Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности цитологии новых хищных грамотрицательных ультрамикробактерий

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности цитологии новых хищных грамотрицательных ультрамикробактерий"

005532350

На правах рукописи

ПОЛИВЦЕВ А ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ЦИТОЛОГИИ новых хищных ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ УЛЬТРАМИКРОВАКТЕРИЙ

03.02.03 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

29 АВГ 2013

ПУЩИНО — 2013

005532350

Работа выполнена в лаборатории цитологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Дуда Виталий Иосифович

Официальные оппоненты: Головлева Людмила Алексеевпа

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, зав. лабораторией

Мулюкии Андрей Львович

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация Федеральное государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 26 » сентября 2013 г. в 10 часов 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru Автореферат разослан « / » июля 2013 г.

Ученый секретарь (

Диссертационного совета, ^ //

кандидат биологических наук / ' Васильева Н. В.

/

/ /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В настоящее время микробиологами получены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о существовании и широком распространении в природе ультрамелких форм бактерий с объемом клеток менее 0,1 мкм3, т.е. близким к теоретически рассчитанному минимальному размеру клеток (Workshop, 1999, Schut et al., 1997; Cavicchioli and Ostrowski, 2003, 2003; Panikov, 2004; Duda et al., 2011; Дуда с соавт., 2012). Имеются свидетельства того, что ультрамикробактерии (УМБ) являются составной частью микробных сообществ многих природных экосистем: они обнаружены в почвах, илах, льдах Гренландии, многолетнемерзлых грунтах, кишечнике человека и насекомых, ризосфере растений (Vancanneyt et al., 2001, Janssen et al., 1997, Iizuka et al, 1998, Miteva, Brenchley, 2005, Geissinger et al, 2009). Ультрамелкие бактериальные формы являются представителями домена Bacteria, где их ближайшими родственниками являются виды с более крупными, типичными для бактерий клетками, что указывает на полифилетическое происхождение УМБ. Однако, несомненно, что таксономическое, физиолого-биохимическое разнообразие и экологическая роль в природе, а также происхождение УМБ - ещё слабо исследованная область микробиологии. Очевидно, что для изучения этого нового для исследователей аспекта мира микроорганизмов необходимы специальные подходы и инструментарий.

Мелким размерам клеток (объемом менее 0,1 мкм3) соответствуют малые размеры геномов - от 3,2 до 0,56 Mb. Высокая численность ультрамелких бактерий в морских экосистемах свидетельствует о существенном вкладе УМБ в формирование биомассы океана (Vancanneyt et al., 2001; Rappe et al., 2002). Изучение чистых культур УМБ показало, что они способны использовать в качестве субстратов различные органические соединения (Schut et al., 1993, 1995, 1997а, Giovannoni et al., 2005b), в том числе — полихлорированные бифенилы (May et al., 2008). Некоторые морские олиготрофные УМБ обладают протеородопсином и способны использовать в энергетическом метаболизме энергию солнечного света (Giovannoni et al., 2005а). Культивируемые формы УМБ характеризуются большим разнообразием морфологии, ультраструктурной организации, физиологии и биохимии. По строеншо клеточной оболочки УМБ разделяются на три группы: грамположительные, грамотрицательные и лишённые клеточной стенки.

Среди ультрамикропрокариот (УМП) ювестны паразитические представители УМБ, такие как Micavibrio admirandus, Bdellovibrio bacteriovorus, Mycoplasma genitalium (Abram et al., 1974, Ламбина с соавт., 1982, Fraser et al., 1995, Jurkevitch, Davidov, 2006J и ультрамикроархея - Nanoarchaeum equitans (Huber et al., 2002). Хищные УМБ (паразиты микроорганизмов) относятся к организмам различных филогенетических линий и являются одним из основных экологических факторов, формирующих структуру сообществ, управляющих микробным разнообразием (Jurkevitch, 2007). Среди их жертв есть как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии и даже эукариотические микроорганизмы. Однако цитологические аспекты паразитизма подробно изучались лишь у представителей семейства Bdellovibrionaceae (Abram et al., 1974).

В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН выделены уникальные хищные бактерии - Micavibrio admirandus (Ламбина с соавт., 1982) и Micavibrio aeroginosavorus (Ламбина с соавт., 1983), а недавно -четыре штамма грамотрицательных УМБ - NF1, NF3, NF4 и NF5. У штаммов NF1 и NF3 обнаружена способность к факультативному паразитизму на живых клетках цианобактерий Chlorogbeopsis fritschii АТСС 27193, Anabaena variabilis АТСС 29413, Nostoc muscorum sp. 3 и Spirulina sp. (Дуда с соавт., 2007). Показано, что при совместном культивировании УМБ и цианобактерий происходит адгезия УМБ к хозяйским клеткам, их проникновение внутрь клеток и лизис последних (Дуда с соавт,, 2007). Однако цитологические механизмы взаимодействия паразитических УМБ с гетеротрофными бактериями остаются слабо изученными.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы состоит в характеристике особенностей строения клеток новых ультрамикробактерий - штаммов NF1, NF3, NF4, NF5 и сравнительном анализе цитологических аспектов хищничества этих штаммов.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. Изучить особенности морфологии и ультраструктурной организации клеток исследуемых штаммов УМБ.

2. Охарактеризовать филогенетическое положение исследуемых штаммов NF4

и NF5.

3. С помощью методов электронной, флуоресцентной микроскопии и цитохимии изучить цитологические аспекты взаимодействия бактерий-хищников и бактерий-жертв.

Научная новизна работы

Впервые с помощью флуоресцентной, фазово-контрастной, электронной микроскопии и электронно-цитохимических методов изучена ультраструктурная организация, циклы развития и этология новых хищных У МБ - штаммов Kaistia sp., NF1, NF3 и Chryseobacterium sp., NF4 и NF5.

Установлено, что: 1) изученные штаммы NF4 и NF5 представлены неподвижными клетками с грамотрицательной организацией оболочек; 2) клетки штаммов NF1, NF3, NF4 и NF5 репродуцируются как путём поперечного деления, так и почкования; 3) уникальной цитологической особенностью штаммов NF1 и NF3 является наличие на их клеточной поверхности конусовидных периплазматических протрузий, выполняющих функцию прикрепления к оболочкам хозяйских клеток; 4) клетки всех изученных штаммов УМБ обладают поверхностной сетью, состоящей из длинных полисахаридных нитей, которые снабжены гранулами (узелками), расположенными по всей длине нитей с интервалом =20 нм; 5) обнаружена способность исследуемых штаммов к эпибионтному факультативному хищничеству на некоторых грамотрицательных и грамположительных бактериях.

Показано, что взаимодействие хищных клеток с жертвами происходит при помощи неизвестных ранее механизмов с участием таких клеточных структур, как полисахаридные сети, обладающие особыми гранулами (узелками), и протрузии — конусовидные адгезивные выступы клеток у штаммов NF1 и NF3. Использование этих адгезивных структур, а также сил броуновского движения в процессе взаимодействия с клетками-жертвами является особенностью этологии изученных ультрамикробактерий.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в настоящей работе результаты имеют большое не только теоретическое, но и прикладное значение. Изученные штаммы УМБ могут служить модельными организмами в проводящихся исследованиях, посвященных решению как теоретических проблем минимализации микробной клетки, эволюции УМБ, так и в биотехнологических разработках, основой которых может быть обнаруженная паразитическая активность охарактеризованных нами УМБ. Полученные нами

результаты используются при чтении курсов лекций по цитологии микроорганизмов для магистрантов Пущинского государственного естественно-научного института и студентам Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Апробация материалов работы

Результаты и основные положения работы представлены на международной конференции FEMS (4th FEMS Congress of European Microbiologists, Geneva, Switzerland, 2011), на международной конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008, 2010, 2012, 2013), международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), всероссийском, с международным участием, биологическом конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз Россия 2008» и школе - конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008, 2010), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2010), атакже на семинарах и постерных сессиях ИБФМ РАН (Пущино, 2008-2011).

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 9 - в форме тезисов, 4 - экспериментальные статьи и 1 обзор.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Есиковой Т.З., к.б.н. Акимову В.Н., к. б.н. Шороховой А.П., Гафарову А.Б. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Дуде В.И. и к.б.н. Сузиной Н.Е.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 175 ссылок, из них 29 на русском и 146 на английском языках, содержит 5 таблиц и 43 рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали штаммы УМБ: NF1, NF3, NF4 и NF5. Штаммы NF1 и NF5 выделенные из образца нефтешлама Нижнекамского нефтекомбината (Татарстан), штамм NF3 - из ризосферы растения Pedilanthus tithymaloides, а штамм NF4 - из ила озера Байкал. В качестве тест-объектов для выявления паразитического действия УМБ использовали бактерии: Bacillus subtilis

штамм АТСС6633, и Acidovorax delafieldii 39, выделенный из ила озера Байкал и охарактеризованный в лаборатории цитологии микроорганизмов ИБФМ РАН.

Бактерии культивировали в жидкой или на агаризованной среде 5/5, минеральной среде М9.

Общие микробиологические и молекулярно-генетические таксономические исследования проводили принятыми методами (Sambrook et al., 1989; Wheeler et al., 1996; De Bruijn, 1992).

Гены 16S pPHK амплифицировали с помощью ПЦР и универсальных бактериальных праймеров 27F и 1492R, секвенировали с использованием Beckman-Coulter CEQtm 2000XL DNA Analysis System. Для филогенетического анализа в TREECON использовали почти полные последовательности генов 16S рРНК.

Для выявления антагонистических взаимоотношений УМБ с хемоорганотрофными бактериями применяли метод посева культур на поверхность агара в виде пересекающихся штрихов и луночно-диффузионный метод.

Наличие и тип паразитической активности УМБ определяли по результатам микроскопического анализа, выраженности и прочности адсорбции клеток УМБ на бактериях-жертвах, лизису клеток тест-организмов и игнгибиции спорообразования в бинарных культурах. Изучение объектов в фазово-контрастном режиме проводили в световых микроскопах OPTON ICM 405 и ЛЮМАМ 2 (JIOMO, Россия). Для флуоресцентно-микроскопического анализа клетки в контрольных вариантах (монокультуры) опыта и в бинарных культурах окрашивали реактивом «Live/Dead» (Molecular probe) в течение 15 мин при 28°С. Препараты просматривали в микроскопе ЛЮМАМ (ЛОМО, Россия).

Для определения спектра утилизируемых субстратов и изучения некоторых биохимических особенностей исследуемых штаммов использовали Api-тесты (Api 20Е, Api 20 NE) (Biomerieux, France), следуя инструкциям производителя.

Качественный состав цитохромов в клетках изолятов определяли по дифференциальным спектрам поглощения и по спектрам первой производной согласно (Shipp W.S., 1972) на спектрофотометре Shimadzu UV-160. Анализ на наличие в клетках плазмидной ДНК осуществляли, используя модифицированный метод Экхардта (Eckardt Т., 1978). Мол. % Г+Ц в ДНК определяли методом термической денатурации. Состав жирных кислот устанавливали, используя хромато-масс-спектрометрический анализ на хромато-масс-спектрометре АТ-5975 Agillent

Technologies (США). Дыхательные хиноны анализировали в соответствии со стандартным методом Коллинза.

Электронно-микроскопические исследования проводили по общепринятым методикам. Биомассу клеток чистых или бинарных культур фиксировали 1,5% (v/v) раствором глутаральдегида в 0,05 М какодилатном буфере (pH 7,2) при 4 С° в течение 1 ч. После трехкратной промывки этим же буфером материал дополнительно фиксировали 1% раствором 0s04 в 0,05 М какодилатном буфере при 20°С в течение 3 ч. Для контрастирования полисахаридов клеточных стенок и вещества капсул применяли глютар-осмиевую фиксацию в присутствии рутениевого красного (Luft J.H., 1964). После дегидратации материал заключали в эпон 812 и делали ультратонкие срезы на ультратоме LKB III (Швеция). Срезы монтировали на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, и контрастировали 3% раствором уранилацетата в 70% этаноле в течение 30 мин., а затем окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds Е., 1963) при 20°С в течение 4-5 мин при 20°С. Препараты интактных бактериальных клеток негативно контрастировали 0,2% водным раствором уранилацетата. Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-100В при ускоряющем напряжении 60 кВ.

Для изучения применяли методы, описанные в работе ГаейраГ. (Гайер, 1974).

Методы исследований подробно описаны в диссертационной работе и публикациях.

Штаммы №1 и 1ЧЕЗ. Установлено, что в цикле развития штамма №1 и №3 образуются два типа клеток: кокковидные, имеющие в диаметре 0,4 - 0,8 мкм, и ультрамелкие - с диаметром 0,2 - 0,3 мкм. (Поливцева с соавт., 2007). Ультрамелкие клетки образуются в процессе почкования (рис. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Морфология н ультраструктура новых штаммов УМБ

Рис. 1. Множественное почкование ультрамелких клеток штамма NF1. Н - нуклеоид; Пт -

перетяжка.

Цитометрия на уровне ультратонких срезов позволила выявить 4 фракции ультрамелких клеток, выраженные в объемных величинах (мкм3) (рис. 2). В популяции редко встречаются клетки объемом более 0,1 мкм3, они составляют менее 1% от общего числа клеток (на диаграмме не представлены).

количество клеток, %

1(10 90 80 70 60 50 40 30 21) 10 0

(1,09-0.1

0,(14 - 0.05

ооъем клеток, мкм

Рис. 2. Фракционная структура популяции клеток штамма NF1 2-х сут. культуры, выросшей на среде 5/5.

Морфологической и ультраструктурной особенностью клеток изучаемых штаммов является наличие на их поверхности конусовидных или сферических протрузий (рис. 3). Протрузии покрыты наружной мембраной и заполнены периплазматическим веществом, поэтому эти структуры названы нами периплазматическими протрузиями (Поливцева, 2008), в отличие от простек, включающих в себя как периплазму, так и цитоплазму. Протрузии могут служить в качестве адгезивных структур, участвующих в прикреплении клеток NF1 и NF3 к клеткам жертв.

рШЩ I Рис. 3. Ультратонкий срез клетки штамма NF1 нм Щ из 2-х суточной культуры, выросшей на агаризованной среде 5/5. НМ - наружная мембрана; ЦМ - цитоплазматическая мембрана; ПП - периплазматические протрузии; П -периплазма; M - муреин; Пч - почка; Пт -перетяжка.

Клетки штаммов NF1 и NF3 в бинарных культурах с клетками жертв образуют на их поверхности сеть, состоящую из тонких полисахаридных фибрилл длинной -30 - 40 нм и толстых тяжей — сплетений тонких фибрилл длинной -20 - 30 нм,

7

расположенных перпендикулярно к поверхности клетки (рис. 4). Эти структуры хорошо контрастируются рутениевым красным - электронномикроскопическим контрастером полисахаридов (Гайер, 1974). Характерным признаком тяжей является расположение на них электронноплотных узелков-гранул величиной -15 - 50 нм с интервалом около 20 - 60 нм.

Рис. 4. Фрагменты ультратонкого среза клеток штамма NF1 фиксированных рутениевым красным. Видны полисахаридные нити (ПН) и узелки (У) на них.

Штаммы NF4 и NF5. При росте на агаризованных среде 5/5 штаммы NF4 и NF5. образуют жёлтые (NF4) или жёлто-коричневые (NF5) слизистые колонии диаметром 2-4 мм. Клетки имеют сферическую, овальную или бобовидную формы или вид коротких палочек (коккобациллы) (рис. 5). Их размеры: 0.2 - 0,4 мкм х 0,2 -0,5 мкм. Объем клеток составляет в среднем от 0,004 до 0,04 мкм3. Среди них значительную часть (30 — 60%) составляют мелкие кокки с диаметром 0,18 - 0,3 мкм и объемом 0,004 - 0,02 мкм3.

Рис. 5. Вид клеток штамма NF4 в 4-сут (а), суточной (б) и 2-сут (в) культурах при росте в жидкой среде 5/5 при 28°С. Морфология клеток штамма NF5 была схожей в тех же условиях культивирования. Фазовый контраст. Стрелками показаны места деления клеток и их расхождение на коккоидные элементы.

8

Особенности роста и цикла развития изолятов выражаются в длительной лаг-фазе (48 час) и протяженной постстационарной стадии развития без резкого снижения числа жизнеспособных клеток.

Размножение штаммов NF4 и NF5 происходит различными путями: 1) отделением на полюсах палочковидных клеток мелких кокковидных особей, 2) почкованием кокковидных и палочковидных клеток, 3) септирование палочковидных клеток на множество кокковидных особей, 4) редко - бинарным делением палочковидных клеток. Множественность типов репродукции обусловливает большой морфологический полиморфизм культур этих штаммов.

На ультратонких срезах видно, что оболочка клеток у штаммов NF4 и NF5 имеет грамотрицательный тип строения; в ней выявляются: а) наружная мембрана клеточной стенки, б) муреиновый слой и в) периплазматическая зона (рис. 6). Отсутствуют мезосомы; характерные для грамположительных бактерий. Вывод о грамотрицательном типе организации клеток подтверждается положительным тестом с 3% КОН. Кроме того, при окраске интактных клеток по методу негативного контрастирования выявляется муаровая структура поверхности клеток, она покрыта множеством извилин, что характерно для многих грамотрицательных бактерий.

Рис. 6. Ультратонкие срезы клеток штамма NF4 из 2-х сут. культуры, выросшей на агаризованной среде 5/5. Н - нуклеоид; НМ - наружная мембрана, ПН - полисахаридные нити; У - узелки у полисахаридных нитей; ЦМ - цитоплазматическая мембрана. М - муреин; Пф -гранулы полифосфатов.

На срезах клеток нуклеоид хорошо выявляется в виде центрально расположенных крупных светлых (электроннопрозрачных) зон, заполненных фибриллами ДНК и окруженных тонким слоем электронноплотной цитоплазмы (рис. 3). По объёму нуклеоид составляет 3/4 части цитоплазмы. У палочковидных клеток нуклеоид имеет вид тяжа, расположенного вдоль длинной оси клетки от одного полюса к другому, его визуальный размер превосходит в несколько раз величину нуклеоида кокковидных клеток. Клетки обоих штаммов неподвижны, что

подтверждается данными фазово-контрастной микроскопии клеток из жидких среда, а также тем, что жгутики, фимбрии, спины, рапидосомы и другие подобные им нитчатые поверхностные структуры не были обнаружены на электронно-микроскопических фотографиях.

Электронно-микроскопический анализ препаратов клеток штамма №4 показал, что они окружены обширной сетью, состоящей из нитей и небольших электронно-плотных гранул на них. Нити имеют вид тонких одиночных фибрилл или сплетённых из них жгутов, предположительно состоящих из вещества полисахаридной природы (рис. 7).

Высокий контраст узелков полисахаридной сети у штамма №4 на ультратонких срезах при использовании стандартной глютар-осмиевой фиксации образцов обусловлен высоким сродством к тетраокиси осмия, что, в свою очередь может указывать на наличие липидов в этих структурах. В качестве контроля в данном случае могут служить срезы, приготовленные без использования осмия в качестве контрастера для цитохимических исследований. Анализ таких неконтрастных срезов позволяет сделать вывод о положительной роли тетраокиси осмия для выявления липидный структур.

Рис. 7. Ультратонкий срез клетки шт. ЫР4. Клетки фиксированы в присутствии рутениевого красного. У - липкие узелки и ПН - полисахаридные нити.

JllШжfШI 1 5 мкм ЦРРЕ-

Измерения на негативно контрастированных препаратах (рис. 8) позволили установить, что наиболее тонкие нити имеют толщину ~5,5 - 6,0 нм, а пучки нитей -18-35 нм. Узелки выглядят как округлые гранулы с зернистой ультраструктурой и диаметром -25 нм. Гранулы нанизаны на нити в виде бусинок с интервалом ~ 50 -100 нм. Нити без узелков являются, по-видимому, полисахаридами слизи, обильно синтезирующейся штаммами №4 и на что указывает слизистая консистенция

колоний и плохая осаждаемость клеток (особенно штамма при

центрифугировании (1 ООООд, 20 мин).

Рис. 8. Полисахаридные нити с узелками в 3-х суточной культуре штамма NF4 из 2х суточной культуры на плотной среде 5/5. Негативное контрастирование уранилацетатом. ПН - полисахаридные нити, У - узелки на полисахаридных нитях.

2. Физиолого-биохимические свойства новых штаммов УМБ

Штаммы NF1 и NF3. Уникальной физиологической особенностью этих штаммов является их способность к факультативному хищничеству на некоторых бактериях (см. главу «Хищничество новых штаммов УМБ...»). Физиолого-биохимические свойства штаммов NF1 и NF3 были рассмотрены в работе Дуды с соавторами (Дуда с соавт., 2007).

Штаммы NF4 и NF5. Эти штаммы являются аэробными и психротолерантными бактериями; хемоорганотрофами. В качестве источника углерода и энергии используют цитрат натрия и узкий спектр аминокислот; другие углеводы - моно- и дисахариды, пентозы, гексозы, спирты, а также N-ацетил-глюкозамин не поддерживают роста. Полимерные органические соединения - белки, липиды, полисахариды (целлюлозу, муреин, агар, пектин) не разлагают и не усваивают, что свидетельствует об отсутствии у изолятов ряда существенных внеклеточных гидролаз (см. табл. 3,4 Диссертации).

3. Филогенетическое положение новых штаммов УМБ

Ранее на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штаммы NF1 и NF3 были отнесены к роду Kaistia, относящегося к классу а-Proteobacteria (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2005) и близки к типовому штамму Kaistia adipata Chj404T (AY039817) (Дуда с соавт., 2007). В настоящей работе мы впервые приводим филогенетическое дерево (рис. 9), которое демонстрирует положение штаммов NF1 и NF3 среди близких родов почкующихся и простековых а-Proteobacíeria: Proslhecomicrobium, Labrys, Angulomicrobium, Hyphomicrobium, Pedomicrobium.

nf3

100

1 nf1

Kaistia adipata AY039817 Kaistia granuli AB244762

Prosthecomicrobium pneumaticum ABO 17203

Labrys monachus AJ535707

к

100

Ancyclobacter aquaticus M62790

— Anguloniicrobium tetraedrale AJ535708

— Rhodoplanes roseus D25313

Blaslochloris sulfoviridis D86S14

100

100

-Rhodopseudomonas palustris D25312

Microvirga subterranea AY078053

-Methylobacterium organophilum D32226

-Hyphomicrobium chloromelhanicum AFI98623

Filomicrobium fusiforme Y14313

-Pedomicrobium australicum X97693

- Rhodomicrobium vannielii M34127

Aurantimonas coralicida AY065627

Рис. 9. Филогенетическое дерево, характеризующее положение штамма NF1 и NF3 среди близких видов рода Kaistia и некоторых других родов a-Proteobacteria.

Штаммы NF4 и NF5, очень близки между собой как по содержанию Г+Ц в ДНК (40,8 мол % у шт. NF4 и 40,5 мол % у шт. NF5), гомологии их ДНК, близкой к 100% , а также по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (100%). Большинство фенотипических признаков у этих штаммов аналогичны. Следовательно, штаммы NF4 и NF5 принадлежат к одному виду. По ряду описанных фенотипических признаков, профилю клеточных жирных кислот, составу оснований в ДНК и нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штаммы NF4 и NF5 близки к представителям рода Chryseobacterium филума Bacteroidetes (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2011): C. solincola , C. antarcticum и С. jeonii. (Vancanneyt et al., 2001) (рис. 10).

83

С. soli (EF591302)

ч:

100

- "С protertyticum " (ЛВ1139830)

С. soldanellieola (AY883415)

- strain LMB 10 (DQ147564) С. aquaticum [АМ748690)

С. mdolthettcum (AY468448) С. scophthaímum (AJ27I009) С. piscium (АМ040439) С. balustinum (AY468447)

- С. dueguense (EF076759)

- С. jeujiiense (EF59J303)

- С. Iiileum (АМ489609) C.JooMri ÍA.I27 НПО)

С. тигЫит (EF554366]

100

strain NF4

С. solîncola (EU516352) С. jeoilii (AY553294)

- С. antarcticum (AY553293)

С. hispanicum (AM1S9I83) — С. í»»tt (EF204446)

ч

- С. knreense (AF344179)

С. haifense (ЕК204450) С. aníhropi (АМ982786)

- Riemerellct columbina (AF18I448)

- Bcrgeyella zotthelciim (M93153)

Рис. 10. Филогенетическое дерево, характеризующее положение штамма NF4 среди близких видов рода Chryseobacteriam.

При изучении геномов было обнаружено, что размер генома у штаммов NF1 и NF3 составляет ~ 2,4 Mb, а у штаммов NF4 и NF5 - 1,7 Mb. Эти величины согласуются с уже известными величинами геномов, свойственных ранее описанным в литературе свободноживущим олиготрофным УМБ, таким как Sphingopyxis alaskensis, Candidatus Pelagibacter ubique и Micavibrio aemginosavorus, величины геномов у которых составляют 3,4 Mb (Lauro et al., 2009) и 1,3 Mb (Giovannoni et al., 2005), 2,5 (Wang et al., 2011) соответственно.

4. Хищничество новых штаммов УМБ: адаптации на ультраструктурном уровне

Ранее у штаммов NF1 и NF3 обнаружена способность к факультативному паразитизму на живых клетках цианобактерий (Дуда В. И. с соавт., 2007). Для выявления спектра возможных бактерий-жертв этих штаммов, а также изолятов NF4 и NF5 проводили тестирование антагонистической активности по отношению к аэробным гетеротрофным бактериям. Наиболее чувствительными к действию паразитов оказались тест-объекты В. subtilis АТСС 6633 и A. delafieldii 39.

Изучение ультратонких срезов показало, что клетки А. с1е1сфеМи 39 имеют типичную для грамотрицательных бактерий организацию. Оболочка клеток состоит из цитоплазматической мембраны, слоя пептидогликана или муреина, наружной мембраны и покрывающего ее (в один слой) Э-слоя (рис. 11).

Клетки грамположительной бактерии-жертвы В. зиЫШэ АТСС 6633, также характеризуются наличием 8-слоя на внешней поверхности клеточной стенки. Ультраструктурная организация Б-слоя В. яиЬйШ АТСС 6633 легко выявляется на ультратонких срезах клеток, фиксированных в присутствии рутениевого красного, что выявило наличие полисахаридного компонента в составе Э-слоя (рис. 12).

мембрана; M - муреин.

Исследование взаимодействия клеток штамма NF1 с гетеротрофными бактериями

На первых этапах взаимодействия культур в бинарных системах в среде без источника углерода происходит прикрепление клеток штаммов NF1 к клеткам как В. subtilis АТСС 6633, так и A. delafieldii 39. Этот процесс хорошо детектируется методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии (рис. 13).

Методом посева штамма NF1 и тест-объектов на богатую питательную среду 5/5 в виде пересекающихся штрихов было выявлено, что штамм NF1 вызывал ингибирование роста В. subtilis АТСС 6633 и A. delafieldii 39. В местах пересечения

Рис. 11. Ультратонкий срез клеток А. delaf^eldii штамм 39 в экспоненциальной фазе роста. Э - Э-слой клеточной стенки; НМ - наружная мембрана; ЦМ - цитоплазматическая

Рис. 12. Ультраструктурная организация поверхности клеток В. эиЫШя АТСС 6633. (а и б - фрагменты ультратонких срезов).В.е. - клетка В.^ зиЫШь.

штрихов на 2 - 3 сутки роста наблюдалось уменьшение объема биомассы и лизис клеток тест-объектов. Микроскопические исследования взаимодействующих бактерий показали, что клетки штамма NF1 плотно прикреплены к поверхности клеток тест-объекта.

Деградативные изменения, выражающиеся в просветлении цитоплазмы, нарушении ригидности и частичном разрушении клеточной оболочки в клетках-жертвах начинаются с 6 часа взаимодействия. В то же время клетки паразита сохраняются лучше и размножаются.

Анализ препаратов, окрашенных реактивом "Live/Dead", показал, что клетки штамма NF1 прикрепляются только к живым клеткам жертвам (флюоресцируют зеленым цветом) (рис. 13)

V УМБ - r-fVj-,

. 1" ш 1 ^J^k ^ЯИ

1MB—Hj * *кж Ф «S v.-i?*-\>-- TV <1* - У,'J

Рис. 13. Фазово-контрастный (а) и флуоресцентно-микроскопический (б) снимки клеток бинарной культуры NF1 и Bacillus subtilis после инкубирования кокультуры в течение 1 часа. КЖ-клетки бацилл; NF1 - клетки ультрамикробактерий

Особо следует отметить, что присутствие клеток штамма NF1 в бинарных культурах оказывает сильное ингибирующее действие на спорообразование клеток бацилл, задерживая на трое суток начало этого процесса и уменьшая количество образующихся спор.

Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов клеток в бинарных культурах штамм NF1 и В. subtilis АТСС 6633 и штамм NF1 и А. delafieldü 39 позволил выявить ультраструктурные детали прикрепления клеток штаммов NF1 и NF3 к оболочкам клеток - жертв. Для клеток штамма NF1 в бинарных культурах с бактериями жертвами характерно наличие обширного периплазматического пространства и большого числа периплазматических протрузий (рис. 14).

Клетки штамма NF1 взаимодействуют с клетками-жертвами путем образования плотных контактов между наружной мембраной штамма NF1 и S-слоем оболочки

клеток В. .чиЫШх АТСС 6633 и А. с1е1сфеШИ 39. Вначале наблюдается установление межклеточных контактов в местах прилегания протрузий штамм №1 вершинами их конусовидных или сферических образований к поверхности клеточной стенки клеток-жертв. Затем периферическая часть периплазматических протрузий в местах контакта немного уплощается, в результате чего протяженность контактирующих поверхностей на ультратонких срезах может достигать 15 нм и более (рис. 14 а, г). В местах контактов выявляются следующие локальные изменения в структуре клеточных стенок В. хиЫШя АТСС 6633: а) лизис небольших участков клеточной стенки (сопоставимых с протяженностью контактирующих поверхностей) (рис. 14в); б) просветление участков клеточной стенки В. ятлЫИк АТСС 6633 на протяжении всей ее толщины в местах контактов; в) значительные комплексные деструктивные изменения в местах межклеточных контактов, затрагивающие все периферические клеточные структуры: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану и цитоплазму (рис. 14); г) в некоторых случаях в местах контактов можно наблюдать образование каналов между оболочкой протрузии и клеточной стенкой клеток В. эиЫШя АТСС 6633 (рис. 146).

Рис. 14. Ультратонкий срез взаимодействующих клеток в бинарной культуре №1 + В. зиЫШэ. АТСС 6633. КЖ - клетка-жертва; МК - места контактов. С - субъединицы Э-слоя клетки- жертвы; НМ — наружная мембрана. КС - клеточная стенка; ПП -периплазматические простеки; №1 -клетки штамма № 1. Через 7-10 суток описанные процессы приводят к лизису значительной части клеток популяции бацилл и А.с1е1сфе1с1И 39, что подтвердилось экспериментами по динамике снижения КОЕ, результаты которых представлены на (рис. 15).

11,00Е+11 ¡2 1.00Е+10

о

'А 1.00Е+09

I.00E+08

1.00Е+07 -О

Рис. 15. Динамика изменения численности клеток штамма NF1 и В. subtilis АТСС 6633 в моно- и бинарных культурах в фосфатном буфере: 1 - шт. NF1, монокультура; 2 - шт. NF1, бинарная культура; 3 - В. subtilis АТСС 6633, монокультура; 4-5. subtilis АТСС 6633, бинарная культура.

Особо следует отметить, что присутствие клеток штамма NF1 в бинарных культурах оказывает сильное ингибирующее действие на спорообразование клеток В. subtilis АТСС 6633, задерживая на трое суток начало этого процесса и уменьшая количество образующихся спор (рис. 16).

Рис. 16. Образование спор (в %) В. subtilis АТСС 663 в монокультуре (контроль) и при росте в бинарной культуре со штаммом NF1 (опыт).

Исследование взаимодействия клеток штаммов NF4 с гетеротрофными бактериями

Клетки штаммов NF4 и NF5 способны прочно прикрепляться к клеткам В.

subtilis АТСС 6633 в бинарных культурах при росте, как в жидких, так и на плотных

питательных средах, а также в клеточных суспензиях, приготовленных на стерильной

водопроводной воде, либо на фосфатном буфере.

Конъюгированные клетки не разъединяются ни под воздействием токов воды в

препарате, ни при встряхивании и центрифугировании суспензий, что

17

15 сутки 20

свидетельствует о прочности когезии клеток. К одной клетке В. ¡иЬ/Шв АТСС 6633 может быть прикреплено от 2 - 3 до нескольких десятков клеток УМБ (рис. 17).

Рис. 17. Взаимодействующая культура штамм ИР4 и В. зиЫШз АТСС 6633 в течение 20 мин (а), 7 суток (б) и 20 суток (в). Фазово-контрастная микроскопия. УМБ - клетки ультрамикробактерии №4; В.е. - В. яиЬНШ АТСС 6633; С - споры.

Электронно-микроскопические исследования позволили обнаружить, что клетки УМБ прикрепляются к поверхностным субъединичным 8-слоям В. зиЫШв АТСС 6633, причем в местах прикрепления формируется несколько пластинок из СС в виде стопок (рис. 18). Как показали наблюдения за смешанными суспензиями клеток, процесс адгезии происходит очень быстро - через 10 - 15 мин после объединения культур более 50% живых клеток В. яиЫШз АТСС 6633 уже содержали прочно прикрепившиеся к ним клетки УМБ. Активно взаимодействуют с В. бнЫШя АТСС 6633 наиболее ультрамелкие клетки УМБ.

Рис. 18. Ультратонкий срез клеток из бинарной культуры ЫБ4 и В. хиЬНИ.ч АТСС 6633.

УМБ - ультрамикробактерии, Б - Б-слой клеточной стенки В. эиЫШв АТСС 6633,

КЖ - клетка жертва В. яиЬННй АТСС 6633.

Подсчет численности клеток-хищника и клеток-жертвы, как в бинарной культуре, так и монокультуре проводили в течение почти двух недель роста. В случае с бинарной культурой, содержавшей вначале опыта 1,1-109 КОЕ/мл ОТ4 и 3,8-107 КОЕ/мл В. зиЫШэ АТСС 6633, численность КОЕ В. хиЬИШ АТСС 6633 снижалась на 3 - 5 сутки примерно в 5 - 6 раз, численность КОЕ изученных УМБ в этих условиях возрастала (рис. 19). Поскольку в данном варианте опытов в среду не добавлялись пищевые субстраты, рост УМБ мог поддерживаться только за счет субстратов, синтезируемых В. яиЫШз АТСС 6633.

Рис. 19. Динамика развития штаммов NF4 и В. subtilis АТСС 6633 в моно- и бинарных культурах в фосфатном буфере: 1 - шт. NF4, монокультура; 2 - шт. NF4, бинарная культура; 3-5. subtilis АТСС 6633, монокультура; 4-5. subtilis АТСС 6633, бинарная культура. Исследования фазово-контрастной микроскопии, так же как и наблюдения с помощью флуоресцентной микроскопии с применением двухкомпонентного красителя Live/Dead показали, что в бинарных суспензиях клетки 5. subtilis АТСС 6633 (с прикрепленными к ним УМБ) длительное время оставались живыми, и только часть из них подвергалась глубокой деструкции.

Под воздействием штамма NF4 у 5. subtilis АТСС 6633 происходили нарушения процесса спорообразования, также как в случае штамма NF1: около 60% образовавшихся спор были недозревшими - темными в фазово-контрастном микроскопе, а не блестящими (как это свойственно нормальным зрелым спорам).

Таким образом, штаммы NF1, и NF4 можно определить как факультативные паразитические эпибионты или эктопаразиты (хищники). Они способны прикрепляться к поверхности клетки хозяина, образовывать при этом плотный контакт между оболочками и расти на этих клетках. Такой способ существования не является для них обязательным и исследуемые штаммы УМБ способны к свободному росту за счёт использования ограниченного набора органических соединений.

5. Цитохимическое изучение адгезивного аппарата клеток хищников Изучение взаимодействия клеток штамма NF1 п A. delajieldii 39 Полисахаридная сеть с узелками (гранулами) штамма NF1 хорошо визуализируется при окрашивании рутениевым красным, как и в случае монокультуры штамма NF1 (рис. 4), так и в бинарной культуре, представленной смесью штаммов NF1 и A. delafieldii 39. К каждой клетке A. delafieldii прикреплено более десятка узелков (рис. 20).

о 2 4 6 8 10 12

Рис. 20. Ультратонкие срезы клеток из взаимодействующей бинарной культуры - штамм ОТ1 + А. ¿екфеШИ 39. УМБ - клетки штамма №1; КЖ - клетки А. с/е1а/1е1сШ 39; ПН - полисахаридные нити; У - «липкие» узелки; в -Б-слой клетки-жертвы. Изучение взаимодействия клеток штамма ОТ4 и В. яиЬИШ АТСС 6633 Анализ ультратонких срезов бинарной культуры №4 + В. зиЫШв АТСС 6633, окрашенных рутениевым красным, позволил сделать вывод, что в процессе взаимодействия происходит «захват» клетки-жертвы полисахаридными нитями, образуемыми штаммом ОТ4 (рис. 7). Но узелки, хорошо выявляющиеся в бинарной культуре №1 и А. с!е1а/1еШ 39, визуализируются слабее. Возможно при фиксации и заливке клеток часть вещества, входящего в состав узелков удаляется.

Эксперименты по изучению взаимодействующих культур в динамике показали что, полисахаридная сеть, которую образуют клетки УМБ, претерпевает некоторые изменения. На начальных этапах взаимодействия полисахаридные нити незначительны и служат в качестве ловчих сетей (рис. 21).

Через несколько часов взаимодействия культур полисахаридные нити плотно охватывают поверхность клетки-жертвы. В результате клетка В. зиЫШх АТСС 6633 покрывается полисахаридной сетью, причем местами происходит отрыв 8-слоя.

Рис. 21. Ультратонкий срез препарата бинарной культуры №4 и В. зиЪИШ АТСС 6633 после 2,5 часов взаимодействия. УМБ - клетки штамм КЖ -

клетки жертвы В. яиЬНШ АТСС 6633; ПН -полисахаридные нити

Окрашивание ультратонких срезов В. .чиЬШЬ АТСС 6633 спиртовыми растворами ФВК подтвердило обнаруживаемое другими методами электронной микроскопии наличие белковых структур (гликопротеиновых Э-слоев) на поверхности клеток В. хиЬИИз АТСС 6633 в виде слоистых структур, тангенциально ориентированные к поверхности клеток. Выявляемые этим методом Э-слои на ультратонких срезах выглядят намного тоньше и более однородны по толщине по сравнению с результатами общепринятых подходов с использованием рутениевого красного. В последнем случае 8-слои выявляются в результате контрастирования их полисахаридной составляющей.

Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов клеток штамма ЫБ4, приготовленных и контрастированных аналогичным образом, позволил выявить повышение электронной контрастности узелков-гранул. Эти данные позволяют сделать вывод о наличии белка в составе узелков полисахаридных нитей.

Окрашивание ультратонких срезов клеток во взаимодействующей популяции бактерии-жертвы В. аиЫШя АТСС 6633 и бактерии-хищника штамм КР4 водными растворами ФВК с нейтральными значениями рН также приводят к интенсивному контрастированию узелков межклеточной фибриллярной сети штамма №4 и поверхностного слоя клеточной стенки В. яиЬИШ АТСС 6633.

6. Цитохимическая локализация щелочной фосфатазы

Методом электронно-микроскопической цитохимии изучена локализация щелочной фосфатазы (ЩФ) в клетках штамма №1 как в монокультуре штамма №1, так и в бинарной культуре с В. шЬИНн АТСС 6633 (рис. 22). Локализация ЩФ определения по местам отложения в клетках фосфата свинца в результате гидролиза Ыа-Р-глицерофосфата.

Установлено, что продукт цитохимической реакции локализован преимущественно в периплазматическом пространстве внутри и на поверхности периплазматических протрузий (ГШ), характерных для клеток штаммов №1 и №3. В местах контакта ПП с поверхностью клеточной стенки клетки-жертвы продукт реакции выявляется также на внешней поверхности наружной мембраны.

Рис. 22. Ультратонкий срез клеток бинарной культуры яиЫШз

АТСС 6633 после проведения цитохимической реакции на щелочную фосфатазу. КЖ - клетки В. зиЬМз АТСС 6633; - клетки паразита штамм №1; Г1р -продукты реакции; ПП -периплазматические протрузии.

На бинарной культуре штамма №4 и В. показано, что продукт

цитохимической реакции на щелочную фосфатазу локализован преимущественно на поверхности клеток УМБ. Продукты реакции почти равномерно распределены по поверхности клетки штамма №4, как в случае проведения эксперимента с взаимодействующей культурой, так и в случае монокультуры штамма №4 (рис. 23).

Рис. 23. Ультратонкий срез клеток из бинарной культуры штамм №4 и В. ¡иЫШз АТСС 6633 (а) и монокультуры штамма №4 (б). УМБ - клетки штамма №4; КЖ - клетка-жертва В. яиЫШэ АТСС 6633/ Пр - продукт цитохимической реакции. 7. Механизм когезии клеток-хищника и клеток-жертв Полученные экспериментальные данные позволяют схематически представить особый механизм, обеспечивающий сближение, «причаливание» и прочное скрепление клеток так, как он показан на рисунке 24.

пн Л

/

У/

J5 i AiKVKV-

fcb. fc

1 Sj fei!

Рис. 24. Схематическое изображение механизма когезии клеток-хищника (X) и клеток-жертв (КЖ), функционирующего у хищных неподвижных ультрамикробактерий, основанного на использовании ими сети полисахаридных нитей (ПН), содержащих липкие гранулы-узелки (У).

В установлении контакта между взаимодействующими клетками, по-видимому, важную роль играют углевод-углеводные взаимодействия. Взаимодействие УМБ с клетками хемоорганотрофных бактерий - В. subtilis АТСС 6633 и А. delafieldii 39, не противоречит этому выводу, поскольку изученные бактерии обладают S-слоем, а, как известно, белки S-слоев бактерий могут быть гликозилированными (Sidhu, Olsen, 1997).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе изучены особенности морфологии, ультраструктуры клеток, физиологии и филогенетического положения новых штаммов УМБ - NF1, NF3, NF4 и NF5.

Результаты работы показали, что штаммы изучаемых микроорганизмов обладают следующими уникальными свойствами: 1) способностью образовывать ультрамелкие клетки с объемом менее 0,1 мкм3, в их числе и предельные мелкие клетки с объемом 0,004 - 0,02 мкм3, последние характерны для штаммов NF4 и NF5; 2) олиготрофностью: исследуемые штаммы в качестве источника углерода и энергии используют только узкий набор аминокислот; кроме того, они не способны разлагать и усваивать экзогенные сложные полимерные органические вещества - протеины, крахмал, целлюлозу, липиды; 3) способностью к эпибиозу - существованию в плотно прикрепленном состоянии к хозяйским клеткам В. subtilis АТСС 6633 и A. delafieldii

39. При этом наблюдается взаимодействие, характерное для системы хищник-жертва, поэтому можно определить исследованные штаммы, как факультативно-паразитические (хищные) бактерии-эпибионты. В этом проявляется дуализм их стиля жизни. Ранее было показано, что штаммы NF1 и NF3 способны также паразитировать на живых клетках некоторых видов цианобактерий (Дуда В. И. с соавт., 2007). Взаимоотношение штаммов NF4 и NF5 и цианобактерий ещё не изучено.

Было установлено филогенетическое положение штаммов NF4 и NF5. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. показал, что они относятся к филуму Bacteroidetes и наиболее близки к некоторым видам рода Chryseobacterium: С. solincola, С. antarcticum, и C.jeonii.

Определен размер генома у изученных УМБ: Kaistia sp., NF1 и NF3 он составляет ~ 2,4 Mb, а у Chryseobacterium sp., NF4 и NF5 - 1,7 Mb.

Анализ полученных данных о размерах бактериальных клеток штаммов NF1, NF3, NF4 и NF5 и величине их геномов позволил в соответствии с современными критериями сделать вывод о принадлежности исследуемых штаммов к ультрамикробактериям (УМБ).

Охарактеризованы ультраструктурная организация и цитобиохимические особенности новых штаммов УМБ. Было показано, что: 1) штаммам NF4 и NF5 свойственна характерная для грамотрицательных бактерий организация клеточной стенки (аналогичный вывод для штаммов NF1 и NF3 был сделан в работе (Дуда с соавт., 2007)); 2) клетки штаммов NF1 и NF3 имеют на своей поверхности протрузии - выступы сферической и конусовидной формы, которые представляют собой локальные расширения периплазматической зоны, вследствие чего они могут быть обозначены как периплазматические протрузии; 3) у клеток всех изученных штаммов не выявлены поверхностные нитчатые придатки - жгутики, фимбрии, пили, спины, рапидосомы и другие подобные им структуры; 4) на поверхности клеток исследованных штаммов выявляется полисахаридный матрикс, состоящий из сеточки полисахаридных нитей с прикрепленными к ним электронноплотными узелками в виде гранул. Нити хорошо контрастируются рутениевым красным - красителем для кислых полисахаридов.

При глютаральдегидной фиксации препаратов электронных контраст узелков-гранул полисахаридной сети был очень низкий, но он значительно повышался при использовании глютар-осмиевой фиксации, что очевидно обусловлено высоким

сродством узелков к тетраокиси осмия. Контрастирование осмием - известным красителем липидов - указывает на наличие липидов в этих структурах. Визуализация полисахаридных нитей (канатов) и узелков на негативно контрастированных препаратах подтвердила реальность этих структур и соответствие их вида с изображениями на ультратонких срезах.

Использование методов цитохимической детекции белков с помощью обработки спиртовым раствором ФВК позволило установить повышение электронной плотности гранул (узелков), что позволяет сделать вывод о наличии белка в составе этих структур.

Таким образом, применение методов цитохимии указывает на сложный состав ловчей сети и связанных с ней узелков-гранул. Ловчая сеть состоит из полисахаридных нитей, тогда как узелки имеют сложный вероятно белково-липидный состав. Полученные данные являются основой дальнейших планирующихся исследований по характеристике биохимического состава описанных структур.

Выяснены особенности межклеточных взаимодействий в системе: неподвижный бактериальный паразит + хозяин. Установлено, что бактериальные паразиты из родов Kaistia (штаммы NFIh NF3) и Chryseobacterium (штаммы NF4 и NF5) обладают особыми адгезивными клеточными структурами: ловчими полисахаридными сетями, нити которых снабжены множеством расположенных на них узелков, а также прикрепительными конусовидными протрузиями у клеток штаммов NF1 и NF3. С помощью этих структур осуществляются процессы улавливания (заякоривания) клеток, сближения и прочного прикрепления клеток хищников к жертвам. Уникальная особенность описанного механизма состоит в том, что для когезии используется подвижность клеток, обусловленная силами броуновского движения. Эти силы обусловливают последовательное прикрепление полисахаридных нитей к поверхности жертв, что полностью снимает потребности в энергетических затратах на улавливание жертв и стягивание клеток хищников и жертв.

Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что среди УМБ имеются формы с новыми, неизвестными ранее физиологическими свойствами и ультраструктурами.

Новый механизм межклеточного взаимодействия (когезии) существенно отличается от механизмов, функционирующих у известных подвижных бактериальных паразитов - хищников (например, представителей родов Bdellovibrio, Micavibrio, Ensifer, Cupriavidus), не обладающих специфическими адгезивными структурами, но использующих при взаимодействии с жертвами реакции хемотаксиса и жгутиковую подвижность.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что большинство клеток штаммов NF1, NF3, NF4 и NF5 представлены в развивающихся культурах ультрамелкими клетками, объемом менее 0,1 мкм3. Учитывая ультрамелкие размеры клеток и сравнительно небольшие размеры их геномов, выделенные организмы определены как ультрамикробактерии.

2. Установлено, что штаммы NF4 и NF5 принадлежат к филуму грамотрицательных бактерий - Bacteroidetes и роду Chryseobacterium.

3. Особенностью штаммов NF1, NF3, NF4 и NF5 является их способность к факультативному хищничеству на гетеротрофных бактериях - В. subtilis АТСС 6633 и A. delafieldii 39. Для бактерий родов Kaistia и Chryseobacterium образование ультрамелких хищных форм показано впервые.

4. Клетки исследуемых штаммов формируют капсулоподобный матрикс, образованный полисахаридными нитями и электронноплотными узелками-гранулами, расположенными на них. Показано, что отличительным признаком ультраструктурной организации штаммов NF1 и NF3 является наличие у их клеток протрузий.

5. Описан новый механизм когезии клеток хищников и клеток жертв, основанный на канатном принципе подтягивания клеток хищников к клеткам жертв, при котором в качестве молекулярных канатов служат полисахаридные нити, а источником внеклеточной толкательной энергии являются силы броуновского движения. Местом прикрепления полисахаридных нитей является S-слой клеточной стенки бактерии-жертвы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1) Сузина Н.Е., Есикова Т.З., Акимов В.Н., Абашина Т.Н., Дмитриев В.В., Поливцева В.Н., Дуда В.И., Воронин A.M. Электронно-микроскопическое и флуоресцентно-микроскопическое изучение эктопаразитизма ультрамикробактерий рода Kaistia, штаммов NF1 и NF3 // Микробиология. - 2008. - Т. 77. - С. 55-62.

2) Дуда В.И., Сузина Н.Е., Есикова Т.З., Поливцева В.Н., Воронин A.M. Новый механизм когезии клеток бактерий-хищников и бактерий-жертв // Доклады Академии Наук. - 2008. - Т. 422. - С. 841-844

3) Duda V.l., Suzina N.E., Esikova T.Z., Akimov V.N., Oleinikov R.R., Polivtseva V.N., Abashina T.N., Boronin A.M. The Cytological Characterization of Parasitic Action of Ultramicrobacteria NF1 and NF3 from the Genus Kaistia on Chemoorganotrophic and Phototrophic Bacteria // FEMS Microbiology Ecology. - 2009. - V. 69. - P. 180 - 193

4) Сузина H.E., Дуда В.И., Есикова T.3., Шорохова А.П., Гафаров A.B., Олейников P.P., Акимов В.Н., Абашина Т.Н., Поливцева В.Н., Воронин A.M. Новая ультрамикробактерия из рода Chryseobacterium - факультативный эпибионт Bacillus subtilis И Микробиология. - 20И. - Т. 80. - С. 529-542

5) Дуда В.И., Сузина Н.Е., Поливцева В.Н., Воронин А. М. Ультрамикробактерии: становление концепции и вклад ультрамикробактерий в биологию //Микробиология. -2012 . - Т. 81. - С. 415^27.

Тезисы

1) Поливцева В.Н., Сузина Н.Е., Дуда В.И. Цитологические основы взаимодействия бактерии рода Kaistia sp. штамма NF1 с грамположительными и грамотрицательными бактериями, Тезисы III Международной Молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва. - 2007. -С.89

2) Поливцева В.И. Цитология паразитизма бактерии Kaistia sp. штамма NF1 на некоторых грамположительных и грамотрицательных бактериях // I Всероссийский, с международным участием, биологический конгресс студентов и аспирантов «Симбиоз Россия 2008» и школа - конференция «Биология: традиции и инновации в 21 веке», - Казань . - 2008. - С.75

3) Поливцева В.Н. Цитологические аспекты паразитизма ультрамикробактерий Kaistia sp. штамм NF1 на некоторых грамположительных и грамотрицательных бактериях II 12-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2008. - С. 272-273

4) Поливцева В.Н. Цитологическая характеристика эктопаразитизма новых ультрамикробактерий рода Chryseobacterium на бактериях рода Bacillus II 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2010. - С. 253

5) Поливцева В.Н., Абашина Т.Н Новая грамотрицательная ультрамикробактерия из рода Chryseobacterium — факультативный эпибионт Bacillus subtilis II XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ». - Москва. - 2010. - С. 179 - 180

6) Поливцева В.Н. Цитологические аспекты механизма эктопаразитизма новых ультрамикробактерий рода Chryseobacterium на бактериях рода Bacillus II III Всероссийский конгресс студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия 2010» и школа-конференция «Инновационные методы изучения биосистем». - Нижний Новгород.-2010.-С. 68

7) Polivtseva V., Suzina N., Duda V. Cytological characteristic of new ultramicrobacteria // 4th FEMS Congress of European Microbiologists. - Geneva. -Switzerland. - 2011. - Poster № 540.

8) Поливцева B.H., Сузина H.E., Шорохова А.П., Абашина Т.Н., Дуда В.И. Ультраструктура и ядерно-цитоплазматические соотношения у клеток ультрамикробактерии Chryseobacterium solincola, штамм NF4 // 16-ая международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. -2012.-С. 32-33

9) Поливцева В. Н., Абашина Т. Н, Сузина Н. Е., Дуда В. И. Бактериальные S-слои: молекулярная организация и акцепторная роль при взаимодействии хищник-жертва // 17-ая международная школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века». - Пущино. -2013. - С. 38

Подписано в печать:

09.07.2013

Заказ № 8621 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wvvw.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поливцева, Валентина Николаевна, Пущино

Российская Академия наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

На правах рукописи

Ж'

04201361049

Поливцева Валентина Николаевна

Особенности цитологии новых хищных грамотрицательных

ультрамикробактерий 03.02.03. Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. В.И. Дуда

Пущино - 2013

Оглавление

Введение..............................................................................................................4

Обзор литературы

1. Явление минимализации микробных клеток и понятие ультрамикробактерии (УМБ)..........8

1.1. Минимальные размеры микробных клеток..........................................................9

1.2. Терминология для описания мелких микробных форм............................................10

2. Биоразнообразие У МБ.......................................................................................13

2.1. Ультрамикроклетки в природных местообитаниях..................................................13

2.2. Методологические принципы поиска новых форм УМБ...........................................15

2.3. Культивируемые УМБ....................................................................................16

3. Прокариотный паразитизм.........................................................................................18

3.1. Стратегия взаимодействия «волчий стиль» (wolfpack)....................................21

3.2. Периплазматические хищники..................................................................22

3.3. Эпибионты..........................................................................................24

3.4. Цитоплазматические хищники..................................................................28

3.5. Хищники с неопределенной стратегией......................................................28

4. Роль электронной микроскопии в выделении и изучении новых штаммов УМБ..................30

Экспериментальная часть

5. Объекты и методы....................................................................................................33

5.1. Культуры бактерий......................................................................................33

5.2. Микробиологические методы........................................................................33

5.3. Методы характеристики физиолого-биохимических свойств штаммов NF4 и NF5......33

5.4. Изучение взаимодействия культур УМБ с культурами тест-объектов - Bacillus subtilis АТСС6633 или Acidovorax delafieldii 39.....................................................................36

5.5. Молекулярно-генетические методы исследования.................................................37

5.6. Светооптические методы исследования............................................................39

5.7. Электронномикроскопические методы исследования................................................39

6. Результаты и обсуждение....................................................................................43

6.1. Морфология и ультраструктура клеток новых штаммов УМБ.................................43

6.2. Физиолого-биохимические свойства новых штаммов УМБ.......................................52

6.3. Филогенетическое положение новых штаммов УМБ..............................................55

6.4. Хищничество новых штаммов УМБ: адаптации на ультраструктурном уровне...........59

6.4.1. Ультраструктура клеток A. delafieldii 39 и В. subtilis АТСС 6633.......................59

6.4.2. Изучение взаимодействия штамма NF1 с гетеротрофными бактериями..............64

6.4.3. Изучение взаимодействия штамма №4 с гетеротрофными бактериями............71

6.5. Цитохимическое изучение адгезивного аппарата клеток хищников.........................74

6.5.1 Изучение взаимодействия клеток штамма №1 и А. с1е1аАеШИ 39.....................74

6.5.2 Изучение взаимодействия штамма №4 с В. зиЪНШ АТСС 6633.......................75

6.6. Цитохимическая локализация щелочной фосфатазы............................................82

6.7. Механизм когезии клеток хищника и клеток жертв..............................................85

Заключение........................................................................................................87

Выводы............................................................................................................93

Список сокращений и условных обозначений...........................................................94

Список использованной литературы......................................................................95

Введение

В настоящее время микробиологами получены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о существовании и широком распространении в природе ультрамелких форм бактерий с объемом клеток менее 0,1 мкм3, т.е. близким к теоретически рассчитанному минимальному размеру клеток (Workshop, 1999, Schut et al., 1997; Cavicchioli and Ostrowski, 2003, 2003; Panikov, 2004; Duda et al., 2011; Дуда с соавт., 2012). Имеются свидетельства того, что ультрамикробактерии (УМБ) являются составной частью микробных сообществ многих природных экосистем: они обнаружены в почвах, илах, льдах Гренландии, многолетнемерзлых грунтах, кишечнике человека и насекомых, ризосфере растений (Vancanneyt et al., 2001, Janssen et al., 1997, Iizuka et al., 1998, Miteva, Brenchley, 2005, Geissinger et al., 2009). Ультрамелкие бактериальные формы являются представителями домена Bacteria, где их ближайшими родственниками являются виды с более крупными, типичными для бактерий клетками, что указывает на полифилетическое происхождение УМБ. Однако, несомненно, что таксономическое, физиолого-биохимическое разнообразие и экологическая роль в природе, а также происхождение УМБ - ещё слабо исследованная область микробиологии. Причины слабой изученности УМБ связаны с методическими трудностями при исследовании этих ультрамелких организмов (Torella and Morita, 1981, Rappe et al., 2002), обусловленными пределами разрешения светового микроскопа, а также характерным медленным развитием колоний. По этой причине выделение нового вида УМБ еще недавно воспринималось как значительное открытие. Очевидно, что для изучения этого нового для исследователей аспекта мира микроорганизмов необходимы специальные подходы и инструментарий.

Мелким размерам клеток (объемом менее 0,1 мкм ) соответствуют малые размеры геномов - от 3,2 до 0,56 Mb. Высокая численность ультрамелких бактерий в морских экосистемах свидетельствует о существенном вкладе УМБ в формирование биомассы океана (Vancanneyt et al., 2001; Rappe et al., 2002). Изучение чистых культур УМБ показало, что они способны использовать в качестве субстратов различные органические соединения (Schut et al., 1993, 1995, 1997а, Giovannoni et al., 2005b), в том числе - полихлорированные бифенилы (May et al., 2008). Некоторые морские олиготрофные УМБ обладают протеородопсином и способны использовать в энергетическом метаболизме энергию солнечного света (Giovannoni et al., 2005а). Культивируемые формы УМБ характеризуются большим разнообразием морфологии, ультраструктурной организации, физиологии и биохимии. По строению

клеточной оболочки УМБ разделяются на три группы: грамположительные, грамотрицательные и лишённые клеточной стенки.

Среди ультрамикропрокариот (УМП) известны паразитические представители УМБ, такие как Micavibrio admirandus, Bdellovibrio bacteriovorus, Mycoplasma genitalium (Abram et al., 1974, Ламбина с соавт., 1982, Fraser et al., 1995, Jurkevitch, Davidov, 2006) и ультрамикроархея (УМА) - Nanoarchaeum equitans (Huber et al., 2002). Хищные УМБ (паразиты микроорганизмов) относятся к организмам различных филогенетических линий и являются одним из основных экологических факторов, формирующих структуру сообществ, управляющих микробным разнообразием (Jurkevitch, 2007). Среди их жертв есть как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии и даже эукариотические микроорганизмы. Однако цитологические аспекты паразитизма подробно изучались лишь у представителей семейства Bdellovibrionaceae (Abram et al., 1974).

В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН выделены уникальные хищные бактерии - Micavibrio admirandus (Ламбина с соавт., 1982) и Micavibrio aeroginosavorus (Ламбина с соавт., 1983), а недавно - четыре штамма грамотрицательных УМБ - NF1, NF3, NF4 и NF5. У штаммов NF1 и NF3 обнаружена способность к факультативному паразитизму на живых клетках цианобактерий Chlorogloeopsis fritschii АТСС 27193, Anabaena variabilis АТСС 29413, Nostoc muscorum sp. 3 и Spirulina sp. (Дуда с соавт., 2007). Показано, что при совместном культивировании УМБ и цианобактерий происходит адгезия УМБ к хозяйским клеткам, их проникновение внутрь клеток и лизис последних (Дуда с соавт., 2007). Однако цитологические механизмы взаимодействия паразитических УМБ с гетеротрофными бактериями остаются слабо изученными.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы состоит в характеристике особенностей строения клеток новых ультрамикробактерий - штаммов NF1, NF3, NF4, NF5 и сравнительном анализе цитологических аспектов хищничества этих штаммов.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. Изучить особенности морфологии и ультраструктурной организации клеток исследуемых штаммов УМБ.

2. Охарактеризовать филогенетическое положение исследуемых штаммов NF4 и NF5.

3. С помощью методов электронной, флуоресцентной микроскопии и цитохимии изучить цитологические аспекты взаимодействия бактерий-хищников и бактерий-жертв.

Научная новизна работы

Впервые с помощью флуоресцентной, фазово-контрастной и электронной микроскопии, а также электронно-цитохимических методов изучена ультраструктурная организация, циклы развития и этология новых хищных УМБ - штаммов Kaistia sp., NF1, NF3 и Chryseobacterium sp., NF4 и NF5.

Установлено, что: 1) изученные штаммы NF4 и NF5 представлены неподвижными клетками с грамотрицательной организацией оболочек; 2) клетки штаммов NF1, NF3, NF4 и NF5 репродуцируются как путём поперечного деления, так и почкования; 3) уникальной цитологической особенностью штаммов NF1 и NF3 является наличие на их клеточной поверхности конусовидных периплазматических протрузий, выполняющих функцию прикрепления к оболочкам хозяйских клеток; 4) клетки всех изученных штаммов УМБ обладают поверхностной сетью, состоящей из длинных полисахаридных нитей, которые снабжены гранулами (узелками), расположенными по всей длине нитей с интервалом ~20 нм; 5) обнаружена способность исследуемых штаммов к эпибионтному факультативному хищничеству на некоторых грамотрицательных и грамположительных бактериях.

Показано, что взаимодействие хищных клеток с жертвами происходит при помощи неизвестных ранее механизмов с участием таких клеточных структур, как полисахаридные сети, обладающие особыми гранулами (узелками), и протрузии - конусовидные адгезивные выступы клеток у штаммов NF1 и NF3. Использование этих структур, а также сил броуновского движения в процессе взаимодействия с клетками-жертвами является особенностью этологии изученных ультрамикробактерий.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в настоящей работе результаты имеют большое не только теоретическое, но и прикладное значение. Изученные штаммы УМБ могут служить модельными организмами в проводящихся исследованиях, посвященных решению как теоретических проблем минимализации микробной клетки, эволюции УМБ, так и в биотехнологических разработках, основой которых может быть обнаруженная паразитическая активность охарактеризованных нами УМБ. Полученные нами результаты используются при чтении курсов лекций по цитологии микроорганизмов для магистрантов Пущинского государственного естественнонаучного института и студентам Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Апробация материалов работы

Результаты и основные положения работы представлены на международной конференции FEMS (4th FEMS Congress of European Microbiologists, Geneva, Switzerland, 2011), на международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2010, 2012, 2013), международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), всероссийском, с международным участием, биологическом конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз Россия 2008» и школе - конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008, 2010), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2010), а также на семинарах и постерных сессиях ИБФМ РАН (Пущино, 2008-2011).

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 9 - в форме тезисов, 4 -экспериментальные статьи и 1 обзор.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Есиковой Т.З., к.б.н. Акимову В.Н., к. б.н. Шороховой А.П., Гафарову А.Б. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Дуде В.И. и к.б.н. Сузиной Н.Е.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 174 ссылгЬ, из них 29 на русском и 143 на английском языках, содержит 5 таблиц и 43 рисунка.

Обзор литературы 1. Явление мииимализации микробных клеток и понятие ультрамикробактерии (УМБ)

1.1. Минимальные размеры микробных клеток

Подавляющее большинство бактерий, которые изучаются традиционными микробиологическими методами, имеют форму палочек 1 мкм толщиной и 5 мкм длинной (Шлегель, 1987). Более мелкие бактерии, близкие к теоретически установленному минимальному размеру клетки и наблюдаемые в природных микробных сообществах, в настоящее время изучены недостаточно, что обусловлено, с одной стороны, пределом разрешения светового микроскопа, составляющим ~0,2 мкм, а с другой стороны -образованием ультрамелкими бактериями «микроколоний», невидимых невооруженным глазом, или более медленным развитием колоний (Torella, Morita, 1981). Таким образом, методические преимущества работы с микробными клетками обычных размеров ослабили внимание к более мелким формам, и, как следствие, их обнаружение воспринимается как необычный феномен.

Тем не менее, накоплено достаточно данных, чтобы признать существование жизнеспособных прокариот с объемом пролиферирующих клеток, менее 0,1 мкм .

Теоретические расчетные минимальные размеры клеток представляют интерес, как пример ожидаемого предела размеров выделенных новых видов УМБ. Большинство расчетов исходят из базовых принципов строения и функционирования микробной клетки, которое включает ряд величин, практически не зависящих от таксономической или физиологической принадлежности бактерии: размеры и количество основных ферментов главных метаболических путей, размеры рибосомы, толщина мембраны, диаметр максимально компактизованного минимального генома и т.д. Таким образом, теоретически возможный предел определяется тем, что клетка должна быть окружена мембраной, по крайней мере, толщиной около 8 нм и содержать рибосомы диаметром около 20 нм. У автономно репродуцирующихся микроорганизмов наименьший геном найден у облигатного паразита Mycoplasma genitalium (0,58 Mb) (Fraser et al., 1995) и y Nanoarchaeum equitans (0,49 Mb) -паразитического эпибионта археи Ignicoccus hospitalis (Waters et al., 2003). Рекордно мелкий геном (0,16 Mb) обнаружен y внутриклеточного симбионта листоблошек Carsonella ruddii (Nakabachi et al., 2006). Значительное сокращение генетической информации у данных микроорганизмов связано с паразитическим образом их жизни.

Теоретические расчеты (Workshop, 1999) показывают, что вероятно, геномы таких размеров наиболее близки к минимальному набору генов необходимых для поддержания жизнедеятельности и репродукции (табл. 1). Такое количество ДНК укладывается в шар диаметром не более 0,12 мкм. Таким образом, диаметр автономно репродуцирующейся, шаровидной клетки не может быть меньше 0,12-0,17 мкм. Согласно более поздним расчетам других авторов с учетом необходимости присутствия минимального набора белков и кодирующих их генов, а также одной рибосомы, такая прокариотическая клетка должна иметь размер около 0,2 мкм (Workshop, 1999).

Таблица 1

Теоретические расчеты предельного размера клеток

Число нерибосомальных белков (каждый из которых в 10 копиях) Диаметр клетки и её структур, мкм

Цитоплазма Цитоплазма + мембрана Цитоплазма + мембрана + стенка

100 0,174 0,186 0,206

200 0,206 0,218 0,238

300 0,230 0,242 0,262

Но экспериментальные данные в этом отношении крайне малочисленны.

Некоторые теоретические расчеты допускают даже существование автономно репродуцирующихся жизнеспособных клеток диаметром 0,14 мкм. Утверждения же о существовании нанобактерий с размером клеток ~ 0,03 - 0,05 мкм и не содержащих ДНК и рибосом (Kajander and Ciftcioglu, 1998) являются спекулятивными, а применение к подобным частицам термина бактерия является некорректным.

1.2. Терминология для описания мелких микробных форм

Необходимо отметить отсутствие в этой области микробиологии устоявшихся общепринятых и однозначных терминов и понятий.

Ультрамелкие клетки (УМК).

Термин УМК в ряде публикаций применяется для обозначения ультрамелких клеток независимо от их происхождения. УМК (син. наноклетки, клетки-карлики, лилипуты, наноразмерные (nanosized) клетки, фильтрующиеся формы и другие) наблюдаются: а) в старых культурах, б) у индигенных микроорганизмов, персистируюгцих in situ в природных

местообитаниях, в) в популяциях, полученных из природных образцов с помощью различных методов дифференциального центрифугирования, либо фильтрации через фильтры с порами от 0,4 до ОД мкм (Bae et al., 1972; Дмитриев с соавт., 2001) или г) образуются в виде патологических форм под влиянием различных неблагоприятных факторов среды (Дуда с соавт., 2012).

Следует обратить особое внимание на явление уменьшения размеров клеток, наблюдающееся в онтогенезе - в процессе развития "обычных" бактерий при старении их культур. В старых культурах обычных бактерий мелкие клетки образуются в результате последнего редукци