Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей ультрапресных вод

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей ультрапресных вод"

005060265

На правах рукописи

Федотова Анна Вячеславовна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ БАКТЕРИЙ И АРХЕЙ УЛЬТРАПРЕСНЫХ ВОД

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ ¿013

Москва - 2013

005060265

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, заведующий

лабораторией микробиологии болотных экосистем, ИНМИ РАН Дедыш Светлана Николаевна

Официальные оппоненты: Турова Татьяна Павловна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, ИНМИ РАН

Дорофеев Александр Геннадьевич

кандидат биологических наук, главный специалист Курьяновского отделения Инженерно- Технологического центра ОАО Мосводоканал

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Защита состоится 25 июня 2013 в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им С.Н. Виноградского Российской академии наук по адресу: 117312, г. Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН Автореферат разослан «_» мая 2013 года

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Хижняк Татьяна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Вопрос достаточности и качества природной пресной воды является одной из наиболее актуальных проблем XXI века. Важнейшими природными центрами формирования ультрапресных вод в условиях равнинных ландшафтов, характерных для бореальной зоны России и других стран Северного полушария, являются болотные экосистемы (Заварзин, Дедыш, 2008). Формирующиеся в болотах гумусированные кислые воды питают многочисленные озера и реки северных регионов. Анализ вод малых ацидных озер, расположенных на заболоченных водосборах Верхней Волги показал, что микроорганизмы в них представлены преимущественно клетками малых размеров, которые с трудом поддаются идентификации с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и стандартного набора группо-специфичных зондов (Куличевская и др., 2011). Существенная часть этих клеток представлена ультрамикроформами, проникающими через «бактериальные» фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, которые повсеместно используются для очистки воды, питательных сред, сывороток и проч. от клеток микроорганизмов.

Несмотря на то, что интерес к фильтрующимся формам микроорганизмов появился давно (Sherman, Safford, 1928; Kleinberger-Nobel, 1951; Имшенецкий, Солнцева, 1958), сведения о них остаются весьма ограниченными. Впервые термин «ультрамикробактерия» был применен в 1981 году для описания морских гетеротрофных бактерий с диаметром клеток менее 0.3 мкм, которые медленно росли на стандартных питательных средах и не увеличивались в размерах при продолжительном культивировании в лаборатории (Torella, Monta, 1981). В настоящее время термин «ультрамикробактерия» применяют для обозначения клеток объемом менее 0.1 мкм3 (Schut et al., 1997; Velimirov, 2001), а имеющиеся сведения об их биологии и разнообразии суммированы в ряде обзоров (Velimirov, 2001; Panikov, 2005; Duda, 2011; Дуда и др., 2012). Большинство этих организмов являются свободноживущими гетеротрофами, однако известны и паразитические формы (Huber et al., 2002; Сузина и др., 2011), а также потенциально опасные представители (Audic et al., 2007).

Многие ультрамикробактерии способны проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Признание этого факта микробиологами долгое время сдерживалось тем обстоятельством, что фильтрующиеся формы клеток или вообще не прорастают на стандартных питательных средах, или же образуют ультрамикроколонии, незаметные невооруженным глазом (Torella, Morita, 1981; MacDonell, Hood, 1982; Hahn, 2004). Эту проблему «некультивируемости» фильтрующихся форм удалось частично решить путем использования сильно разбавленных питательных сред и продолжительной

инкубации посевов. Применение такого подхода для анализа образцов воды ряда рек, озер и прудов позволило получить коллекцию изолятов фильтрующихся форм бактерий, относящихся к филогенетическим группам Bacteroidetes, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Actinobacteria и Spirochaetes, многие из которых были в дальнейшем охарактеризованы в качестве новых таксонов (Hahn, 2004; Hahn et al., 2009,2010, 2012).

Ни один из приемов культивирования, однако, не позволяет охватить все разнообразие присутствующих в образце микроорганизмов. Хорошей альтернативой здесь является использование молекулярных методов, хотя перечень работ по молекулярной идентификации фильтрующихся форм микроорганизмов остается крайне скудным. Он ограничен исследованиями проб фильтрованной средиземноморской воды (Haller et al., 1999), грунтовых вод урановой шахты (Miyoshi et al., 2004), а также торфа кислых сфагновых болот (Panikov, 2005; Лысак и др., 2010). Идентификация основных популяций фильтрующихся бактерий была также проведена для воды ряда рек и озер Швейцарии (Wang et al., 2007). Было показано, что мл воды этих пресноводных водоемов содержит около 104 микробных клеток, способных проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, что составляет от 0.03 до 3.6% от общей численности бактериопланктона (Wang et al., 2007). Для водоемов России таких исследований не проводилось. Настоящая работа, таким образом, была предпринята для восполнения дефицита информации о численности и природе фильтрующихся форм микроорганизмов в водах пресноводных экосистем севера Европейской части России.

Цели и задачи исследования

Цель работы - молекулярная идентификация ультрамикро-форм бактерий и архей в ультрапресных водах экосистем водосбора Верхней Волги, а также водах Рыбинского водохранилища.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение численности клеток микроорганизмов, проникающих через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, в водах малых озёр и болот водосбора Верхней Волги, а также воде Рыбинского водохранилища.

2. Оценка применимости культуральных подходов для выявления и изучения фильтрующихся микробных клеток.

3. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей воды исследуемых экосистем путём формирования и анализа библиотеки клонов генов 16S рРНК, а также сравнение состава фильтрующихся микроорганизмов в водах водохранилища и водосборных территорий.

Научная новизна и значимость работы

В настоящей работе впервые получены данные о численности и филогенетической принадлежности фильтрующихся форм микроорганизмов в ультрапресных водах природных экосистем водосбора Верхней Волги и Рыбинского водохранилища. Это первое системное исследование фильтрующихся микробных клеток, выполненное для водоемов России. Исследование показало, что численность фильтрующихся микроорганизмов в природных водах может быть довольно высока и достигать 104 клеток в 1 мл воды. Установлено, что состав фильтрующихся бактерий на заболоченных водосборных территориях отличен от такового в водах водохранилища. Организмов, близких известным патогенам в составе фильтрующихся бактерий не обнаружено. В составе фильтрующихся архей всех исследованных пресноводных экосистем впервые выявлены представители неизученного и не полученного пока в культурах кластера LDS филума Euryarchaeota. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что археи этой группы представлены клетками ультрамикро-диапазона.

Практическая значимость

Идентификация и изучение ультрамикроформ микроорганизмов ультрапресных экосистем севера России имеет приоритетное значение в рамках проблемы водопользования, оценки потенциальных рисков и совершенствования методик очистки воды. В ходе выполнения работы получено и проанализировано около 250 клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся бактерий и 300 клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся архей; из них в GenBank депонировано 215 последовательностей. База данных этих последовательностей может быть использована для разработки молекулярных методов детекции фильтрующихся микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. Международной молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, ИНМИ РАН, 2010.

2. 16-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА», Пущино, ИБФМ РАН, 2012.

3. Конференции молодых учёных «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты», Москва, 2012.

4. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.

5. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 8 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 5 тезисах конференций.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на /и страницах, включая ¿L таблиц,-рисунков и списка литературы из//.Наименований, из них /.2-j- на русском и у.О^ на английском языке.

Место проведения работы и благодарности

Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2009 по 2013 годы под руководством д.б.н. С.Н. Дедыш.

Использованные в работе образцы воды и торфа были предоставлены автору к.б.н. А.Н. Буториным и д.б.н. В.Т. Комовым (ИБВВ РАН). Электронно-микроскопические исследования фильтрованной воды были проведены совместно с В.В. Сорокиным (ИНМИ РАН) и к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН). Сравнительный анализ видового состава фильтрующихся микроорганизмов различных экосистем проведен совместно с Ю.М. Серкебаевой (ИНМИ РАН).

Работа выполнена при финансировании в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Автор выражает искреннюю благодарность всем вышеупомянутым участникам данной работы, а также особую признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и к.б.н. С.Э. Беловой за полезные практические советы и помощь на всех этапах работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

1. Объектами исследования были образцы воды, отобранные из малых ацидных озёр Дубровское и Мотыкино, и торф болота Обуховское, расположенных на заболоченном Молого-Шекснинском водосборе бассейна Верхней Волги, а также образцы воды Рыбинского водохранилища, отобранные в районе гидрологической станции Брейтово (Табл. 1).

Таблица 1. Характеристика исследованных в работе пресноводных экосистем

Пресноводная экосистема, расположение, время отбора образцов Трофность рН Число клеток, выявленных окраской ДАФИ

Общая численность микробных клеток, мл'1 Численность фильтрующихся клеток, мл"1 (и их доля)

Озеро Дубровское, Вологодская область, 58°10ТМ, 37°33'Е, 06.2009 Дистрофное 4.4 3.89±0.40 х 10й 1.69±0.53 х Ю4 (0.4%)

Озеро Мотыкино, Вологодская область, 58° 1074, 37°33'Е, 06.2009 Олиготрофное 4.7 1.03±0.10х 106 3.16±0.43 х 104(3.1%)

Болото Обуховское, Ярославская обл., 58°1<т, 38°12'Е, 05.2010 Олиготрофное 4.2 8.06±0.86х108* 3.75±0.42 х Ю6* (0.5%)

Водохранилище Рыбинское, станция Брейтово, Ярославская обл., 58° 18Т4, 37°52'Е 07.2011 Мезотрофное 7.0 1.44±0.08 х Ю6 2.28±0.16 х Ю4(1.6%)

Данные численности приведены в расчете на 1 г сырого торфа.

2. Общую численность микроорганизмов в образцах определяли путём учёта

клеток, осаждённых из предварительно фиксированных спиртом (1:1) проб воды на

тёмных мембранных фильтрах «Millipore» с диаметром пор 0.22 мкм и окрашенных

1мкМ раствором ДНК-специфичного красителя ДАФИ (4', 6' - диамидино-2-

фенилиндол). Подсчёт клеток в препаратах производили с помощью микроскопа Zeiss

Axioplan 2 (Йена. Германия) со светофильтром Zeiss 02, специфичным для окраски

ДАФИ. Подсчет клеток производили в 100 полях зрения, с последующим расчётом на 1 мл воды. Численность фильтрующихся клеток в воде, пропущенной через фильтр с порами 0.22 мкм, определяли путём их осаждения на фильтрах с диметром пор 0.09 мкм с последующей окраской и подсчётом по описанной выше методике.

3. Исследование фильтрующихся клеток с помощью электронной микроскопии

проводили с использованием многократно концентрированных фильтратов воды. Суспензии клеток наносили на формваровые пленки-подложки, высушивали, напыляли углеродом и исследовали на просвечивающем электронном микроскопе ■ШМ-1400 (ШОЬ, Япония) при ускоряющем напряжении 80 КэВ.

4. Учет фильтрующихся клеток методом посева проводили с использованием следующих питательных сред: 1) комплексной агаризованной среды Я2А («Б1Гсо»), разведенной в 100 раз; 2) среды БВ2, содержащей (мг л'1): КЫ03 - 50, ЫН4С1 - 50, М§804 х 7Н20 - 60, СаС12 * 2Н20 - 20, дрожжевой экстракт - 50, пируват Ыа - 300; агар «01&о» - 18 г/л. Количество выросших колоний подсчитывали спустя 2 месяца после посева. Выделение культур фильтрующихся микроорганизмов производилось также с использованием жидких сред следующего состава (мг л"1): 1) Р^БОд х 7Н20 - 20, №ЦЖ)з - 30, дрожжевой экстракт - 50, оксалат Иа - 100, сукцинат № - 100, малат N3 - 100; 2) Г^БОд х 7Н20 - 20, Ж^Шз - 30, дрожжевой экстракт - 10, казаминовые кислоты - 10, пектин - 30; 3) М§804 х 7Н20 - 20, ЫН4Ы03 - 30, казаминовые кислоты - 10, пептон — 10.

5. Идентификацию полученных изолятов проводили путем выделения ДНК из клеток с использованием модифицированного метода, основанного на применении додецил сульфата натрия (БОБ) в качестве лизирующего агента (Бес^Ь е! а1., 1998), ПЦР-амплификации фрагментов генов 16Б рРНК с праймерами 9{ и 1492г (Weisburg е1 а1., 1991), их секвенирования и анализа.

6. Сбор фракции фильтрующихся клеток для молекулярной идентификации

осуществляли путем пропускания воды через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм фирмы «МПНроге» с помощью вакуумной установки той же фирмы и последующего осаждения фильтрующихся форм на фильтре с диаметром пор 0.09 мкм. При работе с образцами торфа, клетки предварительно десорбировали в гомогенизаторе Ва£1УНхег 100 "МЫМк" (Мегеаепсе, Франция). Полученную суспензию фильтровали через мембранные фильтры «МПНроге» с диаметром пор 5 мкм для удаления крупных частиц, а дальнейшую обработку проводили, как описано выше для образцов воды.

Фильтры с собранными на них клетками использовали для выделения тотальной ДНК с использованием набора "FastDNA SPIN kit for soil". ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразнон цепной реакции (ПЦР) с амплификацией фрагментов генов 16S рРНК бактерий (праймеры 9f и 1492r, Weisburg et al., 1991) и архей (праймеры 109f и 915r, Grosskopf et al, 1998) на термоциклере РЕ GeneAmp PCR System 9700 ("Perkin Elmer Applied Biosystems", США). Полученные ампликоны были клонированы с помощью набора "pGem-T Easy Vector Systemll" ("Promega"). Отбор рекомбинантных клонов осуществляли путем амплификации клонированных фрагментов с использованием вектор-специфичных праймеров. Сортировку полученных клонов осуществляли с помощью рестрикционного анализа. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора "WizardR Plus Minipreps DNA Purification System" ("Promega"). Определение нуклеотидных последовательностей проводили на секвенаторе ABI 377А ("Perkin Elmer Applied Biosystems", США).

Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы SeqMan (Laser Gene 7.0; DNA Star Package). Сравнение полученных последовательностей с таковыми в базе данных GenBank осуществляли с использованием программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Проверку полученных библиотек клонов генов 16S рРНК на наличие химер проводили с использованием программы Bellerophon 3.0

(http://comp_bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl). Построение филогенетических дендрограмм осуществляли с использованием программного пакета ARB (http://www.arb home.de'). Статистическую достоверность дендрограмм рассчитывали с использованием программного пакета Phylip с помощью "bootstrap"- анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев.

Определенные в настоящей работе нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК фильтрующихся форм прокариот депонированы в GenBank под номерами JN825208-JN825301, JQ697092-JQ697150 и КС878619- КС878680.

8. Сравнение видового состава фильтрующихся микроорганизмов различных экосистем проводили с использованием программного пакета MOTHUR (Schloss et al., 2009), SINA Incremental Aligner (Pruesse et al., 2012) и SILVA в качестве референсной базы данных (Quast et al., 2013). Последовательности с уровнем сходства выше 97% были объединены в операционные таксономические единицы (OTE) с помощью алгоритма кластеризации Average neighbor. Построение диаграмм, отражающих соотношение уникальных и общих OTE в клонотеках, полученных из различных образцов, производили с помощью программного пакета MOTHUR.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Определение численности фильтрующихся клеток методом прямого микроскопического учета. Общая численность бактериопланктона в воде ацидных озер Дубровское и Мотыкино составила 3.89±0.40 и 1.03±0.10x106 клеток мл-1, соответственно (Табл. 1). В тех же образцах воды, после их пропускания через фильтр с порами 0.22 мкм было обнаружено 1.69±0.53 и 3.16±0.43 х 104 клеток мл4, что составило 0.4 и 3.1% общей численности микробных клеток.

Общая численность микроорганизмов в 1 г влажного торфа болота Обуховское составила 8.06±0.86><108 клеток. Из них, через фильтр с порами 0.22 мкм были способны проникать 3.75±0.42 х106 клеток г"1, то есть 0.5% общего числа микробных клеток. Величины того же порядка были получены ранее при оценке численности фильтрующихся клеток в почве верхового торфяника (Лысак и др., 2010) при пересчете на 1 г влажного торфа.

При анализе воды Рыбинского водохранилища было выявлено 1.44±0.08хЮ6 микробных клеток мл'1, что согласуется с ранее опубликованными данными (Романенко, 1971; Рыбинское водохранилище и его жизнь, 1972). После фильтрации в образце было выявлено 2.28±0.16хЮ4 клеток мл"1 или 1.6% общего числа микробных клеток в исследуемой воде.

Таким образом, численность фильтрующихся микроорганизмов достигала 104 клеток в 1 мл воды озер и водохранилища и 106 клеток в 1 г сырого торфа верхового болота, составляя до нескольких процентов общего числа микробных клеток.

2. Электронно-микроскопические исследования. Анализ фильтрованной воды с

помощью электронной микроскопии позволил выявить ряд объектов ультрамикро-размеров (120-250 нм), имеющих сферическую форму (Рис. 1). Малые размеры затрудняли наблюдение клеточных структур, однако у ряда объектов просматривалась клеточная стенка (Рис. 1, AI). Принятый в настоящее время консенсус в отношении минимального размера, обеспечивающего самостоятельное существование живой клетки, сводится к объему от 0.014 до 0.06 мкм3 и диаметру от 0.14 до 0.30 мкм (Koch, 1997; Maniloff, 1997; Psenner, Loferer, 1997). Выявленные в фильтрованной воде объекты имели близкие характеристики, хотя следует иметь в виду возможность некоторого уменьшения их размеров в процессе подготовки препаратов для микроскопии. Примечательно, что в проведенных ранее исследованиях воды Рыбинского водохранилища также отмечалось наличие большого числа крайне мелких, с размерами на грани разрешения светового микроскопа (0.2 мкм), очень коротких палочковидных и сферических клеток (Рыбинское водохранилище и его жизнь, 1972).

Рис. 1. Электронная микрофотография клеток микроорганизмов, выявленных в фильтрованной воде Рыбинского водохранилища (А, Б); маркер, 200 нм. Увеличенный имидж ультрамикро-клетки (AI); маркер, 100 нм.

3. Культивирование на питательных средах. Возможность учета фильтрующихся клеток методом посева была оценена на примере образца воды, отобранного из озера Дубровское. Число колоний, сформировавшихся на средах R2A (1:100) и SB2 при посеве фильтрованной воды составило 0.93><102 и 2.00><102 КОЕ мл"1, соответственно. Таким образом, лишь 0.5-1.2% присутствовавших в фильтрованной воде клеток были способны сформировать колонии при посеве на плотные питательные среды.

Рассев полученных колоний позволил выделить в чистую культуру 10 штаммов бактерий. Определение частичной последовательности гена 16S рРНК изолятов выявило высокое сходство (97-99%) с нуклеотидными последовательностями известных представителей родов Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Sphingomonas и Ralstonia (Таблица 2). Полученные из фильтрованной воды изоляты имели клетки палочковидной морфологии, с диаметром 0.3-0.5 мкм (Рис. 2). При дальнейшем культивировании в лабораторных условиях, однако, клетки изолятов приобретали более крупные размеры (до 1-2 мкм), характерные для представителей этих родов. Эти изоляты не представляли численно преобладающие популяции фильтрующихся клеток, выявленные в воде с помощью молекулярного анализа (см. раздел 4.1).

Таблица 2. Результаты идентификации изолятов бактерий, полученных из образцов фильтрованной воды методом посева на питательные среды.

Сходство

Места отбора Выделенный Ближайший культивируемый генов

проб воды штамм филогенетический родственник 16S рРНК, %

Озёра Дубровское DSB20 Mesorhysobium amorphae (FG025126) 99

и Мотыкино DSB21 Bradyrhizobium elkanii (FG025139) 99

DSB22 Sphingomonas sp. (AJ926494) 98

DSB4 Pseudomonas veronii (DQ525597) 99

DSB11 Pseudomonas veronii (DQ525597) 99

IS252 Sphingomonas rhizogenes (AY962684) 99

IS251 Sphingomonas melonis (AM777422) 98

IS260 Ralstonia picketii (CP001644) 99

ISlds Parvibaculum lavamentivorans 98

(CP000774)

Plnl Polynucleobacter nessesarius subsp. 100

asymbioticus (AB470420)

Болото Р09 Ralstonia picketii (CP001644) 99

Обуховское Р04 Microbacterium oxydans (AJ717356) 100

PO 15 Ralstonia detusculanse (AF280433) 100

Р065 Raltsoniasp. (GU936705) 100

РОб Brachybacterium muris (NR024571) 99

Водохранилище Рыбинское RBI Brevundimonas sp. (JQ396622) 99

IS P3-6 Marmoricola scoriae (FN3 86750) 98

Исключение составили лишь изоляты рода Pseudomonas, штаммы DSB-4 и DSB-11, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК которых были идентичны таковым, выявленным в фильтрованной воде с помощью молекулярного анализа (см. раздел 4.1). Аналогичные результаты были получены для фильтрованной воды болота Обуховское и воды водохранилища Рыбинское, откуда было выделено 7 штаммов фильтрующихся бактерий (Таблица 2). Единственным изолятом истинной ультрамикробактерии, полученной из исследованных образцов воды был штамм Pin 1 (Рис. 23) подвида Polynucleobacter nessesarius subsp. asymbioticus, детально охарактеризованного ранее австрийскими исследователями (Hahn et al., 2009,2012).

Рис. 2. Морфология клеток изолятов, полученных из фильтрованной воды методом посева: А — DSB4Microbacterium sp. Р04, Б - Bradyrhizobium sp. DSB21, В - Ralstonia sp. P065, Г -Mesorhizobium sp. DSB20, Д - Brevundimonas sp. RB1, E - Pseudomonas sp., Ж - Parvibaculum sp. IS lds , 3 - Polynucleobacter nessesarius subsp. asymbioticus Pin 1. Маркер - 2 мкм.

Таким образом, метод посева оказался малопригоден для идентификации фильтрующихся клеток, поэтому для получения более полного представления об их разнообразии был применен анализ библиотек клонов, сформированных путем ПЦР-амплификации генов 16Б рРНК бактерий и архей из ДНК фракции клеток, собранных из фильтратов воды.

4.Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий 4.1. Малые озёра водосбора. Сформированная библиотека клонированных нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК фильтрующихся форм бактерий включала 86 клонов, из которых 25 были получены из озера Дубровское, а 61 - из озера Мотыкино. Из них 74 клонированных нуклеотидных последовательностей принадлежали представителям класса Ве1арго1еоЬас1еПа, 4 - А1ркарго!еоЬас1ег1а, 2 -ОаттарШеоЬааегга и еще шесть представляли филум АсИпоЬааепа (Рис. 3).

У

ё

Clone 084 (2), 0В7, DB8 (2), DB36, DB42, DB65, МВ48 (3), МВ83 (2), МВ87, МВ8Э (2), МВ97, МВ98, МВ109 (2) Clone DB38 (8) Clone DB40 Clone DB34 (2)

Herbaspiritlum lusftanum, AF543312 Clone DB41 (2) Clone DB45 Clone DB60 'Minibacterium messiliensis\CP0002Q9 HerminUmonas Qtaciei, EU489741 Clone MB105 (5) ■ Clone MB111 Clone MB58 (3) Clone MB50 (7] ^ Curvibactar gracilis. AB 109889 Burkholdcria fungotum, AJ544691 Burttholderia bospita, AY040353 Clone MB108 (12) Clone MB115(5) Clone MB24 Clone MB99 (5)

'Ferrovurn myxofaciens', EF133608 Clone DB27

Pseudomonas antarctica. FM955872 Clone DB28

Pseudomonas fluorescens, AF506040

100 ,-bacterium Ellin362, AF498744

'— Clone MB47

100

87

- Clone MB125 (3)

- Mesorfiizobium amorphae, AF041442 _l- Clone MB123 (6)

'Candidatus Planktophila limnetica" FJ428831

Betaproteobacteria

Gammaproteobacte Alphaproteobacteri Actinobacteria

0.10

Рис. 3. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16Б рРНК бактерий, выявленных в фильтрованной воде, и ближайших представителей филогенетических групп Рго1еоЬас1епа и АмтоЬас/епа. Клоны, полученные из воды озера Дубровское и Мотыкино, обозначены буквенными индексами ОВ и МВ соответственно. Маркер - 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.

Фильтрующиеся формы бетапротеобактерий, выявленные в воде ацидных озер, относились к семействам Oxalobacteraceae, Comamonadaceae and Burkholderiaceae. Клонированные фрагменты генов 16S рРНК обнаруживали наибольшее сходство (9499%) с таковыми у представителей родов Herbaspirillum, Herminiimonas, Curvibacter и Burkholderia. Нуклеотидные последовательности клонов DB27 и DB28, представляющие класс Gammaproteobacteria, обнаруживали 99% сходства с последовательностями гена 16S рРНК представителей рода Pseudomonas, выделенных из талых льдов Арктики и речной воды (Vardhan Reddy et al., 2009). Последовательности этих клонов были идентичны нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК штаммов DSB-4 и DSB-11, выделенных из фильтрованной воды озер методом посева. Четыре клона, образующие общий кластер с представителями класса Alphaproteobacteria, обнаруживали лишь отдаленное родство (-90% сходства генов 16S рРНК) с таксономически описанными организмами. Они проявляли наибольшее сходство (95-97%) с последовательностью гена 16S рРНК ^охарактеризованной бактерии ЕШп362, выделенной из почв Австралии (Sait et al., 2002). Шесть клонов, представляющих филум Actinobacteria, обнаруживали наибольшее сходство (95%) с последовательностями гена 16S рРНК типичного представителя ультрамикро-бактериопланктона пресной воды, 'Candidates Planktophila limnetica'.

4.2 Сфагновое болото водосбора. Полученная из торфа библиотека клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся форм бактерий включала 100 клонов, из которых 65 нуклеотидных последовательностей принадлежали представителям филума Proteobacteria и 35 - филума Bacteroidetes (Рис. 4). Протеобактерии были представлены двумя классами — Betaproteobacteria (44 клона) и Gammaproteobacteria (21 клон), а филум Bacteroidetes - классами Flavobacteria (34 клона) и Sphingobacteria (1 клон).

Все клонированные последовательности генов 16S рРНК, относящиеся к Betaproteobacteria, обнаруживали наибольшее сходство (98-99%) с таковыми у бактерий рода Janthinobacterium, в том числе вида J. lividum, а также таксономически ^охарактеризованными, психрофильными представителями этого рода, выделенными из осадков антарктического озера (Shivaji et al., 2011).

Класс Gammaproteobacteria был представлен 21 клонами, двадцать из которых обнаруживали высокое (99%) сходство с последовательностями гена 16S рРНК психрофильных представителей рода Pseudomonas - Ps. psychrophila, Ps. antarctica и изолятов из Антарктики. Одна клонированная последовательность принадлежала представителю рода Acinetobacter и была наиболее близка (99% сходства) к таковой у изолята этого рода, выделенного из осадков талых вод Арктического ледника.

Большая группа клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16Б рРНК фильтрующихся форм болотных бактерий принадлежала к классу ПспоЬааепа. Из них 10 клонов представляли бактерий рода СИгузеоЬааегшт и 24 клона - бактерий рода ЕрИ'йУюттопаа. Один клон обнаруживал высокое сходство (99%) с последовательностями гена 16Б рРНК ЗрЫщоЪаМегшт /аесшт, выделенного из Альпийских ледников.

100П

Clone РОВ 14 (8) - Clone РОВ 36 (22) Clone РОВ 38 (6)

Janthinobaderium lividum, AF174648 И— Clone РОВ 23 (8)

Janthinobaderium sp., GU733463 j— Clone РОВ 21 «F— Clone РОВ 50 99 P— Clone РОВ 106 (2) Ii- ClonePOB11 (7) Г Pseudomonas antardica, FM955872 1 Clone POB 7 (9) — Pseudomonas fluorescens, AF506040

1Q0i- ^c/nefobacfer/woffi/, AF188302

Clone POB 54

Chryseobaderium balustinum, M58771 Clone POB 25 (9)

Chryseobaderium scophthalmum, AJ271009 Chryseobaderium vrystaalense, AJ871398 Clone POB 110 Chryseobaderium formosense, NR_036872

Clone POB 15 (12) Clone POB 17 (12) Epilithonimonas ladis, EF204460 Clone POB 34

Betaproteobacteria

Gammaproteobacteri

Sphingobaderium faedum, AJ438176

Bactemidetes

Рис. 4. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных последовательностей генов 165 рРНК фильтрующихся форм бактерий, выявленных в торфе сфагнового болота, и некоторых представителей филогенетических групп Рго1еоЬас1епа и Вас1его 'к1е1е$. Клоны, полученные из торфа Обуховского болота, обозначены буквенными индексами РОВ. Маркер - 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.

4.3 Рыбинское водохранилище. Полученная из образца фильтрованной воды библиотека клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бактерий насчитывала 61 клон, 60 из которых принадлежали представителям класса Betaproteobacteria и обнаруживали высокое сходство (99.0-99.5%) с последовательностями генов 16S рРНК Polynucleobacter necessarius subsp. asymbioticus (Рис. 5). Представители этого таксона - свободноживущие ультрамикробактерии с объёмом клеток менее 0.1 мкм3, являющиеся типичными обитателями пресноводных водоемов (Hahn, 2003; Hahn et al., 2009; Wang et al., 2009).

Особенно высока численность Polynucleobacter necessarins subsp. asymbioticus в водоемах олиготрофного типа с застойными водами и высоким содержанием гуминовых соединений. Изолят таких бактерий был получен в настоящей работе из воды озера Дубровское (Таблица 2). О способности клеток этих бактерий проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм сообщалось ранее (Hahn, 2004). Эти бактерии имеют малый размер генома (2.1 млн. пар оснований) и являются хемоорганотрофами, использующими ограниченный спектр органических кислот, источником которых в природных экосистемах выступает фотодеградация гуминовых соединений (Hahn et al., 2012).

Только одна из полученных последовательностей генов 16S рРНК фракции фильтрующихся бактерий, клон RB150, принадлежала представителю класса Alphaproteobacteria (Рис. 5). Она обнаруживала лишь отдаленное сходство (-90%) с последовательностями гена 16S рРНК таксономически описанных организмов и принадлежала к той же группе последовательностей, что и клонированная последовательность МВ47, полученная из фильтрованной воды озера Мотыкино.

98 Г

90

Clone RB 21 Clone RB 6 (2) Clone RB 41 Clone RB 35 Ь Clone RB 43

г P necessarius subsp. asymbioticus, AJ550666 I Clone RB 12 (2) Clone RB 42 Clone RB 17 Clone RB 40 (48) Clone RB 50 Clone RB 30

P. necessarius subsp. asymbioticus. AJ 550657 P. necessarius subsp. asymbioticus, AJ879783 Polynucleobacter difficilis, FM208161 Polynucleobacter cosmopolitanus, AJ550672 Polynucleobacter rams, FM208182

100 I— Ralstonia insidiosa, AF488779 Ralstonia solanacearum, X67036

100

г- Burkholderia cepacia, M22518 1-Burkholderia gladioli, X67038

100

—гь

100 r

Limnobacter thiooxidans. AJ289885 bacterium Ellin332, AF498714 Clone RB 150

bacterium Ellin362, AF498744 acidic lake bacterium, JN825270

— acidic lake bacterium, JN825272

- Mesorbizobium amorphae, AF041442

Betaproteobacteria

Alphaproteobacteria

0.10

Рис. 5. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бактерий, выявленных в фильтрованной воде, и некоторых представителей классов Alpha- и Betaproteobacteria. Клоны, полученные из воды Рыбинского водохранилища, обозначены буквенными индексами RB. Маркер — 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.

А) малые озера

Б)болото

В) водохранилище

1 2

3

4

5

Рис. 6. Состав библиотеки клонов генов 16S рРНК бактерий, полученных из фракции фильтрующихся клеток воды малых озер (А), торфа сфагнового болота водосбора (Б) и воды Рыбинского водохранилища (В). 1 - Alphaproteobacteria, 2 - Betaproteobacteria, 3 Gammaproteobacteria, 4 - Actinobacteria, 5 - Bacteroidetes.

Состав фильтрующихся бактерий в проанализированных пресноводных экосистемах представлен на Рисунке 6. Во всех случаях, в качестве доминирующей группы выступали представители класса Betaproteobacteria. Для сфагнового болота была характерна высокая доля представителей филума Bacteroidetes. Наибольшее разнообразие фильтрующихся бактерий было выявлено в воде ацидных озер, а наименьшее — в воде Рыбинского водохранилища.

5. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм архей 5.1 Малые озёра водосбора. Библиотека клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК архей, выявленных в фильтрованной воде ацидных озер, включала 120 последовательностей представителей Euryarchaeota, из них 48 были получены из озера Дубровское и 72 - из озера Мотыкино. Лишь треть этих клонов обнаруживала высокое сходство (97-99%) с генами 16S рРНК таксономически описанных организмов - представителей порядков Methanobacteriales и Methanosarciriales (Рис. 7). 34 клона образовывали общие кластеры с нуклеотидными последовательностями метаногенов рода Methanobacterium, а также последовательностями клонов, полученных ранее из болот Финляндии и США (Metje et al., 2005; Cadillo-Quiroz et al., 2008) и многолетней мерзлотной почвы России (Metje et al., 2007). Группы из 3-х и 4-х клонов, выявленные в фильтрованной воде, обнаруживали высокое сходство с нуклеотидными последовательностями генов 16S рРНК метаногенов рода Methanobrevibacter и Methanosarcina, соответственно.

,_£lone 0A1.91, MA14, 20, 24, 63, P0A7, 19, J-^34, 79, 81, 97, 112, RA44, 56, 126

-P Clone POA77

r-F'Clone DA7, DA86, MA17, MA 30, MA62 t_ "Mackenzie river" archaeon, EF014514

HgisssKag

_ u "Mackenzie riveT archaeon, DQ310430

~_I C oneDA74

1 Clone DA85 -contaminated aquifer archaeon, AF050612

Clone DA3, 62, 65, 69, 71, 90, MA29, 45, POAHO (2)

r^ RA9, 25 (2), 33 (4), 55 (7), 86 (4), 92, 104 (6)

Clone RA61 (4)

Clone DA46, 83, MA54, RA23, 24 (3), SO, 125

Clone POA62

— river" archaeon, EU244266

■ arctic peat archaeon. AM712544 rctic take archaeon. EU782019 Clone DA16,87, MA32, 59 — hydrotermal vent archaeon, AB019752 Clone DA15

- freshwater sediment archaeon, GU257043

Mackenzie river' archaeon, DQ310396 - Clone DA55

hydrotermal vent archaeon. AB019753 ftone DA42, MA31, 64, RA16 (4), 17 (3), 36 (3), 64, 90 (2), 100 Clone DA26

c,oc№#8

ne lor

lone Fx--* lone PQA6 lone POA55

Lake Uebreta* archaeon, FR820727

"Mackenzie river" archaeon. DQ310418

P СЮпёр/ Г^ Clone DA

__rieäTl Li clone

Lj- Methan

~ tJaihansil

■ "Macker

Clone MA11 f Clone MA15 1 Clone MA4 - Clone DA63 •Clone RA30

£l^flSi4tSAsSiKint archaeon, GU257266 -— togaltei^ archaeon, AM905420

frWii

Clone «ft 697129 7 Clone DA34, 80, MA1, 5, 13, 22, 27, 28, 33, 39, 40, RA14 (3), 31, 34 (3), ' 48 (2), 52, 53, 57. 65, 69 (2), 73 (2), 74 (7), 101 (3), 111, 116 minerotrophic fen archaeon. EUT55988

subarctic permafrost ai ' ----------

leon. C

LDS cluster

boreal fen archaeon, AM905408 хздarchaeon. FJ822548

_____PDA139

.. lethanobactenum formicicum. AF028689 Methanobacterium subterraneum, X99045

*' " 'bacterium thermoautotrophicus. AE000930

lone L

.....

Methanobrevibacter smithil, U55235 Methanobacterium brvanbi, AF028688

"lore POA1 (6). 21 (2), 43, 47, 51 (2), 57 (2), 67 (2), 93 (2), 98 (4), lone Р&/Щ (Pi' RA27' 29 I4'' 46 I3)' 63 (2K 67 (2). 81. 93 (3), 110, 120 Clone POA58 (3) ,-lone POA37 (21 ICIone POA45 (2) Methanoregula boonel. DQ282124 Methanospnaerula palustris, EU 156000

------ч

,59 (2)

Methanosarcina lacustera, AF432127 mazeli, AF028691 wetland soil archaeon, AB570044 loneVSJSf'f0n archaeon' AM905394 at boaarchaeon. FJ822579 (2)

boreal forest archaeon, GU815337

- 'Candidatus Nitrososphaera gargensis",

'Cenarchaeum symbiosum" U51469

RC-V

Methanobacteriales

- uaiauunHii symbiosum" u.

Nitmsopumilus maritimus, DQ085Ö97

Methanomlcroblates

Methariosarcinales

Thaumarchaeota

Рис. 7. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного аналша клонированных нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК архей, выявленных в фильтрованной воде озер (лиловый и красный цвет), болота (зеленый) и водохранилища Рыбинское (синий). Маркер - 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.

Остальные клонированные последовательности были значительно удалены (7174% сходства генов 16S рРНК) от таковых у всех ранее охарактеризованных архей и принадлежали к пока неизученному классу мезофильных Euryarchaeota с условным названием LDS (Lake Dagow Sediment). Филогенетический кластер LDS был сформирован в 2004 году, на основе группы клонов, выявленных в озерных осадках (Glissman et al., 2003). В составе этого кластера клоны, полученные ранее в ходе молекулярных исследований из различных, преимущественно северных, экосистем, таких как меромектические озера, арктический шельф и северные реки (Galand et al., 2006, 2008; Pouliot et al., 2009).

5.2 Сфагновое болото водосбора. Библиотека фрагментов генов 16S рРНК фильтрующихся архей, выявленных в торфе болота Обуховское, состояла из 77 клонированных нуклеотидных последовательностей, из них 73 последовательности относились к филуму Euryarchaeota и 4 - к филуму Thaumarchaeota (Рис. 7).

Около половины клонов генов 16S рРНК эвриархей составляли нуклеотидные последовательности метаногенов порядков Methanobacteriales, Methanomicrobiales и Methanosarcinales. Особенно многочисленную группу (41 клон) составляли последовательности генов 16S рРНК, принадлежащие к порядку Methanomicrobiales и обнаруживающие 97-98% сходства с таковыми у болотного ацидофильного метаногена Methanoregula boonei (Brauer et al., 2011). Эти архей являются типичными обитателями кислых болотных экосистем и имеют очень мелкие клетки с диаметром 0.2-0.3 мкм. Единственный клон, представляющий порядок Methanobacteriales, принадлежал к филогенетической ветви Methanobacterium subterraneum, метаногена с очень тонкими (0.10-0.15 мкм в диаметре) палочковидными клетками (Kotelnikova et al., 1998). Представители порядка Methanosarcinales были обнаружены нами как в воде ацидных озер, так и в торфе болота. Другая половина клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся болотных архей принадлежала к двум ^охарактеризованным классам мезофильных Euryarchaeota -LDS (22 клона) и RC-V (Rice Cluster V) (5 клонов). Клонированные последовательности представителей LDS, выявленные в торфе болота, образовывали общие кластеры с последовательностями, полученными из воды ацидных озер Дубровское и Мотыкино.

Четыре клонированные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК фильтрующихся форм болотных архей представляли Thaumarchaeota. Эта группа архей насчитывает лишь ограниченное число культивируемых и охарактеризованных представителей, однако среди них уже известны организмы с клетками ультрамикро-диапазона. Среди последних - типичный обитатель морских вод Candidatus Nitrosopumilus martimus, палочковидные клетки которого имеют диаметр 0.17 - 0.22

мкм (Könneke et al., 2005). Полученные в нашей работе последовательности таумархей, однако, обнаруживали наибольшее сходство (до 99%) с клонами, выявленными ранее в различных болотных экосистемах. По всей видимости, отдельные группы в пределах Thaumarchaeota являются типичными обитателями северных болот.

5.3 Рыбинское водохранилище. Библиотека клонированных нуклеотидных последовательностей генов I6S рРНК фильтрующихся архей насчитывала 105 клонов, представляющих филум Euryarchaeota (Рис. 7). Из них, 47 клонированных фрагментов генов 16S рРНК принадлежали метаногенам порядков Methanobacteriales и Methanomicrobiales. Представители порядка Methanobacteriales, филогенетически близкие к Methanobacterium subterrenium, были выявлены нами ранее в составе фракции фильтрующихся архей как в воде ацидных озер, так и в болотной воде. 18 клонированных последовательностей представляли порядок Methanomicrobiales и обнаруживали высокое сходство с последовательностью гена 16S рРНК болотного метано гена Methanoregula boonei (Brauer et al., 2011). Эти архей также выявлялись нами ранее при анализе пула ультрамелких прокариот сфагнового болота. Остальные 58 клонов представляли два ^охарактеризованных класса эвриархей - LDS и RC-V. Наиболее многочисленными были последовательности, относящиеся к классу LDS, в составе которого можно выделить, по крайней мере, четыре отдельных филогенетических ветви (Рис. 7). Каждая из этих ветвей представлена нуклеотидными последовательностями генов 16S рРНК, выявленными в ходе наших исследований в воде ацидных озер и сфагнового болота водосборных территорий, а также воде Рыбинского водохранилища. Очевидно, что представители класса LDS являются типичными обитателями пресноводных экосистем севера России.

Групповая представленность фильтрующихся архей в проанализированных пресноводных экосистемах показана на Рисунке 8. Во всех исследованных в настоящей работе экосистемах в качестве доминирующей группы выступали эвриархеи класса LDS. Представители класса RC-V составляли относительно небольшую долю фильтрующихся архей в водах болота и водохранилища. От трети до половины фильтрующихся архей составляли клетки известных метаногенов классов Methanobacteriales, Methanomicrobiales и Methanosarcinales.

А) малые озера

Б) болото

В) водохранилище

Рис. 8. Состав библиотеки клонов генов 16Б рРНК бактерий, полученных из фракции фильтрующихся клеток воды малых озер (А), торфа сфагнового болота водосбора (Б) и (В) воды Рыбинского водохранилища. 1 - Л/ег/юлобайег/а/е^, 2 - Ме1Иапот1сгоЫа1е5, 3 - Ме1Иапо$агста1е5, 4 — класс 1Л)8, 5 - класс ЯС-У, 6 - ТЬаитагсЬаео1а.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показало настоящее исследование, численность фильтрующихся микроорганизмов, проникающих через «бактериальные» фильтры с порами диаметром 0.22 мкм, в пресноводных северных экосистемах может быть довольно велика и достигать 104 клеток в 1 мл воды. Лишь 0.5-1.2% этих клеток способны сформировать колонии при посеве на традиционные агаризованные питательные среды. Спектр изолятов, полученных из фильтрованной воды методом посева, включал представителей хорошо известных таксонов, таких как виды родов Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Sphingomonas, Ralstonia и Microbacterium. Клетки этих бактерий имели тенденцию увеличения в размерах при культивировании в лаборатории, то есть не являлись истинными ультрамикробактериями (Дуда и др., 2012). В своем большинстве, эти организмы были нерепрезентативны для пула фильтрующихся бактерий, выявленного в воде с помощью молекулярного анализа. Таким образом, метод посева оказался малопригоден для выявления и идентификации фильтрующихся клеток. Более полное представление об их разнообразии было получено с помощью анализа библиотек клонов, сформированных путем ПЦР-амплификации генов 16S рРНК бактерий и архей из ДНК фракции клеток, собранных из фильтратов воды.

Результаты сравнения разнообразия пула последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся форм микроорганизмов воды Рыбинского водохранилища с таковым в воде ацидных озер и сфагнового болота Молого-Шекснинского водосбора представлены на Рисунке 9.

Рис. 9. Диаграмма, иллюстрирующая количество общих и уникальных операционных таксономических единиц (OTE) с уровнем сходства 97% среди клонов генов 16S рРНК бактерий (А) и архей (Б), полученных из образцов фильтрованной воды Рыбинского водохранилища, а также малых озер Дубровское и Мотыкино и болота Обуховское, расположенных на водосборных территориях.

Как видно из диаграммы, разнообразие фильтрующихся бактерий в трех исследованных пресноводных экосистемах было довольно низким, причем пулы фильтрующихся бактерий этих экосистем существенно различались (Рис. 9А). Наибольшее разнообразие фильтрующихся бактерий (10 OTE) было выявлено в воде ацидных озер, тогда как в воде водохранилища оно было наименьшим (3 OTE). Ни в озерах, ни в болоте не были обнаружены нуклеотидные последовательности ультрамикробактерий подвида Polynucleobacter necessarius subsp. asymbioticus, характерные для воды водохранилища, хотя изолят этих бактерий был получен из фильтрованной воды озера Дубровское. По всей видимости, в озерной воде численность Polynucleobacter necessarius subsp. asymbioticus была очень низка. Единственным таксоном, общим для воды озер и болота были представители рода Pseudomonas. Таким образом, видовой состав фильтрующихся бактерий воды Рыбинского водохранилища был отличен от такового в водах болот и малых озер, расположенных на водосборных территориях. Причиной этого может выступать существенное различие величин pH и природы растворенного органического вещества вод водохранилища и экосистем заболоченных водосборов. Результаты идентификации фильтрующихся форм бактерий позволяют классифицировать их как

олиготрофных хемоорганотрофов, использующих продукты деградации гуминовых соединений, которыми богаты воды, поступающие с заболоченных водосборов. Филотипов, близких к известным патогенам, в составе фракции фильтрующихся бактерий изученных пресноводных экосистем выявлено не было.

Иной результат был получен при сравнении пулов фильтрующихся архей (Рис. 9Б). Филогенетическое разнообразие этих организмов было существенно выше такового у бактерий - от 10 OTE в воде водохранилища до 17 OTE в воде ацидных озер. Четыре OTE, составленные представителями класса LDS, были общими для всех трех исследованных экосистем, что подтверждает специфическую приуроченность архей этой группы к пресноводным экосистемам. Метаногены вида Methanoregula boonei были таксоном, общим для водохранилища и болота, тогда как архей, родственные Methanobacterium subterrenium, выступали в качестве таксона, общего для водохранилища и ацидных озер.

Таким образом, в отличие от пула фильтрующихся бактерий, который был уникален для каждой из исследованных экосистем, видовой состав фильтрующихся архей воды Рыбинского водохранилища обнаруживал существенное сходство с таковым в озерах и болотах водосборной территории и характеризовался доминированием представителей класса LDS. В составе этой группы архей пока нет культивируемых представителей, но в GenBank имеется уже более 400 нуклеотидных последовательностей ее представителей. Детальный анализ параметров экосистем, из которых данные нуклеотидные последовательности были получены, показал, что основными местообитаниями этой некультивируемой группы эвриархей являются аэробные пресноводные экосистемы и пресноводные осадки (Barberan et al., 2011). Сведения о физиологии или метаболическом типе представителей LDS до настоящего времени доступны не были. Как свидетельствуют наши исследования, организмы этой группы имеют клетки ультрамикро-диапазона. Исследование биологии этих архей представляет значительный интерес для дальнейших исследований.

выводы

1. Впервые осуществлена оценка численности микроорганизмов, проникающих через «бактериальные» фильтры с порами диаметром 0.22 мкм, в пресноводных экосистемах водосбора Верхней Волги (малых ацидных озерах и сфагновом болоте) и водах Рыбинского водохранилища. Показано, что численность фильтрующихся микроорганизмов составляет 104 клеток в 1 мл воды озер и водохранилища и 10б клеток в 1 г сырого торфа верхового болота.

2. Установлено, что методы посева неприменимы для количественного учета фильтрующихся микроорганизмов. Лишь 0.5-1.2% присутствовавших в фильтрованной воде микробных клеток были способны формировать колонии на питательных средах.

3. Молекулярная идентификация фильтрующихся бактерий показала, что во всех исследованных пресноводных экосистемах преобладают представители Betaproteobacteria, однако видовой состав пула фильтрующихся бактерий был уникален для каждой из исследованных экосистем.

4. Подавляющее большинство выявленных в исследованных экосистемах последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся бактерий обнаруживали высокое сходство (97-100%) с таковыми у представителей хорошо изученных родов, таких как Polynucleobacter, Pseudomonas, Herbaspirillum, Herminiimonas, Curvibacter, Burkholderia, Janthinobacterium, Chryseobacterium и Epilithonimonas. Филотипы, близкие к известным патогенам, в составе фракции фильтрующихся бактерий выявлены не были.

5. В отличие от бактерий, пулы фильтрующихся архей водосборных территорий и водохранилища обнаруживали существенное сходство и характеризовались преобладанием представителей неизученного филогенетического кластера LDS в пределах Euryarchaeota. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК представителей этого кластера обнаруживают лишь 71-74% сходства с таковыми

у охарактеризованных архей, а их клетки, по всей видимости, имеют ультрамикро- размеры.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Федотова А.В., Белова С.Э., Куличевская И.С., Дедыш С.Н. (2012). Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей в воде ацидных озер севера России. Микробиология. Т. 81, № 3. С. 306-312.

2. Белова С.Э., Федотова А.В., Дедыш С.Н. (2012). Ультрамикро-формы прокариот в сфагновом болоте водосбора Верхней Волги. Микробиология. Т. 81, №5. С. 665-671.

3. Федотова А.В., Серкебаева Ю.М., Сорокин В.В., Дедыш С.Н. Фильтрующиеся формы микроорганизмов в водах Рыбинского водохранилища. Микробиология (в печати).

Тезисы

1. Федотова А.В., Белова С.Э. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей в воде ацидного озера Дубровское. Материалы VI Международной молодёжной школы-конфкренции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН, 2627 октября 2012. МАКС Пресс, Москва. С. 119-120.

2. Федотова А.В., Дедыш С.Н. Исследование фильтрующихся форм микроорганизмов в воде Рыбинского водохранилища. БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных, 16-21 апреля 2012, Пущино. С. 46.

3. Федотова А.В. Молекулярная идентификация ультрамелких, фильтрующихся форм микробных клеток в воде Рыбинского водохранилища. Конференция молодых учёных «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты». 13 апреля 2012, Москва. С. 13.

4. Fedotova A.V., Belova S.E., Dedysh S.N. Phylogenetic analysis of microorganisms in two acidic boreal lakes that pass through 0.2-mikrometr-pore-size-filters. 4th FEMS Congress of European Microbiologists. June 26 - 30,2011. Geneva, Switzerland.

5. Fedotova A.V., Dedysh S.N. Representatives of the uncultured Euryarchaeota clade LDS prevail among filterable archaea in Northern freshwater habitats. 14th International Symposium on Microbial Ecology. August 19-24, 2012. Copenhagen, Denmark.

Формат 60x90/16. Заказ 1683. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,0.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федотова, Анна Вячеславовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им С.Н. Виноградского Российской академии наук

На правах рукописи

04201358028

Федотова Анна Вячеславовна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ БАКТЕРИЙ И АРХЕЙ УЛЬТРАПРЕСНЫХ ВОД

Специальность 03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, Дедыш С.Н.

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. 5

Актуальность проблемы. 5

Цели и задачи исследования. 7

Научная новизна и значимость работы. 8

Практическая значимость. 9

Апробация работы. 9

Публикации. 10

Объём и структура диссертации. 10

Место проведения работы и благодарности. 10

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 12

1.1. История вопроса и терминология. 12

1.1.1. История открытия фильтрующихся форм микроорганизмов. 12

1.1.2. Терминология, используемая для обозначения микроорганизмов

с клетками наноразмеров. 13

1.1.3. Нанобактерии и научные дискуссии об их природе. 14

1.1.4. Теоретические расчеты размеров «минимальной» живой клетки. 17

1.2. Известное разнообразие ультрамикропрокариот. 18

1.2.1. Свободноживущие прокариоты с клетками улътрамикро-размеров. 18

1.2.2. Паразитические формы и факультативные эпибионты. 29

1.2.3. Потенциально опасные представители. 36

1.3. Распространение микроорганизмов с клетками ультрамикро-диапазона в пресноводных экосистемах и методы их детекции. 39 1.3.1. Фильтрующиеся формы прокариот в ледниках. 39 1.3.2 Ультрамикроформы микроорганизмов в экстремальных местах обитания. 44

1.3.3. Ультрамикроформы прокариот в почвах. 47

1.3.4. Выявление фильтрующихся форм микробных клеток в пресных

водах с помощью культивирования. 48

1.3.5. Количественные исследования фильтрующихся

микроорганизмов в водах пресных водоемов. 50

1.3.6. Оценка разнообразия фильтрующихся клеток с помощью молекулярных методов. 52

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 56

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 56

2.1. Объекты исследования. 56

2.2. Методы микроскопии. 59

2.2.1. Учет общей численности микроорганизмов и численности фильтрующихся клеток в исследуемых образцах. 59

2.2.2. Анализ фильтрующихся клеток методом FISH. 61

2.2.3. Исследование фильтрующихся клеток

с помощью электронной микроскопии. 61

2.3. Методы культивирования.

2.3.1. Учёт и выделение фильтрующихся микроорганизмов с помощью посева. 62

2.3.2. Экстракция ДНК из клеток изолятов. 63

2.3.3. ПЦР-амплификация и определение нуклеотидных последовательностей генов 16SрРНК изолятов, выделенных из проб воды методом посева. 64

2.4. Молекулярные методы идентификации. 66

2.4.1. Сбор фракции фильтрующихся клеток для молекулярной идентификации и выделение ДНК. 66

2.4.2. ПЦР-амплификация, клонирование и анализ генов 16SрРНК. 66

2.4.3. Сравнение видового состава фильтрующихся микроорганизмов различных экосистем. 68 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 69

3.1. Выявление и учет фильтрующихся микроорганизмов с помощью микроскопии. 69 3.1.1 Определение численности фильтрующихся клеток методом прямого микроскопического учета. 69

3.1.2. Идентификация фильтрующихся форм прокариот с помощью

метода FISH. 70

3.1.3. Электронно-микроскопические исследования. 72

3.2. Культивирование на питательных средах. 73

3.3. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий. 77

3.3.1. Малые озёра водосбора. 77

3.3.2. Сфагновое болото водосбора. 80

3.3.3. Рыбинское водохранилище. 83

3.4 Молекулярная идентификация фильтрующихся форм архей. 86

3.4.1 Малые озёра водосбора. 86

3.4.2. Сфагновое болото водосбора. 88

3.4.3. Рыбинское водохранилище. 91

3.4.4. Присутствие представителя ЬББ - кластера в культуре бактерии Рап>1Ьаси1ит \avamentivorans. 93

3.4.5. Сравнительный анализ состава библиотек клонов генов 165 рРНК архей трёх исследованных экосистем. 96 ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 97 ВЫВОДЫ. 101 Список работ, опубликованных по теме диссертации. 102 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 103

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Вопрос достаточности и качества природной пресной воды на Земле - одна из глобальных проблем XXI века. Важнейшими природными центрами формирования ультрапресных вод в условиях равнинных ландшафтов, характерных для бореальной зоны России и других стран Северного полушария, являются болотные экосистемы (Заварзин, Дедыш, 2008). Формирующиеся в болотах гумусированные кислые воды питают многочисленные озера и реки северных регионов. Анализ вод малых ацидных озер, расположенных на заболоченных водосборах Верхней Волги показал, что микроорганизмы в них представлены преимущественно клетками малых размеров, которые с трудом поддаются идентификации с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и стандартного набора группо-специфичных зондов (Куличевская и др., 2011). Существенная часть этих клеток представлена ультрамикроформами, проникающими через «бактериальные» фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, которые повсеместно используются для очистки воды, питательных сред, сывороток и проч. от клеток микроорганизмов.

Несмотря на то, что интерес к фильтрующимся формам микроорганизмов появился давно (Sherman, Safford, 1928; Kleinberger-Nobel, 1951; Имшенецкий, Солнцева, 1958), сведения о них остаются весьма ограниченными. Впервые термин «ультрамикробактерия» был применен в 1981 году для описания морских гетеротрофных бактерий с диаметром клеток менее 0.3 мкм, которые медленно росли на стандартных питательных средах и не увеличивались в размерах при продолжительном культивировании в лаборатории (Torella, Morita, 1981). В дальнейшем трактовка этого термина была уточнена, так как оказалось, что многие из

таких мелких объектов представляют голодающие формы клеток, которые приобретают «нормальные» размеры в условиях доступности субстрата (MacDonell, Hood, 1982; Velimirov, 2001). В настоящее время термин «ультрамикробактерия» применяют для обозначения клеток объемом менее 0.1 мкм3 (Velimirov, 2001; Schut et al., 1997), а имеющиеся сведения об их биологии и разнообразии суммированы в ряде обзоров (Velimirov, 2001; Panikov, 2005; Duda, 2011; Дуда и др., 2012). Большинство этих организмов являются свободноживущими гетеротрофами, однако известны и паразитические формы (Huber et al., 2002; Сузина и др., 2011), а также потенциально опасные представители (Audic et al., 2007).

Многие ультрамикробактерии способны проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Признание этого факта микробиологами долгое время сдерживалось тем обстоятельством, что фильтрующиеся формы клеток или вообще не прорастают на стандартных питательных средах, или же образуют ультрамикроколонии, незаметные невооруженным глазом (Torella, Morita, 1981; MacDonell, Hood, 1982; Hahn, 2004). Эту проблему «некультивируемости» фильтрующихся форм удалось частично решить путем использования сильно разбавленных питательных сред и продолжительной инкубации посевов. Применение такого подхода для анализа образцов воды ряда рек, озер и прудов позволило получить коллекцию изолятов фильтрующихся форм бактерий, относящихся к филогенетическим группам Bacteroidetes, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Actinobacteria и Spirochaetes, многие из которых были в дальнейшем охарактеризованы в качестве новых таксонов (Hahn, 2003; Hahn et al., 2009, 2010, 2012).

Ни один из приемов культивирования, однако, не позволяет охватить все разнообразие присутствующих в образце микроорганизмов. Хорошей альтернативой

здесь является использование молекулярных методов, хотя перечень работ по молекулярной идентификации фильтрующихся форм микроорганизмов остается крайне скудным. Он ограничен исследованиями проб фильтрованной средиземноморской воды (Haller et al., 1999), грунтовых вод урановой шахты (Miyoshi et al., 2004), а также торфа кислых сфагновых болот (Panikov, 2005; Лысак и др., 2010). Идентификация основных популяций фильтрующихся бактерий была также проведена для воды ряда рек и озер Швейцарии (Wang et al., 2007). Было показано, что мл воды этих пресноводных водоемов содержит около 104 микробных клеток, способных проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, что составляет от 0.03 до 3.6% от общей численности бактериопланктона (Wang et al., 2007). Для водоемов России таких исследований не проводилось. Настоящая работа, таким образом, была предпринята для восполнения дефицита информации о численности и природе фильтрующихся форм микроорганизмов в водах пресноводных экосистем севера Европейской части России.

Цели и задачи исследования.

Цель работы - молекулярная идентификация ультрамикроформ бактерий и архей в ультрапресных водах экосистем водосбора Верхней Волги, а также водах Рыбинского водохранилища.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Определение численности клеток микроорганизмов, проникающих через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, в водах малых озёр и болот водосбора Верхней Волги, а также воде Рыбинского водохранилища.

2. Оценка применимости культуральных подходов для выявления и изучения фильтрующихся микробных клеток.

3. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей воды исследуемых экосистем путём формирования и анализа библиотеки клонов генов 168 рРНК, а также сравнение состава фильтрующихся микроорганизмов в водах водохранилища и водосборных территорий.

Научная новизна и значимость работы.

В настоящей работе впервые получены данные о численности и филогенетической принадлежности фильтрующихся форм микроорганизмов в ультрапресных водах природных экосистем водосбора Верхней Волги и Рыбинского водохранилища. Это первое системное исследование фильтрующихся микробных клеток, выполненное для водоемов России. Исследование показало, что численность фильтрующихся микроорганизмов в природных водах может быть довольно высока и достигать 104 клеток в 1 мл воды. Установлено, что состав фильтрующихся бактерий на заболоченных водосборных территориях отличен от такового в водах водохранилища. Организмов, близких известным патогенам в составе фильтрующихся бактерий не обнаружено. В составе фильтрующихся архей всех исследованных пресноводных экосистем впервые выявлены представители неизученного и не полученного пока в культурах кластера ЫЭБ филума ЕигуагсЬаеога. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что архей этой группы представлены клетками ультрамикро-диапазона.

Практическая значимость.

Идентификация и изучение ультрамикроформ микроорганизмов ультрапресных экосистем севера России имеет приоритетное значение в рамках проблемы водопользования, оценки потенциальных рисков и совершенствования методик очистки воды. В ходе выполнения работы получено и проанализировано около 250 клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся бактерий и 300 клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся архей; из них в GenBank депонировано 215 последовательностей. База данных этих последовательностей может быть использована для разработки молекулярных методов детекции фильтрующихся микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. Международной молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, ИНМИ РАН, 2010.

2. 16-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА», Пущино, ИБФМ РАН, 2012.

3. Конференции молодых учёных «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты», Москва, 2012.

4. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.

5. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen; Denmark, 2012.

Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 8 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 5 тезисах конференций.

Объём и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 118 страницах, включая 2 таблицы, 32 рисунка и списка литературы из 117 наименований, из них 13 - на русском и 104 - на английском языке.

Место проведения работы и благодарности.

Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2009 по 2013 годы под руководством д.б.н. С.Н. Дедыш.

Использованные в работе образцы воды и торфа были предоставлены автору к.б.н. А.Н. Буториным и д.б.н. В.Т. Комовым (ИБВВ РАН). Элекронно-микроскопические исследования фильтрованной воды были проведены совместно с В.В. Сорокиным (ИНМИ РАН) и к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН). Сравнительный анализ видового состава фильтрующихся микроорганизмов различных экосистем проведен совместно с Ю.М. Серкебаевой (ИНМИ РАН). Работа выполнена при финансировании в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Автор выражает искреннюю благодарность всем вышеупомянутым участникам данной работы, а также особую признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и к.б.н. С.Э. Беловой за полезные практические советы и помощь на всех этапах работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. История вопроса и терминология.

1.1.1. История открытия фильтрующихся форм микроорганизмов.

Фильтрация является стандартной процедурой стерилизации чувствительных к высоким температурам медицинских и лабораторных растворов, а также широко используется для очистки питьевой воды от клеток микроорганизмов. Первые сообщения об образовании некоторыми бактериями ультрамелких клеток, способных проникать через поры фильтров, появились в 30-х годах прошлого века (Sherman, Safford, 1928). Как оказалось, фильтрация сред и растворов через используемые в то время фильтры с размером пор 0.45 микрона не приводила к желаемому результату. Фильтрующиеся клетки микроорганизмов были обнаружены и в ряде других исследованных объектов, таких как молоко, почва, компост, фекалии и проч. (Sherman, Safford, 1928). Примечательно, что такие фильтрующиеся клетки обнаруживали крайне слабый и медленный рост на традиционно используемых микробиологами питательных средах, поэтому их сложно было выявить с помощью рутинных методов. Дальнейшие исследования показали, что целый ряд бактерий способен формировать фильтрующиеся формы клеток (Kleinberger-Nobel, 1951). В экспериментальных исследованиях фильтрующихся форм клеток и их свойств принимали участие и российские ученые (Имшенецкий, Солнцева, 1958). Результаты этих исследований и сделанные на их основании выводы, тем не менее, имеют ограниченную ценность на фоне современного уровня развития микробиологической науки.

1.1.2. Терминология, используемая для обозначения микроорганизмов с клетками наноразмерного диапазона.

Несмотря на то, что интерес к микроорганизмам с клетками наноразмерного диапазона появился давно, сведения о них остаются весьма ограниченными. Термин «ультрамикробактерия» был впервые применен в 1981 году для описания морских гетеротрофных бактерий с диаметром клеток менее 0.3 микрон (мкм), которые медленно росли на стандартных питательных средах и не увеличивались в размерах при продолжительном культивировании в лаборатории (Torella, Morita, 1981). В дальнейшем трактовка этого термина была уточнена, так как оказалось, что многие из таких мелких объектов представляют голодающие формы клеток, которые приобретают «нормальные» размеры в условиях доступности субстрата (MacDonel, Hood, 1982; Velimirov, 2001). Для таких часто встречающихся в природных местообитаниях микробных форм более корректным является термин «ультрамикроклетки» (Дуда и др., 2012).

В настоящее время термин «ультрамикробактерия» применяют для обозначения клеток объемом менее 0.1 мкм (Velimirov, 2001, Shut et al., 1997). К наиболее важным специфическим особенностям ультрамикробактерий относят следующие характеристики (Velimirov, 2001, Duda, 2011; Дуда и др., 2012):

- Объем клетки менее 0.1 мкм3 (это либо шаровидные клетки диаметром менее 0.5 цт или же очень тонкие клетки 0.1 мкм х 10 мкм, 0.2 мкм х 3 мкм),

- Сохранение малых размеров при культивировании в лабораторных условиях или условиях доступности субстрата,

- Малый размер генома (0.5 - 3.2 млн. пар оснований).

В числе других присущих ультрамикробактериям характеристик нужно упомянуть низкое содержание ДНК на фоне высокого содержания белка, высокую устойчивость к стрессовым факторам, в том числе адаптацию к длительному голоданию за счёт уникальных физиологических и молекулярных стратегий.

Термин «нанобактерии» впервые был употреблён в 1988 году в качестве синонима термина «ультрамикробактерия» (Morita, 1988). Большинство авторов в современной литературе применяют этот термин в аналогичном контексте.

1.1.3. Нанобактерии и научные дискуссии об их природе.

В 1998 году термин «нанобактерии» был использован применительно к обнаруженным в сыворотке крови частицам наноразмеров (от 20 до 500 нанометров в диаметре), которые своей формой напоминали микробные клетки (Kajander, Ciftcioglu, 1998). Ультратонкие срезы этих объектов также обнаруживали некоторое сходство со срезами бактериальных клеток (Рис. 1). Как было показано, эти нанообъекты выступали в качестве центров осаждения фосфата кальция, что послужило основанием для пред�