологических изменений в клетке хозяина на ранних этапах взаимодействия,специфика липидного и углеводного метаболизма.
3. У бактериальных паразитов рода Bdellovibrio выявлено значительное варьирование спектров литического действия, степени чувствительности к вибриостатическому птеридину, содержания ГЦ в ДНК, липидного и белкового состава мембран. Показана зависимость специфичности и жирнокислотного состава липидов бделловибрионов от вида инфицируемых бактерий.В то же время ряд корреляций с другими признаками, обнаруженный при анализе белковых спектров мембран,указывает на приемлемость хемотаксономического подхода к кла-
ССИфИКЭЦИИ Вс1е11оУ1Ьг:ю.
4. На основании результатов ингиб'иторного анализа с примене-шем углеводов и лектинов получены свидетельства роли углевод-бе-1кового узнавания в процессе взаимодействия паразитических бакте-шй с хозяевами.
5. С применением цейтраферной микрокиносъемки уточнены и легализированы особенности морфодинамики взаимодействующих клеток. Остановлена сопряженность процесса внедрения паразита и образована бделлопласта.Еключающего две стадии: "набухание" и приобретете собственно сферической формы. Показано,что функционально зна-шмым фактором внедрения является интактность пептидогликана клеточной стенки хозяина.
6. В типичном процессе популяционных взаимодействий в двухко-яюнентной.системе выделяются три периода с адекватными ростовыми сарактеристиками: латентный,равновесия и преимущественного лизиса. Регуляция численности взаимодействующих популяций осуществляется ю типу обратной связи,обусловливающей их продолжительное -сосуществование в колебательном режиме.
7. Взаимодействие В1е11оу1Ъг1.о с хозяином реализуется в диа-
7 Я
изоне концентраций последнего 10 - 5x10 кл/мл.При снижении плот-юсти популяции хозяина ниже критического -уровня происходит обратимое блокирование терминальных стадий инфекционного цикла паразита и когезия Оделлопластов.Дезагрегация клеточных конгломератов 1 возобновление внутриклеточного развития Вс1е11оУ1Ьг1о инициируются введением в систему клеток бактерии-хозяина или их клеточных экстрактов.
8. Показана зависимость кинетических характеристик двухкомпо-гентной системы,определяемых соотношением скоростей лизиса и размножения популяции хозяина, от множественности инфекции.При условии постоянной концентрации бактерии-хозяина скорость процесса взаимодействия зависит прямо пропорционально от множественности шфекции,тогда как зависимость коэффициента размножения от множественности имеет обратный характер.
9. Установлена,что зависимость Б<1е11оу1Ьг1о от хозяина в зна-штельной степени определяется трофическим фактором : коэффициент размножения паразита максимален при взаимодействии с клетками,на-:одящимися в лаг-фазе,и не превышает единицы при взаимодействии с слетками,подвергнутыми длительному голоданию.В бесклеточных экст-зактах паразитов выявлена большая часть ферментов цикла трикарбо-ювых кислот,вместе с тем получены очевидные свидетельства незна-штельной роли углеводов в их метаболизме: редуцированная окислительная часть пентозофосфатного цикла,низкие активности ферментов
гликолиза.В клетках Вс1е11оу1Ьг1о обнаружены неорганические полифосфаты, а также ферменты,участвующие как в их потреблении,так и в биосинтезе.
10. В противоположность распространенному представлению о Вс1е11оу1Ьг1о как строгом аэробе,экспериментально доказано,что условия анаэробиоза ингибируют (увеличение продолжительности латентного периода и периода равновесия, уменьшение доли лизированных клеток в популяции хозяина),но не предотвращают процесс взаимодействия в двухкомпонентной системе.
11. На основе анализа межпопуляционных взаимодействий и закономерностей количественного распространения паразитических бактерий в водных экосистемах предложена концепция иммобилизованной двухкомпонентной системы как наиболее адекватной модели существования и жизнедеятельности Вйе11оуэ.Ьг1о в природе. Подобраны условия коиммобшшзации паразита и хозяина на поверхности и в матрик-се различных носителей,обеспечивающие реализацию процесса их взаимодействия и пролонгированное, по сравнению со свободным состоянием, сохранение жизнеспособности.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ламбина В. А. , Бирюзова В. И., Иванчикова С. М., Чуркина JL Г. , Ледова ДА. , Афиногенова А. В. , Благодатская В. М. 1971. Мор-фолого-цитологические и физиологические особенности паразита бактерий Bdellovibrio bacteriovorus, Stolp. Тезисы докл. IV съезда ВМО, Минск, с. 27-28.
2. Печников H В. , Федорова А. М. , Ратнер Е. Н., Лебедева Е. И. , Мелентьева Т. М. , Кудрявцева Л. В. , Афиногенова А. В. .Ламбина В. А. 1972. Визуализация процессов дезинтеграции микроорганизмов. Тезисы докл. Всес. конф. " Дезинтеграция микроорганизмов", Пущино, с. 142-157.
3. Афиногенова A. R , Ламбина В. А. 1973. Динамика роста и развития двухкомпонентной бактериальной системы паразит-хозяин. Тезисы докл. Всес. конф. по управляемому биосинтезу и биофизике популяций, Красноярск,с. 65-66.
4. Афиногенова А. В., Яюс Л. И. , Ламбина В. А. 1974. Физиологические характеристики роста и развития двухкомпонентной бактериальной системы паразит-хозяин. Сб. "Физиология и биохимия микроорганизмов", сер. биол., вып. 2, Горький, с. 127-133.
5. Lambina V. А. , Afinogenova А. V. ,Blagodatskaya V. M. .Petchni-kov N. V. 1974. Physiological peculiarities and morphodyna-mic of the interaction of Bdellovibrio bacteriovorus with host bacteria. Proc. I Int. Congr. IAMS, Tokyo, v. 3, p. 224-229.
6. Ламбина E A., Афиногенова А. В. , Коновалова С. M. , Печников Е В. .Федорова А. М. ,Фихте Б. А. .Скрябин Г. К. 1974.0 характере паразитизма Bdellovibrio bacteriovorus Stolp et Starr gen. et sp. nov. Изв. АН СССР,сер. биол. ,N. I.e. 81-88.
7. Ламбина В. А. , Афиногенова А. В., Коновалова С. М. , Самойлен-коВ. А. 1974. Физиологические особенности взаимодействия Bdellovibrio bacteriovorus с бактерией-хозяином. Там же, N. 2, с. 204-210.
8. Ламбина В. А. , Чувильская Н. А. .Ледова Л. А. .Афиногенова А. В. , Авербург И. В. 1974. Количественные закономерности распространения Bdellovibrio bacteriovorus в речной воде. Микробио-
логия.т. 43, в. 4,с. 715-720.
Печников Е В. .Афиногенова A.B., Ламбина В. А. 1974. Особенности образования сферопласта бактерии-хозяина в процессе взаимодействия с Bdellovibrio bacteriovorus. Цитология,т. 17, в. 3,с. 343-347.
Э. Ламбина В. А., Чувильская Е А. , Ледова Л. А. , Афиногенова А. В. 1975. Bdellovibrio bacteriovorus как составная часть природной микрофлоры. Тезисы докл. V съезда ВМО, Ереван, с. 89-90.
1. Афиногенова А. В. , Ламбина В. А. 1977. Влияние температурного фактора на динамику взаимодействия Bdellovibrio bacteriovorus с бактерией-хозяином. Микробиология,т. 46,в. 4, с. 741745.
2. Бобык М. А. , Афиногенова А. В., Чуркина Л. Г. , Заичкин Э. И. , Ламбина В. А. , Кулаев И. С. 1978. Отделение Bdellovibrio bacteriovorus от клеток и мембран бактерий-хозяев. Изв. АН СССР, сер. биол. N. I.e. 155-157.
3. Афиногенова А. В. , Ратнер Е. Е , Ламбина В. А. 1978. Колебания численности паразита и хозяина в двухкомпонентной бактериальной системе. Микробиология,т. 47,в. 2,с. 265-269.
!.. Афиногенова А. В. , Шкидченко А. Е , Ламбина В. А. 1979. Сравнительное изучение динамики взаимодействия Bdellovibrio bacteriovorus с бактерией-хозяином в аэробных и анаэробных условиях. Там же, т. 48, в. 1,с. 102-105.
5. Андреев Л. В. , Ромай Пенабад С. , Афиногенова А. В. , Ламбина
B. А. 1979. Исследование особенностей жирнокислотного состава бактериальных паразитов рода Bdellovibrio. Тезисы докл. Всес. конф. "Биосинтез и метаболизм липидов у микроорганизмов", М. , с. 27-30.
5. Ромай Пенабад С. , Афиногенова А. Е .Ламбина В. А. 1979. Характеристика бделловибрионов, выделенных из сточных вод, по спектрам литическогй действия. Тезисы докл. Всес. конф. "Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды", Пущино,с. 182-184.
Bobyk M. А. , Afinogenova А. V. , Dudinskaya M. V. .Lambina V. A. , Kulaev I. S. 1980. Detection of polyphosphates and enzymes of polyphosphate metabolism in Bdellovibrio bacteriovorus, Zbl. Bakt. , II Abt. ,B. 135,H. 6,S. 461-466.
i. Severin A. I. , Afinogenova A. V. , Bobyk M. A. ,Kulaev I.S. .Lambina V. A. ,1981. Protein composition of Bdellovibrio bacteriovorus and Escherichia coli membranes during their interaction. Ibid. ,B. 135,H. 1,S. 3-9.
!. Афиногенова А. В. , Ромай Пенабад С. , Коновалова С. M. .Чуркина Л. Г. .Ламбина Е А. 1981. Сравнительная характеристика штаммов Bdellovibrio, выделенных из речной и сточных вод. Микробиология,т. 50,в. 2,с. 378-385.
). Lambina V. А. , Afinogenova А. V. .Romay Penabad Z.', Konovalova S. M., Pushkareva A. P. 1981. New genus and species of exoparasitic bacteria Micavibrio admirandus. Abstr. IV Int. Conf. Culture Collections. Brno,p. 45.
.. Afinogenova A. V. , Romay Penabad Z. .Lambina V. A. 1981. Taxonomy of bacteria of Bdellovibrio genus. Abstr. IV Int. Conf. Culture Collections, Brno, p. 46.
Северин А. И. , Афиногенова A. E , Ерова Т. E. .Бобык M. A. , Ламбина В. А. .Кулаев И. С. 1981. Сравнительное изучение белкового состава мембран бактерий рода Bdellovibrio. Микробиология, т. 50, в. 6, с. 980-984.
î. Ламбина В. А. , Афиногенова А. Е , Ромай Пенабад С. , Коновалова
C. М. , Пушкарева А. Е 1982. Micavibrio admirandus gen. et sp. nov. Там же,т. 51, в. 1, с.114-117. v Afinogenova А. V. , Romay Penabad Z. , Lambina V. A. 1982. Host range characterization of the genus Bdellovibrio. .Biologia
(Bratislava), ser. С, v. 37, N. 3, p. 327-334.
25. Afinogenova A. V. , Romay Penabad Z. , Lambina V. A. 1981. Bakterien der Gattung Bdellovibrio als biotischer Faktor im Wasser. Ref. Ill Int. Hvdromikrobiol. Svmp. , I. Daubner ( ed. ), Bratislava, 3. 459-464.
26. Andreev L. V. , Afinogenova A. V. , Romay Penabad Z. , Lambina V. A. 1983. Peculiarities of the fatty acid composition of Bdellovibrio. Folia microbiologica, v. 28,N. 1 ,p. 28-35.
27. Афиногенова А. В. , Ромай Пенабад С. , Чуркина JL Г. , Ламбина В. А. 1983. Способ определения чувствительности к птеридину паразитических бактерий рода Bdellovibrio. Виол, науки, N.6,104-105.
28. Severin А. I. , Afinogenova А. V. , Larrbina V. А. 1983. Membrane proteins of parasitic bacteria of Bdellovibrio genus. Abstr. FENG Int. Symp. "Environmental regulation of microbial metabolism" , Pushchino, p. 161-162.
29. Ламбина RA. , Афиногенова А. В. .Ромай Пенабад С. , Коновалова С. М. , Андреев Л В. 1983. Новый вид экзопаразитических бактерий рода Micaví brio,разрушающих грамогрицательные бактерии. Микробиология, т. 52, в. 5, с. 777-782.
30. Маркелова ЕЮ. .Афиногенова А. В. .Коновалова С.М. , Ламбина В. А. 1984. Отделение экзопаразитических бактерий рода Micavib-rio от клеток и мембран бактерии-хозяина. Биол. науки, N. 4, с. 103-106.
31. Чемерис Н. А. .Афиногенова А. В. ,Царикаева Т.О. 1984. Роль углевод-белкового узнавания в процессе прикрепления Bdellovibrio к клеткам бактерий-хозяев. Микробиология,т.53, в. 4, с. 556-558.
32. Ламбина В. А. .Афиногенова А. В. .Коновалова С. М. , Ледова Л. А. . Чуркина Л Г. 1984. Методы исследований бактериальных паразитов. Методические рекомендации. Пуидано.
33. Severin A. I. .Afinogenova А. V. 1985. Protein composition of Е.coli membranes before and after their interaction with Bdellovibrio bacteriovorus bacterial parasite. Abstr. Int. Symp. "Bacteria and the host", Prague, p. 109.
34. Афиногенова A. R , Маркелова R ¡0. 1985. Особенности метаболической организации экзопаразитических бактерий рода Micavibrio. Тезисы докл.. VII съезда ВШ, Алма-Ата, с. 13.
35. Афиногенова А. В. , Коновалова С. М. , Ламбина R А. 1986. Утрата признака видовой моноспецифичности зкзопаразитическими бактериями рода Micavibrio. Микробиология, т. 55, в. 3, с. 487489.
36. Afinogenova А. V. , Markelova N.'Yu. , Lamb i na V. А. 1986. Detection of enzyme activities of some metabolic pathways in Micavibrio admirandus and Bdellovibrio bacteriovorus. Zbl. Bakt. , II Abt. , B. 141, H. 6, S. 471-475.
37. Chemeris N. A. , Afinogenova A. V. 1986. Role of carbohydrate receptors in the interaction of Micavibrio admirandus and host-bacterium. Ibid. ,B. 141,H. 7, S. 559-562.
38. Афиногенова A. R , Маркелова R Ю. , Ламбина R A. 1987. Анализ межпопуляционных взаимодействий в двухкомпонентной системе Micavibrio admirandus - Escherichia coli. Биол". науки.N. 6, с. 101- 104.
39. Ламбина R А., Ледова Л. А., Афиногенова А. В. 1987. Взаимоотношения бделловибрионов с бактериями-хозяевами в прибрежной зоне северо-восточной части Черного моря. Микробиол. ж.,т. 49, в. 3, с. 41-46.
40. Маркелова R Ю. , Афиногенова А. В. , Северин А. И. 1986. Выделение и некоторые свойства внутриклеточной протеиназы из экзопаразитических бактерий Micavibrio admirandus. Тезисы докл. Всес. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Кобулети,
-
Афиногенова, Альбина Владимировна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1992
-
ВАК 03.00.07
- Развитие Bdellovibrio в иммобилизованных бактериальных системах хищник-жертва
- Структура и взаимоотношения компонентов системы "осетровые рыбы - паразитические гидробионты - среда" в ихтиопатологическом мониторинге водоемов юга России
- Особенности цитологии новых хищных грамотрицательных ультрамикробактерий
- Продукция и состав органического вещества циано-бактериальных матов щелочных водных экосистем Забайкалья
- Эколого-физиологические и биохимические особенности функционирования паразитарной системы нематоды Hysterothylacium Aduncum (RUD., 1802) в Чёрном море
