Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие Bdellovibrio в иммобилизованных бактериальных системах хищник-жертва

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шорохова, Анна Павловна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИМ.Г.К. СКРЯБИНА

' Л; 2 / - V ^ ... _ V На правах рукописи

Шорохова Анна Павловна

РАЗВИТИЕ BDELLOVIBRIO В ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СИСТЕМАХ ХИЩНИК - ЖЕРТВА

03.00.7 -Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н. А.В. Афиногенова

Пущино - 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений, используемых в диссертации 6

ВВЕДЕНИЕ 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Характеристика бактерий рода Вс1е11оу1Ьгю 12

ГЛАВА 2. Экология бактерий рода Вёе11оу1Ьпо 22

2.1. Распространение бделловибрионов в природе 23

2.2. Роль Вс1е11оу1Ьгю в природе 27 ГЛАВА 3. Иммобилизация бактериальных клеток. 37

3.1. Адгезия микроорганизмов на твердых поверхностях. Адгезия и когезия - процесс взаимодействия двух поверхностей 38

3.2. Роль твердой поверхности в жизнедеятельности микроорганизмов 45 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ *

ГЛАВА 4. Объекты и методы исследования. 49

4.1. Штаммы Вс1е1ктЬгю и бактерий -жертв. 49

4.2. Среды для культивирования. 49

4.3. Культивирование Вс1е11оу1Ьгю и клеток бактерии-жертвы. 49

4.3.1. Определение числа клеток бделловибрионов. 50

4.3.2. Определение количества интактных и инфицированных клеток бактерии- жертвы. 50

4.4. Световая микроскопия. 50

4.5. Электронная микроскопия. 51

4.5.1. Ультратонкие срезы. 51

4.5.2. Электронно -микроскопическая криофрактография. 51

4.5.3. Приготовление препаратов для сканирующей микроскопии. 52

4.6. Отделение ВсЬПоуШпо от клеток и мембран бактерии -жертвы. 52

4.7. Изучение гидрофобных свойств клеток. 53

4.8. Получение бделлопластов бактерии -жертвы. 53

4.9. Изучение агрегатной устойчивости двухкомпонентной бактериальной системы. 54

4.10. Определение внеклеточных полисахаридов. 55 4.10.1. Определение содержания глюкозы в культуральной

среде. 55

4.11. Иммобилизация двухкомпонентной бактериальной системы в ПААГ. 56

4.12. Иммобилизация Bdellovibrio и бактерии -жертвы на гранулированных и волокнистых носителях. 57

4.12.1. Взаимодействие Bdellovibrio с углеродно-волокнистым носителем. 58

4.12.2. Подбор оптимальных условий адсорбции. 58

4.13. Ингибировани внутриклеточного роста

бделловибрионов. 58

4.14. Изучения влияния физико- химических факторов на процессы десорбции клеток двухкомпонентной бактериальной системы с углеродно- волокнистого носителя. 58

4.15. Эксперименты в искусственно изолированных экосистемах in situ. 59

4.15.1. Определение общего количества микроорганизмов. 59

4.15.2. Определение общего количества сапрофитных микроорганизмов. 60

4.15.3. Определение количества грамотрицательных микроорганизмов. 60

4.15.4. Определение количества E.coli. 60

4.15.5. Определение количества псевдомонад. 60

4.16. Изучение поведения двухкомпонентной бактериальной системы, иммобилизованной на АУВМ-Ш в условиях

непрерывного культивирования. 60

4.17. Статистический анализ экспериментальных данных. 61

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 5. Иммобилизация двухкомпонентной бактериальной системы в полиакриламидный гель. 62

5.1. Подбор оптимальных условий иммобилизации. 62

5.2. Изучение взаимодействия Bdellovibrio с жертвой в

матриксе носителя 65

ГЛАВА 6. Иммобилизация Bdellovibrio и бактерии- жертвы на поверхности гранулированных и волокнистых носителей 69

6.1.Изучение адгезивной способности Bdellovibrio и жертвы в отношении различных носителей. 69

6.2.Влияние времени экспозиции, температуры, pH и плотности бактериальной суспензии на связывание клеток двухкомпонентной системы с носителем. 70 6.3.Определение удельной емкости АУВМ-3. 73

6.4.Изучение взаимодействия Bdellovibrio и жертвы на поверхности АУВМ-3 77

6.5.Изучение природы сил адгезии клеток двухкомпонентной системы на АУВМ-3. 81 ГЛАВА 7 Когезия клеток в периодической культуре Bdellovibrio - жертва. 86 7.1 .Динамика когезии бделлопластов в двухкомпонентной бактериальной системе. 86 7.2.Изучение агрегатной устойчивости двухкомпонентной системы 88 ГЛАВА 8 Иммобилизация Bdellovibrio как подход для разработки новых биотехнологических способов обеззараживания загрязненных вод. 98 8.1.Влияние интродукции Е coli на динамику численности

некоторых групп бактерий и Bdellovibrio микрокосмах in situ. 98

8.2.Влияние интродукции в сточные сооружения иммобилизованных на носителях клеток Bdellovibrio на динамику очистки воды. 100

8.3.Изучение декомтаминации загрязненной воды путем интродукции иммобилизованных на АУВМ -3

бделловибрионов в условиях непрерывного культивирования. 102 ОБСУЖДЕНИЕ 104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125

ВЫВОДЫ 129

ЛИТЕРАТУРА 131

Список сокращений, используемых в диссертации ДП - дрожжево-пептонная среда

ДП/4 , дрожжево-пептонная вода, разведенная в четыре раза МПА - мясопептонный агар МПБ - мясо-пептонный бульон ПААГ - полиакриламидный гель АА - акриламид МБА - метиленбисакриламид ТЕМЭД - МДчГДчГ1 Ы1 -тетраметилэтилендиамин АУВМ- (I, II, III) - активированный углеродно-волокнистый материал "Днепр" МН ПЭГ - полиэтиленгликоль ПАВ - поверхностно-активные вещества СРС - цетидилперидиниумхлорид Ь8 - лаурилсульфат натрия РР - пирофосфат натрия ЭМБО - диметилсульфоксид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований.

Bdellovibrio - хищные бактерии, рост и развитие которых осуществляется в периплазме грамотрицательных бактерий. Жизненный цикл бделловибрио-нов состоит из двух стадий - внеклеточной нерепродуктивной и внутриклеточной репродуктивной. Широкое распространение бактерий рода Bdellovibrio в природе, позволяет рассматривать их как составную часть природных микробоценозов. Установлена корреляция между численностью бделловибрионов и уровнем микробного загрязнения природных водоемов, что может служить косвенным подтверждением их активного функционирования и участия в регуляции численности грамотрицательных бактерий. В то же время прямое доказательство значимости и роли этой группы микроорганизмов в почвенных и водных микробоценозах оказалось весьма затруднительным. Априорно принималось, что взаимодействие хищных бактерий с жертвами осуществляется в водной фазе естественных местообитаний. Известно, что решающим фактором для размножения бделловибрионов в таких условиях является концентрация потенциальных жертв (Rittenberg, 1979), на несколько порядков превосходящая уровни численности грамотрицательных бактерий в водоемах и почве. Данные об экстремально высокой чувствительности Bdellovibrio во внеклеточной стадии к физико-химическим воздействиям (Varón a Shilo 1968; Fridberg, 1977) также не способствовали пониманию аспектов, связанных с выживанием и функциональной активностью этой группы бактерий в структуре бактериопланктона водных экосистем. Требовался иной подход, позволяющий объяснить не только факт широкого распространения хищников в природе, но и оценить характер их функционирования в естественной среде обитания.

Было сделано предположение, что жизнедеятельность Bdellovibrio в естественной среде обитания приурочена к границам раздела фаз, которые, как известно, аккумулируют на единицу площади в десятки тысяч раз большие количества микроорганизмов, чем в единице объема (Costerton et al, 1987;

Costerton, 1995). В литературе сообщалось о единичных случаях обнаружения хищных бактерий в биообрастаниях различных поверхностей, изъятых из морской среды, (Williams, 1987). Эти данные рассматривались как результат концентрации Bdellovibrio из водной толщи, и не увязывались со способом их жизнедеятельности на поверхностях. Нам представлялось, что иммобилизованные двухкомпонентные системы Bdellovibrio - жертва являются наиболее адекватной моделью для экспериментальной проверки выдвинутого предположения, в котором центральное место занимает доказательство процесса взаимодействия между хищником и жертвой.

В связи с актуальностью проблемы очистки окружающей среды от прогрессирующего загрязнения все большее значение приобретает поиск безопасных путей преодоления кризисных ситуаций. Широкий спектр литическо-го действия Bdellovibrio по отношению к грамотрицательным бактериям, высокий репродуктивный потенциал, отсутствие патогенности для человека, животных и растений, позволяет использовать бделловибрионы в разработке эффективных и экологически безопасных технологий обеззараживания загрязненных вод. Практическая реализация этого подхода в значительной мере сдерживается отсутствием надежных способов интродукции бделловибрио-нов в загрязненные источники, которые обеспечивали бы пролонгированное сохранение их жизнеспособности и функциональной активности. В данной ситуации иммобилизованные системы представляются одним из технологических путей решения проблемы интродукции Bdellovibrio.

В связи с изложенным, целью данной работы являлось изучение взаимодействия Bdellovibrio с жертвой в иммобилизованном состоянии и возможности использования бактериальных хищников, иммобилизованных на твердых носителях, для очистки загрязненных вод. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Разработать методы искусственной иммобилизации двухкомпонентной бактериальной системы на поверхности гранулированных и волокнистых носителей и в полиакриламидный гель.

2. Получить экспериментальное подтверждение осуществления процесса взаимодействия хищника с жертвой в иммобилизованном состоянии при адгезии на поверхности биологически инертных волокнистых носителей и при включении в полиакриламидный гель.

3. Выявить роль внутриклеточной стадии хищника в развитии Bdellovibrio в иммобилизованном на носителе состоянии и неблагоприятных для роста условий.

4. Исследовать влияние интродукции в сточные воды бделловибрионов, иммобилизованных на волокнистом носителе, на процесс очистки воды от бактериального загрязнения в модельных экспериментах in situ и в условиях непрерывного культивирования.

Научная новизна.

Впервые изучено поведение двухкомпонентной бактериальной системы хищник-жертва в иммобилизованном состоянии.

Установлено активное функционирование системы хищник-жертва в иммобилизованном состоянии. Показано осуществление процесса взаимодействия хищника и жертвы в гранулах ПААГ и на поверхности волокна. Методами электронной микроскопии были выявлены все стадии развития бделло-вибриона на поверхности носителя. Кроме того, выявлена особенность развития двухкомпонентной системы в иммобилизованном состоянии, выражающаяся в формировании особой разновидности покоящихся форм, организованных по типу цист с многоклеточным сложноструктурированным "ядром" с обширной полисахаридной оболочкой ("коллективная циста"). Образование подобных структур обнаружено и в периодической двухкомпонентной системе, что дает бделловибриону возможность закрепляться и развиваться на поверхности, а также переживать неблагоприятные условия среды. Иммобилизованное состояние обеспечивает бделловибриону пролонгированное сохранение жизнеспособности.

Впервые разработаны способы иммобилизации клеток двухкомпонентной системы в полиакриламидном геле и на поверхности гранулированных и во-

локнистых носителей. Подобраны благоприятные условия иммобилизации, которые обеспечивали активное функционирование иммобилизованной двух-компонентной системы. Иммобилизация бделловибрионов во внутриклеточной стадии развития обеспечивает больший процент выживаемости при включении в гранулы геля и адсорбции на поверхности активированного углеродно-волокнистого материала АУВМ-Ш клеток двухкомпонентной системы, по сравнению с иммобилизацией внеклеточных бделловибрионов.

Изучение иммобилизованных систем позволило установить, что инфицированные клетки бактерии-жертвы обладают повышенными гидрофобными свойствами по сравнению с интактными, что позволило бделловибриону активно взаимодействовать с твёрдой поверхностью. Гидрофобное взаимодействие является основным механизмом адгезии хищников на твердых поверхностях и когезии бделлопластов в суспензии клеток. Коиммобилизация Вс1е11оу1Ьпо во внутриклеточной стадии развития и бактерии-жертвы на различных носителях, при высокой прочности связывания, не исключает свободной миграции клеток в жидкую фазу.

На основе полученных данных предложена концепция иммобилизованной двухкомпонентной системы, как наиболее адекватной модели существования ВёеПоуШпо природе, позволяющая объяснить развитие бделловибрионов в природных условиях.

Практическая ценность.

Результаты работы представляют практический интерес в связи с перспективами использования бактерий -хищников как биологического способа очистки бытовых и сельскохозяйственных стоков. Интродукция иммобилизованных на волокне бделловибрионов в сточные воды вызывает ускорение процесса лизиса грамотрицательных бактерий. На основе иммобилизованных систем, с использованием бактерий рода ВёеПоуМэпо могут быть предложены безопасные для окружающей среды технологии по обеззараживанию загрязненных водоемов.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции "Биотехнология и биосинтез популяций" (Алма-Ата, 1991), на школе-конференции молодых ученых "Микробиология и биотехнология" (Алушта, 1991), на Международном симпозиуме по экологии микроорганизмов (Барселона, 1992).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 3 сообщения в тезисной форме.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Изложена на 151 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, иллюстрирована 25 рисунками. Список литературы включает 237 наименований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Характеристика бактерий рода Bdellovibrio.

В 1962 году при выделении бактериофагов из почвенных образцов, Штольпом и Петцольдом (Stolp a Petzold, 1962) были обнаружены на газоне тест бактерий необычные литические пятна, которые увеличивались в размерах с течением времени. Светооптический анализ материала пятна обнаружил маленькие, подвижные бактерии вибриоидной формы. Так были открыты бактерии рода Bdellovibrio, которые первоначально были описаны как экзо-паразиты и лишь спустя пять лет охарактеризованы как внутриклеточные паразиты грамотрицательных бактерий (Bergey's Manual, 1984). Хеспел с соавт. (Hespell et al., 1973) на основании данных о том, что необратимые изменения клетки хозяина, пораженной бделловибрионами (прекращение синтеза РНК, белка, деградация ДНК), предшествуют началу роста Bdellovibrio, предложили рассматривать взаимоотношения бделловибрионов с бактериальными клетками как хищничество. Клетки вибрионов имеют размеры 0,2-0,4 х 0,81,2 мкм, снабжены обычно одним полярным очехлённым жгутиком (Burnham et al, 1968; Seidler a Starr, 1968; Abram a Davis, 1970; Ламбина с соавт., 1973; Коновалова с соавт., 1977.), диаметр которого в 1,5-2 раза превышает диаметр жгутика других бактерий и составляет по данным разных авторов от 21-25 нм (Abram а Davis, 1970) до 28 нм (Seidler a Starr, 1968). В основании жгутика бактерий рода Bdellovibrio обнаружено базальное тело (Коновалова с соавт., 1977), ультраструктура которого по форме, размерам и строению (Thomashow а Rittenberg, 1985 a,b) имеет сходство с организацией аналогичных образований у других грамотрицательных бактерий и представляет систему колец, одетых на сердцевину жгутика. Однако в базальном теле бделловибриона отсутствует L-кольцо, находящееся в наружной мембране грамотрицательных бактерий (De Pamphilis а Adler, 1971), а имеется только кольцо, на уровне внутреннего слоя клеточной стенки, соответствующего Р-кольцу, а также терминальное и субтерминальное кольца, располагающиеся на уровне клеточной мембраны (Thomashow а Rittenberg, 1985 a,b), соответствующие S- и

М-кольцам других бактерий.

О происхождении чехла жгутика у бактерий рода Bdellovibrio в литературе имеются различные сведения. Большинство исследователей (Burnham et al., 1968, 1970; Seidler a Starr, 1968; Abram a Davis, 1970; Thomashow a Rittenberg, 1985 a,b), придерживаются точки зрения, что чехол жгутика является продолжением клеточной стенки бделловибриона. С другой точки зрения, очехлён-ный жгутик берет начало в цитоплазме и непосредственно связан с базальной везикулой (Ламбина с соавт., 1973; Коновалова с соавт., 1977).

Ультратонкая организация клеток Bdellovibrio при общем сходстве с другими грамотрицательными бактериями имеет свои отличительные черты. Так, например, внешняя поверхность цитоплазматической мембраны клеток Bdellovibrio покрыта рассеянными частицами диаметром 6-10 нм, тогда как у клеток Escherichia coli подобные частицы плотно упакованы. Контур внутреннего осмофильного слоя клеточной стенки хищника зубчатый в отличие от относительно гладких концов сколов этого слоя у E.coli (Abram а Davis, 1970). Центральную часть клетки занимает нуклеоид (Starr a Bagient, 1966; Ламбина и Иванчикова, 1973).

Геном большинства штаммов Bdellovibrio составляет 1/3 от размера генома клетки бактерии- жертвы (Seidler a Starr, 1968) и занимает около 2/3 общего цитоплазматического пространства бделловибриона (Starr а Bagient, 1966). В ДНК Bdellovibrio sp.OITH обнаружен